專利名稱：兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海藻糖的生產(chǎn)方法，特別是涉及一種以葡萄糖為基質(zhì)采用兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖的方法。
海藻糖雖然有難以估量的應(yīng)用前景，但其較高的價(jià)格是海藻糖廣泛應(yīng)用的主要限制因素。目前海藻糖的生產(chǎn)方法有以下三種1.酵母提取法采用特殊的培養(yǎng)工藝使酵母細(xì)胞內(nèi)積累較高的海藻糖，然后收集細(xì)胞用酒精抽提法提取。它為胞內(nèi)產(chǎn)品，發(fā)酵水平低，成本高。
2.細(xì)菌發(fā)酵法它主要以細(xì)菌(包括基因工程菌)為菌種生產(chǎn)胞外海藻糖，如以正烷烴為基質(zhì)培養(yǎng)Arthrobacter的發(fā)酵生產(chǎn)，以蔗糖、葡萄糖為基質(zhì)培養(yǎng)Brevibacterium、Corynebacterium等發(fā)酵生產(chǎn)，還有利用Nocardia、Micrococcaceae等微生物的培養(yǎng)來生產(chǎn)海藻糖的。但轉(zhuǎn)化率低，糖類副產(chǎn)物多，產(chǎn)品分離困難。
3.細(xì)菌酶合成法即利用酶制劑所具有的轉(zhuǎn)糖基作用，在離體條件下作用于底物，合成海藻糖。細(xì)菌酶法的合成路線有多種；如由麥芽糖經(jīng)麥芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶催化轉(zhuǎn)化為海藻糖；由麥芽糖經(jīng)分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶一步轉(zhuǎn)化為海藻糖；由淀粉或寡糖經(jīng)新型葡糖基轉(zhuǎn)移酶和新型α-淀粉酶聯(lián)合作用合成海藻糖等。細(xì)菌酶合成法雖具有特異性好、轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)，但所用酶需要精制，制酶的費(fèi)用很高，且產(chǎn)品分離過程較復(fù)雜，因而生產(chǎn)成本較高。
在上述三種生產(chǎn)方法中，細(xì)菌酶合成法是目前世界上生產(chǎn)海藻糖的主要方法，其產(chǎn)品的國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格為10～12美元/kg。如用作食品保護(hù)劑，其有效的保護(hù)作用應(yīng)添加15％左右，每公斤食品所需的保護(hù)劑成本將高達(dá)1.5～1.8美元。
本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是通常它包括菌體培養(yǎng)、海藻糖的合成、海藻糖的提取、分離、純化、濃縮、結(jié)晶、干燥，其特征在于采用兩步發(fā)酵法利用酵母細(xì)胞中的海藻糖合成酶系合成胞外海藻糖，同時(shí)鈍化酵母的海藻糖分解酶活性，并用混合床離子交換系統(tǒng)分離純化海藻糖，其具體方法如下(1)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞培養(yǎng)采用現(xiàn)有技術(shù)的氮饑餓、熱休克、滲透脅迫方法，誘導(dǎo)酵母細(xì)胞產(chǎn)生較多的應(yīng)激酶——海藻糖合成酶系，脅迫生長(zhǎng)型酵母細(xì)胞向應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)變；(2)胞外海藻糖的合成首先采用物理或化學(xué)的方法對(duì)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞進(jìn)行休克處理；然后采用海藻糖合成培養(yǎng)基進(jìn)行胞外海藻糖的合成；搖瓶試驗(yàn)為500mL三角瓶，裝液量60～120mL，轉(zhuǎn)速100～180r/min；發(fā)酵罐試驗(yàn)采用5L自控罐以流加葡萄糖的方式進(jìn)行胞外海藻糖合成，其生產(chǎn)工藝是初始裝液量2.5L，初始糖濃度為1～2％，pH4.0～70，溶氧10％～40％，合成溫度40～48℃；反應(yīng)過程中用10％Na2CO3調(diào)節(jié)pH，并可根據(jù)消耗的糖量補(bǔ)加葡萄糖液，最終反應(yīng)液量為3L，反應(yīng)液海藻糖含量可達(dá)10～16g/L；(3)海藻糖的分離與純化將反應(yīng)液離心除酵母細(xì)胞，取上清液高溫滅菌，用截留分子量為10000的中空纖維超濾裝置過濾除大分子物質(zhì)；隨后采用混合床離子交換柱分離海藻糖和葡萄糖；本發(fā)明還可以采用如下技術(shù)措施所述的采用物理或化學(xué)的方法對(duì)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞進(jìn)行休克處理，其具體的方法有(1)甲苯處理法按每克酵母泥加入2～10％甲苯5mL，30～40℃處理1h。