專利名稱：一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法及其在提高RT-PCR和多重RT-PCR反應(yīng)專一性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1970年Baltimore和Temin分別在鼠白血病病毒和肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，又稱RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶或RNA依賴的DNA聚合酶，這一重要發(fā)現(xiàn)是生命科學(xué)研究的里程碑，也是分子生物學(xué)研究特別是離體合成cDNA建立基因文庫所不可或缺的工具，兩名科學(xué)家于1975年獲諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。八十年代中期PCR技術(shù)建立，發(fā)明人Mullis因此項成就于1993年獲諾貝爾化學(xué)獎。反轉(zhuǎn)錄PCR可以看作是將上述發(fā)現(xiàn)和發(fā)明疊合起來的一項技術(shù)。反轉(zhuǎn)錄PCR能以RNA為原始模板擴增出特定的DNA，在基因表達檢測和定量分析及基因克隆等方面正顯示越來越廣闊的應(yīng)用前景。
RT-PCR技術(shù)建立之初通常將反轉(zhuǎn)錄步驟和擴增步驟先后分兩管進行。反轉(zhuǎn)錄引物采用基因?qū)Ｒ灰锛碢CR引物對中的反引物、或由不同順序六個堿基組成的隨機引物或oligo(dT)引物三種。通過調(diào)整緩沖液組成和pH值，建立和發(fā)展了更簡單的一管式RT-PCR技術(shù)。一管式RT-PCR不排斥用oligo(dT)和隨機引物來合成cDNA，但實際上幾乎都是用基因?qū)Ｒ灰飦磉M行反轉(zhuǎn)錄并完成擴增。以oligo(dT)和隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄的二管式RT-PCR和以基因?qū)Ｒ灰镞M行反轉(zhuǎn)錄的一管式RT-PCR在需要合成的cDNA的目標基因數(shù)量和長度方面有天壤之別，應(yīng)用前一種方法所合成的cDNA長度越長越好，合成的cDNA基因數(shù)量越多越好，應(yīng)用后一種方法則希望只合成目標基因cDNA，其長度比目標擴增產(chǎn)物略長。但是，在從二管式發(fā)展至一管式的進程中對反轉(zhuǎn)錄步驟的反應(yīng)時間、酶用量和反應(yīng)溫度并沒有作出相應(yīng)的調(diào)整顯然是不合理的。目前一管式RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄時間通常為30-60分鐘，文獻報導(dǎo)的低限為15分鐘，本發(fā)明則將反應(yīng)時間縮短為30秒鐘至15分鐘。目前使用常溫反轉(zhuǎn)錄酶AMV和MMLV及其變異品種的一管式RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄步驟溫度范圍為37-50℃，本發(fā)明則可在小于37℃包括室溫和大于50℃下進行。目前一管式RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶的用量與二管式相同或比二管式少幾至幾十倍，本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄酶的用量比二管式少幾十至幾百倍，比現(xiàn)有的一管式RT-PCR試劑盒規(guī)定用量也少幾至幾十倍。本發(fā)明不僅能大大節(jié)約時間和資源而且有助于提高擴增的專一性。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法及其在提高RT-PCR和多重RT-PCR反應(yīng)專一性中的應(yīng)用，以突破現(xiàn)有反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時間、溫度和反轉(zhuǎn)錄酶用量上的限制，克服兩管式反轉(zhuǎn)錄PCR和多重RT-PCR在反應(yīng)專一上的缺陷。
技術(shù)方案本發(fā)明提供一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法，其步驟依次包括(1)在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，依據(jù)RNA鏈合成DNA模板；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行合成反應(yīng)；其中，步驟(1)的反應(yīng)時間為0.5-15分鐘，優(yōu)選1-5分鐘。
