專利名稱：用于抗癌的縫裂層孔菌深層發(fā)酵生產(chǎn)多糖蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域；涉及一種生產(chǎn)多糖蛋白的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤常稱癌癥，是一組嚴(yán)重威脅人類健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。
治療惡性腫瘤的方法包括外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療(簡(jiǎn)稱化療)?；煆?qiáng)調(diào)全身性治療而有別于適合局部腫瘤治療的外科手術(shù)和放射治療。
近年來(lái)，細(xì)胞分子生物學(xué)的進(jìn)步以及腫瘤藥理學(xué)的發(fā)展，為惡性腫瘤的藥物防治提供了不少新靶點(diǎn)，抗惡性腫瘤藥正從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類藥物向針對(duì)機(jī)制的多環(huán)節(jié)作用的新型抗惡性腫瘤藥物發(fā)展，如腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑、腫瘤細(xì)胞凋亡(apoptosis)誘導(dǎo)劑、抗腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移藥、新生血管生成抑制劑、腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)劑以及腫瘤基因治療等。
采用生物發(fā)酵技術(shù)，制取抗癌藥物，如靈芝多糖，對(duì)癌癥病人有一定療效，其抑瘤率為20％左右。

發(fā)明內(nèi)容
；本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)抗癌更為有效地用于抗癌的縫裂層孔菌深層發(fā)酵生產(chǎn)多糖蛋白的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是利用縫裂層孔菌<Phellinus rimosus(Berk.)pilat>做為菌種。
其生產(chǎn)方法如下a、深層發(fā)酵取葡萄糖或蔗糖2-4％，豆餅粉或水溶性豆粉1-3％、KH2PO40.2-0.3％、MgSO40.1-0.3％、VB10.1-0.3％加90-98％水配制培養(yǎng)基，118-130℃，罐壓0.15-0.20兆帕20-40分鐘、冷卻30℃以下接入縫裂層孔菌種子，培養(yǎng)時(shí)間80～100小時(shí)，培養(yǎng)溫度25-26℃菌絲呈球狀，產(chǎn)生菌絲體多糖及胞外多糖，殘?zhí)菫?％以下可終止培養(yǎng)；b、提取多糖蛋白將上述培養(yǎng)菌絲體經(jīng)過(guò)濾得菌體加入4～5倍熱水95～100℃提取2-4小時(shí)抽提取液，同發(fā)酵液合并真空濃縮為原體積的1/5-1/6，加入4-5倍量乙醇，醇析20-28小時(shí)得到多糖體蛋白，離心分離，干燥得多糖蛋白粉。
本發(fā)明的有益效果是藥理研究證明，對(duì)S180抑瘤率41％。
本發(fā)明提供的多糖蛋白是一種新型的抗腫瘤免疫作用的新藥，為證明其治療抗腫瘤作用效果，發(fā)明者使用按實(shí)施例1中提供的方法制備得到的多糖蛋白，進(jìn)行了藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果如下三批深層發(fā)酵縫裂層孔菌生產(chǎn)多糖蛋白抗腫瘤作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果三批深層發(fā)酵縫裂層孔菌生產(chǎn)多糖蛋白灌胃給藥對(duì)肉瘤(S180)、肝癌(Hep)、胃癌(MFC)細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑瘤作用，其中對(duì)S180作用顯著，較低劑量即可顯示明顯作用；延長(zhǎng)S180荷瘤鼠生存時(shí)間；同時(shí)可增加吞噬指數(shù)a、廓清指數(shù)k及胸腺系數(shù)；對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能亦有增強(qiáng)作用。
試驗(yàn)材料動(dòng)物昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22g。由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。質(zhì)量合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字第10-5107號(hào)。
藥物三批深層發(fā)酵縫裂層孔菌生產(chǎn)多糖蛋白(以下簡(jiǎn)稱多糖蛋白)由通化振國(guó)藥業(yè)提供，注射用環(huán)磷酰胺，由上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格200mg/支。批號(hào)990905。RPMI1640由Hyclone公司提供；ConA由Sigma公司生產(chǎn)。
腫瘤細(xì)胞株肉瘤(S180)、肝癌(Hep)、胃癌(MFC)由本室常規(guī)傳代培養(yǎng)。