3h后胞外海藻糖含量為100％；(2)加熱處理法35～43℃振蕩培養(yǎng)1h后，升溫至45～65℃處理1h。4～6h后胞外海藻糖含量達(dá)100％；所述的海藻糖合成培養(yǎng)基配方為葡萄糖2～3g、NaCl 2～3g、MgSO4·7H2O 60～70mg、FeSO4·7H2O 6～8mg、CaCl2·2H2O 8～10mg、CoCl20.4～0.5mg、CuSO4·5H2O 0.8～1.0mg、核黃素0.08～0.10mg、VB60.8～1.0mg、對(duì)氨基苯甲酸0.16～0.20mg、肌醇0.8～1.0mg、煙酰胺0.8～1.0mg，溶于100mL 80～160mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4(pH5.0～7.0)緩沖液中；所述的混合床離子交換柱分離的條件為陰陽(yáng)樹脂用量體積比為2∶0.8～1.6，整個(gè)分離環(huán)境維持在pH中性，溫度30～40℃，流速0.6～1.6mL/min時(shí)，用無離子水作洗脫劑。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明是以葡萄糖為基質(zhì)的兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖，該方法簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝、設(shè)備簡(jiǎn)單、投資少，海藻糖轉(zhuǎn)化率高、易于產(chǎn)品分離、無糖類副產(chǎn)物、降低了生產(chǎn)成本、價(jià)格便宜，而生產(chǎn)成本的降低，有可能使海藻糖獲得廣泛的應(yīng)用，特別是在食品工業(yè)方面，海藻糖是一種能改善干燥加工食品質(zhì)量和保持原有風(fēng)味不變的天然食品添加劑，其甜度低、易代謝和消化，廉價(jià)的海藻糖還可以廣泛應(yīng)用于奶類、肉類、果汁飲料、蔬菜汁、風(fēng)味調(diào)料等的保存。
圖2是本發(fā)明兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖實(shí)施例2的工藝流程圖。
限氮培養(yǎng)基配方葡萄糖4％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，
MgSO40.2％，KH2PO40.5％，pH5.0～6.0。
胞外海藻糖合成培養(yǎng)基配方葡萄糖2～3g、NaCl 2～3g、MgSO4·7H2O 60～70mg/100mL、FeSO4·7 H2O 6～8mg/100mL、CaCl2·2H2O 8～10mg/100mL、CoCl20.4～0.5mg/100mL、CuSO4·5H2O 0.8～1.0mg/100mL、核黃素0.08～0.10mg/100mL、VB60.8～1.0mg/100mL、對(duì)氨基苯甲酸0.16～0.20mg/100mL、肌醇0.8～1.0mg/100mL、煙酰胺0.8～1.0mg/100mL，溶于濃度為80～160mmol/L Na2HPO4-KH2PO4(pH5.0～7.0)的緩沖液中。其具體生產(chǎn)步驟如下(1)海藻糖高產(chǎn)菌株的選育首先采用誘變育種的方法選育出應(yīng)激反應(yīng)敏感的菌株，以積累較高的海藻糖；隨后采用基因重組技術(shù)選育海藻糖分解酶(基因ATH1和NTH1)活性缺失的菌株，從而獲得高產(chǎn)海藻糖的生產(chǎn)菌株，其胞內(nèi)海藻糖含量達(dá)23～25％。
(2)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞培養(yǎng)首先按正常的培養(yǎng)方法培養(yǎng)一定濃度的酵母細(xì)胞，然后采用現(xiàn)有技術(shù)的氮饑餓、熱休克、滲透脅迫等方法，誘導(dǎo)酵母細(xì)胞產(chǎn)生較多的應(yīng)激酶——海藻糖合成酶系，脅迫生長(zhǎng)型酵母細(xì)胞向應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，其方法包括氮饑餓培養(yǎng)三角瓶實(shí)驗(yàn)采用控制培養(yǎng)基碳、氮比來實(shí)現(xiàn)；發(fā)酵罐培養(yǎng)則采用流加培養(yǎng)的方法來控制，在發(fā)酵初期流加較多的氮以積累較多的細(xì)胞，在流加培養(yǎng)中、后期停止流加氮源，以獲得含氮量低的酵母細(xì)胞。
