專利名稱：人源抗戊肝病毒基因工程抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預防和治療用人源基因工程抗體的制備及應用，尤其是特異性針對戊肝病毒保護性抗原ORF2蛋白的基因工程抗體。
自1975年B淋巴細胞雜交瘤細胞融合技術(shù)問世以來，單克隆抗體作為一類用于基礎(chǔ)研究，實驗室診斷，臨床治療和預防的新型產(chǎn)物，其運用價值和開發(fā)前景已獲得普遍的肯定。分子生物學和分子免疫學的研究發(fā)展導致了基因工程抗體的產(chǎn)生和發(fā)展。通過抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對單克隆抗體的研究有了突破性進展并越來越顯示出其重要意義及實際運用前景80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫技術(shù)興起和整個基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，使當今世界人源或基因工程抗體的開發(fā)研究取得很大進展并已由基礎(chǔ)研究階段步入實質(zhì)性應用研究和開發(fā)階段。目前美國FDA批準上市或待批的生物制品中，各種形式的單克隆抗體和基因工程抗體占到一定比例，目前以批準上市的67種生物制品中，治療和預防用單克隆抗體和基因工程抗體共有9種。正在待批中等抗體有54種。其中已批準上市并且產(chǎn)生巨大經(jīng)濟和社會效益的四種人源化基因工程抗體中，其中有一種即為抗病毒基因工程抗體，其商品名為“SynagisTM″，為人源化抗呼吸道合病毒(RSV)基因工程抗體。
至今為止，大多數(shù)病毒性疾病無特異性治療藥物。戊肝病毒的主要傳播途徑是糞-口傳播，已報道的爆發(fā)流行中主要由飲用水污染造成。在流行地區(qū)，對戊肝的預防首要的是提供潔凈的飲用水，而疫苗預防是最終控制發(fā)展中國家戊型肝炎流行的重要措施。美國、印度和中國已有關(guān)于戊型肝炎病毒重組蛋白疫苗的動物實驗的報道，但結(jié)果并不一致，因此在戊型肝炎的預防和治療方面，特別是爆發(fā)流行時，被動免疫的作用也是值得重視的。根據(jù)對疫區(qū)的研究報道，僅靠自然免疫產(chǎn)生的抗體起到的保護作用是不完全的。最近的研究表明，在爆發(fā)流行中對孕婦進行免疫球蛋白治療可有效減少感染病毒的數(shù)量，但急性感染病例仍不能得到控制。另據(jù)報道，來自于黑猩猩的針對ORF2蛋白的單克隆抗體在對恒河猴的病毒攻擊實驗中起到了一定保護作用。因此，對人源抗戊型肝炎病毒抗體的研究不僅對疾病的預防和治療有一定的作用，而且對進一步研究病毒在體內(nèi)的致病機制提供了有利的工具。用純鼠源單克隆抗體預防和治療病毒性疾病在國際上尚無任何批準的先例，鼠源抗體人用最大的不利之處為異源蛋白，在人體內(nèi)易引起遺傳免疫排斥而使抗體失效并引起免疫性疾病。因此，特異性抗病毒人源抗體是病毒性疾病預防和治療的最有前景的生物制品之一。人源抗病毒基因工程抗體的研究除已成功的抗RSV抗體外，通過噬菌體表面呈現(xiàn)系統(tǒng)，基因工程抗體庫技術(shù)和分子生物學手段的聯(lián)合運用，這一領(lǐng)域的研究已取得重大進展。
本發(fā)明的目的是通過基因工程手段和噬菌體表面表達技術(shù)結(jié)合運用，直接從人抗體基因庫中篩選出抗戊肝病毒的基因工程單克隆抗體，獲得其抗體基因，為將來可能的臨床抗病毒預防和治療提供可行性的特異性抗體藥物。
本發(fā)明陳述的人源抗戊肝病毒基因工程抗體包括1、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，包括Fab抗體基因、基因產(chǎn)物及其應用。其主要特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核和真核細胞中獲得有效表達的特異性結(jié)合戊肝病毒的功能性抗體。
2、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要特征在于抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定的，其相應的氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，是人源抗戊肝病毒基因工程抗體可變區(qū)核苷酸和氨基酸序列。
3、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要基因特征在于特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來源于對人源抗戊肝病毒抗體基因庫的特異性富積篩選表達，其輕鏈(VL)和重鏈(VH)各自相應的三個CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列。重鏈(VH)三個CDR區(qū)的氨基酸序列包括HEV-Fab-216CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDYVWGSYGYFDY。HEV-Fab-315CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPLVDMITLGGVWLFDY。HEV-Fab-319CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTLGGSYGY。HEV-Fab-328CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTFGGVWLFDY。HEV-Fab-404CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTFGGVWLFDY。
