專利名稱：質(zhì)量放大的壓電生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及壓電電傳感生物芯片的制作技術(shù)，納米材料標(biāo)記技術(shù)，生物材料標(biāo)記技術(shù)及電傳感芯片信號(hào)的讀取技術(shù)。
背景技術(shù)：
生物芯片是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)。它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。按所固定的探針，基因芯片可分為cDNA芯片和寡核苷酸微陣列芯片。cDNA芯片根據(jù)已有的cDNA文庫，通過PCR擴(kuò)增獲得制備芯片所需的探針。寡核苷酸通過末端修飾集團(tuán)固化在芯片上?；蛐酒苽浼夹g(shù)隨著基因芯片技術(shù)的不斷成熟而不斷發(fā)展，常用的制備技術(shù)有接觸點(diǎn)樣法(Stanford大學(xué))、光刻原位合成法(affymetrix公司)、噴墨法、分子印章合成法等。基因芯片靶標(biāo)常用熒光染料標(biāo)記。雜交后，常用的芯片信號(hào)檢測是將芯片置入芯片掃描儀中，通過采集各反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、熒光強(qiáng)弱、再經(jīng)相關(guān)軟件分析圖像，即可獲得有關(guān)生物信息。
綜觀所有生物傳感機(jī)制，光技術(shù)是占主導(dǎo)地位的。光譜分析法無疑是敏感度最高的化學(xué)分析手段。附著的熒光標(biāo)記乃至一些生物分子本身都擁有特征性強(qiáng)、方便的能級(jí)來進(jìn)行光分子吸收與放射，從而使光在頻譜(等價(jià)于能量，E＝hν。h是普朗克常數(shù)，ν是光波頻率)中容易被分辯出來。光技術(shù)的不足之處是其讀入系統(tǒng)體積大，造價(jià)高，使用壽命短。另外，熒光染料有不穩(wěn)定，易分解，背景熒光干擾等弱點(diǎn)。因此，有必要找到一種新的檢測方法，能夠進(jìn)一步提高檢測的特異性、準(zhǔn)確度和靈敏度，開發(fā)出能克服前述缺點(diǎn)的新一代芯片。
電致傳感指的是將外界信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的技術(shù)。與光致傳感相比，它們在生物領(lǐng)域應(yīng)用較晚。直至上世紀(jì)五十年代后，精密電測量儀器普遍應(yīng)用之后才開始顯示出優(yōu)勢。微電子技術(shù)使所有技術(shù)都朝電子方向靠攏，傳感器也不例外。只有直接將生物信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，然后直接傳入數(shù)據(jù)系統(tǒng)，才順理成章。而其它所有的方式都變得相對不那么直接了。在感應(yīng)性方面，電傳感完全有可能達(dá)到光的敏感度，甚至比光更高。一個(gè)很好的例子就是，所有生物都具有液相和氣相化學(xué)傳感器如動(dòng)物的舌頭與鼻子，昆蟲的觸角。這些天然的傳感器在許多方面連我們最好的儀器都望塵莫及。它們都是以電傳導(dǎo)為基礎(chǔ)的化學(xué)信號(hào)直接激發(fā)細(xì)胞的電激感，并通過中樞神經(jīng)回傳至大腦(當(dāng)然也是電方式)。光系統(tǒng)通常都比較昂貴，診所很難擁有，更不用說患者個(gè)人了。相比之下，電子系統(tǒng)價(jià)格低廉。而且，同樣功能的電子芯片價(jià)格繼續(xù)以每18個(gè)月50％的速度下降(摩爾定律)。隨著時(shí)間推移，我們必將看到生物芯片越來越向電致傳感方向發(fā)展。
晶體受外界機(jī)械壓力的作用，在其表面產(chǎn)生電荷的現(xiàn)象，稱為壓電效應(yīng)。比較常用的壓電材料有石英、鈮酸釔、PZT、鈦酸鋇等，還包括一些合成和天然的聚合物。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)交變激勵(lì)電壓施加于壓電晶體電極兩端時(shí)，晶體會(huì)產(chǎn)生機(jī)械變形振蕩。當(dāng)交變電壓頻率達(dá)到晶體固有頻率時(shí)，振幅加大，形成壓電諧振。此特定頻率稱為諧振頻率。根據(jù)壓電傳感機(jī)理，用壓電晶體制成諧振結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)其輸出信號(hào)與晶體的物理尺寸和性質(zhì)密切相關(guān)。一般來講，振動(dòng)頻率與諧振器件的質(zhì)量成相反的函數(shù)關(guān)系。當(dāng)有附加物質(zhì)結(jié)合在諧振器件表面，其質(zhì)量改變時(shí)，共振頻率便隨之移動(dòng)。如果我們在器件表面固化有特別化學(xué)識(shí)別性的材料，它會(huì)因某種特別樣品物質(zhì)的存在而使器件表面總的附加物質(zhì)量增加或減少，我們便可依靠共振頻率的移動(dòng)來測定這種化學(xué)親和或剝離過程。由此實(shí)現(xiàn)化學(xué)或生物電傳感器。這就是壓電體聲波(Bulk Acoustic WaveBAW)傳感器的原理。壓電表面聲波(Surface Acoustic WaveSAW)工作原理稍有改變。壓電聲波由發(fā)射極發(fā)出，經(jīng)過晶片表面?zhèn)鞑サ浇邮諛O。從發(fā)射到接收的延遲時(shí)間由延遲距離和延遲表面的負(fù)載決定(圖10)。但與BAW一致之處是我們同樣可以借助一個(gè)時(shí)間域(頻率倒數(shù)便為時(shí)間)信號(hào)檢測器件表面總的附加物質(zhì)質(zhì)量增加或減少。這是本項(xiàng)發(fā)明的基本原理之一。