熱休克即酵母的溫度休克培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)后期提高培養(yǎng)溫度至35~43℃，終止酵母細(xì)胞的繁殖能力，誘導(dǎo)酵母海藻糖合成酶系的形成。
滲透脅迫在酵母培養(yǎng)的后期，向培養(yǎng)基中添加1.5~3.0％的NaCl，提高其培養(yǎng)系統(tǒng)的滲透壓，脅迫生長(zhǎng)型酵母細(xì)胞向應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。
(3)胞外海藻糖的合成首先采用物理或化學(xué)的方法對(duì)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞進(jìn)行休克處理，打破酵母細(xì)胞膜對(duì)海藻糖滲透性的限制，使應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為海藻糖合成態(tài)細(xì)胞；然后采用海藻糖合成培養(yǎng)基進(jìn)行胞外海藻糖的合成。搖瓶試驗(yàn)為500mL三角瓶，裝液量60～120mL，轉(zhuǎn)速100～180r/min。發(fā)酵罐試驗(yàn)采用5L自控罐以流加葡萄糖的方式進(jìn)行胞外海藻糖合成，其生產(chǎn)工藝是初始裝液量2.5L，初始葡萄糖濃度為1～2％，pH4.0～70，溶氧10％～40％，合成溫度40～48℃。反應(yīng)過程中用10％ Na2CO3調(diào)節(jié)pH，并可根據(jù)消耗的糖量補(bǔ)加葡萄糖液，最終反應(yīng)液量為3L左右，反應(yīng)液海藻糖含量可達(dá)10～16g/L。
(4)海藻糖的分離與純化將反應(yīng)液離心除去酵母細(xì)胞，取上清液高溫滅菌，用截留分子量為10000的中空纖維超濾裝置過濾除大分子物質(zhì)；隨后采用混合床離子交換柱分離海藻糖和葡萄糖，在收集液不含葡萄糖的情況下海藻糖收率達(dá)到80％以上。
本發(fā)明的其它有關(guān)技術(shù)措施(1)所述使應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為海藻糖合成態(tài)細(xì)胞的具體方法有物理方法和化學(xué)方法加熱處理法35～43℃振蕩培養(yǎng)1h后，升溫至45～65℃處理1h。4～6h后胞外海藻糖含量達(dá)100％。
甲苯處理法按每克酵母泥加入2～10％甲苯5mL，30～40℃處理1h。3h后胞外海藻糖含量為100％。
(2)所述混合床離子交換柱分離的條件為陰陽(yáng)樹脂用量體積比為2∶0.8～1.6，整個(gè)分離環(huán)境維持在pH中性，溫度30～40℃，流速0.6～1.6mL/min時(shí)，用無離子水作洗脫劑，可實(shí)現(xiàn)海藻糖與葡萄糖完全分離，海藻糖收率達(dá)到80％以上。
實(shí)施例1500mL三角瓶海藻糖合成試驗(yàn) 如

圖1所示1、應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞培養(yǎng)250mL三角瓶中裝有50mL復(fù)合培養(yǎng)基，接種斜面保藏菌種1～2環(huán)，30℃恒溫靜置培養(yǎng)24～36h，作為一級(jí)種子。然后在500mL三角瓶?jī)?nèi)裝入100mL限氮培養(yǎng)基，以5％的接種量接入一級(jí)種子液，30℃，150r/min振蕩培養(yǎng)16～24h。培養(yǎng)后期提高溫度至36～38℃，啟動(dòng)酵母海藻糖合成酶系基因的表達(dá)，再向培養(yǎng)基中添加2.5％的NaCl，刺激酵母海藻糖合成酶系的形成，使酵母中海藻糖積累量增加。培養(yǎng)結(jié)束后，離心并用無菌水洗滌2次后備用。
2、海藻糖的合成稱取應(yīng)激態(tài)酵母泥2g，用4％甲苯10mL，36～38℃振蕩處理1h，酵母轉(zhuǎn)變?yōu)楹Ｔ逄呛铣蓱B(tài)細(xì)胞，解除細(xì)胞壁膜對(duì)海藻糖滲透性的限制。離心、洗滌分離甲苯后將酵母泥轉(zhuǎn)入裝有100mL海藻糖合成培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，46～48℃振蕩反應(yīng)6h，合成胞外海藻糖。在合成過程中，初始葡萄糖糖濃度為2％、pH5.0，當(dāng)葡萄糖濃度下降至0.5％以下時(shí)，再補(bǔ)加一定的糖，使糖濃度維持在1.0％左右。在此條件下反應(yīng)液中海藻糖含量可達(dá)7.3g/L。
