專利名稱：一種蛇毒凝血酶及其生產(chǎn)方法與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種凝血酶及其生產(chǎn)方法與應用，特別是涉及一種蛇毒凝血酶及其生產(chǎn)方法與應用。
背景技術(shù)：
凝血酶以纖維蛋白I為作用底物，迅速轉(zhuǎn)入血管受傷部成為纖維蛋白凝塊，阻止血液自受傷部位流出。凝血過程大致分為三個階段，即凝血因子X的激活；凝血酶原的激活；纖維蛋白原變成纖維蛋白。能使纖維蛋白原變成纖維蛋白的作用稱為類凝血酶樣作用；能通過激活凝血因子X及凝血酶原而發(fā)揮作用的，稱為類凝血激酶樣作用。蛇毒中含有豐富的蛋白酶，其中一類絲氨酸蛋白酶與蛇傷造成的血液凝固失調(diào)等毒理作用密切相關(guān)，屬于凝血酶類。很多凝血酶樣酶(促纖維蛋白原凝固酶)已經(jīng)從各種蛇毒中提純，并已先后用于制備臨床用藥。
1767年，F(xiàn)ontana首次敘述了蛇毒的凝血作用，此后二百多年來，有關(guān)蛇毒應用于血液系統(tǒng)的研究不斷取得成績。
1967年從馬來亞紅口蝮(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒中分離的凝血酶樣酶(促纖維蛋白原凝固酶)具有脫纖維蛋白的作用，可用于臨床，已命名為Ancrod或Arvin，是一種單鏈的糖肽，含碳水化合物25-36％，由17個氨基酸組成，等電點6.5，分子量35400D±1400D(Ewart，M.R.，Biochem J.1970，118，603；Collins，J.P.etal.Eur.JBiochem，26，510)。人體靜脈或皮下注射Ancrod，血漿纖維蛋白原水平會依據(jù)劑量而減少，因此這種酶制劑Ancrod可用于防治血管栓塞性疾病，又由于它的作用靶位是纖維蛋白原的Aa鏈，還可用于研究纖維蛋白原到纖維蛋白的轉(zhuǎn)換。
Ouyang(Ouyang，C.，(1957)J.Formosan Med.Assoc，56，435)將從尖吻蝮(Akistrodon acutus)蛇毒中分離的凝血酶樣酶稱為Acutin，分子量24000，等電點酸性，它作用于纖維蛋白原的a鏈，分解出纖維蛋白肽A。它還進一步降解已形成的纖維蛋白的a鏈。Acutin引起纖維蛋白原凝結(jié)，形成對血漿溶解高度敏感的結(jié)塊。Komori等(1988)從尖吻蝮蛇毒中分離出4種具有不同化學和免疫學特性的凝血酶樣酶，都能從血纖維蛋白原中分解出纖維蛋白肽A，但其中僅有一種酶像凝血酶一樣，能激活凝血因子XII。
昆明動物研究所將從尖吻蝮蛇蛇毒分離出的Acutin稱為“去纖酶”應用于臨床治療腦血栓、心臟血栓、眼底靜脈血栓及脈管炎，療效顯著。
蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒中所含的凝血酶樣酶，像銅頭蝮的A.contortrix毒一樣，能選擇性地從纖維蛋白原分解出纖維蛋白肽B，是一種單鏈的糖蛋白，分子量43000D(Ouyang，C.，etal.，(1983)Toxicon，21，797)。該酶的酶活能可被DFP(二異丙基磷酰氟)和PMSF(苯甲基磺酰氟)所抑制，具精氨酸酯酶特性，它分解苯甲酰精氨酸乙酯比胰蛋白酶快2.5倍，分解TAME(對甲苯磺酰精氨酸甲酯)則比胰蛋白酶慢50倍。蝮蛇蛇毒中分離的酶凝結(jié)纖維蛋白原很慢，釋放血纖肽的動力學分析表明血纖肽Bβ鏈分裂出來較快，而釋放導致凝塊形成的血纖肽則較慢，它不像銅頭蝮那樣由溫度取決酶活力大小。我國用于提取抗凝酶的毒蛇已有尖吻蝮、蝮蛇(蛇島、浙江)。
從南美洲銅頭蝮(Agkistrodon contortrix)蛇毒中分離的酶稱為“Venzyme”，能從血纖維蛋白原中迅速地分解出血纖肽B，而較慢地釋放血纖肽A。Venzyme分子量為64000D，不穩(wěn)定，在pH 3時空氣中暴露2小時，酶活力喪失；pH 10下放置2小時，活性損失60％，pH7時60℃加熱30分鐘，活力喪失95％(Shimizu，A.，et.al.，(1987)Toxicon，21，679)。由于Venzyme作用于纖維蛋白原的Bβ鏈，這種獨特性可用于研究那些作用于Aa-鏈的凝血酶(如紅口蝮、矛頭蝮和響尾蛇的“Anrod”、“batroxobin”、“Crotalase”)形成和凝血酶交叉組合的理化特性。