在壓電體中，石英因其良好的機(jī)械、電化學(xué)和溫度等綜合性能，應(yīng)用最廣。是壓電化學(xué)和壓電生物傳感器的首選材料。以石英晶體制成的BAW器件又叫做石英晶微天平QCM(Quartz-Crystal-Microbalance)。對于AT方向切割的石英晶體，其振動(dòng)頻率f0反比于晶體厚度d，關(guān)系式為f0＝kf/d。其中kf為頻率常數(shù)(一般取0.168Mhz.cm)。當(dāng)有物質(zhì)結(jié)合在具有化學(xué)敏感性的上表面時(shí)，晶體的質(zhì)量變化為Δm，所產(chǎn)生的頻移Δf由Sauerbrey方程給出Δf＝-[2f02Δm]/[A(ρqμq)1/2]頻移Δf與質(zhì)量變化為Δm呈線性關(guān)系。這里ρq是石英的密度(2.648g-cm-3)，μq是石英的密度剪切模量(2.947×10-11dyn-cm-2)。對于共振頻率為5MHz的石英諧振器件，1Hz的共振頻率移動(dòng)相當(dāng)于17ng/cm2的質(zhì)量變化。
壓電體聲波是比較成熟的技術(shù)。在化學(xué)或生物檢測上應(yīng)用很廣。但由於其信號(hào)強(qiáng)度與表面附加物質(zhì)質(zhì)量變化成正比。對于DNA片段(切片之后的)，氨基酸，多肽酶等這樣的低中分子量的的生物分子，頻率移動(dòng)較小。信號(hào)不穩(wěn)定，受環(huán)境干擾大。以含20至40個(gè)堿基的DNA為例，在1014/cm2表面密度(這是已經(jīng)報(bào)道的最高值)情況下，只能對5MHZ的石英BAW器件產(chǎn)生1HZ的頻率移動(dòng)。SAW器件在靈敏度上也有類似問題。這就使其在這類生物傳感器上的應(yīng)用非常有限。尤其是在生物芯片上，傳感器要做成信號(hào)重復(fù)性很高的陣列就更不可能了。本項(xiàng)發(fā)明利用納米或生物大分子材料，對樣品生物分子進(jìn)行標(biāo)記，從而增大了被探測分子的有效質(zhì)量，使壓電聲波信號(hào)大大增強(qiáng)。由于這種標(biāo)記側(cè)重的是樣品生物分子的有效質(zhì)量，因此稱之為質(zhì)量標(biāo)記。出於這一原理，它的標(biāo)記材料選擇范圍甚廣。計(jì)算表明，放大效應(yīng)是非?？捎^的。以常用的納米金為例，在理想狀態(tài)下，它對20至40個(gè)堿基DNA放大作用為一百萬倍。即使考慮到不太理想的反應(yīng)率、以及納米顆粒表面沉積等因素，我們預(yù)計(jì)仍有一萬倍的放大效果。顯而易見，質(zhì)量標(biāo)記對壓電體聲波效應(yīng)的放大作用完全改變了BAW固有的缺陷。使其在中小分子的化學(xué)、生物檢測、尤其是陣列BAW傳感生物芯片的實(shí)用化成為可能。質(zhì)量標(biāo)記對SAW的意義與BAW基本相同。這是本項(xiàng)發(fā)明的基本原理之二。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用壓電聲波原理制作的生物芯片，以及利用納米金或其它質(zhì)量標(biāo)記材料進(jìn)行檢測的方法。
A、一種壓電體聲波(BAW)傳感器(圖3、圖4的第一到第4步)，包括壓電晶體基片和上下表面的傳感電極。壓電晶體基片一般采用AT方向切割的石英晶片，但亦包括其他可能的壓電晶體基片。上下表面?zhèn)鞲须姌O藉由半導(dǎo)體電子芯片的技術(shù)形成。電極可用金、銀以及其它一切與生物兼容的導(dǎo)電材料直接制成；或以其他金屬導(dǎo)電材料制成，然后再覆蓋與生物兼容的導(dǎo)電或絕緣材(鍍金層或沉積二氧化硅薄膜等)。
B、一種壓電表面聲波(SAW)傳感器(圖10)，與BAW不同處在于電極只在壓電晶體基片的一側(cè)表面，設(shè)有發(fā)射極和接收極，它們與地極呈梳形安裝。壓電聲波由發(fā)射極發(fā)出，沿晶片表面?zhèn)鞑サ浇邮諛O。延遲時(shí)間由發(fā)收電極的延遲距離和延遲表面的負(fù)載決定。壓電晶體基片一般采用石英晶片，但亦包括其他可能的壓電晶體基片。同樣，表面?zhèn)鞲须姌O藉由半導(dǎo)體電子芯片的技術(shù)形成。電極可用金、銀以及其它一切與生物兼容的導(dǎo)電材料直接制成；或以其它金屬導(dǎo)電材料制成，然后再覆蓋與生物兼容的導(dǎo)電或絕緣材(鍍金層或沉積二氧化硅薄膜等)。
C、在A所述的傳感器上表面、下表面、或上下二表面上固定生物探針。在B所述的傳感器電極同側(cè)延遲表面上固定生物探針。固定的生物探針一般是指單鏈DNA，RNA，抗體，蛋白；亦包括其它一切可能與分析物形成生物、化學(xué)親和或剝離反應(yīng)的物質(zhì)。這里所指的親和反應(yīng)包括單鏈DNA與單鏈DNA的雜交，mRNA與DNA，mRNA與tRNA，抗體與抗原的結(jié)合，蛋白質(zhì)與荷爾蒙的結(jié)合，蛋白質(zhì)與維生素的結(jié)合，蛋白質(zhì)在酶催化條件下形成或擴(kuò)展等等。這里所指的剝離反應(yīng)包括DNA在酶切割下斷鏈，蛋白質(zhì)在酶催化分解，以及上述親和反應(yīng)的逆過程(在濃度、溫度、酸鹼度改變后及機(jī)械振動(dòng)條件下而產(chǎn)生)。這種化學(xué)親和或剝離反應(yīng)可依靠A、B所述的傳感器共振頻率移動(dòng)來測定。
