專利名稱：N的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種表達(dá)重組Nα-脫乙?；诵叵偎卅?(Nα-desacetyl thymosin α1)單體的分泌型表達(dá)載體，用該分泌型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的工程菌宿主細(xì)胞，以及利用具有上述表達(dá)載體的工程菌發(fā)酵表達(dá)并純化Nα-脫乙?；诵叵偎卅?單體的方法。
背景技術(shù)：
胸腺素α1(Thymosin α1)是一種從胸腺組分5(TF5)中分離純化得到的一種具有多種生物活性的多肽。人們對胸腺中活性分子的研究最早開始于1964年J.J.Klein，A.L.Goldstein等對小鼠胸腺提取物的研究，此后A.L.Goldstein從小牛胸腺中提取出一類更加穩(wěn)定的多肽混合物，將之命名為胸腺組分5(A.L.Goldstein，et al，Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1996，56，1010)。胸腺組分5中含有30-40種激素樣多肽，分子量從1000-15000Da不等。隨著進(jìn)一步的研究，人們發(fā)現(xiàn)TF5中有一種多肽具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞成熟的功能，命名為胸腺素α1。天然胸腺素α1是由28個(gè)氨基酸(SDAAV DTSSE ITTKDLKEKK EVVEE AEN)組成的酸性多肽，等電點(diǎn)為4.2，分子量為3108Da，并且N-末端氨基酸被乙?；６矣袌?bào)道指出，N端缺少乙酰化修飾的胸腺素α1活性基本不受影響(Wetzel R.，et al，Biochemistry1980，19(26)6096-104；Xiu ZY，et al，Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2002，18(5)541-5)。
胸腺素α1對胸腺依賴的淋巴細(xì)胞的發(fā)育有重要作用。它是一種對T淋巴系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)劑，可以促使T細(xì)胞成熟和分化，促使成熟的T細(xì)胞、NK細(xì)胞分泌各種淋巴因子，如白介素-2和γ-干擾素，同時(shí)促進(jìn)白介素-2受體(IL-2R)的生成。胸腺素α1作為一種免疫增強(qiáng)劑，主要用于免疫缺陷和免疫受抑制的疾病，其臨床應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾方面①慢性肝炎的治療。胸腺素α1對病毒性肝炎如乙型肝炎、丙型肝炎等有效。病毒性乙型肝炎和丙型肝炎是困擾全球的疾病，它們可能導(dǎo)致肝癌和肝硬化的發(fā)生進(jìn)而引起死亡。胸腺素α1和干擾素聯(lián)用治療乙型肝炎是極其有效的。這是目前用于治療該疾病的最有效方法。在中國肝病協(xié)會(huì)指導(dǎo)下，進(jìn)行的一項(xiàng)多中心臨床實(shí)驗(yàn)表明，胸腺素α1治療慢性乙型肝炎出現(xiàn)很明顯陽性反應(yīng)率(47％)，如果采用胸腺素α1和干擾素聯(lián)合給藥，陽性反應(yīng)率可達(dá)61％以上。
②用作疫苗佐劑。當(dāng)病人的免疫力下降時(shí)(如老年人或長期接受血透析的病人)對其接種疫苗就可能無法得到足夠的抗體效價(jià)，這時(shí)便可以使用胸腺素α1來增強(qiáng)流感疫苗和乙肝疫苗的有效性。
③HIV的治療?；颊吒腥綡IV一段時(shí)間后，免疫系統(tǒng)會(huì)遭受毀滅性的打擊，病人往往死于一些對正常人來說微不足到的感染。胸腺素α1一方面可以提高抗病毒藥物的療效，另一方面可逐漸恢復(fù)病人的免疫能力，以抵抗致命的其它感染。
④癌癥的治療。胸腺素α1被證實(shí)對惡性黑色素瘤、肺癌、紅白血病鱗狀上皮細(xì)胞癌、直腸結(jié)腸癌有療效。且對惡性黑色素瘤的治療已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。
⑤用于放療和化療病人的免疫系統(tǒng)恢復(fù)。