3、反應(yīng)液預(yù)處理將反應(yīng)液離心除去酵母細(xì)胞，取上清液高溫滅菌，用截留分子量為10000的中空纖維超濾裝置過濾除大分子物質(zhì)。
4、海藻糖的分離與純化層析柱為Φ16×600mm，陰陽(yáng)樹脂用量體積比為2∶1，用蒸餾水洗至中性。樣液上柱體積6mL，用蒸餾水作洗脫劑，流速0.8～1.0mL/min。當(dāng)收集液體積為100mL時(shí)，海藻糖收率為83.29％，此時(shí)葡萄糖尚未流出層析柱；當(dāng)流出液體積為110mL時(shí)，海藻糖收率為84.34％，葡萄糖收率為0.17％。
5、海藻糖樣品制備純化后的海藻糖液在常壓下煮沸濃縮至濃度為40％。在150mL的三角瓶中，加入4mL濃縮海藻糖液、16mL無水乙醇和0.01g海藻糖晶種，置于40℃搖床，在轉(zhuǎn)速150r/mim下結(jié)晶1h后，停止振蕩，養(yǎng)晶20h；將析出的晶體經(jīng)濾紙過濾后，用少量乙醇洗滌。常壓下，60℃干燥15h至恒重，得到海藻糖二水合晶體。用此法制得的海藻糖純度在99％以上，結(jié)晶收率為89％。
實(shí)施例25L自控發(fā)酵罐合成海藻糖 如圖2所示1、應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞流加培養(yǎng)按2％的接種量將酵母泥接入已滅菌的5L自控發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度28℃～30℃，培養(yǎng)過程中用10％Na2CO3調(diào)節(jié)pH，流加糖蜜和營(yíng)養(yǎng)鹽，使整個(gè)過程中培養(yǎng)基內(nèi)可發(fā)酵性糖一直保持在0.1～1％，最終液體體積為3L左右；培養(yǎng)開始時(shí)pH控制在3.8~4.5，10h后逐漸提高，當(dāng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，提高發(fā)酵液pH至5.0~7.0；培養(yǎng)后期加入2.5％的NaCl，提高發(fā)酵液溫度至36～38℃，直至培養(yǎng)結(jié)束。離心得酵母泥并用無菌水洗滌兩次后保藏。此時(shí)，酵母細(xì)胞積累了較多的應(yīng)激酶——海藻糖合成酶系，其胞內(nèi)海藻糖含量為23～25％。
2、胞外海藻糖的合成稱取酵母泥150g加入5L自控發(fā)酵罐中，采用加熱法進(jìn)行細(xì)胞休克處理，先36～38℃培養(yǎng)1h，隨后升溫至50～55℃處理1h，使酵母轉(zhuǎn)變?yōu)楹Ｔ逄呛铣蓱B(tài)細(xì)胞。
在發(fā)酵罐中加入初始葡萄糖濃度為2％、pH5.0的合成培養(yǎng)基，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量使溶氧飽和度為30～40％，在45～48℃反應(yīng)5～7h結(jié)束，反應(yīng)過程中用10％Na2CO3調(diào)節(jié)pH，并可根據(jù)消耗的糖量補(bǔ)加葡萄糖液，最終反應(yīng)液量為3L左右。在此條件下反應(yīng)液中海藻糖含量為14.5g/L，單位細(xì)胞的海藻糖合成量為131.8％。而在酵母提取法中，酵母細(xì)胞的海藻糖含量一般不超過20％。
3、反應(yīng)液預(yù)處理同實(shí)施例1。
4、海藻糖的分離與純化同實(shí)施例1。
5、海藻糖樣品制備同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖的方法，通常它包括菌體培養(yǎng)、海藻糖的合成、海藻糖的提取、分離、純化、濃縮、結(jié)晶、干燥，其特征在于采用兩步發(fā)酵法利用酵母細(xì)胞中的海藻糖合成酶系合成胞外海藻糖，同時(shí)鈍化酵母的海藻糖分解酶活性，并用混合床離子交換系統(tǒng)分離純化海藻糖，其具體方法如下(1)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞培養(yǎng)采用現(xiàn)有技術(shù)的氮饑餓、熱休克、滲透脅迫方法，誘導(dǎo)酵母細(xì)胞產(chǎn)生較多的應(yīng)激酶——海藻糖合成酶系，脅迫生長(zhǎng)型酵母細(xì)胞向應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)變；(2)胞外海藻糖的合成首先采用物理或化學(xué)的方法對(duì)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞進(jìn)行休克處理；然后采用海藻糖合成培養(yǎng)基進(jìn)行胞外海藻糖的合成；搖瓶試驗(yàn)為500mL