專利名稱：預(yù)防或治療sars冠狀病毒的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的藥物，尤其是涉及利用RNA干擾技術(shù)制備的預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的藥物。
背景技術(shù)：
目前被稱為非典型肺炎的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe Acute RespiratorySydrome，SARS)在中國(guó)和世界范圍內(nèi)一些地區(qū)肆意橫行，如何對(duì)抗SARS感染，挽救生命已經(jīng)成為全世界所關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。許多專家學(xué)者已經(jīng)積極投身于針對(duì)病原體SARS冠狀病毒的疫苗的研制工作中，以期望能夠盡快找到控制SARS的手段。但是疫苗的研制不僅需要較長(zhǎng)時(shí)間，而且已經(jīng)證實(shí)SARS冠狀病毒存在不同的變種，這種變異特性必將增加疫苗研制的難度和周期，并降低其治療的有效性。因此當(dāng)務(wù)之急是尋求一種能夠快速有效控制SARS的新方法。
RNA干擾技術(shù)，是近年來(lái)生物學(xué)領(lǐng)域中出現(xiàn)的一門(mén)新興技術(shù)，它的出現(xiàn)為整個(gè)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了一場(chǎng)新的變革。利用長(zhǎng)度為19-21bp的雙鏈RNA(dsRNA)，可以選擇性降解與其序列同源的mRNA，有效抑制特定基因的表達(dá)。由于RNA干擾技術(shù)具有特異性阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)的特點(diǎn)，因而該技術(shù)可以作為抵御病毒等病原微生物感染的一種新型治療手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。大量研究表明，利用RNA干擾技術(shù)可以有效控制HIV病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和流感病毒等病原微生物對(duì)細(xì)胞的感染。
目前鑒于引起SARS的冠狀病毒基因測(cè)序已經(jīng)完成，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可能是現(xiàn)階段對(duì)抗該病毒感染，快速控制疾病進(jìn)程最為有效的方式。RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶是SARS冠狀病毒在感染細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制所必需的。設(shè)計(jì)并合成特異性針對(duì)編碼該聚合酶基因序列全長(zhǎng)的多種dsRNA，并將其同時(shí)導(dǎo)入患者體內(nèi)，可以選擇性降解該酶的mRNA，阻斷其蛋白表達(dá)，使SARS冠狀病毒在感染細(xì)胞中無(wú)法完成復(fù)制過(guò)程，從而切斷病原體在體內(nèi)的代謝途徑，有效控制疾病進(jìn)程。由于引起SARS的冠狀病毒是RNA病毒，而設(shè)計(jì)的dsRNA與病毒的v-RNA和c-RNA都具有序列同源性，因而采用RNA干擾手段，有可能直接引發(fā)病毒v-RNA和c-RNA的降解，從而在根本上清除感染細(xì)胞中的病毒。
采用RNA干擾技術(shù)治療SARS具有如下優(yōu)點(diǎn)首先，由于所設(shè)計(jì)的多種dsRNA幾乎含蓋編碼該酶基因序列的全長(zhǎng)，以及RNA干擾技術(shù)自身所具有的特點(diǎn)，因而這種方法具有高效性，特異性；第二，由于SARS冠狀病毒的RNA聚合酶在不同變種間具有高度保守性，這一特點(diǎn)可以保證該治療方式不會(huì)因?yàn)樽儺愔甑某霈F(xiàn)而影響其療效，確保該種方法具有長(zhǎng)期有效性；第三，由于所合成的dsRNA在序列上與人不存在任何同源性，以及RNA自身的屬性，該種治療不會(huì)給患者帶來(lái)毒副作用，使用安全可靠。另外，目前合成dsRNA化學(xué)方法或生物方法都已經(jīng)十分成熟，并且整個(gè)合成過(guò)程周期短，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。鑒于RNA干擾技術(shù)具有以上特點(diǎn)，我們認(rèn)為目前研制和開(kāi)發(fā)治療SARS的dsRNA藥物不但具有實(shí)際可操作性而且擁有良好的應(yīng)用前景。