輕鏈(VL)三個CDR區(qū)的氨基酸序列包括HEV-Fab-216CDR1為TGGSSNIGSSYHVH；CDR2為ADTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-315CDR1為TGGSSNIGSSYHVH；CDR2為DTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-319CDR1為AGSSSNIGAAYDVH，CDR2為SNSNRPS；CDR3為QSYDRSLNGVV。HEV-Fab-328CDR1為TGGSSNIGSSYHVH；CDR2為ADTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-404CDR1為AGSSSNIGAAYDVH；CDR2為SNSNRPS；CDR3為QSYDRSLNGVV。
4、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404 Fab抗體，其特征在于為一種在原核細胞中獲得穩(wěn)定有效表達的基因重組的人源抗戊肝病毒ORF2蛋白基因工程Fab抗體，由重鏈Fd和lamda鏈組成。
5、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要功能特征在于特異性識別戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白，應具有抗戊肝病毒感染的中和活性功能。
6、人源抗戊肝病毒基因工程抗體的用途，其特征在于利用上述獲得的抗體可變區(qū)，F(xiàn)ab或全抗體基因，可以在原核細胞、酵母細胞、真核細胞及任何重組病毒系統(tǒng)中表達和生產(chǎn)此抗體基因或以此為基礎(chǔ)改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和戊肝病毒感染的抗體產(chǎn)物，其基因表達產(chǎn)物可望在臨床上用于預防和治療由戊肝病毒引起的戊型肝炎。
7、人源抗戊肝病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)抗戊肝病毒中和抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的可變區(qū)中的CDR區(qū)特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈CDR區(qū)的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗戊肝病毒ORF2的中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物。
傳統(tǒng)的利用雜交瘤細胞技術(shù)獲得人源單克隆抗體相當困難，而且建立的細胞系通常不穩(wěn)定，基因易丟失。本發(fā)明陳述的人源抗戊肝病毒基因工程抗體，是在獲得抗體基因的基礎(chǔ)上獲得基因產(chǎn)物的表達，此抗體基因可隨著質(zhì)粒DNA在細菌內(nèi)的復制而穩(wěn)定復制，并可根據(jù)不同需要任意改建抗體基因，從而獲得一種可行性的臨床治療用抗體制劑。
以下的優(yōu)先實施例對本發(fā)明作詳細說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容在這些實施例中，為說明本發(fā)明，采用噬菌體表達載體為pComb3(Barbas C.III et al，Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991，8910164-10168)。所用主要菌株為商品化產(chǎn)品XLI-Blu(美國Strategene公司)。所用噬菌體為VCSM13(美國Invitrogene公司)。
實施例1-5為人源抗戊肝病毒基因工程抗體的篩選制備方法；實施例7為人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的基因特征；實例7-8為人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的特異性蛋白結(jié)合及功能特征。
實例1，人源IgG Fab段基因的PCR擴增用淋巴細胞分離液從免疫后經(jīng)檢測抗體滴度達到保護水平的人體外周抗凝血中分離淋巴細胞，用Tril-Zon(美國Gibco，BRL)提取總細胞RNA，用Olig-dT引物將提取的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Gibco，BRL)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用一組特異性IgGFabGamma鏈、Kampa鏈及Lamda鏈引物，對人源輕鏈和重鏈Fab基因進行PCR擴增。PCR條件為94℃1分鐘，54℃1分鐘、72℃2分鐘，35個循環(huán)(PE 4800)，上述PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，經(jīng)過DNA純化試劑盒QIAquickTMkit(德國QIAGEN公司)純化后，獲得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd鏈PCR產(chǎn)物。
實例2，噬菌體抗體基因庫的建立將不同引物合成的Kamba和Lamda鏈PCR產(chǎn)物混合，將不同引物合成的Fd鏈混合，分別用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌體載體pComb3，將克隆入輕，重鏈基因的pComb3載體DNA連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水懸起，電轉(zhuǎn)導入事先制備好的200ul電轉(zhuǎn)菌XLI-Blu，(電轉(zhuǎn)條件為Bio-Red電轉(zhuǎn)儀，0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2.5K伏)，電轉(zhuǎn)后加10mlSOC培養(yǎng)液，37℃1小時，加入10ml帶有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)液(3)，37℃1小時，加入80-100ml前述SB，37℃ 2小時后加入輔助噬菌體M13GCM1 X10 12，1小時后加入卡那霉素(70ug/ml)，37℃搖床培養(yǎng)過夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌體上清，經(jīng)9000rpm，20分鐘，4℃離心后，用2ml 0.02M PBS PH7.4重懸沉淀，建立噬菌體抗體庫，分裝保存于-20℃冰柜中。