從蝮蛇日本亞種(Agkistrodon haly brevicaudus)蛇毒中分離的凝血酶(纖凝精氨酸蛋白酶)是分子量為39000D的糖肽，由323個氨基酸殘基構(gòu)成，分子中谷氨酸和天冬氨酸含量較高。
從東部菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)蛇毒中分離的凝血酶樣酶稱為響尾蛇酶Crotalase，分子量為32700D，碳水化合物含巖藻糖、甘露糖、半乳糖和葡萄胺，占響尾蛇酶Crotalase干重的5.4％。Crotalase在中性或微堿的磷酸緩沖液中較為穩(wěn)定，但如在pH5以下的酸性條件，酯酶活性能很快失活(Markland，F(xiàn).S.，etal.，(1971)J.Biol.Chem.，246，6460)。Crotalase僅從纖維蛋白原分子中分解出血纖肽A，如延長培養(yǎng)將導致纖維蛋白鏈的降解。Crotalase也用于脫纖維蛋白原療法。
世界衛(wèi)生組織將從矛頭蝮(Bother atrox)蛇毒中分離純化的凝血酶樣酶命名為“Batroxobin”，它有很多重要的用途，如用于止血稱作“Retilase”(蛇酶)或用于脫纖維蛋白原療法稱作Defibrase”(脫纖酶)，用做診斷的工具稱作“Reptilase-Reagent”(蛇酶試劑)。自矛頭蝮(B.atrox)蛇毒中分離的“Batroxobin”，分子量為43000D；自Bother.moojeni蛇毒中分離的“Batroxobin”，分子量為36000D，由6條二硫鏈相接，含碳水化合物27％；由己糖、葡糖胺、唾液酸構(gòu)成的“Batroxobin”是單鏈的糖肽，等電點6-7。在20℃、pH2.5-9的范圍內(nèi)，在水溶液中仍能保持穩(wěn)定幾小時；在甘油溶液中100℃加熱1小時，活性仍無明顯損失，表明能從矛頭蝮B.atrox或B.moojeni蛇毒中大批量生產(chǎn)Batroxobin(Hofmann，H.，etal.，(1987)Biochemistry，26，780)。止血藥Batroxobin是一種局部止血劑，用于流血部位的纖凝作用不為血漿凝血酶抑制劑或任何抗凝介質(zhì)所抑制。
從B.atrox或是B.moojeni中來的Batroxobin(矛頭蝮纖凝酶)像凝血酶樣酶ancrid一樣，分解纖維蛋白原Aa鏈上16精氨酸-17甘氨酸酯鏈，引起血纖肽A釋放形成纖維蛋白單體。
國外學者研究表明，Reptilase由兩種有效成分組成，具有類凝血酶和類凝血激酶樣作用。在正常血管內(nèi)，Reptilase只發(fā)揮類凝血酶樣作用，不發(fā)揮類凝血激酶樣作用，而在血管破損時，Reptilase同時發(fā)揮類凝血酶樣作用和類凝血激酶樣作用。蛇酶Retilase(Pentaphar公司的注冊商標CH4002巴塞爾)為含凝血酶homecoagulaes的止血藥，血液凝固系統(tǒng)來自B.atrox的毒液。Batroxobin又叫蛇酶，作為引起纖維蛋白I單體形成的媒介，小劑量注射在較長時間可使血液更易凝結(jié)。
目前較知名的同類品種為立止血(Reptilase、Hemocoagulase)，它是由瑞士素高大藥廠制造的一種用于治療和預防有出血癥狀疾病的酶性止血劑，是從巴西洞蝮蛇的毒液中提純制得的無菌凍干制劑。中國每年進口數(shù)百萬支“立止血”，價格達3-4億人民幣以上。
白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(pallas)]產(chǎn)于中國的長白山，資源豐富，開發(fā)價值很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有顯著止血效果的蛇毒凝血酶及其生產(chǎn)方法。
一種蛇毒凝血酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提取；該凝血酶的SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳呈三條帶，三條帶的分子量分別為54000D，34000D及15000D。