相對上述的一管式RT-PCR方法，二管式RT-PCR通常以隨機引物和oligo(dT)進行反轉(zhuǎn)錄，它是以反應(yīng)體系中所有的RNA或所有的mRNA為模板，目的是合成出盡可能多的基因和盡可能長、盡可能完整的的cDNA，所得到的cDNA庫可作為基因擴增的模板。二管式RT-PCR用隨機引物和oligo(dT)進行反轉(zhuǎn)錄的最重要優(yōu)點是所得到的cDNA能用于各種目標基因的擴增。但是，正因為它是一個包羅萬象的非常復(fù)雜的cDNA模板庫，對于任何一個特定基因的擴增而言顯然有百弊而無一利。一管式RT-PCR以基因?qū)Ｒ灰镞M行反轉(zhuǎn)錄，目的只是得到一定長度的可作為目標擴增產(chǎn)物模板的cDNA。如果反轉(zhuǎn)錄步驟不合成非目標基因cDNA或只合成很短的片段，則擴增步驟受到非目標基因干擾就可能大大減少，PCR可以在更寬的條件下進行而仍保持其專一性。同樣，如果反轉(zhuǎn)錄步驟合成的目標基因cDNA長度只比設(shè)計的擴增產(chǎn)物略長，則可避免擴增產(chǎn)物上游的順序?qū)U增可能造成的干擾。所以，一管式RT-PCR和二管式RT-PCR在對cDNA合成的要求上可以說正好相反，說明有必要在反應(yīng)時間上作相應(yīng)的調(diào)整。以下事實則說明反轉(zhuǎn)錄步驟的反應(yīng)時間有可能大大縮短。人和哺乳動物基因mRNA的平均長度約為2kb，通常長度范圍為0.5-8kb，有些mRNA長度則超過10kb。目前各種二管式或一管式商品RT-PCR試劑盒都稱能在通常的15-60分鐘反應(yīng)時間內(nèi)得到完整的cDNA。Eppendorff公司的RT-PCR試劑盒則稱得到了12.5kb長的擴增產(chǎn)物。這說明在現(xiàn)有的試劑和反應(yīng)條件下，cDNA合成速度至少在每分鐘200堿基以上?；虮磉_分析和臨床檢測對擴增產(chǎn)物的長度一般并沒有任何限制，如果假定擴增產(chǎn)物為200堿基，則根據(jù)上述數(shù)據(jù)有可能在1分鐘之內(nèi)完成相應(yīng)的cDNA合成。根據(jù)酶活力的定義和產(chǎn)品的比活力也可計算cDNA的合成速度。以Roche公司反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品AMV和MMLV為例，其比活力分別為50,000和40,000U/mg蛋白，其倒數(shù)分別為20和25ng酶蛋白/U。假定二種酶蛋白的分子量均為為71,000道爾登，則每一個單位酶分別含0.28和0.35pmol酶分子。Roche公司AMV和M-MMLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品的單位定義是指以Poly(dA)為模板以oligo(dT)為引物時，在37℃培養(yǎng)10分鐘內(nèi)，摻入到核酸中的標記核苷酸為1nmol，即每分鐘有100pmol核苷酸摻入至cDNA。由此可推算二種反轉(zhuǎn)錄酶的合成速度分別為每分鐘約360和290個堿基。假定反轉(zhuǎn)錄酶以天然目標基因RNA為模板的cDNA合成速度與上述以單元素的人工合成模板相仿，則每個反轉(zhuǎn)錄酶分子能在1分鐘之內(nèi)合成300堿基以上的cDNA。反轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它也能以DNA為模板合成cDNA，但速度通常遠小于以RNA為模板時的速度。根據(jù)文獻(F.M.Ausubel等，Current Protocols in Molecularbiology，Vol1，Unit3.7，2000)AMV反轉(zhuǎn)錄酶以DNA為模板的合成速度可達每秒鐘約5個堿基即每分鐘約300個堿基，由此也可推斷反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA的速度至少達每分鐘幾百堿基。
本發(fā)明提供一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法，其步驟依次包括(1)反轉(zhuǎn)錄酶催化下，依據(jù)RNA鏈合成DNA模板；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行合成反應(yīng)；其中，步驟(1)的反應(yīng)溫度范圍為4-37℃或50-75℃，優(yōu)選15-37℃或50-60℃。
常溫反轉(zhuǎn)錄酶AMV和MMLV的最適反應(yīng)溫度分別為37℃和42℃左右，雖然反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的速度隨溫度下降而顯著下降，但在30℃、室溫、甚至更低的溫度下仍能在幾分鐘至幾十分鐘的時間內(nèi)完成幾百堿基cDNA的合成。在反應(yīng)速度較低完成幾百個堿基合成需要幾分鐘至幾十分鐘而不是幾秒鐘至幾十秒鐘的情況下，有可能通過控制反應(yīng)時間來限制所合成的cDNA的長度，使得目標擴增產(chǎn)物的cDNA能完成合成，而比擴增產(chǎn)物更長的目標基因和非目標基因cDNA的合成受到限制。通過這種控制可降低模板的復(fù)雜性，從而提高擴增的專一性。反轉(zhuǎn)錄步驟的溫度也可能向更高的溫度擴展。目前反轉(zhuǎn)錄酶的最適溫度和在較高溫度下的半衰期都是以反應(yīng)時間為一小時來進行測定的。如果以保溫15分鐘或更短的時間來測定，則酶的最適溫度可能顯著提高，半衰期可能延長，通過添加甘油和其他試劑也可能使酶的耐熱性顯著增強，所以反轉(zhuǎn)錄酶有可能在較短的時間同時又在較高的溫度下完成幾百堿基cDNA的合成。提高反轉(zhuǎn)錄溫度可減少RNA二級結(jié)構(gòu)，同時減少基因?qū)Ｒ灰锱c非目標RNA順序的假性結(jié)合，從而增強cDNA合成和擴增的專一性。