D、A所述的BAW單元傳感器可單獨(dú)使用；也可采用無源式或有源式形成陣列設(shè)計(jì)。無源式陣列可采用子元獨(dú)立連接法(見圖8)，或交叉連接法(見圖9)。交叉連接的上下電極貫穿線(BUS)交叉處不存在絕緣問題。由於貫穿線較細(xì)，交叉處的寄生壓電效應(yīng)和寄生電容都屬於二級(jí)效應(yīng)。交叉連接法避免了連線擁擠的問題?？蓪?shí)現(xiàn)中高密度陣列芯片，在數(shù)平方厘米大的基片上制作數(shù)萬子元的傳感器陣列。在圖8、圖9的設(shè)計(jì)中，某些情況下一側(cè)表面的諸個(gè)或所有電極可以在芯片上連通在一起，再與線路板連接。
E、B所述的SAW單元傳感器可單獨(dú)使用；也可采用無源式或有源式形成陣列設(shè)計(jì)。無源式陣列可采用子元獨(dú)立連接法(圖略，與圖8類似，把每個(gè)子元電極接線獨(dú)立從周邊引出)，或交叉連接法(見圖10)。交叉連接法的地、發(fā)、收三極貫穿線(BUS)交叉處絕緣問題可藉由半導(dǎo)體電子芯片制作技術(shù)中的通用的雙層金屬立體連接法完成。此法可實(shí)現(xiàn)中高密度陣列的芯片。在數(shù)平方厘米大的基片上制作數(shù)千乃至數(shù)萬子元的傳感器陣列。在(圖10)某些情況下諸個(gè)或所有的電極可以在芯片上連通在一起，再與線路板連接。
F、在D、E所述的傳感陣列芯片的情況下，C所述的生物探針采用與傳感器陣列同位固定，形成與傳感器陣列相匹配的生物探針陣列?？捎霉饪谭ㄖ鹨槐┞秱鞲衅鼽c(diǎn)元實(shí)現(xiàn)，這個(gè)方法幾何精度是最高的。我們也可以采用接觸點(diǎn)樣法、光刻原位合成法、噴墨法、及分子印章合成法來完成。每個(gè)子元的傳感器可獨(dú)立地測定與其相配的生物探針上的特異的生物信號(hào)。
G、為了減輕A所述傳感器下表面的影響，A、D所述的芯片可用MEMS刻蝕方法在下表面蝕刻一個(gè)平槽；或者把下表面進(jìn)行封裝；或者在下表面蝕刻平槽后再進(jìn)行封裝。但在某些情況下，這些步驟可以免去。
H、一種利用BAW或SAW生物芯片進(jìn)行生物檢測的方法，包括把樣品生物材料用納米粒子材料標(biāo)記后，與生物芯片上的探針雜交，以獲得放大的壓電體聲波效應(yīng)，便于進(jìn)行信號(hào)采集和分析處理。此法稱為“直接標(biāo)記法”。
I、一種利用BAW或SAW生物芯片進(jìn)行生物檢測的方法，包括把樣品生物材料與生物芯片上的探針雜交后，再用標(biāo)記材料標(biāo)記樣品生物材料，以獲得由質(zhì)量標(biāo)記材料所產(chǎn)生的壓電體聲波效應(yīng)。便於排除前面各步反應(yīng)的干擾，進(jìn)行信號(hào)采集和分析處理。此法稱為“追加標(biāo)記法”。
J、納米金、銀是H、I常用的質(zhì)量標(biāo)記材料。但本發(fā)明包括其它一切對壓電聲波效應(yīng)有質(zhì)量放大的納米粒子標(biāo)記材料，或其它有質(zhì)量放大的生物性(如大分子)標(biāo)記材料。
K、一種生物材料的標(biāo)記材料的鍵合方法生物材料與標(biāo)記材料直接鍵合。此法適用于H、I所述的標(biāo)記方法。
L、一種生物材料的標(biāo)記材料的鍵合方法生物材料與標(biāo)記材料首先被分別附著于一個(gè)親和對的兩部分，然后當(dāng)這些經(jīng)過預(yù)處理的生物材料與標(biāo)記材料結(jié)合時(shí)，標(biāo)記材料與生物材料藉由親和對的鍵合得以實(shí)現(xiàn)。這種方法使質(zhì)量標(biāo)記材料的制備過程更加簡單，因此一種預(yù)處理的質(zhì)量標(biāo)記材料能夠用來標(biāo)記各種生物材料。此法適用于H、I所述的標(biāo)記方法。但在I所述的標(biāo)記方法中作用更大。
M、內(nèi)容L所述生物親和對，可以使用卵白素-生物素體系、鏈球卵白素(streptavidin)-生物素體系、或者其它生物親和對體系。卵白素由四個(gè)相同的亞基組成。每個(gè)亞基能夠連接一個(gè)生物素分子，這種配對擁有目前為止最高的親和系數(shù)(K＝1015M-1)，幾乎是其最接近競爭者的1000倍。卵白素有四個(gè)位點(diǎn)，從而使附著多種納米粒子以發(fā)展多功能感應(yīng)裝置成為可能。卵白素同樣也可用來連接一種感應(yīng)系統(tǒng)里的多種生物親和系統(tǒng)，或通過親和素-生物素的多點(diǎn)橋連和再次復(fù)合達(dá)到多次放大，進(jìn)一步提高檢測靈敏度。
N、信號(hào)讀取方法(見圖12)。D、E中所述交叉連接法無源式陣列電路拓?fù)鋵W(xué)與存儲(chǔ)器類似，在行列地址交叉的子元上讀取信號(hào)。故可借用許多通用IC實(shí)現(xiàn)整個(gè)陣列信號(hào)讀取。如果要制作小型便攜式測試系統(tǒng)，可利用數(shù)字信號(hào)處理器(DSP)或掌中型電腦實(shí)現(xiàn)。此法當(dāng)然也適合于對單個(gè)傳感器和獨(dú)立連接法所實(shí)現(xiàn)的陣列的信號(hào)讀取。區(qū)別只在復(fù)用器的連線上稍有改動(dòng)。
本發(fā)明具有以下創(chuàng)新點(diǎn)●用納米粒子質(zhì)量特性，放大原較微弱的BAW、SAW生物信號(hào)，尤其是中小分子量的分析物，擴(kuò)大效率至少上萬倍，完全可使壓電型傳感器投入實(shí)用。將壓電體聲波技術(shù)應(yīng)用于生物芯片，開辟了除熒光檢測，放射性標(biāo)記檢測，金標(biāo)銀染等常規(guī)檢測方法以外的生物芯片檢測新領(lǐng)域。壓電體聲波技術(shù)對質(zhì)量變化的高敏感性成為生物芯片高敏感度和高準(zhǔn)確率的有力保障。
