專利名稱：高轉(zhuǎn)移傾向的人乳腺癌細(xì)胞系及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌細(xì)胞系，特別是一種高轉(zhuǎn)移傾向的人乳腺癌細(xì)胞系及其建立的方法，屬動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域。
以往在腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型中應(yīng)用裸鼠，該品系的特點(diǎn)是先天性無(wú)胸腺，T細(xì)胞功能明顯喪失，B細(xì)胞功能正常，NK細(xì)胞活力增強(qiáng)，完全無(wú)毛。被廣泛應(yīng)用于人類腫瘤轉(zhuǎn)移因素、腫瘤異植性和腫瘤診斷治療等腫瘤研究領(lǐng)域。
有研究應(yīng)用人腫瘤塊接種動(dòng)物來(lái)模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的自然過(guò)程，但是成功率較低。將培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞接種SCID鼠具有很好的應(yīng)用價(jià)值，具有重復(fù)性好、轉(zhuǎn)移效率高和時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。因此，在本研究中我們應(yīng)用SCID鼠腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，成功的建立了高轉(zhuǎn)移傾向人乳腺癌細(xì)胞系LM-MCF-7。
本發(fā)明的技術(shù)方案是利用SCID鼠人乳腺癌的轉(zhuǎn)移病灶肺組織作為建系瘤源，作為一種新的篩選高轉(zhuǎn)移傾向腫瘤細(xì)胞的方法，采用體外原代培養(yǎng)方式，建成了一株具有高轉(zhuǎn)移傾向的人乳腺癌細(xì)胞系，命名為L(zhǎng)M-MCF-7。本項(xiàng)目為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30270322)的階段性成果。本發(fā)明的有益效果是1、SCID小鼠動(dòng)物模型可以用來(lái)篩選高轉(zhuǎn)移傾向腫瘤細(xì)胞株；
2、獲得的高轉(zhuǎn)移傾向細(xì)胞株可用于篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物；3、通過(guò)與親本細(xì)胞的比較，可應(yīng)用高轉(zhuǎn)移傾向細(xì)胞株用于篩選腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因；4、可用于研究腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)理；5、進(jìn)而制備腫瘤轉(zhuǎn)移的DNA疫苗；6、通過(guò)接種動(dòng)物來(lái)檢測(cè)抗腫瘤轉(zhuǎn)移的疫苗的效果。
圖2.第70代貼壁生長(zhǎng)的LM-MCF-7細(xì)胞(A，×100)，細(xì)胞均呈簇樣生長(zhǎng)，細(xì)胞為典型的上皮樣細(xì)胞，其形狀不規(guī)則，細(xì)胞排列緊密，界限清楚，接觸性抑制喪失。對(duì)照為親本細(xì)胞MCF-7(B，×100)。
圖3.LM-MCF-7細(xì)胞SCID鼠骨髓轉(zhuǎn)移灶(HE×400，箭頭示)。細(xì)胞接種30天以后，骨髓自發(fā)轉(zhuǎn)移率100％(20/20)，提示該細(xì)胞可能以血道轉(zhuǎn)移為主。符合臨床乳腺癌轉(zhuǎn)移特征。
圖4.LM-MCF-7細(xì)胞系染色體。結(jié)果顯示該細(xì)胞染色體核型變異大，為多倍體細(xì)胞，染色體發(fā)生數(shù)目和結(jié)構(gòu)的畸變，染色體分布范圍在59-65條。染色體數(shù)目改變主要表現(xiàn)為染色體單體、三體和多體。符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。
圖5.親本細(xì)胞MCF-7接種SCID鼠后68天，肺組織病理組織觀察，在肺組織中有早期轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的腫瘤組織(箭頭示)。(從該組織中原代培養(yǎng)獲得LM-MCF-7細(xì)胞)。
2)確認(rèn)轉(zhuǎn)移部位將SCID鼠處死，對(duì)各個(gè)組織的病理切片進(jìn)行顯微鏡下觀察，確立其轉(zhuǎn)移灶的部位為肺臟、脾臟、骨髓和淋巴結(jié)等。
3)高轉(zhuǎn)移傾向的人乳腺癌細(xì)胞系的獲得接種MCF-7細(xì)胞68天后，將SCID鼠處死，取出肺臟，進(jìn)行原代培養(yǎng)。采用下列步驟雙抗的Hank’s液漂洗組織塊5分鐘；使用剪刀剪碎組織，去除血液、脂肪、神經(jīng)組織、結(jié)締組織和壞死組織；將肺組織剪切成1mm3左右小塊；將剪切好的小塊用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶，用接種針將其均勻擺置，間隔0.5cm；組織塊放好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，蓋好瓶蓋，放置在37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；放置3小時(shí)，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，向瓶?jī)?nèi)注入10ml RPMI1640培養(yǎng)液(含20％血清)，靜置培養(yǎng)；原代培養(yǎng)每3天換液一次，去除已漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞。