目前國(guó)內(nèi)外的研究已證明了SARS冠狀病毒的基因序列。鑒于國(guó)外已投入大量人力和物力研制抗SARS的siRNA(short interfering RNAs)，我們的研究目標(biāo)是以能夠快速投入臨床應(yīng)用為目的，研發(fā)具有抗SARS病毒的準(zhǔn)確性和安全性的藥物。依據(jù)國(guó)外研究的最新成果，快速且行之有效的技術(shù)是采用siRNA技術(shù)。以往采用siRNA技術(shù)抗病毒的研究成果，已為本發(fā)明的抗SARS冠狀病毒藥物提供了可實(shí)施的技術(shù)路線。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的藥物，其為含有抗SARS冠狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的聚合酶的siRNA藥物(Anti-SARS coronavirussiRNAs)，或者包含該siRNA藥物中的全部RNA序列的RNAi(interfering RNA)藥物。本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的方法，包括施用有效劑量的上述藥物，可以用來(lái)預(yù)防或治療有可能以及已經(jīng)感染SARS冠狀病毒的相關(guān)人群。
本發(fā)明原理在于特異性siRNA針對(duì)病毒基因組保守序列，抑制病毒的mRNA。針對(duì)病毒的mRNA、病毒的nucleocapsid(NP)、病毒RNA轉(zhuǎn)錄酶(RNAtranscriptase，PA)、病毒的virion RNA以及互補(bǔ)RNA(complementary RNA)。設(shè)計(jì)并制備含特異siRNA的質(zhì)粒，并將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入選定的靶細(xì)胞進(jìn)行抗SARS病毒的研究。通過(guò)特異性抑制病毒的NP和PA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制途徑，最終為人類供治療和預(yù)防SARS病毒感染提供快速便宜的有效藥物。
本發(fā)明提供抗SARS冠狀病毒的siRNA藥物，其具體技術(shù)方案如下根據(jù)NCBI(National Center for Biotechnology，美國(guó)生物信息中心)在GenBank提供的SARS冠狀病毒的RNA聚合酶序列(AY268070，Hong Kong Strain completeseq of polymerase)，合成抗SARS冠狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的RNA聚合酶的全部RNA寡核苷酸，混合克分?jǐn)?shù)相等的互補(bǔ)寡核苷酸，進(jìn)行加熱，退火，然后進(jìn)行RNA寡核苷酸修飾，制備互補(bǔ)雙鏈(24對(duì)，見(jiàn)序列表1)，進(jìn)行siRNA雙向分析鑒定，得到最后的產(chǎn)物。
該藥物可以是包括序列表中的全部或部分RNA，加入培養(yǎng)基、脂質(zhì)體等，經(jīng)過(guò)混合處理，制備而成的混合物。
本發(fā)明提供另一種抗SARS冠狀病毒的經(jīng)過(guò)質(zhì)粒包裝的RNAi藥物，其具體技術(shù)方案如下合成抗SARS冠狀病毒RNA聚合酶的全部siRNA寡核苷酸(24對(duì))，插入小段編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的DNA模板片段，然后混合克分?jǐn)?shù)相等的互補(bǔ)寡核苷酸(complementary oligonucleotides)，按照合成siRNA藥物中加熱和退火的步驟進(jìn)行，制備而得互補(bǔ)雙鏈(24對(duì)，見(jiàn)序列表2)。
pSilencer 1.0-U6質(zhì)粒(由Ambion公司提供)進(jìn)行酶消化，純化并稀釋純化的DNA，用上述雙鏈寡核苷酸插入片段和消化好的1.0-U6質(zhì)粒DNA連接，在室溫下孵育過(guò)夜，得到裝載后的pSilencer 1.0-U6質(zhì)粒。同時(shí)制備不含插入片段的空載質(zhì)粒做陰性對(duì)照。本發(fā)明中的質(zhì)粒并不僅限于使用該質(zhì)粒，可以適用本技術(shù)領(lǐng)域中相關(guān)技術(shù)人員熟知的其他質(zhì)粒進(jìn)行。