試驗(yàn)與結(jié)果1、多糖蛋白對(duì)S180肉瘤的抑制作用[1]無(wú)菌條件下取接種第7天S180瘤源動(dòng)物的腹水，加無(wú)菌生理鹽水稀釋，使其濃度為1×107個(gè)活癌細(xì)胞/ml，取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠右前肢腋下皮下接種0.2ml，約含2×106個(gè)活瘤細(xì)胞。接種后次日將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成五組，空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組及給藥三個(gè)劑量組，劑量分別為2.0g/kg、1.0g/kg、0.5g/kg。空白對(duì)照組每日灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g，連續(xù)給藥10天；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg，隔日給藥；多糖蛋白三個(gè)劑量組均為每日灌胃給藥，連續(xù)10天。荷瘤小鼠停藥后次日將動(dòng)物處死，解剖皮下瘤塊并稱重，分別計(jì)算各組的平均瘤重，計(jì)算抑瘤率。發(fā)酵生產(chǎn)的三批多糖蛋白重復(fù)試驗(yàn)。
抑瘤率＝(空白對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/空白對(duì)照組瘤重×100％結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 蛋白多糖對(duì)小鼠S180的抑制作用(x±SD，n＝10)批次 空白組陽(yáng)性對(duì)照組大劑量組中劑量組 小劑量組第一批瘤重1.14±0.460.29±0.27***0.62±0.26**0.74±0.43 0.83±0.47抑瘤率74.1 45.634.627.0第二批瘤重1.23±0.440.32±0.26***0.69±0.14**0.77±0.42**0.87±0.37抑瘤率 73.8 43.737.128.9第三批瘤重1.41±0.590.45±0.25***0.71±0.44**0.88±0.36*0.98±0.48抑瘤率68.2 49.837.630.9注與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
由表1結(jié)果可見(jiàn)，在三批抑瘤試驗(yàn)中，多糖蛋白對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。各次換瘤試驗(yàn)抑瘤率均體現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中亦觀察到環(huán)磷酰胺對(duì)S180有顯著的抑瘤作用。
2、多糖蛋白對(duì)肝癌的抑制作用無(wú)菌條件下取接種第7天Hep瘤源動(dòng)物的腹水，加無(wú)菌生理鹽水稀釋，使其濃度為1×107個(gè)活癌細(xì)胞/ml，取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠右前肢腋下皮下接種0.2ml，約含2×106個(gè)活瘤細(xì)胞。接種后次日將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成五組，空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、多糖蛋白給藥組分三個(gè)劑量組2.0g/kg、1.0g/kg、0.5g/kg。空白對(duì)照組每日灌胃給蒸餾水0.2ml/10g，連續(xù)給藥10天；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg，隔日給藥；多糖蛋白三個(gè)劑量均為每日灌胃給藥，連續(xù)10天。荷瘤小鼠停藥后次日將動(dòng)物處死，解剖皮下瘤塊并稱重，分別計(jì)算各組的平均瘤重，計(jì)算抑瘤率。
抑瘤率＝(空白對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/空白對(duì)照組瘤重×100％結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 多糖蛋白對(duì)小鼠肝癌的抑制作用(x±SD，n＝10)肝癌 空白組 陽(yáng)性對(duì)照組 大劑量組中劑量組 小劑量組瘤重 0.838±0.394(9)0.265±0.223(9)**0.491±0.264(9)*0.522±0.280(9)0.686±0.369抑瘤率 68.4 41.437.7 18.1與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
由表2結(jié)果可見(jiàn)，多糖蛋白對(duì)肝癌荷瘤Hep小鼠腫瘤生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其中大劑量組(2g/kg)作用較明顯，抑瘤率達(dá)41.4％，與空白組比較有顯著性差異(P＜0.05)3、多糖蛋白(第三批)對(duì)胃癌的作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分配、荷瘤及給藥方法同2，結(jié)果見(jiàn)表3表3 多糖蛋白對(duì)小鼠胃癌的抑瘤作用(x±SD，n＝10)空白組 陽(yáng)性對(duì)照組大劑量組中劑量組小劑量組第一次瘤重 2.36±0.34 0.29±0.071.41±0.33**1.80±0.35*2.19±0.42抑瘤率 87.5％40％23％7％第二次瘤重 1.38±0.43 0.17±0.030.91±0.26 1.05±0.21 1.13±0.32抑瘤率 90％ 33％*23％17％與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.