實例3，用于抗體庫富集篩選的戊肝病毒抗原的制備所用抗原為原核表達并純化的HEVORF2蛋白，由本所肝炎室畢勝利老師惠贈。濃度為2mg/ml。
實例4，噬菌體抗體庫的特異性富集篩選用0.1M NaHCO3(pH8.6)的溶液包被純化的戊肝病毒抗原(0.5-1μg/ml)，每孔55μl，4℃過夜；次日用1×PBST洗去未吸附的抗原，用4％的脫脂奶37℃封閉1小時，棄封閉液；每孔加入50μl噬菌體抗體庫，37℃孵育2小時，棄去孔中未結(jié)合的噬菌體，用1×TBST(50mMTris-HCl，150mM NaCl，0.5％Tween 20，pH7.5)洗液沖洗各孔，沖洗時，用帶有吸頭的移液器反復吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌體；最后用ddH20洗兩遍，吸凈孔中的液體；每孔加入50μl Gly-HCl(pH2.2)的洗脫液，室溫孵育10分鐘。加入適量的2M Tris，以中和洗脫下來的噬菌體；將洗脫的噬菌體立即加入2ml新鮮制備的XLI-Blu菌液中(OD600＝1)，室溫孵育15-20分鐘；然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨芐青霉素20μg/ml，四環(huán)素10μg/ml)，立即取10μl涂氨芐青霉素平皿，以滴定噬菌體；三角瓶與37℃振蕩培養(yǎng)1小時，加入100mlSB(氨芐青霉素100μg/ml)，37℃1小時后，加入輔助噬菌體VCSM13 1ml，37℃振蕩培養(yǎng)2小時，加入卡那霉素(終濃度70μg/ml)，37℃培養(yǎng)過夜。如此反復篩選4-5次。
實例5，人IgGFab抗體可溶性表達產(chǎn)物的制備將帶有陽性抗體輕重鏈基因插入的陽性克隆擴增后按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA，用SpeI和NheI切除載體中的gIII，變FdgIII融合蛋白為獨立表達的蛋白，連接后轉(zhuǎn)化XLl-Blu菌，從過夜生長的氨芐碟子中挑取單個菌落，接種SB或TB細菌培養(yǎng)液，當細菌長至OD600＝0.2-0.3，加入1m M IPTG，在30℃誘導表達10-12小時。收獲細菌，離心后加入原培養(yǎng)液1/10體積的PBS(0.02 M pH7.4)重懸，反復凍融三次，4℃10000rpm離心10分鐘，上清即為表達的Fab抗體。備用于進一步的檢測和鑒定。陰性對照為載體pComb3轉(zhuǎn)化菌按同樣方法制備的細菌裂解液。
實例6人IgGFab抗體E216的可變區(qū)基因的核酸序列分析用Qiagen Miniprep Kit(美國Qiagen)制備質(zhì)粒DNA進行核酸序列分析。測序為自動測序。至少3個克隆被用于確定同一相同的序列。所獲序列均用DNA Strider(美國微軟公司)序列分析軟件進行分析處理，并比較Internet網(wǎng)絡(luò)上基因庫中的IgG序列。證實人源抗戊肝病毒基因工程Fab抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404基因由人IgGγ鏈Fd和λ鏈組成，其基因特征由VH和VL結(jié)構(gòu)域中的6個CDR區(qū)的特異性核甘酸序列和氨基酸構(gòu)成，序列比較資料如

圖1，是人源抗戊肝病毒基因工程抗體可變區(qū)氨基酸序列及分析比較。
實例7，從戊肝病毒免疫供體血液中分離淋巴細胞，用PCR技術(shù)擴增了人源IgGFab抗體基因，建立了噬菌體抗體基因庫，用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選并從富集篩選后獲得的Fab陽性克隆中，最后選出5株陽性克隆，F(xiàn)ab抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，來源于純化抗原的篩選。將表達的菌體細胞裂解上清同時檢測其對抗人Fab抗體的結(jié)合活性及對戊肝病毒純化抗原的抗原結(jié)合活性。ELISA結(jié)果表明獲得株單抗不僅被抗人IgGFab抗體所識別，同樣也識別結(jié)合上述純化戊肝病毒ORF2抗原，如說明書附圖2所示，為ELISA檢測抗原結(jié)合活性結(jié)果。
實例8，間接免疫熒光(IFA)試驗檢測將用于表達ORF2蛋白的桿狀病毒感染sf9細胞，27℃培養(yǎng)、96 hrs后，滴加至玻璃底片上，丙酮固定15min，加入Fab表達上清，37℃溫育30min，Tween/PBS沖洗，晾干，加入FITC標記的抗人Fab抗體，37℃溫育30min，沖洗，晾干，伊文氏藍染色后熒光顯微鏡觀察結(jié)果(陰性對照為陰性血清對照)。結(jié)果顯示，感染96小時后的sf9細胞中觀察到熒光，如說明書附圖3A所示，陰性血清對照未觀察到熒光，如說明書附圖3B所示，說明Fab抗體對戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白的結(jié)合具有很高的特異性。
實例9，HEV-Fab-216輕鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTATCTGGGGCCCTAGGGCAGAGGGTGACCATCCCCTGCACTGGGGGCAGCE L T Q P P S V S G A L G Q R V T I P CT G G STCCAACATCGGCTCAAGTTATCACGTCCATTGGTATCGCCAACTTCCGGGAACAGCCCCCAGACTGCTCATTS N I G S S Y H V HW Y R Q L P G T A P R L L ICDR1TATGCTGACACCAGGCGACCCTCTGGGGTCCCTGGACGATTCTCTGCTTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCTCCYA D T R R P SG V P G R F S A S K S G T S A SCDR2CTGGCCATTACTGACCTCCAGGCTGGAGATGAGGCAGATTATTATTGCCAGACCTATGACTCCGATCTGGGTL