本發(fā)明提供一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法，其步驟依次包括(1)在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，依據(jù)RNA鏈合成DNA模板；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行合成反應(yīng)；其中，步驟(1)的反轉(zhuǎn)錄酶為MMLV1-200單位/μg總RNA模板或AMV1-200單位/μg總RNA模板，優(yōu)選反轉(zhuǎn)錄酶為MMLV4-50單位/μg總RNA模板或AMV4-50單位/μg總RNA模板。
相比較于上述的一管式RT-PCR反應(yīng)方法，二管式RT-PCR通常取五分之一至五十分之一的cDNA用于PCR，而一管式RT-PCR反轉(zhuǎn)錄所合成的cDNA被全部用于PCR。某些公司出品的一管式RT-PCR試劑盒已將反轉(zhuǎn)錄酶的用量比本公司的二管式試劑盒降低了幾至幾十倍。但是，用基因?qū)Ｒ灰锏囊还苁絉T-PCR的反轉(zhuǎn)錄酶用量理論上有進一步下調(diào)的空間。人細胞內(nèi)的mRNA種類多達幾萬種，其中99％以上是屬于低豐度的，其拷貝數(shù)只占總mRNAs拷貝數(shù)的幾萬分之一至幾十萬分之一。換言之，使用基因?qū)Ｒ灰镞M行反轉(zhuǎn)錄的一管式RT-PCR所要求合成的目標基因cDNA的量比二管式需要合成的cDNA庫要少幾個數(shù)量級，一管式RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄酶的用量有大大降低的潛力。M.J.Roth等(Journal Biological Chemistry，1985，2609326-9335)指出cDNA產(chǎn)物的長度與反轉(zhuǎn)錄酶的加量有關(guān)，當反轉(zhuǎn)錄酶濃度低于一定值時不合成cDNA或只能合成幾百堿基長的cDNA。這提示不能只根據(jù)所需要合成cDNA的數(shù)量將一管式RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄酶用量無限制地按比例降低。但是，另一方面Roth等指出的事實卻表明有可能通過降低酶用量來控制合成cDNA的長度，使其在一般擴增產(chǎn)物的幾百堿基長度之內(nèi)，從而提高擴增的專一性。
本發(fā)明同時提供上述的有關(guān)反應(yīng)溫度范圍的反應(yīng)方案在提高RT-PCR擴增專一性中的應(yīng)用，其技術(shù)關(guān)鍵在于步驟(1)的反應(yīng)溫度為4-37℃，優(yōu)選25-37℃，以限制比目標擴增產(chǎn)物長度更長的cDNA的合成。
本發(fā)明同時提供上述的有關(guān)反應(yīng)溫度范圍的反應(yīng)方法在提高RT-PCR擴增專一性中的應(yīng)用，其技術(shù)關(guān)鍵在于步驟(1)的反應(yīng)溫度為50-75℃，以降低RNA二級結(jié)構(gòu)提高基因?qū)Ｒ灰锖铣蒫DNA的專一性。
本發(fā)明同時提供上述的有關(guān)反轉(zhuǎn)錄酶用量范圍的反應(yīng)方案在提高RT-PCR擴增專一性中的應(yīng)用，其技術(shù)關(guān)鍵在于降低反轉(zhuǎn)錄酶用量至MMLV1-200單位/μg總RNA模板或AMV1-200單位/μg總RNA模板來限制比目標擴增產(chǎn)物長度更長的cDNA的合成。
有益效果上述的有關(guān)縮短反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時間、擴展反轉(zhuǎn)錄步驟的反應(yīng)溫度和減少反轉(zhuǎn)錄酶的用量的技術(shù)方案所帶來的獨特的技術(shù)效果有如下幾點1.將一管式RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄時間從目前的15分鐘至1小時縮短至半分鐘至15分鐘，完成整個RT-PCR的測定時間也大大縮短。
2.可在室溫配制RT-PCR反應(yīng)液并在室溫置留若干時間來完成反轉(zhuǎn)錄，不必在基因擴增儀或其他儀器上進行反應(yīng)使操作簡化。
3.可在比37℃更低的溫度下包括室溫下進行反轉(zhuǎn)錄，從而有可能通過控制反轉(zhuǎn)錄步驟的時間來限制比目標擴增產(chǎn)物長度更長的cDNA的合成有利擴增的專一性。
4.可在比50℃更高的溫度下進行反轉(zhuǎn)錄既快速又能降低RNA二級結(jié)構(gòu)，減少引物與非模板RNA的假性結(jié)合，有利于減少非目標cDNA即非專一半擴增鏈的合成，促進目標基因產(chǎn)物的擴增。
5.反轉(zhuǎn)錄酶用量可是各種一管式RT-PCR試劑盒規(guī)定的用量的二分之一至百分之一。節(jié)約了較昂貴的反轉(zhuǎn)錄酶試劑。
6.降低反轉(zhuǎn)錄酶用量有可能通過控制酶用量來限制比目標擴增產(chǎn)物長度更長的cDNA的合成有利擴增的專一性。
具體實施例方式
實施例1.
實施例1以人肌動球蛋白基因作為目標基因。引物與目標順序的上下游均高度匹配而且中間跨越一個內(nèi)含子，基因組DNA污染導(dǎo)致的擴增產(chǎn)物比由以cDNA為模板得到的擴增產(chǎn)物大約100堿基能加以區(qū)別。引物的順序和特性示于表1和表2。
表1.表實施例1引物順序