4、多糖蛋白對(duì)S180肉瘤荷瘤小鼠免疫吞噬功能的影響[2]接種方法同上，取40只小鼠，雌雄各半，接種后次日將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成4組，空白對(duì)照組，多糖蛋白給藥組分三個(gè)劑量組1.5g/kg、0.5g/kg、0.167g/kg?？瞻讓?duì)照組每日灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g，連續(xù)10天；多糖蛋白給藥各組每日灌胃給藥一次，連續(xù)10天。末次給藥后30min，尾靜注印度墨汁0.1ml/10g，眶后靜脈叢取血201，于1、5min測(cè)光密度值，并稱體重、脾重、胸腺重，計(jì)算廓清指數(shù)K及吞噬活性a。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 多糖蛋白對(duì)荷瘤小鼠免疫吞噬功能的影響(x±SD，n＝10)組別劑量數(shù)脾系數(shù)胸腺系數(shù) 廓清指數(shù)K 吞噬指數(shù)a(g/kg)(g/100g) (g/100g)空白組0.86±0.110.248±0.049 0.047±0.016 4.90±0.521.5 0.90±0.120.252±0.057 0.081±0.021***6.19±0.69**多糖蛋白 0.5 0.92±0.110.248±0.043 0.075±0.018*6.06±0.94*0.1670.89±±0.12 0.243±0.043 0.075±0.019*6.08±0.74*與空白組比較*P＜0.05，**P＜0.01.***P＜0.001由表3結(jié)果可見(jiàn)，多糖蛋白可增加廓清指數(shù)K及吞噬活性a，與空白組比較具有顯著性差異。
4、多糖蛋白對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響[3]小鼠摘眼球放血處死，無(wú)菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI1640培養(yǎng)液的玻璃研磨器內(nèi)，研磨成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾至離心管中，1500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清，同樣方式洗滌細(xì)胞兩次，最后制成5×106細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液1001加入96孔培養(yǎng)板中，再加入刀豆蛋白A(ConA)或多糖蛋白溶液1001，使每孔最終體積2001。37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，終止培養(yǎng)液前6小時(shí)加入MTT201，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入DMSO201,570nm測(cè)光密度值(OD)。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 多糖蛋白對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響(x±SD，n＝10)組別 OD值空白組 0.092±0.018ConA組 0.534±0.200*多糖蛋白250μg/ml0.896±0.66525μg/ml 0.182±0.482*2.5μg/ml0.941±0.413*0.25μg/ml 0.760±0.289*0.025μg/ml 0.746±0.607多糖蛋白+ConA組250μg/ml0.158±0.074△25μg/ml 0.190±0.019△2.5μg/ml0.128±0.013△
0.25μg/ml 0.554±0.6970.025μg/ml 0.215±0.015*注與空白組比較，*P＜0.05，與ConA組比較△P＜0.05由表5結(jié)果可見(jiàn)，多糖蛋白單獨(dú)使用即可促使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其中25g/ml、2.5g/ml、0.25g/ml三個(gè)劑量組作用明顯，與空白組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。