A I T D L Q A G D E A D Y Y CQ T Y D S D L GCDR3GGCTCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAGAGTGACAGTCTTAGGTG S VF G G G T R V T V L G實例10，HEV-Fab-216重鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACCL E S G G G L V Q P G G S L R L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGTF SS S A M SW V R Q S P G K G L E W V ST I SCDR1GGTTTTGGTGGTAGCACATACTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTACAAGG F G G S T Y Y T D S V K GR F T I S R D N 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G G S L I L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGTF SS S A M SW V R Q S P G K G L E W V ST I SCDR1GGTTTTGGTGGTAGCACATACTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTACAAGG F G G S T Y Y T D S V K GR F T I S R D N Y KCDR2AACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCCCTN T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A KV PTTAGTGGATATGATTACGTTGGGGGGAGTATGGCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCL V D M I T L G G V W L F D YW G Q G T L V T VCDR3實例13，HEV-Fab-319輕鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGCGTCACCATCCCCTGCGCTGGGAGCAGCE L T Q P P S V S G A P G Q S V T I P CA G S STCCAATATCGGGGCAGCATATGATGTGCATTGGTACCAACAATTTCCAGGGACAGTCCCCAAACTCCTCATCS N I G A A Y D V HW Y Q Q F P G T V P K L L ICDR1TACAGTAACAGCAATCGACCCTCAGGGGTCCCTGCCCGATTCTCTGGCTCCAAATCTGGCACCTCAGGCTCCYS N S N R P SG V P A R F S G S K S G T S G SCDR2CTGGCCATCACCGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTTATTATTACTGCCAGTCCTATGATAGGAGCCTGAATL A I T G L Q A E D E A Y Y Y CQ S Y D R S L NCDR3GGTGTAGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTG V VF G G G T K L T V L G實例14，HEV-Fab-319重鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGATACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACCL E S G G G L V Q P G G S L I L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGTF SS S A M SW V R Q S P G K G L E W V S T I SCDR1GGTTTTGGTGGTAGCACATACTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTACAAGG F G G S T Y Y T D S V K GR F T I S R D N Y KCDR2AACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCCCCN T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A KV PTTTAGTGGATATGATACGTTGGGGGGAAGTTATGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCF S G Y D T L G G S Y G YF D Y W G Q G T L V TCDR3GTCTCTTCAV S S實例15，HEV-Fab-328輕鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTATCTGGGGCCCTAGGGCAGAGGGTGACCATCCCCTGCACTGGGGGCAGCE L T Q P P S V S G A L G Q R V T I P CT G G 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權(quán)利要求
1.人源抗戊肝病毒基因工程抗體包括5株Fab抗體基因、基因產(chǎn)物及其應用，分別命名為HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404。其主要特征在于這些重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核細胞中獲得有效表達的特異性結(jié)合戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白的功能性抗體。