表2.實施例1引物的特性

實施例1用ClonTech出品的人組織總RNA為原始模板并用該公司的的TITANIUM一管式試劑盒按其規(guī)定成份在室溫下配制反應(yīng)液。每管反應(yīng)體積5微升，每50微升加人組織總RNA0.5微克，引物濃度1uM。反轉(zhuǎn)錄溫度50℃試驗時間為0-15分鐘。PCR首次變性94℃4分鐘，循環(huán)變性94°10秒鐘，退火65℃1分鐘，延伸70℃1分鐘，共30循環(huán)。反轉(zhuǎn)錄時起動基因擴增程序當溫度達到50℃后加入第一個試管，相隔一定的時間后加入其他試管使在50℃的反轉(zhuǎn)錄時間達到指定值。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束當擴增儀溫度升至94℃后加最后一個試管作為反轉(zhuǎn)錄時間為“0”分鐘。試驗結(jié)果示于表3。
表3.實施例1結(jié)果

試驗結(jié)果表明反轉(zhuǎn)錄時間從1分鐘至15分鐘都得到同樣強的目標產(chǎn)物條帶。50℃“0”分鐘培養(yǎng)也得到同樣強的擴增產(chǎn)物，說明在室溫配制反應(yīng)液及隨后在室溫放置15分鐘已能完成長約200堿基的目標cDNA的合成。
實施例2實施例2以人腺苷酸環(huán)化酶的一種亞型的基因(基因庫編號XM_028817〕為目標基因，引物的順序和特性示于表4和表5，擴增產(chǎn)物跨越二個內(nèi)含子，基因組DNA污染導(dǎo)致的擴增產(chǎn)物能與以cDNA為模板得到的擴增產(chǎn)物明顯區(qū)別。
表4.實施例2引物順序