所述凝血酶具有類凝血酶樣活性及類凝血激酶樣活性。它的SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳的三條帶，按照分子量從大到小各帶所占比例分別為7-12％，76-86％及7-12％(重量)。該凝血酶對于牛纖維蛋白原的初凝時間為60-120秒；所述凝血酶對于標準人血漿的初凝時間為40-80秒。
一種生產(chǎn)蛇毒凝血酶的方法，包括如下步驟(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用緩沖液溶解，離心沉淀，酚飽和溶液洗脫，得到蛇毒凝血酶I級酶制品；(2)將所得的蛇毒凝血酶I級酶制品用緩沖液溶解，再經(jīng)離子交換柱層析，用緩沖液洗脫，得精制蛇毒酶液。
所述用酚飽和溶液洗脫進行2次為益；所述溶解I級酶制品所用的溶劑是0.05mol/L Tris-HCl緩沖液；I級酶制品所用的離子交換劑為DEAE-Sephadex A-50；離子交換柱層析后用Tris-HCl緩沖液NaCl直線梯度洗脫。
為了得到更加純化的蛇毒凝血酶，可以對上述獲得的精制蛇毒酶液再進行如下加工將所述精制蛇毒酶液凍干，得到精制蛇毒酶液的凍干品；將精制蛇毒酶液的凍干品經(jīng)脫鹽得到蛇毒凝血酶II級酶制品溶液。
精制蛇毒酶液凍干品脫鹽所用層析柱為G-75柱；所述全部提取過程在10±2℃的GMP環(huán)境中進行。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種有效的凝血藥物及其生產(chǎn)方法。
一種凝血藥，它的活性成分是蛇毒凝血酶，該凝血酶自白眉蝮蛇蛇毒中提取；它的SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳呈三條帶，三條帶的分子量分別為54000D，34000D及15000D。
一種生產(chǎn)凝血藥的方法，是將白眉蛇毒凝血酶II級酶制品溶液及其佐劑進行過濾、分裝、冷凍、干燥灌封得到的；所述佐劑為甘露醇、水解明膠及注射用水，各種成分的重量(體積)份數(shù)比為25％甘露醇125(體積)水解明膠0.5(重量)注射用水350(體積)凝血酶II級酶制品溶液25(體積)。
實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的凝血藥在0.7U/mg體重的劑量下即有顯著的止血作用。研究表明，白眉蛇毒凝血酶能明顯縮短家兔出血時間及凝血時間，呈正量效關(guān)系，且作用強于立止血。
本發(fā)明的凝血酶從中國特產(chǎn)的長白山白眉蝮蛇蛇毒中分離純化，原料資源豐富，可以為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的保障，實現(xiàn)凝血藥物的國產(chǎn)化。
本發(fā)明的凝血藥物毒性極弱，經(jīng)毒理試驗給小白鼠注射本發(fā)明凝血酶的劑量為250Ku/Kg.B.W，相當于臨床成人用量的2500倍，表明該藥的LD50大于250Ku/Kg.B.W，臨床使用安全，具有廣泛的應用前景。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
具體實施例方式
實施例1、本發(fā)明白眉蛇毒凝血酶及凝血酶藥物制劑的生產(chǎn)取白眉蛇毒晶體20g溶于1000ml 0.9％NaCl注射液中，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄去沉淀。調(diào)整上清液pH至6.5，然后用0.9％NaCl注射液定容至1000ml。向此溶液中加入飽和硫酸銨溶液670毫升，混合物在室溫條件下放置1小時，然后3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄沉淀。向上清中加入飽和硫酸銨溶液552毫升，室溫放置1小時，混合物3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清沉淀溶解在1000ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至5.0。向此溶液中加入90％苯酚7.7毫升，混合物在室溫條件下放置15小時，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清，留沉淀。沉淀用酚飽和溶液洗兩次，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清，留沉淀，得到蛇毒凝血酶I級酶制品。