2.人源抗戊肝病毒基因工程抗體其主要特征在于抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補區(qū)域(Complementarity-Determining Regions，CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定的，其相應的氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，如摘要附圖。
3.人源抗戊肝病毒中和性基因工程抗體，其主要基因特征在于特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來源于對人源抗戊肝病毒抗體基因庫的特異性富積篩選表達，其輕鏈(VL)和重鏈各自相應的三個CDR區(qū)序列為5株抗體特有的全新序列，均由重鏈Fd和Lambda鏈組成。其重鏈(VH)三個CDR區(qū)的氨基酸序列包括HEV-Fab-216CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDYVWGSYGYFDY。HEV-Fab-315CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPLVDM。HEV-Fab-319CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTLGGSYGY。HEV-Fab-328CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTFGGVWLFDY。HEV-Fab-404CDR1為SSAMS；CDR2為TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTFGGVWLFDY輕鏈(VL)三個CDR區(qū)的氨基酸序列包括HEV-Fab-216CDR1為TGGSSNIGSSYHVH；CDR2為ADTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-315CDR1為TGGSSNIGSSYHVH；CDR2為DTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-319CDR1為AGSSSNIGAAYDVH，CDR2為SNSNRPS；CDR3為QSYDRSLNGVV。HEV-Fab-328CDR1為TGGSSNIGSSYHVH；CDR2為ADTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-404CDR1為AGSSSNIGAAYDVH；CDR2為SNSNRPS；CDR3為QSYDRSLNGVV。
4.人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要功能特征在于特異性識別戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白，應具有抗戊肝病毒感染的中和活性功能。
5.根據(jù)上述4條權(quán)利要求，人源抗戊肝病毒基因工程抗體的用途，其特征在于利用上述獲得的中和性抗體可變區(qū)，F(xiàn)ab或全抗體基因，可以在原核細胞、酵母細胞、真核細胞及任何重組病毒系統(tǒng)中表達和生產(chǎn)此抗體基因或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和戊肝病毒感染的抗體產(chǎn)物，其基因表達產(chǎn)物可望在臨床上用于預防和治療由戊肝病毒引起的戊型肝炎。
6.根據(jù)權(quán)利要求2和3，人源抗戊肝病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)抗戊肝病毒中和抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的可變區(qū)中的CDR區(qū)特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈6個CDR區(qū)的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗戊肝病毒ORF2的中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2，3和5，人源抗戊肝病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求2，3中所述的CDR區(qū)氨基酸序列為本抗體專有的抗體序列，任何新的工程抗體可變區(qū)基因或相關(guān)產(chǎn)物基因不應含有與上述任何兩種CDR區(qū)序列完全相同或僅1-2個氨基酸差易的序列或含有權(quán)利要求3中任一種抗體輕重鏈的CDR區(qū)域的特征。任何新的工程抗體全抗體基因不應含有權(quán)利要求4中所述的特征。
全文摘要
人源抗戊肝病毒性基因工程抗體，命名HEV－Fab－216，HEV－Fab－315，HEV－Fab－319，HEV－Fab－328，HEV－Fab－404，包括Fab段、基因產(chǎn)物及其應用。其主要特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核和真核細胞中獲得有效表達的特異性結(jié)合戊肝ORF2蛋白的功能性抗體。其今后的可能用途在于利用此抗體CDR區(qū)或部分或全基因，可在原核、酵母、昆蟲和真核細胞及任何表達系統(tǒng)中生產(chǎn)此抗體，可在臨床上預防或治療HEV相關(guān)疾病。
文檔編號C12N15/63GK1486990SQ0312091
公開日2004年4月7日 申請日期2003年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月25日
發(fā)明者梁米芳, 畢勝利, 杜潤蕾 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所, 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制