●納米金用于光檢測較多，本發(fā)明首次將它用于電學(xué)性陣列生物芯片，拓展了納米金及其它納米粒子標(biāo)記在生物芯片檢測中的應(yīng)用范圍。將生物信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)檢測，避免了其它檢測方法、檢測設(shè)備昂貴復(fù)雜的缺點(diǎn)。電的好處是成本低，可大規(guī)模推廣。
●本發(fā)明提供了將生物識(shí)別系統(tǒng)與納米顆粒、傳感器系統(tǒng)結(jié)合起來的方法，它具有普遍意義并應(yīng)用廣泛。它的意義在于將許多目前光機(jī)制生物芯片轉(zhuǎn)化為電機(jī)制生物芯片。在生物探針方面與光機(jī)制芯片完全一致，可借助相同原理進(jìn)行。
●獨(dú)特的陣列連接法使用與單個(gè)傳感器一樣多的工藝步驟便可實(shí)現(xiàn)陣列連接。電路拓?fù)鋵W(xué)與存儲(chǔ)器類似，故可借用許多通用電器元件實(shí)現(xiàn)芯片信號(hào)讀出。
●生物芯片在電傳感器加工部分與現(xiàn)有半導(dǎo)體工藝完全一致，為大規(guī)模生產(chǎn)找到了生產(chǎn)平臺(tái)，從而使產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控得到保證。我們的方案突破了生物芯片項(xiàng)目在產(chǎn)品化過程中的瓶頸。
●這一設(shè)計(jì)在檢測信號(hào)處理上都可通過商業(yè)化IC芯片完成。最終小型化的檢測系統(tǒng)接近于手機(jī)或更小。


圖1為本發(fā)明所述的基因芯片的制作及其直接標(biāo)記法檢測的流程圖；圖2為本發(fā)明所述的基因芯片的制作及其追加標(biāo)記法檢測的流程圖；圖3為BAW基礎(chǔ)傳感器制作和直接標(biāo)記法雜交過程的切面示意圖；圖4為BAW基礎(chǔ)傳感器制作和追加標(biāo)記法雜交過程的切面示意圖；圖5為用光刻和提剝(Lift-off)形成電極的流程切面示意圖；圖6為直接標(biāo)記法的原理示意圖。用通用鍵合法(L、M)；圖7為追加標(biāo)記法的原理示意圖。用通用鍵合法(L、M)；圖8為BAW的獨(dú)立連接法的無源式陣列設(shè)計(jì)示意圖(只顯示了3×3陣列)；圖9為BAW的交叉連接法的無源式陣列設(shè)計(jì)示意圖(只顯示了4×4陣列)；圖10為SAW的交叉連接法的無源式陣列設(shè)計(jì)示意圖(只顯示了2×2陣列)；圖11為BAW上下電極與測試電路連接示意圖；圖12為信號(hào)檢測系統(tǒng)示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面以石英壓電體聲波(BAW)無源陣列的設(shè)計(jì)制作，以及在DNA芯片生物探測框架下利用納米金的BAW放大效應(yīng)實(shí)現(xiàn)電致傳感芯片為主干，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
加以說明。本文對屬於前述發(fā)明內(nèi)容所圈定的，并涉及公共知識(shí)領(lǐng)域和通用制作工藝的內(nèi)容不一一贅述。但這不等於我們不了解這些可能性和它們的具體實(shí)施方式
。我們對前述發(fā)明內(nèi)容所直接限定或明確引伸限定的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保留一切應(yīng)享有的權(quán)力。
如圖1所示，本發(fā)明所述的基因芯片的制作流程主要包括石英片的處理，石英片上下表面金電極的制作。將設(shè)計(jì)好的探針與上電極同位固化，完成整個(gè)芯片的制備。而上述基因芯片用于檢測的流程則包括按照常規(guī)方法采用PCR擴(kuò)增樣品DNA，并用納米金標(biāo)記樣品DNA(即發(fā)明內(nèi)容H所述的直接標(biāo)記法)。在納米金標(biāo)記樣品DNA與芯片上的探針進(jìn)行雜交后，檢測雜交前后BAW傳感器的頻移。數(shù)據(jù)分析后對每個(gè)陣元DNA雜交狀態(tài)作出判斷。并可藉此進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出醫(yī)學(xué)結(jié)論。
圖2所示的流程在芯片的制備與圖1所示流程完全一樣。檢測的流程采用發(fā)明內(nèi)容I所述的追加標(biāo)記法。樣品DNA一端與生物素結(jié)合。與芯片上的探針進(jìn)行雜交后，再用結(jié)合有卵白素的納米金進(jìn)行標(biāo)記，然后檢測納米金標(biāo)記前后BAW傳感器的頻移。
以上各過程和原理詳述如下(1)BAW基礎(chǔ)傳感器制作圖3展示本發(fā)明生物芯片制作過程的截面圖，以及直接標(biāo)記法的DNA雜交情況。包括對石英片300下表面進(jìn)行蝕刻處理，形成一平槽301后，在上下表面制作金電極302、303。上表面電極303同位固定DNA探針304于金膜表面后，與納米標(biāo)記306材料標(biāo)記過的樣品DNA305雜交，生成最終產(chǎn)物307。壓電體聲波測試通常在晶體片干燥后進(jìn)行。零點(diǎn)頻率信號(hào)檢測在第5步后進(jìn)行。雜交后頻率信號(hào)檢測在第7步后進(jìn)行。在干燥情況下，可極簡單地理論處理納米標(biāo)記的放大效應(yīng)，并能實(shí)現(xiàn)壓電體聲波的最大靈敏度。