沉淀移入含乙酸的95％乙醇中，然后在玻璃負壓過濾器中過濾，過濾物用0.05mol/LTris-HCl緩沖液溶解，上DEAE-Sephadex A-50的層析柱，用0.05mol/L Tris-HCl緩沖液NaCl洗脫，流速為0.8-1.0ml/min，然后，用含有NaCl的0.05mol/L Tris-HCl進行直線梯度洗脫，得到精制蛇毒酶液180毫升。
用標準人血漿進行檢測，收集能使標準人血漿凝固的部分，比活性100Ku/mg，將收集的精制酶液用凍干機凍干，得凍干粉58mg，取凍干品用水溶解，上G-75柱用0.05mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，得到蛇毒凝血酶II級酶制品溶液250毫升。
上述全部提取過程均在10±2℃的GMP環(huán)境中進行。
用標準人血漿進行檢測，收集能使標準人血漿凝固的部分，比活性150Ku/mg，經(jīng)SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳測定呈三條帶，分子量分別為54000，34000，及15000，各帶所占比例分別為7-12％，76-86％及7-12％(重量)。得到的凝血酶對于牛纖維蛋白原的初凝時間為60秒；所述凝血酶對于標準人血漿的初凝時間為40秒。
經(jīng)配方[甘露醇125ml(25％)、水解明膠0.5g、注射用水350ml、凝血酶25ml]超濾、分裝、凍干、灌封得注射用白眉蛇毒凝血酶成品1000支，1Ku/支。
實施例2、本發(fā)明白眉蛇毒凝血酶類凝血酶樣活性測定本發(fā)明白眉蛇毒凝血酶具有類凝血酶樣作用及類凝血激酶樣作用，通過加入EDTA抑制其類凝血激酶樣作用，來觀察白眉蛇毒凝血酶對人纖維蛋白原的類凝血酶樣作用。
向試管中加入本發(fā)明的白眉蛇毒凝血酶樣品1ml(每支樣品用1ml 5×10-3mol/LEDTA溶解)，分成4組，I、II、III分別為白眉蛇毒凝血酶高、中、低劑量組，劑量分別為2Ku/ml、1Ku/ml、0.5Ku/ml，IV組為空白組(加生理鹽水1ml)，各管作用5小時后37℃水浴5分鐘，然后向各管加入0.1％人纖維蛋白原1ml，觀察并記錄人纖維蛋白原凝固時間。結(jié)果如表1所示，表1、人纖維蛋白原凝固時間測定結(jié)果分組管數(shù)(支)樣品劑量(Ku/ml)人纖維蛋白原凝固時間 (s)I152 50±6II 151 80±9 a.b
III 15- 0.5 140±16IV151ml生理鹽水 -aP＜0.01(同I組比較) bP＜0.01(同III組比較)從表1可以看出，在EDTA存在的情況下，本發(fā)明的白眉蛇毒凝血酶能使人纖維蛋白原凝固，表現(xiàn)為類凝血酶樣作用，同時，白眉蛇毒凝血酶使人纖維蛋白原凝固，呈正量效關(guān)系。
實施例3、本發(fā)明白眉蛇毒凝血酶的類凝血激酶樣活性測定本發(fā)明白眉蛇毒凝血酶具有類凝血酶樣作用及類凝血激酶樣作用，通過加入DFP(二異丙基氟磷酸)抑制其類凝血酶樣作用，來觀察白眉蛇毒凝血酶的類凝血激酶樣作用。
向試管中加入本發(fā)明的白眉蛇毒凝血酶樣品1ml(每支樣品用2×10-3mol/L DFP溶液溶解)，分成4組，I、II、III組分別為白眉蛇毒凝血酶高、中、低劑量組，劑量分別為2Ku/ml、1Ku/ml、0.5Ku/ml，IV組為空白對照組(加生理鹽水)，各管作用5小時后37℃水浴5分鐘，然后向各管加入缺凝血因子X的標準血漿(6)1ml或標準人血漿(7)1ml，觀察并記錄血漿凝固時間。結(jié)果如表2、表3所示表2、加入缺X因子血漿后的凝固情況分組試管數(shù)(支) 樣品劑量(Ku/ml)加入缺X因子血漿后凝固情況I 102-II 101-III100.5 -IV 101ml生理鹽水 -表3、加入標準人血漿后的凝固情況及凝固時間結(jié)果分組試管數(shù)(支) 樣品劑量(Ku/ml) 加入標準人血漿后凝固時間(s)I 102 150±16II 101 260±30a.b.c.