當(dāng)由組織塊中長(zhǎng)出的細(xì)胞能夠長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，具體步驟如下向瓶中加入1-2ml消化液(胰酶和EDTA)，室溫3分鐘后，觀察到細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，吸除消化液，加入PBS將培養(yǎng)瓶殘留的消化液洗掉；用吸管吸去瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，分別接種新的培養(yǎng)瓶。當(dāng)細(xì)胞傳代到第三代，將原代培養(yǎng)時(shí)用的20％胎牛血清降為10％，細(xì)胞仍然生長(zhǎng)良好，形態(tài)變得更加均一。
在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于肺組織的原代培養(yǎng)傳代的細(xì)胞呈現(xiàn)上皮樣，細(xì)胞形態(tài)均一，無(wú)接觸抑制，并且生長(zhǎng)十分迅速，大約兩天能夠長(zhǎng)滿瓶底，需要進(jìn)行傳代。該細(xì)胞系在本實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)行了100代以上的培養(yǎng)。將該細(xì)胞命名為L(zhǎng)M-MCF-7。
4)LM-MCF-7細(xì)胞體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)當(dāng)LM-MCF-7細(xì)胞體外培養(yǎng)20代后，將瘤細(xì)胞再回注到SCID鼠皮下，方法同前。結(jié)果顯示，成瘤率達(dá)到100％，并且在SCID鼠的肺臟、腎臟、脾臟、骨髓、淋巴結(jié)和心臟等臟器出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移。本發(fā)明——LM-MCF-7細(xì)胞的檢測(cè)鑒定結(jié)果本發(fā)明采用含有小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)LM-MCF-7細(xì)胞，使其能體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)和穩(wěn)定傳代。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察與驗(yàn)證，體外生長(zhǎng)的LM-MCF-7具有典型的上皮樣形態(tài)，接觸生長(zhǎng)抑制喪失。遺傳學(xué)研究證實(shí)該細(xì)胞為異倍體，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴(yán)重，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。該細(xì)胞SCID鼠接種成瘤率為100％，并在肺、腎、脾和心臟等臟器發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移。經(jīng)檢測(cè)，LM-MCF-7細(xì)胞系仍保留瘤組織原有的生物學(xué)特性，它的建立可為乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的基礎(chǔ)研究和臨床的干預(yù)研究提供理性的模型。
a.LM-MCF-7細(xì)胞表型的鑒定呈現(xiàn)上皮樣，細(xì)胞形態(tài)均一，無(wú)接觸抑制。
b.形態(tài)學(xué)觀察親本細(xì)胞MCF-7接種SCID鼠后，與來(lái)源于親本細(xì)胞MCF-7的高轉(zhuǎn)移傾向細(xì)胞LM-MCF-7接種SCID鼠后的成瘤組織相比，在結(jié)構(gòu)上二者相似，符合乳腺癌的病理學(xué)特征。
c.染色體的鑒定制備染色體，觀察結(jié)果顯示染色體為人染色體，呈多倍體。
d.細(xì)胞來(lái)源的鑒定應(yīng)用乳腺癌相關(guān)抗原(CA15-3 Breast Antigen)的抗體進(jìn)行免疫組化染色，呈陽(yáng)性反應(yīng)。表明為人乳腺癌細(xì)胞。
e.細(xì)胞周期的鑒定應(yīng)用流式細(xì)胞儀獲得細(xì)胞周期倍增時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種高轉(zhuǎn)移傾向人乳腺癌細(xì)胞系(LM-MCF-7)，具有生物學(xué)、遺傳學(xué)和病理學(xué)特征，還具備特殊轉(zhuǎn)移表型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高轉(zhuǎn)移傾向人乳腺癌細(xì)胞系(LM-MCF-7)，其生物學(xué)特征是1)能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)和穩(wěn)定傳代2)典型的上皮樣形態(tài)，接觸性生長(zhǎng)抑制喪失3)可無(wú)限繼代培養(yǎng)