胸腺素α1具有極好的安全記錄。迄今為止，在進(jìn)行過的臨床和非臨床試驗(yàn)中，在包括成年人、老人、孩子在內(nèi)的2000多受試者身上(無論他們是患有乙肝、丙肝、原發(fā)性免疫疾病還是癌癥)，沒有發(fā)現(xiàn)與藥物相關(guān)的明顯毒副作用。而且，當(dāng)與其它藥物如干擾素或化療藥物聯(lián)用時(shí)胸腺素α1不會(huì)增加其他藥物的副作用。副反應(yīng)是輕微和少見的，主要為給藥部位的不適，極少數(shù)量患者會(huì)出現(xiàn)紅斑、暫時(shí)性肌萎縮、關(guān)節(jié)痛以及出疹。
由于胸腺素α1對于感染性疾病具有確切、獨(dú)特的療效，使其具有潛在的商業(yè)價(jià)值，一時(shí)間成為科研人員和商家關(guān)注的熱點(diǎn)。進(jìn)口藥品價(jià)格昂貴(目前日達(dá)仙零售價(jià)為1813.00元/2支/盒)，國內(nèi)大多數(shù)患者無法負(fù)擔(dān)；并且Tα1療效確切，國內(nèi)肝病患者眾多(據(jù)推算，我國約6.9億人已感染過HBV，其中1.2億人攜帶HbsAg，慢性乙型肝炎患者約3000千萬；3.8億人已感染過HCV)，市場前景廣闊；國內(nèi)的藥廠以及科研部門從保護(hù)人民健康的大局和自己的切身利益出發(fā)，紛紛開展該藥物的研究工作。
到目前為止，胸腺素α1及其相關(guān)產(chǎn)品的制備主要有以下幾類方法1.動(dòng)物(如牛、豬)的胸腺中提取。
此類方法的主要產(chǎn)品為胸腺肽，它是一種混合物，缺點(diǎn)是純度低，生物相容性差，很容易產(chǎn)生毒副作用。并且原材料受動(dòng)物數(shù)量的限制，工藝復(fù)雜。
2.化學(xué)方法合成。
此類方法可以用于合成天然和脫乙?；瘍煞N胸腺素α1形式。其缺點(diǎn)是技術(shù)要求高，工藝復(fù)雜，收率低，所得到的產(chǎn)品成本高，大規(guī)模產(chǎn)生難度較大；合成過程中用到許多有毒物質(zhì)，其產(chǎn)品中也就不可避免的會(huì)有有毒物質(zhì)的殘留；化學(xué)合成本身也會(huì)對環(huán)境造成污染。
3.用基因工程方法表達(dá)后純化。
此類方法多以原核生物(如大腸桿菌)為宿主細(xì)胞，通過帶有胸腺素α1基因的載體轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行過量表達(dá)。由于原核生物遺傳方面的特性，缺乏表達(dá)之后的修飾系統(tǒng)，因此表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽不能進(jìn)一步被加工和修飾。所以基因工程方法生產(chǎn)的胸腺素α1，除了N端缺少乙?；揎椡?，與天然胸腺素α1氨基酸組成相同，有科學(xué)研究表明這種修飾的缺乏不對其活性造成影響。而且，用基因工程方法制備會(huì)克服以上兩類方法的不足。
目前利用大腸桿菌表達(dá)N-α脫乙?；诵叵偎卅?方法的研究，都是其本身與其它蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式進(jìn)行共表達(dá)，在純化過程中先分離融合蛋白，然后用特定的酶或溴化氰將兩者分開，進(jìn)一步分離純化得到目的產(chǎn)物。Xiu ZY等將其與GST蛋白質(zhì)共表達(dá)，然后用凝血酶或溴化氰切割融合蛋白，分離純化后獲得單體(Sheng Wu GongCheng Xue Bao，2002，18(5)541-5)；Wetzel R等將其與β-牛乳糖蛋白共表達(dá)，然后用溴化氰切割融合蛋白，分離純化后獲得單體(WetzelR，et al，Biochemistry，1980，19(26)6096-104)；Korobko VG等將其與TNF蛋白質(zhì)共表達(dá)，然后用溴化氰切割融合蛋白，分離純化后獲得單體(Korobko VG，et al，Bioorg Khim，1992，18(5)646-59)。上述方法的缺點(diǎn)是由于加入了二次裂解的步驟，給待分離的樣品增加了新的污染，難免在最終的產(chǎn)品存留雜質(zhì)。同時(shí)工藝本身也比較復(fù)雜，收率低，造成人力和物力的浪費(fèi)。