潮濕和表面上的其它殘余物可能引起干擾，但在納米金標(biāo)記后，這一弱點(diǎn)可大大減小，因?yàn)樗肿右约翱諝庵形降臍怏w全都是小質(zhì)量分子。納米顆粒的放大效應(yīng)可使這些小分子的影響能減少到小于百萬分之一。但如果沒有納米金粒子增強(qiáng)時(shí)，它們的影響就是同分析物一個(gè)數(shù)量級(jí)。也可將芯片部分放在水溶液中進(jìn)行檢測。這種情況下，BAW諧振會(huì)產(chǎn)生阻尼效應(yīng)。通過納米標(biāo)記放大后，即算考慮阻尼，頻率移動(dòng)也可達(dá)到一個(gè)很適于檢測的范圍。在水溶液中檢測可以對DNA雜交的動(dòng)態(tài)過程進(jìn)行觀察。在圖3第5步后即接通測試系統(tǒng)，連續(xù)采集頻率信號(hào)，或?qū)﹃嚵羞M(jìn)行定時(shí)掃描，加以記錄，然后進(jìn)行分析處理。在水溶液中檢測還可以觀察到生物分子在水溶液中與干燥狀態(tài)不同的力學(xué)特性。BAW是聲學(xué)基礎(chǔ)的傳感器，非常適合此類測試。
圖4展示本發(fā)明追加法記法的DNA雜交情況。生物芯片制作過程與圖3直接標(biāo)記法一樣。與圖3不同的是把樣品DNA400與生物芯片上的探針304雜交后形成雙鏈DNA402，再用納米粒子材料401標(biāo)記，最終產(chǎn)物也是307。此法可獲得由納米粒子材料所產(chǎn)生的壓電體聲波效應(yīng)。如果測試在晶體片干燥后進(jìn)行，零點(diǎn)頻率信號(hào)檢測在第6步DNA探針與樣品雜交后進(jìn)行。第7步進(jìn)行追加納米標(biāo)記，而雜交后頻率信號(hào)檢測在第8步進(jìn)行。可以看出，由於頻率移動(dòng)直接來自于最后一步的納米標(biāo)記質(zhì)量增加效應(yīng)，別的干擾因素被降到最低。此法更適合在水溶液中進(jìn)行檢測，可以在第5步后即接通測試系統(tǒng)，也可在第6步后接通測試系統(tǒng)，連續(xù)采集頻率信號(hào)。但兩種情況都會(huì)在第7步納米標(biāo)記過程中觀察到強(qiáng)烈信號(hào)。
圖3、圖4所展示的上下表面電極是藉由半導(dǎo)體電子芯片制作技術(shù)中的通用金屬工藝形成。圖5流程說明了這種通用金屬工藝的一種用光刻和提剝(Lift-off)形成電極的過程。在基片500上覆蓋一層光刻膠501。然后通過掩膜502(一般用Cr膜在透明基片上制成)對光刻膠501曝光。經(jīng)過沖洗后，曝光部分被去掉，形成步驟4所示狀態(tài)。然后在步驟5中用蒸鍍法在光刻膠上覆蓋金膜503；最后，用光刻膠溶劑去掉所有光刻膠。與掩膜空白處一致的形狀便被復(fù)制在金膜上形成504的狀態(tài)(相當(dāng)于302或303)。電極形成也可以用其它多種工藝完成。如種層/光刻/鍍金法，鍍金/光刻/金刻蝕法等等。二氧化硅和金都具有良好的生物兼容性。
需要使用的傳感器表面是上電極表面。在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，較少注重下表面。但下表面對BAW裝置同樣敏感。為減輕這種影響，可用MEMS處理在下表面蝕刻一條平槽301(見圖3、圖4)。平槽工藝可與圖5流程集成一體完成。也可在封裝過程中進(jìn)行特別處理將下表面完全封閉。
(2)樣品的納米金標(biāo)記樣品的納米金標(biāo)記有兩種方法直接標(biāo)記法和追加標(biāo)記法。直接標(biāo)記法是在雜交前先對樣品進(jìn)行納米金標(biāo)記，而追加標(biāo)記法則是在雜交后才進(jìn)行納米金標(biāo)記。這兩種標(biāo)記方法將在下面進(jìn)行詳細(xì)說明。
標(biāo)記的目的是將納米粒子與樣品DNA連接。對于連接辦法，我們既可以通過對生物材料和納米粒子有效的鍵合分子來實(shí)現(xiàn)，也可以制訂一個(gè)可以用于大多數(shù)生物材料的通用鍵合方案。納米金直接標(biāo)記DNA或蛋白質(zhì)已有成熟的技術(shù)。當(dāng)納米粒子與生物材料已經(jīng)確定時(shí)，直接鍵合方法可以從很多公開資料中找到。這里不作過多討論(圖略)。圖6、圖7所示都是通用鍵合方案。生物材料與納米粒子首先被分別附著于一個(gè)親和對的兩部分，然后使這些經(jīng)過預(yù)處理的生物材料與經(jīng)過預(yù)處理的納米粒子結(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)生物材料與納米粒子的鍵合。這種方案使納米粒子的制備過程更加簡單，因?yàn)橐环N預(yù)處理的納米粒子能夠用來標(biāo)記各種生物材料。對于生物親和對，可以有多種選擇，但親和素-生物素體系最有發(fā)展前景。親和素(avidin)又稱卵白素，是從蛋白中提取的一種糖蛋白(分子量68kD)；生物素(biotin)又稱維生素H，是從卵黃和肝中提取的一種小分子物質(zhì)(分子量244.31)。生物素能夠通過化學(xué)反應(yīng)與多種低分子量或高分子量的生物分子結(jié)合，比如DNA，蛋白質(zhì)、荷爾蒙等。
在圖6中，生物材料601(此處為DNA)與親和對中的第一部分602(此處為生物素)結(jié)合成預(yù)處理的樣品生物材料603。納米粒子與親和對中的第二部分604(此處為卵白素)結(jié)合，形成預(yù)處理的納米標(biāo)記材料605。然后605與603結(jié)合，成為完整的納米標(biāo)記的樣品生物材料606。606進(jìn)而與固化的生物探針607(相當(dāng)于304)雜交，形成帶有納米標(biāo)記的雜交產(chǎn)物608(此處為雙鏈DNA，相當(dāng)于307)。