III100.5370±41IV 101ml生理鹽水-aP＜0.01(同I組比較)bP＜0.01(同III組比)從表中的結(jié)果可以看出，在DFP存在的條件下，白眉蛇毒凝血酶不能使缺X因子的標準血漿凝固，但能使標準人血漿凝固，表現(xiàn)為類凝血激酶樣作用，呈正量效關(guān)系，證明白眉蛇毒凝血酶的類凝血激酶樣作用是通過激活X因子而發(fā)揮作用的。
實施例4、本發(fā)明白眉蛇毒凝血酶對家兔全血的促凝作用與立止血比較蛇毒血凝酶具有類凝血酶樣作用及類凝血激酶樣作用。家兔給藥后，通過觀察出血時間及凝血時間，來觀察白眉蛇毒凝血酶的促凝作用。
實驗動物日本大耳白家兔，體重2-3公斤，雌雄各半。
取家兔50只，分成5組，每組10只，I、II、III組分別為白眉蛇毒凝血酶高、中、低劑量組，劑量分別為4Ku/Kg.BW、2Ku/Kg.BW、1Ku/Kg.BW，IV組為空白對照組，注射2ml/Kg.BW生理鹽水，V組為立止血組，劑量為2Ku/Kg.BW。各組靜脈注射15分鐘后，測定家兔出血時間和凝血時間(出血時間測定采用DuKe氏法--實用醫(yī)學檢驗學P116；凝血時間測定采用玻片法--實用醫(yī)學檢驗學P129)。結(jié)果如表4所示表4 家兔出血時間及凝血時間測定結(jié)果分組 例數(shù)(只)給藥劑量(Ku/Kg.BW)出血時間(s)凝血時間(s)I104 23±4d 75±8dII 102 38±5abc 100±11abcIII 101 51±5d 125±12dIV 102ml 74±8 180±20V102 42±4 108±10aP＜0.01(同I組比較)bP＜0.01(同III組比較)cP＜0.01(同IV組比較)從表4的數(shù)據(jù)可以看出，實驗組家兔出血時間及凝血時間明顯短于對照組，并呈明顯劑量依賴關(guān)系。表明，本發(fā)明的白眉蛇毒凝血酶能明顯縮短家兔出血時間及凝血時間，且作用強于立止血。
權(quán)利要求
1.一種蛇毒凝血酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提??；該凝血酶的SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳呈三條帶，三條帶的分子量分別為54000D，34000D及15000D。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血酶，其特征在于所述凝血酶具有類凝血酶樣活性及類凝血激酶樣活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的凝血酶，其特征在于所述凝血酶的SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳的三條帶，按照分子量從大到小各帶所占比例分別為7-12％，76-86％及7-12％(重量)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的凝血酶，其特征在于所述凝血酶對于牛纖維蛋白原的初凝時間為60-120秒；所述凝血酶對于標準人血漿的初凝時間為40-80秒。
5.一種生產(chǎn)蛇毒凝血酶的方法，包括如下步驟(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用緩沖液溶解，離心沉淀，酚飽和溶液洗脫，得到蛇毒凝血酶I級酶制品；(2)將所得的蛇毒凝血酶I級酶制品用緩沖液溶解，再經(jīng)離子交換柱層析，用緩沖液洗脫，得精制蛇毒酶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述用酚飽和溶液洗脫進行2次；所述溶解I級酶制品所用的溶劑是0.05mol/L Tris-HCl緩沖液；I級酶制品所用的離子交換劑為DEAE-Sephadex A-50；離子交換柱層析后用Tris-HCl緩沖液NaCl直線梯度洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于將所述精制蛇毒酶液凍干，得到精制蛇毒酶液的凍干品；將精制蛇毒酶液的凍干品經(jīng)脫鹽得到蛇毒凝血酶II級酶制品溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于精制蛇毒酶液凍干品脫鹽所用層析柱為G-75柱；所述全部提取過程在10±2℃的GMP環(huán)境中進行。
9.一種凝血藥，它的活性成分是蛇毒凝血酶，該凝血酶自白眉蝮蛇蛇毒中提?。凰腟DS-聚丙稀酰胺凝膠電泳呈三條帶，三條帶的分子量分別為54000D，34000D及15000D。
10.一種生產(chǎn)凝血藥的方法，是將白眉蛇毒凝血酶II級酶制品溶液及其佐劑進行過濾、分裝、冷凍、干燥灌封得到的；所述佐劑為甘露醇、水解明膠及注射用水，各種成分的重量(體積)份數(shù)比為25％甘露醇125(體積)水解明膠0.5(重量)注射用水350(體積)凝血酶II級酶制品溶液25(體積)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛇毒凝血酶及其生產(chǎn)方法與應用。本發(fā)明所提供的蛇毒凝血酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提??；該凝血酶的SDS－聚丙稀酰胺凝膠電泳呈三條帶，三條帶的分子量分別為54000D，34000D及15000D。本發(fā)明生產(chǎn)蛇毒凝血酶的方法，包括如下步驟(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用緩沖液溶解，離心沉淀，酚飽和溶液洗脫，得到蛇毒凝血酶I級酶制品；(2)將所得的蛇毒凝血酶I級酶制品用緩沖液溶解，再經(jīng)離子交換柱層析，用緩沖液洗脫，得精制蛇毒酶液。本發(fā)明的凝血藥物毒性極弱，臨床使用安全，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N9/74GK1548534SQ03131420
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月13日
發(fā)明者于洪儒 申請人:錦州泰康生物工程有限責任公司