專利名稱：表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建可以表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB基因和/或新城疫病毒F基因、傳染性支氣管炎病毒S1基因的重組雞痘病毒作為疫苗，用于預(yù)防以上禽病。
背景技術(shù)：
雞傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起的雞的一種急性接觸性呼吸道傳染病。該病以呼吸困難、喘氣、咳出血樣分泌物、受侵害的氣管粘膜細(xì)胞腫脹和水腫、出血并導(dǎo)致糜爛為特征，該病在急性暴發(fā)時(shí)發(fā)病率為100％，死亡率可高達(dá)70％，平均死亡率一般為10％-40％，導(dǎo)致雞死亡和產(chǎn)蛋量下降，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。該病在世界范圍內(nèi)均有流行，我國(guó)在二十世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)本病，1988-1990年曾在許多省份流行，1992年以后在我國(guó)一些地區(qū)又呈地方性流行。
1925年，美國(guó)的May首先報(bào)道在美國(guó)洛島發(fā)現(xiàn)本病，當(dāng)時(shí)稱為“喉頭-氣管炎”。該病曾以不同的名稱命名，如“傳染性支氣管炎”、“禽白喉”等。“喉氣管炎”這一術(shù)語(yǔ)早在1930年就被使用，1931年，雞傳染性喉氣管炎這一病名被美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)禽病專門委員會(huì)所采納。Beaudette首次證明喉氣管炎的病原是一種濾過性病原，即雞傳染性喉氣管炎病毒，它屬于α-皰疹病毒亞科，又稱其為禽皰疹病毒I型。
雞傳染性喉氣管炎是第一個(gè)被有效疫苗控制的禽病毒性疾病。起初，人們用強(qiáng)毒通過泄殖腔接種來使敏感雞獲得免疫，但是免疫雞還能排毒，而成為傳染源。目前國(guó)內(nèi)外主要采用弱毒疫苗來防制本病，盡管該弱毒疫苗具有良好的免疫效力，也比強(qiáng)毒疫苗安全，但尚存在以下幾方面的不足(1)現(xiàn)用的ILTV弱毒疫苗的毒力普遍偏強(qiáng)，接種后反應(yīng)大。因?yàn)樗拿庖咴耘c其毒力呈正相關(guān)，如果毒力通過體外傳代進(jìn)一步降低，那么其免疫效力也隨之下降。(2)與ILTV強(qiáng)毒株一樣ILTV弱毒疫苗也能導(dǎo)致潛伏感染，并且ILTV弱毒疫苗株在雞群的傳播過程中，可引起毒力返強(qiáng)，當(dāng)它與非免疫雞群接觸時(shí)成為潛在的傳染源，所以該弱毒疫苗僅限于本病流行地區(qū)使用，但非免疫雞群一旦傳入本病將導(dǎo)致重大損失。(3)ILTV強(qiáng)弱毒尚無(wú)鑒別診斷方法。由于現(xiàn)用ILTV弱毒疫苗存在的問題，使ILT的完全控制仍然是養(yǎng)禽業(yè)的一大難題。傳統(tǒng)的方法已經(jīng)不能解決現(xiàn)有雞傳染性喉氣管炎弱毒疫苗存在的問題，所以需要開發(fā)研制一種具有與ILT弱毒疫苗同等免疫效力又能克服弱毒疫苗上述不足的新型安全有效的ILT疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種將ILTV的主要免疫原糖蛋白gB基因，新城疫病毒F基因，傳染性支氣管炎病毒S1基因等分別插入FPV轉(zhuǎn)移載體中，然后再用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FPV感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，以獲得抗兩種或多種禽病毒病的重組雞痘病毒活載體疫苗。
上述的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，是一種抗傳染性喉氣管炎和其它禽病毒病的重組雞痘病毒活載體疫苗，將雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和/或其它禽病毒主要保護(hù)性抗原基因插入雞痘病毒弱毒基因組中構(gòu)建重組雞痘病毒活載體疫苗。
上述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，含有傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因全部編碼框(ORF)，該ORF含有2619個(gè)堿基，編碼873個(gè)氨基酸；上述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，插入的傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因的上游有雞痘病毒早晚期啟動(dòng)子(LP2EP2)。
上述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，含有傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因；上述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，插入的傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因的上游分別連有雞痘病毒早晚期啟動(dòng)子(LP2EP2)；上述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，含有傳染性支氣管炎病毒S1基因病上述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，插入的傳染性支氣管炎病毒S1基因的上游連有雞痘病毒早晚期啟動(dòng)子(LP2EP2)；上述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，將傳染性喉氣管炎病毒gB基因和/或其它禽病毒主要保護(hù)性抗原基因插入到雞痘病毒基因組一1.7Kb的EcoRI片段中。