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高轉(zhuǎn)移傾向人乳腺癌細(xì)胞系(LM-MCF-7)，其遺傳學(xué)特征是1)染色體結(jié)構(gòu)畸變，分布范圍在50～70條2)細(xì)胞為異(多)倍體(單體、三體和多體)
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高轉(zhuǎn)移傾向人乳腺癌細(xì)胞系(LM-MCF-7)，其病理學(xué)特征是SCID小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移部位腫瘤細(xì)胞與皮下腫瘤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高轉(zhuǎn)移傾向人乳腺癌細(xì)胞系(LM-MCF-7)，其特殊轉(zhuǎn)移表型病理學(xué)特征是SCID小鼠接種成瘤率和皮下接種的轉(zhuǎn)移率為100％，接種部位和方式無(wú)限制。
6.一種高轉(zhuǎn)移傾向人乳腺癌細(xì)胞系(LM-MCF-7)的建立方法，其特征在于通過(guò)下述方法(實(shí)驗(yàn))建立1)接種SCID鼠取乳腺癌親本MCF-7細(xì)胞懸液(5×107/0.2ml)皮下接種于SCID小鼠肩部，SCID小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液學(xué)研究所提供；2)確認(rèn)轉(zhuǎn)移部位將SCID鼠處死，對(duì)各個(gè)組織的病理切片進(jìn)行顯微鏡下觀察，確立其轉(zhuǎn)移灶的部位為肺臟、脾臟、骨髓和淋巴結(jié)等；3)高轉(zhuǎn)移傾向的人乳腺癌細(xì)胞系的獲得接種MCF-7細(xì)胞68天后，將SCID鼠處死，取出肺臟，進(jìn)行原代培養(yǎng)，采用下列步驟用加有雙抗的Hank’s液漂洗組織塊5分鐘；使用剪刀剪碎組織，去除血液、脂肪、神經(jīng)組織、結(jié)締組織和壞死組織；將肺組織剪切成1mm3左右小塊；將剪切好的小塊用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶，用接種針將其均勻擺置，間隔0.5cm；組織塊放好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，蓋好瓶蓋，放置在37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；放置3小時(shí)，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，向瓶?jī)?nèi)注入10ml RPMI1640培養(yǎng)液(含20％血清)，靜置培養(yǎng)；原代培養(yǎng)每3天換液一次，去除已漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞；當(dāng)由組織塊中長(zhǎng)出的細(xì)胞能夠長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，具體步驟如下向瓶中加入1-2ml消化液(胰酶和EDTA)，室溫3分鐘后，觀察到細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，吸除消化液，加入PBS將培養(yǎng)瓶殘留的消化液洗掉；用吸管吸去瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，分別接種新的培養(yǎng)瓶。當(dāng)細(xì)胞傳代到第三代，將原代培養(yǎng)時(shí)用的20％胎牛血清降為10％；4)LM-MCF-7細(xì)胞體內(nèi)成瘤當(dāng)LM-MCF-7細(xì)胞體外培養(yǎng)20代后，將瘤細(xì)胞再回注到SCID鼠皮下，方法同前；成瘤率達(dá)到100％，并且在SCID鼠的肺臟、腎臟、脾臟、骨髓、淋巴結(jié)和心臟等臟器出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌細(xì)胞系，特別是一種高轉(zhuǎn)移傾向的人乳腺癌細(xì)胞系及其建立的方法，屬動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域。有關(guān)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚不十分清楚。需要建立腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型對(duì)其進(jìn)行深入的研究。以往在腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型中應(yīng)用裸鼠，在本發(fā)明中，我們采用SCID小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，取乳腺癌親本MCF－7細(xì)胞懸液(5×10
文檔編號(hào)C12N5/00GK1473930SQ0313026
公開日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2003年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月27日
發(fā)明者葉麗虹, 張曉東, 朱惠芳, 吳蓮英, 鞠永健 申請(qǐng)人:南開大學(xué)