按照常規(guī)方法制備E.coli的感受態(tài)，將上述連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli并接種在LB皿中37℃過(guò)夜，挑出克隆并搖菌擴(kuò)增，提質(zhì)粒并用HindIII酶切鑒定，陽(yáng)性克隆進(jìn)一步用T3引物測(cè)序鑒定，大量擴(kuò)增并純化陽(yáng)性質(zhì)粒，得到最后的產(chǎn)物。
該藥物pSilencer 1.0-U6質(zhì)?？梢詳y帶全部或部分序列表中RNA的混合物。
對(duì)該質(zhì)?？筍ARS病毒效果可以通過(guò)感染病人標(biāo)本中提取SARS冠狀病毒RNA全長(zhǎng)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在上述制備的cDNA樣品中，通過(guò)PCR技術(shù)篩選出SARS冠狀病毒RNA聚合酶全長(zhǎng)，純化、測(cè)序、擴(kuò)增。重組真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人上皮細(xì)胞系。再利用藥物選擇向靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含特異siRNA的雙鏈RNA片斷(經(jīng)脂質(zhì)體包裝有混合處理)或特異性RNAi質(zhì)粒(經(jīng)混合處理)，使細(xì)胞內(nèi)含有效量siRNA，從而達(dá)到抑制病毒的mRNA的目的，測(cè)定病毒滴度鑒定抑制病毒效果，從而選擇出最佳劑量和用藥方案。也可以進(jìn)行相關(guān)的動(dòng)物試驗(yàn)，將動(dòng)物接種SARS冠狀病毒，然后注射雙鏈RNA片斷(經(jīng)脂質(zhì)體包裝有混合處理)或特異性RNAi質(zhì)粒(經(jīng)混合處理)，觀察癥狀并檢測(cè)病毒。
本發(fā)明還可以采用含有該siRNA或RNAi的多肽藥物用于治療。
本發(fā)明具有如下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)1.由于該方案設(shè)計(jì)是針對(duì)SARS冠狀病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制途徑特異性的RNA聚合酶的全部RNA序列制備的抗SARS冠狀病毒siRNA藥物，具有抗病毒感染高效，且RNA藥物對(duì)人體無(wú)害安全和可靠，所以盡管成本高，但是可以快速投入臨床應(yīng)用。
2.利用質(zhì)粒攜帶抗SARS冠狀病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制途徑特異性RNA聚合酶的全部RNA序列的RNAi藥物，不但具有抗病毒感染高效、安全和可靠的特性，且更具有價(jià)格便宜，可應(yīng)用性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。但由于攜帶基因的質(zhì)粒載體是否有一定副作用，尚需藥物療效和毒理實(shí)驗(yàn)。
3.目前對(duì)SARS冠狀病毒的研究多注重該病毒的基因序列的易變性。由于該病毒結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，為SARS病毒的診斷和治療帶來(lái)巨大的困惑。本項(xiàng)研究的創(chuàng)新性在于設(shè)計(jì)的siRNA不僅針對(duì)SARS的mRNA，而且特異性阻斷病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的RNA聚合酶。無(wú)論該病毒結(jié)構(gòu)多么不穩(wěn)定，從切斷其代謝途徑入手，研發(fā)的RNA藥物將有巨大的治療和預(yù)防的應(yīng)用前景。
序列表1，是抗SARS冠狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制RNA聚合酶的全部siRNA核苷酸序列，共24對(duì)，按照相關(guān)數(shù)字一一對(duì)應(yīng)。
序列表2，是抗SARS冠狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制RNA聚合酶的全部RNA核苷酸序列，共24對(duì)，按照相關(guān)數(shù)字一一對(duì)應(yīng)。