6、多糖蛋白體外抑瘤作用研究采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法體外藥敏試驗(yàn)。于無(wú)菌室、超凈臺(tái)中分別取S180，B16和胃癌培養(yǎng)液，進(jìn)行活細(xì)胞記數(shù)，取(2～5)×105個(gè)/ml濃度的癌細(xì)胞，加入10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于96孔培養(yǎng)皿，100l/孔，給予每組6孔置37℃、CO2培養(yǎng)箱孵育4h，分別加入配制好的5種濃度的蛋白多糖，使培養(yǎng)液終濃度分別為250μg/ml、25μg/ml、2.5μg/ml、0.25μg/ml和0.025μg/ml，空白對(duì)照組不加藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，終止培養(yǎng)前加MTT染料，加DMSO溶解甲瓚，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(見(jiàn)表6)。
表6 多糖蛋白體外抑瘤作用(x±SD，n＝10)組別 劑量(μg) S180Hep 胃癌 B16空白細(xì) 1.432±0.4261.104±0.327 0.876±0.277 1.606±0.474多糖蛋白 250 1.513±0.5491.157±0.429 0.793±0.205 1.689±0.575251.488±0.3771.066±0.332 0.832±0.326 1.598±0.4322.5 1.367±0.4540.987±0.308 0.902±0.301 1.643±0.5330.25 1.417±0.3021.208±0.413 0.782±0.218 1.517±0.6040.025 1.399±0.4461.189±0.396 0.819±0.257 1.588±0.597與空白組比較P＞0.05體外抑瘤試驗(yàn)表明，多糖蛋白在250μg/ml～0.025μg/ml劑量其間，體外無(wú)抑瘤作用(P＞0.05)。
7、多糖蛋白對(duì)S180荷瘤小鼠生命延長(zhǎng)的影響[4]取雄性小鼠100只，小鼠經(jīng)皮膚消毒后，腹腔注射接種S1800.2ml/只，癌細(xì)胞數(shù)目為2×106個(gè)，接種24h后將動(dòng)物隨機(jī)分成5組，空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及給藥三個(gè)劑量組分別為1.5g/kg、0.5g/kg、0.167g/kg組?？瞻讓?duì)照組每日灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g，連續(xù)給藥10天；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg，隔日給藥；多糖蛋白三個(gè)劑量組均為每日灌胃給藥，連續(xù)12天。觀察小鼠生存天數(shù)。
計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命延長(zhǎng)率生命延長(zhǎng)率＝(給藥組平均生存天數(shù)-空白組平均生存天數(shù))/空白組平均生存天數(shù)×100％。
結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 多糖蛋白對(duì)S180荷瘤小鼠生存期的影響(x±SD，n’10)空白組 陽(yáng)性對(duì)照組 大劑量組 中劑量組 小劑量組生存期(b) 18.6±3.421.9±3.5*25.7±5.0**24.8±5.6**27.2±6.5**生命延長(zhǎng)率(％) 17.7 38.7 33.346.2與對(duì)照組比較**P＜0.01，*P＜0.05由表7結(jié)果可見(jiàn)。多糖蛋白各劑量組及環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組均能明顯延長(zhǎng)S180荷瘤小鼠生存的時(shí)間。