這種納米粒子的鍵合方法很適合追加標(biāo)記法。在圖7中，制備親和對預(yù)處理的樣品生物材料603、以及預(yù)處理的納米標(biāo)記材料605的過程與圖6完全相同。區(qū)別在于603先與固化的生物探針607雜交，形成701狀態(tài)。然后追加標(biāo)記605，形成與圖6完全相同的帶有納米標(biāo)記的雜交產(chǎn)物608。這種方法的優(yōu)勢在于首先，納米粒子可以比DNA、氨基酸和其它低中生物分子尺寸大很多，當(dāng)這些分析物附著納米粒子后，會(huì)受到反應(yīng)動(dòng)力學(xué)影響，與基片上的生物探針的雜交會(huì)受到影響；同時(shí)，分析物與納米粒子結(jié)合時(shí)也存在一個(gè)化學(xué)反應(yīng)率的影響。直接標(biāo)記法中，在標(biāo)記過程中有些樣本DNA受化學(xué)反應(yīng)影響未能與納米顆粒結(jié)合而游離于溶液中，造成樣本分析物的浪費(fèi)；但所有這些影響都可以在追加標(biāo)記法中降低到最小程度。沒有結(jié)合納米粒子時(shí)，表面未標(biāo)記的分析物與DNA探針的結(jié)合將非常順利。另一優(yōu)勢是許多生物材料對被探測的電信號(hào)都會(huì)有作用。作為整個(gè)生物識(shí)別最后一步的標(biāo)記過程，追加標(biāo)記法可以區(qū)分納米粒子所產(chǎn)生的凈作用。同時(shí)，在這種方法中，可以通過足量使用與卵白素結(jié)合的納米粒子來確保納米標(biāo)記不是反應(yīng)全過程的限制環(huán)節(jié)。在納米顆粒飽和狀態(tài)下，所有已雜交的DNA將被充分標(biāo)記。
納米顆粒在溶液中具有膠體粒子的性質(zhì)。顆粒表面形成雙電層，依靠外電層的電荷排斥保持膠體溶液的穩(wěn)定。溶液中的離子強(qiáng)度對納米顆粒的分散和穩(wěn)定影響很大。離子強(qiáng)度大，將破壞納米顆粒表面的雙電層，造成粒子凝聚沉降，使其吸收光譜發(fā)生漂移。為消除雜交過程中的非特異性吸附造成的噪音，納米粒子與卵白素之間的結(jié)合力要滿足洗脫時(shí)不丟失信號(hào)。為使納米顆粒與卵白素達(dá)到最佳結(jié)合，孵育方式、孵育溫度及時(shí)間、單點(diǎn)或多點(diǎn)結(jié)合條件的控制，都是優(yōu)化的內(nèi)容。納米顆粒的粒徑不僅與納米制備技術(shù)有關(guān)，同時(shí)關(guān)系到納米粒子的精確定位，以及對雜交和信號(hào)檢測的協(xié)同作用。在直接標(biāo)記法和追加標(biāo)記法中，納米粒徑通過反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和空間位阻而影響雜交及標(biāo)記，通過顆粒尺寸大小來控制質(zhì)量大小并影響其放大作用，從而決定芯片系統(tǒng)的靈敏性。所有這些影響因素都可以利用基本傳感器進(jìn)行直接測量加以優(yōu)化，獲得最佳條件。
(3)生物芯片陣列的設(shè)計(jì)與制作。
圖8所示的是在發(fā)明內(nèi)容D所述的獨(dú)立連接法的BAW無源式陣列。其中800為基片，801為上電極，802為下電極，803為基片下表面平槽(相當(dāng)于301)。這種設(shè)計(jì)避免了單元傳感器與陣列的設(shè)計(jì)跳躍。這個(gè)設(shè)計(jì)中，傳感器陣列的制作與單元傳感器除掩膜不同外，其它完全相同。此工藝步驟相對簡單，可以把成本降到最低。每個(gè)點(diǎn)元的大小及石英的厚度(決定振動(dòng)基本頻率)應(yīng)根據(jù)傳感器與生物探針的要求共同決定。這種連線方案至少可制成50到100的陣列，因而對于中小型的應(yīng)用已經(jīng)足夠了。在測試上可用復(fù)用器開關(guān)電路對點(diǎn)元逐一檢測。
圖9所示的是發(fā)明內(nèi)容D所述的交叉連接法的BAW無源式陣列。其中900為基片，901為下表面電極、902為上表面電極、903為貫穿線、904為對外接線端，905為基片下表面平槽(相當(dāng)于301)。這種設(shè)計(jì)的最大好處是避免了獨(dú)立連接法中的連線擁擠問題。可制成上萬個(gè)陣元的高通量芯片。與圖8一樣，其制作工藝步驟與單元傳感器除掩膜不同外，其它完全相同。
圖10所示的是發(fā)明內(nèi)容E所述的交叉連接法的SAW無源式陣列。圖中，1000為壓電體基片。1001為貫穿線。1002為延遲表面。生物探針一般放在這里。1003為延遲距離，它與1002的表面負(fù)載共同決定SAW的延遲時(shí)間。
在陣列制作中的另一方面是生物探針的同位連接，我們可用光刻法逐一暴露傳感器點(diǎn)元實(shí)現(xiàn)，這個(gè)方法幾何精度是最高的。我們也可以采用接觸點(diǎn)樣法、光刻原位合成法、噴墨法、及分子印章合成法來完成。
(4)信號(hào)檢測系統(tǒng)如圖11所示，上下表面電極的兩側(cè)接觸可以用電路版實(shí)現(xiàn)(圖中方法1)，上下電極直接與電路板連接。上下表面電極的兩側(cè)接觸也可以采用微電機(jī)系統(tǒng)(MEMS)通過穿透蝕刻后再用T接頭實(shí)現(xiàn)(圖中方法2)，其中1101為T形接頭、1102為貫穿孔。