提供以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.抗SARS冠狀病毒的siRNA藥物的制備根據(jù)NCBI在GenBank提供的SARS冠狀病毒的序列(AY268049)，合成抗SARS冠狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制聚合酶的全部RNA寡核苷酸，混合克分?jǐn)?shù)相等的互補(bǔ)寡核苷酸，進(jìn)行加熱，5分鐘內(nèi)加熱到95℃，然后慢慢退火，1℃/30sec，直到35℃，然后，1℃/min，直到5℃，然后進(jìn)行RNA寡核苷酸修飾，制備互補(bǔ)雙鏈(24對(duì)，見(jiàn)序列表1)，進(jìn)行siRNA雙向分析鑒定，得到siRNA藥物。
實(shí)施例2.抗SARS冠狀病毒RNAi藥物的制備合成抗SARS冠狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制聚合酶的全部siRNA寡核苷酸(24對(duì))，插入片段，然后混合克分?jǐn)?shù)相等的互補(bǔ)寡核苷酸，按照實(shí)施例1中加熱和退火的步驟進(jìn)行，制備而得互補(bǔ)雙鏈(24對(duì)，見(jiàn)序列表2)。
pSilencer 1.0-U6質(zhì)粒(由Ambion公司提供)Apa I EcoR I酶消化，1％agarose膠純化并稀釋純化的DNA到0.5μg/μl，用上述雙鏈寡核苷酸插入片段(8ng/μl)和消化好的1.0-U6質(zhì)粒(500ng)DNA連接(T4 DNA連接酶)，在室溫下孵育過(guò)夜，得到裝載后的pSilencer 1.0-U6質(zhì)粒。同時(shí)制備不含插入片段的空載質(zhì)粒做陰性對(duì)照。
按照常規(guī)方法制備E.coli的感受態(tài)，將上述連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli并接種在LB皿中37℃過(guò)夜，挑出克隆并搖菌擴(kuò)增，提質(zhì)粒并用HindIII酶切鑒定，陽(yáng)性克隆進(jìn)一步用T3引物測(cè)序鑒定，大量擴(kuò)增并純化陽(yáng)性質(zhì)粒，得到RNAi藥物。
實(shí)施例3.SARS冠狀病毒檢測(cè)分離已經(jīng)確診感染SARS病毒的病人體內(nèi)的SARS冠狀病毒，將其注射到10天胚齡的雞胚尿囊腔(37℃)中，48小時(shí)后，收獲尿囊液(-80℃保存)，然后采用紅血球凝聚或噬斑測(cè)定病毒滴度。
實(shí)施例4.細(xì)胞培養(yǎng)和病毒轉(zhuǎn)染將SARS冠狀病毒易感真核細(xì)胞系培養(yǎng)，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后測(cè)定病毒滴度。
實(shí)施例5.SARS冠狀病毒和anti-SARS siRNA共同接種雞胚，檢測(cè)抗感染效果研究24對(duì)anti-SARS siRNA進(jìn)行混合處理，然后混入SARS病毒浠釋液，接種入10天胚齡的雞胚尿囊腔，37℃下，17小時(shí)后收獲尿囊液，測(cè)定病毒滴度。檢測(cè)anti-SARS siRNA抗SARS病毒的效果，可以通過(guò)Real Time PCR鑒定或Western印跡實(shí)驗(yàn)鑒定的方法進(jìn)行，從而確定該藥物對(duì)SARS冠狀病毒的抗感染效果。
實(shí)施例6.預(yù)先anti-SARS siRNA接種雞胚，后SARS感染，檢測(cè)預(yù)防效果研究將24對(duì)anti-SARS siRNA混合處理，接種10天胚齡的雞胚尿囊腔，24小時(shí)后加入SARS病毒浠釋液，保持37℃，17小時(shí)，然后收獲尿囊液，測(cè)定病毒滴度。檢測(cè)anti-SARS siRNA預(yù)防SARS病毒感染的效果，可以通過(guò)Real Time PCR鑒定或Western印跡實(shí)驗(yàn)鑒定的方法進(jìn)行，從而確定該藥物對(duì)SARS冠狀病毒的預(yù)防作用。
實(shí)施例7.預(yù)先SARS感染，進(jìn)行anti-SARS siRNA接種，檢測(cè)治療效果研究使用SARS病毒稀釋液感染10天胚齡的雞胚尿囊腔，48小時(shí)后收獲尿囊液，測(cè)定病毒滴度?；旌咸幚?4對(duì)anti-SARS siRNA，保持37℃，17小時(shí)后收獲尿囊液，測(cè)定病毒滴度。檢測(cè)anti-SARS siRNA治療SARS病毒感染的效果，可以通過(guò)RealTime PCR鑒定或Western印跡實(shí)驗(yàn)鑒定的方法進(jìn)行，從而確定該藥物對(duì)SARS冠狀病毒的治療作用。