結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多糖蛋白具有明顯的抑瘤作用，灌胃給藥，可明顯抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)S180荷瘤小鼠生存時(shí)間，與空白組比較具有顯著差異性。對(duì)肝癌、胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)亦具有一定抑制作用。蛋白多糖可增加吞噬活性a，廓清指數(shù)K及胸腺系數(shù)，對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能亦具有增強(qiáng)作用。但蛋白多糖未表現(xiàn)明顯體外抑瘤作用，說(shuō)明蛋白多糖抑瘤作用與免疫調(diào)節(jié)或增加免疫功能有關(guān)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取葡萄糖30kg，水溶性豆粉20kg、KH2PO43kg、MgSO40.5kg、VB1kg加950kg水配成1000立升培養(yǎng)基，用120℃壓力為0.20兆帕實(shí)消滅菌30分鐘。冷卻30℃，接種縫裂層孔菌種子。
通氣培養(yǎng)，通氣量(1∶0.5/V/V)培養(yǎng)溫度25～26℃培養(yǎng)4天得菌絲體25kg、發(fā)酵液500kg。菌絲體加水150立升95～100℃抽提3小時(shí)，過(guò)濾后抽提液同發(fā)酵合并濃縮原體積的1/5，冷卻后加入體積4倍量乙醇，醇析24小時(shí)，得多糖蛋白。噴霧干燥得產(chǎn)品為11kg。
多糖含量為16％，蛋白含量5.8％，多糖分析用3.5二硝基水揚(yáng)酸法，蛋白質(zhì)為凱式定氮法?？鼓[瘤試驗(yàn)對(duì)S180抑瘤率42.7％。
實(shí)施例2庶糖300kg、豆餅粉200kg、KH2PO420kg、MgSO45kg、Nacl1kg、VB10kg加9900kg水配制10噸發(fā)酵液。
經(jīng)實(shí)消滅菌，冷卻26℃后接入1000kg來(lái)自種子罐培養(yǎng)液，經(jīng)24～26℃培養(yǎng)70小時(shí)，通氣量1∶1V/V/每分鐘。罐壓0.20兆帕，攪拌110次/分鐘。
在培養(yǎng)70小時(shí)菌絲體生長(zhǎng)的旺盛，發(fā)酵液為褐色有清香味，檢驗(yàn)時(shí)菌絲粗狀，有分枝，菌絲染色有空泡產(chǎn)生，殘?zhí)墙涤?％以下終止培養(yǎng)。
將10000kg發(fā)酵液得到的菌絲體600kg、發(fā)酵液8000kg。菌絲體加入2000kg水，95～100℃抽提3小時(shí)除菌體。提取液連同發(fā)酵液合并真空濃縮至原體積的1/5。冷卻至室溫后加入體積4倍量95％乙醇液。醇析24小時(shí)，分離沉淀多糖體噴霧干燥。
得到多糖蛋白干粉113kg。多糖含量14％，分析方法為3.5二硝基水揚(yáng)酸法。蛋白含量5％，分析方法凱式定氮法。
權(quán)利要求
1.一種用于抗癌的縫裂層孔菌深層發(fā)酵生產(chǎn)多糖蛋白的方法，其方法是a、深層發(fā)酵取葡萄糖或蔗糖2-4％，豆餅粉或水溶性豆粉1-3％、KH2PO40.2-0.3％、MgSO4 0.1-0.3％、VB10.1-0.3％加90-98％水配制培養(yǎng)基，118-130℃，罐壓0.15-0.20兆帕20-40分鐘、冷卻30℃以下接入縫裂層孔菌種子，培養(yǎng)時(shí)間80～100小時(shí)，培養(yǎng)溫度25-26℃菌絲呈球狀，產(chǎn)生菌絲體多糖及胞外多糖，殘?zhí)菫?％以下可終止培養(yǎng)；b、提取多糖蛋白將上述培養(yǎng)菌絲體經(jīng)過(guò)濾得菌體加入4～5倍熱水95～100℃提取2-4小時(shí)抽提取液，同發(fā)酵液合并真空濃縮為原體積的1/5-1/6，加入4-5倍量乙醇，醇析20-28小時(shí)得到多糖體蛋白，離心分離，干燥得多糖蛋白粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于抗癌的縫裂層孔菌深層發(fā)酵生產(chǎn)多糖蛋白的方法，其特征是利用縫裂層孔菌(Phellinus rimosus(Berk.)pilat)做為菌種。
全文摘要
一種用于抗癌的縫裂層孔菌深層發(fā)酵生產(chǎn)多糖蛋白的方法，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域；其方法是利用縫裂層孔菌做為菌種；經(jīng)深層發(fā)酵、提取多糖蛋白工藝，最后制出多糖蛋白。其有益效果是采用該方法制出的多糖蛋白，有效成分提取率高，并且經(jīng)藥理研究證明，對(duì)S
文檔編號(hào)C12P21/00GK1552888SQ0312713
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月8日
發(fā)明者王振國(guó), 楊世杰, 李敬軒, 李紅, 王振賢 申請(qǐng)人:王振國(guó), 王振賢