采用如圖12電子線路設(shè)計(jì)，可測出BAW的諧振頻率，所有IC芯片都是通用型的，震蕩器前端線路有一定模擬成分。除此之外的其它部分都是數(shù)字線路。工作頻率在1到100兆赫之間。IC選擇范圍大。進(jìn)入產(chǎn)品化后，整個(gè)信號(hào)采集及分析系統(tǒng)可以集中在一個(gè)板子上。一種方案是計(jì)數(shù)儀后加數(shù)字信號(hào)處理器(DSP)。陣列地址可用平行接口實(shí)現(xiàn)，加上配合的液晶顯示系統(tǒng)便可完成。另一種方案是將圖中計(jì)算機(jī)部分用掌上型電腦代替，其接口和軟件都有與PC兼容的，這樣運(yùn)算與顯示部分可全部搬用，但成本稍高一些。SAW的測試與BAW相同。延遲時(shí)間的測定還需增加一些索相環(huán)(PLL)IC及線路。
權(quán)利要求
1.一種壓電體聲波(BAW)傳感器，包括壓電晶體基片和上下表面的傳感電極。其特征在于完整的BAW傳感器至少一個(gè)。上下表面?zhèn)鞲须姌O皆由半導(dǎo)體電子芯片的金屬工藝形成。每個(gè)電極使用至少一次光刻工藝成形，并與其它部件密配。電極可用金、銀以及其它一切與生物兼容的導(dǎo)電材料直接制成；或用其它金屬導(dǎo)電材料制成，然后再覆蓋與生物兼容的導(dǎo)電或絕緣材料實(shí)現(xiàn)生物兼容性。覆蓋絕緣材料的目的也可以是用來實(shí)現(xiàn)在液相檢測時(shí)的電極絕緣。
2.一種壓電表面聲波(SAW)傳感器，包括壓電晶體基片，在壓電晶體基片的一側(cè)表面，設(shè)有發(fā)射極和接收極，它們與地極呈梳形安裝。其特征在于完整的SAW傳感器至少一個(gè)。傳感器的地極、發(fā)射極和接收極皆由半導(dǎo)體電子芯片的金屬工藝形成。使用至少一次光刻工藝成形，并與其它部件密配。電極可用金、銀以及其它一切與生物兼容的導(dǎo)電材料直接制成；或以其它金屬導(dǎo)電材料制成，然后再覆蓋與生物兼容的導(dǎo)電或絕緣材料實(shí)現(xiàn)生物兼容性。覆蓋絕緣材料的目的也可以是用來實(shí)現(xiàn)在液相檢測時(shí)的電極絕緣。
3.改進(jìn)的按權(quán)利要求1所述的壓電體聲波(BAW)傳感器，其特征在于所述的基片用MEMS刻蝕方法在制作電極前在下表面蝕刻一個(gè)平槽；或者把下表面進(jìn)行封裝；或者在下表面蝕刻平槽后，再進(jìn)行封裝。
4.一種生物芯片，包括權(quán)利要求1所述的BAW傳感器，其特征在于在所述的傳感器的上表面電極、下表面電極、或上下二表面電極上固定生物探針。
5.一種生物芯片，包括權(quán)利要求2所述的SAW傳感器，其特征在于在所述的傳感器的電極同側(cè)延遲表面上固定生物探針。
6.采用按權(quán)利要求1所述的壓電體聲波(BAW)傳感器，按獨(dú)立連接法形成的無源式陣列。其特征在于含完整傳感器至少兩個(gè)。每個(gè)子元各電極的接線獨(dú)立向周邊引出。工藝步驟與權(quán)利要求1所述的壓電體聲波(BAW)傳感器相同。傳感器電極和陣列連線的成形，都根據(jù)相應(yīng)的掩膜設(shè)計(jì)而實(shí)現(xiàn)。
7.采用按權(quán)利要求1所述的壓電體聲波(BAW)傳感器，按交叉連接法形成的無源式陣列。其特征在于含完整BAW傳感器至少兩個(gè)。由m和n根電極由貫穿線(BUS)分別把上下表面的m×n電極陣列連接成行和列的結(jié)構(gòu)(無所謂上下表面哪個(gè)取行，哪個(gè)取列連接)。對外接線口總共有m+n個(gè)。工藝步驟與權(quán)利要求1所述的壓電體聲波傳感器相同。傳感器電極和陣列連線的成形，都依靠相應(yīng)的掩膜設(shè)計(jì)而實(shí)現(xiàn)。
8.采用按權(quán)利要求2所述的壓電表面聲波(SAW)傳感器，按獨(dú)立連接法形成的無源式陣列。其特征在于含完整SAW傳感器至少兩個(gè)。每個(gè)子元各電極的接線獨(dú)立向周邊引出。工藝步驟與權(quán)利要求2所述的壓電表面聲波傳感器相同。傳感器電極和陣列連線的成形，都依靠相應(yīng)的掩膜設(shè)計(jì)而實(shí)現(xiàn)。
9.采用按權(quán)利要求2所述的壓電表面聲波(SAW)傳感器，按交叉連接法形成的無源式陣列。其特征在于含完整傳感器至少兩個(gè)。由m和n根電極由貫穿線(BUS)分別把m×n個(gè)電極陣列連接成行和列的結(jié)構(gòu)(無所謂地、發(fā)、收三極哪個(gè)取行，哪個(gè)取列連接)。對外接線口總共有m+2n或2m+n個(gè)。連線(BUS)交叉處絕緣問題可藉由半導(dǎo)體電子芯片制作技術(shù)中的通用的多層金屬立體連接法完成，至少有兩層金屬。工藝步驟與權(quán)利要求2所述的壓電體聲波傳感器相同。傳感器電極和陣列連線的成形，都依靠相應(yīng)的掩膜設(shè)計(jì)而實(shí)現(xiàn)。
10.權(quán)利要求6、7、8、9所述的諸個(gè)陣列電極可以在芯片上連通在一起，再與測試系統(tǒng)連接。
11.改進(jìn)的按權(quán)利要求6、7所述的傳感器陣列。其特征在于所述的基片用MEMS刻蝕方法在制作電極前，在下表面蝕刻一個(gè)平槽；或者把下表面進(jìn)行封裝；或者在下表面先蝕刻平槽再進(jìn)行封裝。
12.一種生物芯片。其特征在于權(quán)利要求6或7所述的BAW傳感器陣列在所述的傳感器陣列的上表面電極、下表面電極、或上下二表面電極上同位固定生物探針。同位固定的方法包括光刻點(diǎn)元逐一暴露法、接觸點(diǎn)樣法、光刻原位合成法、噴墨法、及分子印章合成法等。
13.一種生物芯片。其特征在于權(quán)利要求8或9所述的SAW傳感器陣列在所述的傳感器陣列的電極同側(cè)延遲表面上同位固定生物探針。同位固定的方法包括光刻點(diǎn)元逐一暴露法、接觸點(diǎn)樣法、光刻原位合成法、噴墨法、及分子印章合成法等。
14.一種改進(jìn)的按權(quán)利要求12所述的生物芯片，其特征在于所述的基片用MEMS刻蝕方法在制作電極前在下表面蝕刻一個(gè)平槽；或者把下表面進(jìn)行封裝；或者在下表面蝕刻平槽后，再進(jìn)行封裝。