三角瓶，裝液量60～120mL，轉(zhuǎn)速100～180r/min；發(fā)酵罐試驗(yàn)采用5L自控罐以流加葡萄糖的方式進(jìn)行胞外海藻糖合成，其生產(chǎn)工藝是初始裝液量2.5L，初始糖濃度為1～2％，pH4.0～70，溶氧10％～40％，合成溫度40～48℃；反應(yīng)過程中用10％Na2CO3調(diào)節(jié)pH，并可根據(jù)消耗的糖量補(bǔ)加葡萄糖液，最終反應(yīng)液量為3L，反應(yīng)液海藻糖含量可達(dá)10～16g/L；(3)海藻糖的分離與純化將反應(yīng)液離心除酵母細(xì)胞，取上清液高溫滅菌，用截留分子量為10000的中空纖維超濾裝置過濾除大分子物質(zhì)；隨后采用混合床離子交換柱分離海藻糖和葡萄糖；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖的方法，其特征在于所述的采用化學(xué)的方法對(duì)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞進(jìn)行休克處理即甲苯處理法按每克酵母泥加入2～10％甲苯5mL，30～40℃處理1h。3h后胞外海藻糖含量為100％；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖的方法，其特征在于所述的采用物理的方法對(duì)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞進(jìn)行休克處理即加熱處理法35～43℃振蕩培養(yǎng)1h后，升溫至45～65℃處理1h。4～6h后胞外海藻糖含量達(dá)100％；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖的方法，其特征在于所述的海藻糖合成培養(yǎng)基配方為葡萄糖2～3g、NaCl 2～3g、 MgSO4·7H2O 60～70mg、FeSO4·7H2O 6～8mg、CaCl2·2H2O 8～10mg、CoCl20.4～0.5mg、CuSO4·5H2O 0.8～1.0mg、核黃素0.08～0.10mg、VB60.8～1.0mg、對(duì)氨基苯甲酸0.16～0.20mg、肌醇0.8～1.0mg、煙酰胺0.8～1.0mg，溶于100mL 80～160mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4(pH5.0～7.0)緩沖液中；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖的方法，其特征在于所述的混合床離子交換柱分離的條件為陰陽(yáng)樹脂用量體積比為2∶0.8～1.6，整個(gè)分離環(huán)境維持在pH中性，溫度30～40℃，流速0.6～1.6mL/min時(shí)，用無離子水作洗脫劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以葡萄糖為基質(zhì)兩步發(fā)酵法生產(chǎn)酵母胞外海藻糖的方法，第一步為應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞的培養(yǎng)，采用現(xiàn)有技術(shù)的氮饑餓、熱休克、滲透脅迫等方法，誘導(dǎo)酵母細(xì)胞產(chǎn)生較多的應(yīng)激酶—海藻糖合成酶系；第二步為應(yīng)激代謝產(chǎn)物海藻糖的合成，采用物理或化學(xué)的方法對(duì)應(yīng)激態(tài)酵母細(xì)胞進(jìn)行休克處理，打破酵母細(xì)胞膜對(duì)海藻糖滲透性的限制，利用酵母細(xì)胞中的海藻糖合成酶系大量合成胞外海藻糖。該方法產(chǎn)量高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備投資少、生產(chǎn)成本低，其產(chǎn)品海藻糖對(duì)生物大分子具有良好的非特異性保護(hù)作用，可廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)藥生物制品、食品及化妝品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1458278SQ0312970
公開日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2003年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月12日
發(fā)明者肖冬光, 趙華, 王蘭, 李于, 郭波 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)