表5.實施例2引物的特性

實施例2除正反引物濃度均為0.4uM外所用試劑和方法與實施例1相同。為避免在室溫條件下合成cDNA，所有試劑解凍后置于冰浴，在冰浴上配制反應(yīng)液最后加反轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA聚合酶混合物，反應(yīng)配成后仍保存于冰浴直至按實施例1方法加到基因擴增儀。反轉(zhuǎn)錄和PCR的程序也與實施例1相同，但退火與延伸合并為一步72℃1分半鐘。試驗結(jié)果示于表6。
表6.實施例2結(jié)果

試驗結(jié)果表明在冰浴配制反應(yīng)液并停留約15分鐘然后直接加到溫度為94℃的擴增儀上沒有擴增條帶出現(xiàn)，說明在接近零度的低溫下不能合成cDNA。在50℃反轉(zhuǎn)錄30秒鐘至15分鐘都得到目標擴增產(chǎn)物，而且反轉(zhuǎn)錄1-15分鐘所得到的擴增產(chǎn)物強度相同，表明在試驗條件下1分鐘反轉(zhuǎn)錄已能得到足量的400堿基長的目標cDNA，提示現(xiàn)行一管式RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄時間可大大縮短。
實施例3實施例3以人甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因(基因庫編號XM_006959)〕為目標基因，引物的順序和特性示于表7和表8，擴增產(chǎn)物跨越一個內(nèi)含子，基因組DNA污染導(dǎo)致的擴增產(chǎn)物能與以cDNA為模板得到的擴增產(chǎn)物明顯區(qū)別。
表7.實施例3引物順序

表8.實施例3引物的特性

實施例3按實施例1方法在室溫配制RT-PCR反應(yīng)液，并在室溫放置0-30分鐘作為反轉(zhuǎn)錄步驟，然后立即加到已加熱至94℃的基因擴增儀上開始PCR。PCR程序與實施例2相同，循環(huán)數(shù)為28。試驗結(jié)果示于表9。
表9.實施例3結(jié)果


試驗結(jié)果說明在室溫進行反轉(zhuǎn)錄幾分鐘能完成長至少為200堿基的cDNA的合成，約十分鐘后目標基因的cDNA達到飽和。“0”分鐘反轉(zhuǎn)錄也顯示微弱擴增條帶說明在室溫配至RT-PCR反應(yīng)液的短時間和試管從室溫升至94℃的坡道時間內(nèi)也能合成一些短的cDNA。不加RNA在室溫置留不同時間的負對照試管不出現(xiàn)目標產(chǎn)物條帶說明沒有滯后污染現(xiàn)象。
實施例4實施例4也以人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因為目標基因(基因庫編號XM_006959)，試驗使用二對引物，其中一對引物G1正和G1反的順序已示于表7。另一對引物G2正和G2反的順序和特性示于表10和表11。
表10.實施例4引物順序

表11.實施例4引物的特性

應(yīng)用非原配的G1正引物和G2反引物也能得到擴增產(chǎn)物長度為593堿基。如用二對引物作多重PCR則理論上應(yīng)能得到185，388和593堿基長三種擴增產(chǎn)物。實施例4按實施例2方法在冰浴上配制RT-PCR反應(yīng)液，并立即置于基因擴增儀開始RT-PCR程序，反轉(zhuǎn)錄步驟12分鐘溫度分別為15，20，25，30，35，40，45和50℃。反轉(zhuǎn)錄完成后立即進入PCR，PCR的程序與實施例3相同。試驗結(jié)果示于表12。
表12.實施例4結(jié)果


試驗結(jié)果表明當反應(yīng)時間固定時，完成反轉(zhuǎn)錄使cDNA合成達到飽和所需的溫度與擴增產(chǎn)物長度，即所需合成的cDNA的長度有關(guān)。產(chǎn)物長度為約200堿基時，15℃下即能完成cDNA合成，25℃即達飽和；擴增產(chǎn)物長約400堿基時35℃下能完成cDNA合成，50℃時能達飽和；擴增產(chǎn)物長約600堿基時45℃下能完成cDNA合成，50℃時能達飽和。多重PCR結(jié)果提示控制反轉(zhuǎn)錄步驟在較低的溫度如25-40℃，能使較短的目標基因DNA得到充分的合成，而較長的非目標基因的cDNA不能完成合成。即通過反轉(zhuǎn)錄步驟可以提高RT-PCR的專一性。
實施例5實施例5試驗反轉(zhuǎn)錄的最高允許溫度，所用引物與實施例4相同，所用試劑和RT-PCR反應(yīng)液的配制也與實施例4相同，每管反應(yīng)體積10微升。反轉(zhuǎn)錄設(shè)定為60，65，70或75℃6分鐘，在冰浴配制反應(yīng)液然后直接加到已分別升溫至60，65，70或75℃達一分鐘的基因擴增儀上。反轉(zhuǎn)錄完成后在95℃加熱3分鐘并開始PCR，PCR程序與實施例4相同，退火和延伸70℃1分半鐘，每一試驗含一不加RNA的負對照，結(jié)果示于表13。
表13.實施例5試驗結(jié)果