所以本發(fā)明提供Nα-脫乙酰化人胸腺素α1單體的表達(dá)載體、工程菌及其制備方法克服了上述制備方法的不足，通過構(gòu)建分泌型表達(dá)載體(pTα1)，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli W3110)使之成為工程菌(pTα1/W3110)，然后進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，使Nα-脫乙?；诵叵偎卅?以單體的形式直接分泌到大腸桿菌的細(xì)胞間質(zhì)中。經(jīng)過裂解、酸沉、超濾、層析幾個(gè)簡單純化步驟，即可獲得純度高達(dá)98％以上的單體蛋白，可以直接作為藥物應(yīng)用于臨床。使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)Nα-脫乙酰化人胸腺素α1，最突出的特點(diǎn)在于生產(chǎn)工藝簡單，便于大規(guī)模生產(chǎn)；整個(gè)制備條件溫和，最大程度保持其生物活性；制備過程中所用的原輔料不會(huì)對環(huán)境造成污染；成本大大降低，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種重組Nα-脫乙?；诵叵偎卅?(Nα-desacetyl thymosin α1)單體的分泌型表達(dá)載體(p ST II/Tα1)，該載體含有重組的編碼人胸腺素α1基因序列、與人胸腺素α1編碼序列相連的大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素II信號肽(ST II)序列、和大腸桿菌堿性磷酸酶啟動(dòng)子(phoA promoter)、翻譯增強(qiáng)子序列、Shine-Dalgano序列、Amp及Tet抗性基因、復(fù)制起點(diǎn)。并且該載體含有ST II基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及該人胸腺素α1編碼序列為人工合成的產(chǎn)物。
本發(fā)明提供一種分泌型表達(dá)重組Nα-脫乙?；诵叵偎卅?單體的工程菌(pTα1/w3110)，其宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli)W3110，基因型F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)lamda-，并且被上述的載體所轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明提供一種制備Nα-脫乙酰化人胸腺素α1單體的方法。該方法依次包括下列步驟a.將上述的工程菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行分泌型表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物Nα-脫乙?；诵叵偎卅?單體被分泌到胞周質(zhì)；b.低溫離心收集菌體并于-70℃凍存；c.分離純化表達(dá)產(chǎn)物。分離純化方法主要包括下列步驟①采用低溫、低滲法裂解菌體。
②采用酸沉進(jìn)行粗提③采用CM-sephrose-F.F陽離子交換層析進(jìn)行粗提。
④采用DEAE-Sepharose-F.F陰離子交換層析法進(jìn)行純化。
⑤采用超濾法濃縮樣品。
⑥采用Sephacryl S-100HR凝膠過濾層析法進(jìn)行純化。


圖1.Tα1cDNA及對應(yīng)的氨基酸序列。
圖2.根據(jù)Tα1cDNA合成的寡核苷酸的序列。
圖3.基因工程表達(dá)載體PST II/Tα1的構(gòu)建示意圖。
圖4.基因工程表達(dá)載體PST II/Tα1的酶切圖譜。
第1道DL2000 DNA+DL15000 DNA Marker。
第2道pST II/Tα1質(zhì)粒用內(nèi)切酶Mlu I消化。
第3道pST II/Tα1質(zhì)粒用內(nèi)切酶BamH I。
第4道pST II/Tα1質(zhì)粒用內(nèi)切酶Mlu I+BamH I。
第5道pST II/Tα1質(zhì)粒用內(nèi)切酶Bgl II第6道pST II/Tα1質(zhì)粒DNA(未酶切)圖5.不同發(fā)酵時(shí)間對目的蛋白表達(dá)量的影響(SDS-PAGE)。
第1道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(美國生命技術(shù)公司)第2道發(fā)酵4h pTα1/W3110全菌體蛋白第3道發(fā)酵8h pTα1/W3110全菌體蛋白第4道發(fā)酵12h pTα1/W3110全菌體蛋白第5道發(fā)酵16h pTα1/W3110全菌體蛋白第6道發(fā)酵20h pTα1/W3110全菌體蛋白第7道發(fā)酵24h pTα1/W3110全菌體蛋白第8道發(fā)酵28h pTα1/W3110全菌體蛋白第9道工作參考品圖6.高密度發(fā)酵時(shí)各參數(shù)隨時(shí)間變化的情況。