實(shí)施例8.臨床應(yīng)用藥物劑型的研制SARS病毒感染純系鼠科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，使用不同劑量anti-SARS siRNA抗SARS病毒感染試驗(yàn)，確定最佳的劑量之后，針對(duì)SARS為呼吸道感染特性制備anti-SARS siRNA噴霧劑型。
實(shí)施例9.RNAi藥物抗SARS病毒效果檢測(cè)SARS冠狀病毒感染人上皮細(xì)胞系或通過(guò)感染病人標(biāo)本中提取SARS冠狀病毒RNA全長(zhǎng)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在上述制備的cDNA樣品中，通過(guò)PCR技術(shù)篩選出SARS冠狀病毒RNA聚合酶全長(zhǎng)，純化、測(cè)序、擴(kuò)增。重組真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人上皮細(xì)胞系，進(jìn)行培養(yǎng)，將純化好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，測(cè)定病毒滴定，鑒定抑制病毒的效果，選擇最佳劑量和用藥方案。
實(shí)施例10.質(zhì)粒毒理病毒試驗(yàn)將實(shí)施例2中的空質(zhì)粒和純化好的裝載質(zhì)粒分別注射動(dòng)物，測(cè)量辦致死劑量，并觀察有無(wú)其他副作用，進(jìn)行對(duì)照。實(shí)驗(yàn)按照國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。
序列表1<110>陸愛(ài)麗，侯緯敏<120>預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的藥物<160>48<210>1A<211>21<212>RNA<213>人<400>1UGGCCUCUCU UGUUCUUGCU U 21<210>1B<211>21<212>RNA<213>人<400>2GCAAGAACAA GAGAGGCCAU U 21<210>2A<211>21<212>RNA<213>人<400>3ACAUAACACU UGCUGUAACU U 21<210>2B<211>21<212>RNA<213>人<400>4GUUACAGCAA GUGUUAUGUU U 21<210>3A<211>21<212>RNA
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UUGUAGAUUG CGGACAUACU U 21<210>20A<211>21<212>RNA<213>人<400>39UCUACAACAC AGGCUCUAUU U 21<210>20B<211>21<212>RNA<213>人<400>40AUAGAGCCUG UGUUGUAGAU U 21<210>21A<211>21<212>RNA<213>人<400>41CACAGGCUCU AUGAGUGUCU U 21<210>21B<211>21<212>RNA<213>人<400>42GACACUCAUA GAGCCUGUGU U 21<210>22A<211>21<212>RNA<213>人<400>43AUAGGGAUGU UGAUCAUGAU U 21<210>22B<211>21
<212>RNA<213>人<400>42UCAUGAUCAA CAUCCCUAUU U 21<210>23A<211>21<212>RNA<213>人<400>45UUCGUGGAUG AGUUUUACGU U 21<210>23B<211>21<212>RNA<213>人<400>46CGUAAAACUC AUCCACGAAU U 21<210>24A<211>21<212>RNA<213>人<400>47ACAUUUCUCC AUGAUGAUUU U 21<210>24B<211>21<212>RNA<213>人<400>48AAUCAUCAUG GAGAAAUGUU U 21