結(jié)果表明當反轉(zhuǎn)錄溫度達75℃仍能形成目標擴增產(chǎn)物，不加RNA模板均無擴增產(chǎn)物條帶形成，說明不存在擴增產(chǎn)物的滯后污染。雖然10微升反應(yīng)液從冰浴升至60-75℃僅需兒秒鐘，但是為了排除升溫過程的坡導(dǎo)時間內(nèi)cDNA的合成，還用G1引物對進行一個試驗，在冰浴配制反應(yīng)液但不加反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶混合物，當含反應(yīng)液試管在基因擴增儀上分別達到60，65，70或75C時再加僅0.2微升的酶混合物，使坡道時間縮短至接近零秒，結(jié)果同樣均得到擴增產(chǎn)物，說明作為目標基因模板的cDNA確是在如此高溫下合成的。
實施例6實施例5以人肌動球蛋白基因和人腺苷酸環(huán)化酶的一種亞型作為目標基因，試驗反轉(zhuǎn)錄酶的用量對RT-PCR的影響，引物A1和引物AC正和AC反的順序和特性示于表1，2，4和5。配制反應(yīng)液的試劑和方法與實施例1相同，但每一個試驗管均加相同量的ClonTech公司的Advantage-2PCR試劑盒中的50XTaqDNA聚合酶來代替TITAIUM-RT-PCR試劑盒中的50XTaqDNA聚合酶和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的混合物用于擴增。另外，每一個試驗管再加不同量的50XTaqDNA聚合酶和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶混合物用于反轉(zhuǎn)錄。每一試驗管的反轉(zhuǎn)錄溫度均為50℃時間均為5分鐘。A1引物濃度1uM，退火65℃1分鐘，延伸70℃1分鐘，循環(huán)數(shù)30；AC引物濃度均為0.4uM，退火延伸合為一步72℃1分半鐘，循環(huán)數(shù)32。試驗結(jié)果示于表14。
表14.實施例6結(jié)果


*以試劑盒規(guī)定的反轉(zhuǎn)錄酶加量為100％***以試劑盒規(guī)定的TaqDNA聚合酶加量為100％試驗結(jié)果說明對于較短的約200堿基的擴增產(chǎn)物，只加試劑盒規(guī)定量5％的反轉(zhuǎn)錄酶cDNA的合成即飽和，能得到與加標準量反轉(zhuǎn)錄酶的RT-PCR同樣強的擴增條帶；對于較長的約400堿基的擴增產(chǎn)物，加試劑盒規(guī)定量10％的反轉(zhuǎn)錄酶cDNA的合成也達到飽和，從而得到與加標準量反轉(zhuǎn)錄酶的RT-PCR同樣強的擴增條帶。
實施例7實施例7也試驗反轉(zhuǎn)錄酶用量對RT-PCR的影響，引物AC正和AC反的順序和特性已示于表4和表5。配制反應(yīng)液用的試劑和方法與實施例5相同，但每一個試驗管加不同量的ClonTech公司cDNA合成試劑盒所提供的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(每微升200單位)。反轉(zhuǎn)錄和PCR的條件均與實施例5相同。試驗結(jié)果示于表15。
表15.實施例6結(jié)果