圖7.低滲裂解時(shí)，離心上清液的純度情況(SDS-PAGE)。
第1道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(美國生命技術(shù)公司)第2道裂解液上清第3道裂解液沉淀第4道工作參考品圖8.CM-sephrose-FF離子交換層析圖譜。
圖9.DEAE-Sephrose-FF離子交換層析圖譜。
圖10.Sephacryl S-100HR凝膠過濾層析圖譜。
圖11.純化各步獲得蛋白的純度情況(SDS-PAGE)。
第1道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)第2道裂解液上清第3道CM-sephrose-FF離子交換層析收集樣品第4道DEAE-Sephrose-FF離子交換層析收集樣品第5道超濾濃縮收集樣品第6道Sephacryl S-100HR凝膠過濾層析收集樣品第7道工作參考品具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 Nα-脫乙酰化人胸腺素α1的cDNA合成根據(jù)Tα1氨基酸序列以及大腸桿菌常用密碼子設(shè)計(jì)Tα1cDNA(圖1)。按照上述Tα1cDNA序列合成兩兩互補(bǔ)的四個(gè)寡核苷酸片段(圖2)，互補(bǔ)配對后，兩端分別形成MluI和BamHI核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的粘性末端。
實(shí)施例2 分泌型Nα-脫乙?；诵叵偎卅?表達(dá)載體的構(gòu)建用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的起始質(zhì)粒為pST II，其結(jié)構(gòu)包括堿性磷酸酶啟動(dòng)子(PhoA promoter)，翻譯增強(qiáng)子序列，Shine-Dalgano序列，STII序列，Amp及Tet抗性基因，復(fù)制起點(diǎn)。
將起始質(zhì)粒pST II用Mlu I和BamH I進(jìn)行雙酶切回收后，線性質(zhì)粒粘性末端恰好與上述合成片段互補(bǔ)。
將線性質(zhì)粒與合成的互補(bǔ)配對目的片段在T4連接酶(T4 Ligase)指導(dǎo)下進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、篩選后，即可獲得帶有目的基因片段的重組質(zhì)粒，詳細(xì)的過程見圖3。
實(shí)施例3 分泌型Nα-脫乙?；诵叵偎卅?表達(dá)載體的鑒定由于PTα1質(zhì)粒插入的目的基因片段內(nèi)有一個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn)，而原質(zhì)粒上沒有Bgl II酶切位點(diǎn)，可以很可靠地驗(yàn)證外源基因的插入，結(jié)果見圖4。
實(shí)施例4 分泌型Nα-脫乙?；诵叵偎卅?工程菌的建立表達(dá)用菌株為E.coli W3110，基因型F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)lamda-，購自ATCC。按《Molecular Cloing》(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.and Maniatis，T.1989)中的方法，用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌(W3110)感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定正確的基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)W3110菌中，涂板(TET+LB瓊脂板)，挑菌，提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。原始菌種用脫脂奶粉凍干保存于-70℃，每支1.0ml。為檢查工程菌的穩(wěn)定性，每傳20代作一次酶切圖譜分析，結(jié)果與原始菌種一致，證明本發(fā)明中的工程菌是很穩(wěn)定的。