15.諸種權(quán)利要求4、5、12、13所述的生物探針，其特征在于以下單獨(dú)一種材料或多種材料混合陣元固化單鏈DNA、RNA、抗體、蛋白、一切可能與分析物形成生物、化學(xué)親和或剝離反應(yīng)的物質(zhì)。這里所指的親和反應(yīng)特征在于單鏈DNA與單鏈DNA的雜交，mRNA與DNA，mRNA與tRNA，抗體與抗原的結(jié)合，蛋白質(zhì)與荷爾蒙的結(jié)合，蛋白質(zhì)與維生素的結(jié)合，蛋白質(zhì)在酶催化條件下形成或擴(kuò)展等等。這里所指的剝離反應(yīng)特征在于DNA在酶切割下斷鏈，蛋白質(zhì)在酶催化分解，上述親和反應(yīng)的逆過程(在濃度、溫度、酸鹼度改變后及機(jī)械振動(dòng)條件下而產(chǎn)生)。在液相檢測中，親和或剝離反應(yīng)也可由電化學(xué)反應(yīng)引起，手段是在生物探針下面或附近的電極上，施加相對于溶液的電壓。
16.一種利用質(zhì)量標(biāo)記進(jìn)行生物檢測的方法。其特征在于把樣品生物材料用質(zhì)量標(biāo)記材料(納米粒子或其它生物分子)標(biāo)記后與生物芯片上的探針雜交，以獲得放大的壓電體聲波效應(yīng)。此法稱為直接標(biāo)記法。此權(quán)利要求適用于權(quán)利要求4、5、11、12、13所述的器件和芯片，以及其它的質(zhì)量傳感器件和芯片。
17.一種利用質(zhì)量標(biāo)記進(jìn)行生物檢測的方法。其特征在于樣品生物材料與生物探針雜交后，再用質(zhì)量標(biāo)記材料(納米粒子或其它生物分子)標(biāo)記，以便排除前端各步反應(yīng)的干擾。此法稱為追加標(biāo)記法。此權(quán)利要求適用于權(quán)利要求4、5、11、12、13所述的器件和芯片，以及其它的質(zhì)量傳感器件和芯片。
18.一種生物材料的標(biāo)記鍵合方法。其特征在于生物材料與標(biāo)記材料首先被分別附著于一個(gè)親和對的兩部分，然后當(dāng)這些經(jīng)過預(yù)處理的生物材料與標(biāo)記材料結(jié)合時(shí)，生物材料與標(biāo)記材料藉由親和對的鍵合得以實(shí)現(xiàn)。此權(quán)利要求適用于權(quán)利要求16、17所述的質(zhì)量標(biāo)記方法，以及其它標(biāo)記方法，如熒光標(biāo)記等。
19.一種生物材料的標(biāo)記鍵合方法。其特征在于使用卵白素-生物素體系、鏈球卵白素-生物素體系實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求18所述的鍵合方法。
20.一種生物材料的標(biāo)記鍵合方法。其特征在于利用卵白素的四個(gè)相同的亞基位點(diǎn)，通過親和素-生物素的多點(diǎn)橋連和再次復(fù)合達(dá)到多次放大。
21.一種生物材料的標(biāo)記鍵合方法。其特征在于利用卵白素的四個(gè)相同的亞基位點(diǎn)，附著多種標(biāo)記材料以實(shí)現(xiàn)多屬性標(biāo)記。
22.一種對壓電生物芯片的信號(hào)讀出方法。其特征在于使用振蕩器產(chǎn)生頻率信號(hào)，再由計(jì)數(shù)器轉(zhuǎn)成數(shù)字信號(hào)，傳入電腦或電腦網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析處理。
23.一種對SAW壓電生物芯片的信號(hào)讀出方法。其特征在于使用振蕩器產(chǎn)生頻率信號(hào)，再由計(jì)數(shù)器轉(zhuǎn)成數(shù)字信號(hào)。延遲時(shí)間的測定由索相環(huán)(PLL)線路完成。信號(hào)傳入電腦或電腦網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析處理。
24.一種對陣列電致生物芯片的電信號(hào)讀出方法。其特征在于使用復(fù)用器(multiplexer)至少一個(gè)，利用地址0/1設(shè)置，對芯片陣元逐一讀取。適用于至少兩個(gè)陣元。
25.一種對陣列電致生物芯片的電信號(hào)讀出方法。其特征在于使用行與列至少兩個(gè)復(fù)用器(multiplexer)，利用它們地址0/1設(shè)置，對交叉連接的陣元逐一讀取。
26.一種由權(quán)利要求22、23、24、25所述原理制作的小型便攜式測試系統(tǒng)，可利用上述線路加數(shù)字信號(hào)處理器(DSP)或掌中型電腦實(shí)現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種質(zhì)量放大的壓電生物芯片。所述的發(fā)明將壓電聲波技術(shù)應(yīng)用于生物芯片，開辟了除熒光檢測、放射性標(biāo)記檢測、金銀染等常規(guī)檢測方法以外的生物芯片檢測新領(lǐng)域。其通過納米質(zhì)量特性，放大原較弱的BAW生物信號(hào)，尤其是中小分子量的分析物，擴(kuò)大效率至少千萬倍，使BAW可投入實(shí)用。此外，本發(fā)明還同時(shí)公開了芯片的陣列連接方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1566933SQ03126910
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者陳世正 申請人:中山市泰威技術(shù)開發(fā)有限公司