序列表2<110>陸愛(ài)麗 侯緯敏<120>預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的藥物<160>48<210>1A<211>53<212>RNA<213>人<400>1TGGCCTCTCT TGTTCTTGCT TCAAGAGAGC AAGAACAAGA40GAGGCCATTT TTT 53<210>1B<211>61<212>RNA<213>人<400>2AATTAAAAAA TGGCCTCTCT TGTTCTTGCT CTCTTGAAGC40AAGAACAAGA GAGGCCAGGC C 61<210>2A<211>53<212>RNA<213>人<400>3ACATAACACT TGCTGTAACT TCAAGAGAGT TACAGCAAGT40GTTATGTTTT TTT 53<210>2B<211>61<212>RNA<213>人<400>4AATTAAAAAA ACATAACACT TGCTGTAACT CTCTTGAAGT40TACAGCAAGT GTTATGTGGC C 61
<210>3A<211>53<212>RNA<213>人<400>5CACTTGCTGT AACTTATCAT TCAAGAGATG ATAAGTTACA40GCAAGTGTTT TTT 53<210>3B<211>61<212>RNA<213>人<400>6AATTAAAAAA CACTTGCTGT AACTTATCAT CTCTTGAATG40ATAAGTTACA GCAAGTGGGC C 61<210>4A<211>53<212>RNA<213>人<400>7CTTATCACAC CGTTTCTACT TCAAGAGAGT AGAAACGGTG40TGATAAGTTT TTT 53<210>4B<211>61<212>RNA<213>人<400>8AATTAAAAAA CTTATCACAC CGTTTCTACT CTCTTGAAGT40AGAAACGGTG TGATAAGGGC C 61<210>5A<211>53<212>RNA<213>人<400>9CGAGTGTGCG CAAGTATTAT TCAAGAGATA ATACTTGCGC40
ACACTCGTTT TTT 53<210>5B<211>61<212>RNA<213>人<400>10AATTAAAAAA CGAGTGTGCG CAAGTATAT CTCTTGAATA40ATACTTGCGC ACACT CGGGC C 61<210>6A<211>53<212>RNA<213>人<400>11GTATTAAGTG AGATGGTCAT TCAAGAGATG ACCATCTCAC40 TTAATACTTTTTT 53<210>6B<211>61<212>RNA<213>人<400>12AATTAAAAAA GTATTAAGTG AGATGGTCAT CTCTTGAATG40ACCATCTCAC TTAATACGGC C 61<210>7A<211>53<212>RNA<213>人<400>13GTGAGATGGT CATGTGTGGT TCAAGAGACC ACACATGACC40ATCTCACTTT TTT 53<210>7B<211>61<212>RNA<213>人<400>14
AATTAAAAAA GTGAGATGGT CATGTGTGGT CTCTTGAACC40ACACATGACC ATCTCACGGC C 61<210>8A<211>53<212>RNA<213>人<400>15ACCAGGTGGA ACATCATCCT TCAAGAGAGG ATGATGTTCC40ACCTGGTTTT TTT 53<210>8A<211>61<212>RNA<213>人<400>16AATTAAAAAA ACCAGGTGGA ACATCATCCT CTCTTGAAGG40ATGATGTTCC ACCTGGTGGC C 61<210>9A<211>53<212>RNA<213>人<400>17CATCATCCGG TGATGCTACT TCAAGAGAGT AGCATCACCG40GATGATGTTT TTT 53<210>9B<211>61<212>RNA<213>人<400>18AATTAAAAAA CATCATCCGG TGATGCTACT CTCTTGAAGT40AGCATCACCG GATGATGGGC C 61<210>10A<211>53<212>RNA<213>人
<400>19CTGCTTATGC TAATAGTGTT TCAAGAGAAC ACTATTAGCA TAAGCAGTTTTTT 53<210>10B<211>61<212>RNA<213>人<400>20AATTAAAAAA CTGCTTATGC TAATAGTGTT CTCTTGAAAC40ACTATTAGCA TAAGCAGGGC C 61<210>11A<211>53<212>RNA<213>人<400>21TAGTGTCTTT AACATTTGTT TCAAGAGAAC AAATGTTAAA40GACACTATTT TTT 53<210>11B<211>61<212>RNA<213>人<400>22AATTAAAAAA TAGTGTCTTT AACATTTGTT CTCTTGAAAC40AAATGTTAAA GACACTAGGC C 61<210>12A<211>53<212>RNA<213>人<400>23CATTTGTCAA GCTGTTACAT TCAAGAGATG TAACAGCTTG40ACAAATGTTT TTT 53<210>12B<211>61<212>RNA<213>人