實(shí)施例5 分泌型Nα-脫乙酰化人胸腺素α1工程菌的高密度發(fā)酵種子液培養(yǎng)挑取工程菌單克隆，接種于10ml含TET(5μg/ml)LB培養(yǎng)基中，于37℃搖床中過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm。然后按1∶50轉(zhuǎn)接于含TET的LB中放大培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)200rpm，37℃培養(yǎng)過夜，待OD600光吸收值達(dá)到2.5左右時(shí)上罐。
發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基成分NaH2PO4·2H2O 17gMgSO4·7H2O 24gK2HPO4·3H2O 44.6g(NH4)2SO490g葡萄糖 20g酵母粉 100g微量元素液 10ml其中微量元素液的成分FeCl3·6H2O 1.7gNaMoO4·2H2O 0.7gZnSO4·7H2O 0.8gH3BO50.2g
CuSO4·5H2O0.8gCoCl3·6H2O0.7gMnSO4·H2O 0.5g1MHCl10ml定容至 100ml將培養(yǎng)基按比例加入40L發(fā)酵罐中，加水至20L，121℃高壓滅菌。使用前加入TET(5μg/ml)。
將發(fā)酵種子液按1∶20(V/V)接種于40L發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)。調(diào)整轉(zhuǎn)數(shù)200-800rpm，通氣量0-80％，保證罐壓不高于0.3bar，PH值7.0(通過流加氨水或硫酸來調(diào)節(jié))，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)數(shù)及通氣量維持溶氧量不低于20％，持續(xù)4-5小時(shí)。當(dāng)罐中糖消耗后，補(bǔ)糖速度由0.25g/L/h逐步升至8.0g/L/h，持續(xù)18-20小時(shí)，以后保持5g/L/h至放罐，并且加入消泡劑消泡。在發(fā)酵過程中于不同的時(shí)間間隔取樣，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖5。發(fā)酵終止后，將發(fā)酵罐溫度降至20℃以下，發(fā)酵液用連續(xù)流離心機(jī)16000rpm離心，將收集的菌體壓成片狀，放置-70℃冷凍。Nα-脫乙?；诵叵偎卅?高密度發(fā)酵時(shí)各參數(shù)隨時(shí)間變化的詳細(xì)結(jié)果見圖6。用SDS-PAGE法進(jìn)行菌體總蛋白電泳，經(jīng)掃描儀掃描目的蛋白含量占菌體總蛋白量的10％以上。
實(shí)施例6 分泌型Nα-脫乙?；诵叵偎卅?的純化分離1.裂解菌體通過以上方法獲得的Nα-脫乙?；诵叵偎卅?主要分泌在大腸桿菌的細(xì)胞間質(zhì)中，因此采用低溫、低滲裂解法能有效地抽提出分泌出的Nα-脫乙?；诵叵偎卅?而又不破壞細(xì)胞內(nèi)膜。低滲緩沖溶液為10mMTris-HCl，1mMEDTA，PH值為8.0。從-70℃取出菌體，按照每克濕菌體加入8ml上述低滲緩沖溶液，懸浮細(xì)菌，裂解溫度為4-8℃，同時(shí)緩慢攪拌1.5h裂解完全(結(jié)果見圖7)。
2.酸沉和陽離子交換層析用1N HCl將上述裂解混合液的PH值調(diào)節(jié)到4.0，10分鐘后于4℃、10000rpm離心20min，離心收集上清液。
采用Φ10×50cm柱，CM-Sephrose-F.F陽離子層析介質(zhì)，平衡緩沖液10mM HAc-NaAc，PH4.0，平衡體積為柱床體積5倍以上。將裂解液上清液流穿，流速為240cm/h，收集穿液。電泳檢測純度可達(dá)80％(層析圖譜見圖8)。
3.陰離子交換層析用1N NaOH將上一步流穿液的PH值調(diào)節(jié)到7.0。
采用Φ10×50cm柱，DEAE-Sepharose-F.F陰離子交換介質(zhì)，平衡緩沖液10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH7.0，平衡5個(gè)柱床體積。將調(diào)節(jié)過PH值的流穿液上樣。上樣、平衡流速為240cm/h，洗脫速度為120cm/h。先用含0.02MNaCl的平衡緩沖液洗脫部分雜蛋白后，改用含0.05M NaCl、0.08M NaCl的平衡緩沖液洗脫出胸腺素峰，分段收集，電泳檢測后合樣，純度可達(dá)95％以上。(層析圖譜見圖9)4.超濾濃縮采用Millipore-PALC-C05，膜包截留分量為1KD。平衡緩沖液為10mM磷酸鹽緩沖液(PH為7.0)，超濾濃縮至1L左右。
5.凝膠過濾層析。