**以試劑盒規(guī)定的TaqDNA聚合酶加量為100％試驗結(jié)果表明對于長約400堿基的擴增產(chǎn)物，每100微升RT-PCR反應(yīng)液只加相當于0.02微升的商品反轉(zhuǎn)錄酶，cDNA合成即達飽和，擴增產(chǎn)物強度與加100倍量的反轉(zhuǎn)錄酶所擴增的相同，提示目前試劑盒反轉(zhuǎn)錄酶的用量可再降低。
實施例8實施例8以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(基因庫編號XM_006959)為例說明快速反轉(zhuǎn)錄和快速PCR結(jié)合的快速一管法反轉(zhuǎn)錄PCR。引物順序和特性與表7和表8相同。反轉(zhuǎn)錄PCR用試劑和原始RNA模板與實施例1相同，引物濃度為2uM，每管體積僅2微升，反轉(zhuǎn)錄50℃1分鐘，95℃加熱2分鐘后轉(zhuǎn)入循環(huán)，變性89℃1秒鐘，退火和延伸75℃1秒鐘，30循環(huán)，完成整個反轉(zhuǎn)錄PCR時間僅為17分鐘，電泳和染色顯示得到專一目標擴增產(chǎn)物條帶。
權(quán)利要求
1.一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法，其步驟依次包括(1)在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，依據(jù)RNA鏈合成DNA模板；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行合成反應(yīng)；其特征在于步驟(1)的反應(yīng)時間為0.5-15分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)方法，其特征在于步驟(1)的反應(yīng)時間為1-5分鐘。
3.一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法，其步驟依次包括(1)在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，依據(jù)RNA鏈合成DNA模板；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行合成反應(yīng)；其特征在于步驟(1)的反應(yīng)溫度范圍為4-37℃或50-75℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反應(yīng)方法，其特征在于步驟(1)的反應(yīng)溫度范圍為15-37℃或50-60℃。
5.一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法，其步驟依次包括(1)在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，依據(jù)RNA鏈合成DNA模板；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行合成反應(yīng)；其特征在于步驟(1)的反轉(zhuǎn)錄酶為MMLV1-200單位/μg總RNA模板或AMV1-200單位/μg總RNA模板。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的反應(yīng)方法，其特征在于步驟(1)的反轉(zhuǎn)錄酶為MMLV4-50單位/μg總RNA模板或AMV4-50單位/μg總RNA模板。
7.權(quán)利要求3所述的反應(yīng)方法在提高RT-PCR擴增專一性中的應(yīng)用，其特征在于步驟(1)的反應(yīng)溫度為4-37℃，限制比目標擴增產(chǎn)物長度更長的cDNA的合成。
8.權(quán)利要求3所述的反應(yīng)方法在提高多重RT-PCR擴增專一性中的應(yīng)用，其特征在于步驟(1)的反應(yīng)溫度為25-37℃，限制比目標擴增產(chǎn)物長度更長的cDNA的合成。
9.權(quán)利要求3所述的反應(yīng)方法在提高RT-PCR擴增專一性中的應(yīng)用，其特征在于步驟(1)的反應(yīng)溫度為50-75℃，以降低RNA二級結(jié)構(gòu)和增強反轉(zhuǎn)錄及擴增產(chǎn)物的專一性。
10.權(quán)利要求5所述的反應(yīng)方法在提高RT-PCR擴增專一性中的應(yīng)用，其特征在于降低反轉(zhuǎn)錄酶用量至MMLV1-200單位/μg總RNA模板或AMV1-200單位/μg總RNA模板來限制比目標擴增產(chǎn)物長度更長的cDNA的合成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種一管式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法及其在提高RT－PCR和多重RT－PCR反應(yīng)專一性中的應(yīng)用，特別涉及縮短反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時間至0.5－15分鐘、擴展常溫反轉(zhuǎn)錄酶MMLV和AMV的反轉(zhuǎn)錄步驟的反應(yīng)溫度范圍為4－37℃或50－75℃和減少反轉(zhuǎn)錄酶的用量至MMLV4－50單位/μg總RNA模板或AMV4－50單位/μg總RNA模板的技術(shù)方案，使反應(yīng)加快、反應(yīng)專一性獲得顯著提高。本發(fā)明適用于實驗室用RT－PCR試劑盒和醫(yī)學(xué)核酸檢測用RT－PCR試劑盒的方案設(shè)計和制備。
文檔編號C12Q1/68GK1552886SQ0312889
公開日2004年12月8日 申請日期2003年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月29日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱, 徐文慧 申請人:徐定邦, 徐文慧