<400>24AATTAAAAAA CATTTGTCAA GCTGTTACAT CTCTTGAATG40TAACAGCTTG ACAAATGGGC C 61<210>13A<211>53<212>RNA<213>人<400>25GCTGTTACAG CCAATGTAAT TCAAGAGATT ACATTGGCTG TAACAGCTTTTTT 53<210>13B<211>61<212>RNA<213>人<400>26AATTAAAAAA GCTGTTACAG CCAATGTAAT CTCTTGAATT40ACATTGGCTG TAACAGCGGC C 61<210>14A<211>53<212>RNA<213>人<400>27TGTAAATGCA CTTCTTTCAT TCAAGAGATG AAAGAAGTGC40ATTTACATTT TTT 53<210>14B<211>61<212>RNA<213>人<400>28AATTAAAAAA TGTAAATGCA CTTCTTTCAT CTCTTGAATG40AAAGAAGTGC ATTTACAGGC C 61<210>15A<211>53<212>RNA
<213>人<400>29ATGCACTTCT TTCAACTGAT TCAAGAGATC AGTTGAAAGA40AGTGCATTTT TTT 53<210>15B<211>61<212>RNA<213>人<400>30AATTAAAAAA ATGCACTTCT TTCAACTGAT CTCTTGAATC40AGTTGAAAGA AGTGCATGGC C 61<210>16A<211>53<212>RNA<213>人<400>31CTGATGGTAA TAAGATAGCT TCAAGAGAGC TATCTTATTA40 CCATCAGTTTTTT 53<210>16B<211>61<212>RNA<213>人<400>32AATTAAAAAA CTGATGGTAA TAAGAAGCT CTCTTGAAGC40 TATCTTATTACCATCAGGGC C 61<210>17A<211>53<212>RNA<213>人<400>33TAAGATAGCT GACAAGTATT TCAAGAGAAT ACTTGTCAGCT ATCTTATTTTTT 53<210>17B<211>61
<212>RNA<213>人<400>34AATTAAAAAA TAAGATAGCT GACAAGTATT CTCTTGAAAT40ACTTGTCAGC TATCTTAGGC C 61<210>18A<211>53<212>RNA<213>人<400>35GATAGCTGAC AAGTATGTCT TCAAGAGAGA CATACTTGTC40AGCTATCTTT TTT 53<210>18B<211>61<212>RNA<213>人<400>36AATTAAAAAA GATAGCTGAC AAGTATGTCT CTCTTGAAGA40CATACTTGTC AGCTATCGGC C 61<210>19A<211>53<212>RNA<213>人<400>37GTATGTCCGC AATCTACAAT TCAAGAGATT GTAGATTGCG40GACATACTTT TTT 53<210>19B<211>61<212>RNA<213>人<400>38AATTAAAAAA GTATGTCCGC AATCTACAAT CTCTTGAATT40GTAGATTGCG GACATACGGC C 61<210>20A
<211>53<212>RNA<213>人<400>39TCTACAACAC AGGCTCTATT TCAAGAGAAT AGAGCCTGTG40TTGTAGATTT TTT 53<210>20B<211>61<212>RNA<213>人<400>40AATTAAAAAA TCTACAACAC AGGCTCTTT CTCTTGAAAT40AGAGCCTGTG TTGTAGAGGC C 61<210>21A<211>53<212>RNA<213>人<400>41CACAGGCTCT ATGAGTGTCT TCAAGAGAGA CACTCATAGA40GCCTGTGTTT TTT 53<210>21B<211>61<212>RNA<213>人<400>42AATTAAAAAA CACAGGCTCT ATGAGTGTCT CTCTTGAAGA40CACTCATAGA GCCTGTGGGC C 61<210>22A<211>53<212>RNA<213>人<400>43ATAGGGATGT TGATCATGAT TCAAGAGATC ATGATCAACA40 TCCCTATTTTTTT 53