柱型Index-200，Sephacryl S-100凝膠過濾介質(zhì)，平衡緩沖液10mM磷酸鹽緩沖液(PH7.0)。上樣體積為柱床體積的5％，流速12cm/h，可除去存在的熱原，聚合體等，分段接收主峰，液相檢測后合樣，純度達(dá)98％以上(層析圖譜見圖10)。
(以上各層析步驟收集樣品的情況見圖11)6.檢定。
將上述純化所得的樣品進(jìn)行如下檢定1)用SDS-PAGE純度檢定，考馬斯亮藍(lán)染色，無可見雜帶。
2)用RP-HPLC法進(jìn)行純度檢定，樣品純度大于98％。
3)用E-玫花法進(jìn)行體外活性檢定，樣品活性大于10％。
我們確定了利用pTα1/W3110工種菌制備Nα-脫乙?；诵叵偎卅?的最佳發(fā)酵條件，能夠穩(wěn)定、高效地表達(dá)目的蛋白。表達(dá)量達(dá)菌體總蛋白的15％以上，達(dá)胞周質(zhì)蛋白的30％以上。同時(shí)我們確定了純化工藝流程為最終純度可達(dá)98％以上。按照已確定的發(fā)酵工藝和純化工藝，我們使用150L發(fā)酵罐，連續(xù)三批發(fā)酵，菌體平均重量為9.5Kg，平均每次發(fā)酵可獲得純化的Nα-脫乙?；诵叵偎卅?蛋白13.6g，批間沒有顯著差異，重現(xiàn)性好。發(fā)酵、純化過程中所使用的試劑及各種處理?xiàng)l件都很溫和，對蛋白質(zhì)活性無不良影響，而且純化工藝簡單，完全適合大規(guī)模生產(chǎn)的要求。
權(quán)利要求
1.一種重組Nα-脫乙?；诵叵偎卅?(Nα-desacetyl thymosinα1)單體的分泌型表達(dá)載體(pT SII/Tα1)，其特征在于，該載體含有重組的編碼人胸腺素α1基因序列、與人胸腺素α1編碼序列相連的大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素II信號肽(ST II)序列、和大腸桿菌堿性磷酸酶啟動(dòng)子(phoA promoter)、翻譯增強(qiáng)子序列、Shine-Dalgano序列、Amp及Tet抗性基因、復(fù)制起點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，該載體含有ST II基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及該人胸腺素α1編碼序列為人工合成的產(chǎn)物。
3.一種分泌型表達(dá)重組Nα-脫乙?；诵叵偎卅?單體的工程菌(pTα1/w3110)，其特征在于，其宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichiacoli)W3110，基因型F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)lamda-，并且被權(quán)利要求1所述的載體所轉(zhuǎn)化。
4.一種制備Nα-脫乙酰化人胸腺素α1單體的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟①將權(quán)利要求3所述的工程菌接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行分泌型表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物Nα-脫乙酰化人胸腺素α1單體被分泌到胞周質(zhì)；②低溫離心收集菌體并于-70℃凍存；③分離純化表達(dá)產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所用的分離純化表達(dá)產(chǎn)物的方法依次包括下列步驟①采用低溫、低滲法裂解菌體。②采用酸沉進(jìn)行粗提。③采用CM-sephrose-F.F陽離子交換層析進(jìn)行粗提。④采用DEAE-Sepharose-F.F陰離子交換層析法進(jìn)行純化。⑤采用超濾法濃縮樣品。⑥采用Sephacryl S-100HR凝膠過濾層析法進(jìn)行純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)重組N
文檔編號C12N15/70GK1539978SQ0312793
公開日2004年10月27日 申請日期2003年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者金磊, 金 磊 申請人:長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司