<210>22B<211>61<212>RNA<213>人<400>44AATTAAAAAA ATAGGGATGT TGATCATGAT CTCTTGAATC40ATGATCAACA TCCCTATGGC C 61<210>23A<211>53<212>RNA<213>人<400>45TTCGTGGATG AGTTTTACGT TCAAGAGACG TAAAACTCAT40CCACGAATTT TTT 53<210>23B<211>61<212>RNA<213>人<400>46AATTAAAAAA TTCGTGGATG AGTTTTACGT CTCTTGAACG40TAAAACTCAT CCACGAAGGC C 61<210>24A<211>53<212>RNA<213>人<400>47ACATTTCTCC ATGATGATTT TCAAGAGAAA TCATCATGGA40GAAATGTTTT TTT 53<210>24B<211>61<212>RNA<213>人<400>48AATTAAAAAA ACATTTCTCC ATGATGATTT CTCTTGAAAA40TCATCATGGA GAAATGTGGC C 6權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的藥物，其特征在于該藥物為抗SARS冠狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制RNA聚合酶的siRNA藥物，該藥物含有序列表1中列舉的RNA。
2.一種預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的RNA藥物，其特征在于該藥物為抗SARS冠狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制RNA聚合酶的RNAi藥物，該藥物含有序列表2中列舉的RNA。
3.權(quán)利要求2中所述的RNA藥物，其特征在于該藥物包含的序列表2中的RNA序列，是根據(jù)權(quán)利要求1中所述序列表1中全部RNA進(jìn)行質(zhì)粒包裝后而得到的序列。
4.權(quán)利要求1中的藥物，其特征在于可以是包括全部或部分序列表1中列舉RNA的混合物。
5.權(quán)利要求2中的藥物，其特征在于可以是包括全部或部分序列表2中列舉RNA的混合物。
6.一種預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的方法，它包括施用有效劑量的權(quán)利要求1的藥物。
7.一種預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的方法，它包括施用有效劑量的權(quán)利要求2的藥物。
8.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的藥物，其特征在于可以制備成噴霧劑的形式。
全文摘要
本發(fā)明提供預(yù)防或治療SARS冠狀病毒的藥物，利用SARS冠狀病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制途徑特異性酶的全部RNA序列，制備而得siRNA藥物以及利用特殊質(zhì)粒載體，插入小段編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的DNA模板后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA，在胞內(nèi)siRNA機(jī)制中發(fā)揮作用，制備而得RNAi藥物。上述兩類藥物均具有無(wú)毒性、高效性、特異性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性，施用適當(dāng)劑量的該藥物可以預(yù)防和治療SARS冠狀病毒，是一種能夠快速有效控制SARS冠狀病毒的新藥。
文檔編號(hào)C12N15/113GK1548054SQ0312517
公開(kāi)日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2003年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月8日
發(fā)明者侯緯敏, 沈麗, 陸愛(ài)麗, 扈啟寬 申請(qǐng)人:陸愛(ài)麗, 侯緯敏