一種表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒在預(yù)防雞痘及本發(fā)明的效果是1、新生成的重組雞痘病毒的鑒定為了分離雞痘病毒的DNA，用0.1PFU/Cell的劑量感染單層雞胚成纖維細(xì)胞，放在37℃溫箱中培養(yǎng)4-6天，待CPE達(dá)到100％時(shí)，刮細(xì)胞到培養(yǎng)基中，3000g離心5分鐘收集100％病變的雞痘病毒感染的雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物，棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于1.0ml的PBS中，反復(fù)凍融二次，在最后一次融化后用超聲波打兩次，30秒中間間隔45秒的冰浴冷卻，然后3000g離心5分鐘，將上清在15000g離心20分鐘后，沉淀重懸于10mmol/L Tris(pH7.5)，此即為粗提的雞痘病毒。在上述粗提的病毒中加入10％SDS至終濃度0.4％，蛋白酶K至終濃度140μg/ml，37℃消化3-4小時(shí)，分別用等體積的飽和酚，等體積的飽和酚/氯仿各抽提一次，于水相中加入2倍體積的100％冷乙醇和1/10體積的3mol/LNaAc(pH4.8)，混勻，-20℃冰箱過夜，12000g離心4℃離心20分鐘，棄上清，用70％冷乙醇洗滌沉淀，真空干燥，沉淀用滅菌的TE(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA)置于-20℃冰箱中備用。參照前面的PCR步驟，可以檢測(cè)到2.7kb的目的片段。
2.發(fā)明的外源基因(gB)表達(dá)的檢測(cè)將重組FPV(rFPV)和S-FPV-017感染CEF細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)100％病變后，倒掉培養(yǎng)液，用PBS(pH7.4)洗細(xì)胞二次。加入適量的加熱到85℃的2×SDS凝膠電泳加樣緩沖液裂解細(xì)胞，用細(xì)胞刮棒把粘稠狀的細(xì)胞裂解物收集于一個(gè)微量離心管中，將樣品置于沸水中加熱10分鐘，即為被檢樣品。分別配制10％分離膠，5％的濃縮膠，按分子克隆上所述方法進(jìn)行灌制。待其聚合后，用微量加樣器加樣，同時(shí)加蛋白分子量作為對(duì)照，在BIO-RAD垂直電泳槽上180V電泳，待染料移至底部時(shí)停止電泳，將蛋白分子量切下用0.25％考馬斯亮藍(lán)中(0.25％R250，40％甲醇，10％冰乙醇)染色2小時(shí)，用脫色液(40％甲醇，10％乙酸)脫色，余下的凝膠置于轉(zhuǎn)印裝置，用于Western blot印跡。
將6張Whatman濾紙、NC膜剪成與凝膠同樣大小，在轉(zhuǎn)移液中浸泡3-5分鐘(48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS)。將3塊3MM濾紙對(duì)齊依次放置纖維素膜、凝膠，再依次放置另三張濾紙，放置每一層時(shí)均要除去它們之間的氣泡，然后在TRANS-BLOT SD(Semi-dry Transfer Cell，BIO-RID)轉(zhuǎn)印裝置中22V電轉(zhuǎn)45分鐘(纖維素膜側(cè)靠正極，膠側(cè)靠負(fù)極)。轉(zhuǎn)印完畢，取出NC膜用鉛筆在膜上作好標(biāo)記。夾于兩層濾紙之間，室溫干燥30分鐘。將NC膜放在一個(gè)平皿中，加封閉液(0.2％疊氮鈉，1％(W/V)BSA溶于PBS)，浸過膜即可，室溫下輕振2~3小時(shí)。然后用PBS洗3次，加ILTV多克隆血清(1∶100稀釋)37℃作用2小時(shí)，再用PBS洗3次，Buffer I(150mmol/L NaCl，50mmol/L，Tris.HCl pH7.5)洗10分鐘，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗雞IgG(用含1％BSABuffer I作1∶10000稀釋)37℃作用1小時(shí)。用Buffer I洗3次，Buffer II(10mmol/L TrisHCl pH7.5，150mmol/L NaCl)洗一次，吸凈余液，置于顯色液中。顯色完畢，加0.5mmol EDTA(pH8.0)終止顯色。
3.重組病毒免疫效力將表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因重組雞痘病毒(rFPV-ILTV gB)經(jīng)翅皮下注射接種(5×105PFU/羽)六周齡的SPF雞，免疫后四周以致死劑量雞傳染性喉氣管炎病毒王崗強(qiáng)毒株進(jìn)行喉內(nèi)接種攻毒。結(jié)果該重組雞痘病毒免疫的雞與雞傳染性喉氣管炎病毒弱毒疫苗免疫的雞一樣，對(duì)于ILTV王崗強(qiáng)毒株的攻擊都獲得了100％對(duì)死亡的保護(hù)和70％對(duì)發(fā)病的保護(hù)。ELISA方法檢測(cè)結(jié)果表明，該重組病毒不僅能在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定繁殖子代病毒，而且也能穩(wěn)定地表達(dá)插入重組病毒中的外源糖蛋白gB基因，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB和雞痘病毒的抗體。ILTV王崗強(qiáng)毒株攻擊后的雞的ILTV病毒分離和PCR檢測(cè)結(jié)果都表明，該重組病毒不僅能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，而且也能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)ILTV的細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而保護(hù)該重組病毒免疫雞抵抗ILTV強(qiáng)毒的攻擊。
用重組病毒(rFPV-ILTV gB)(5×105PFU/羽)經(jīng)翅皮下注射接種六周齡的商品雞。接種后4周以致死劑量的雞傳染性喉氣管炎病毒王崗強(qiáng)毒株進(jìn)行喉內(nèi)接種攻毒。攻毒后的死亡保護(hù)率為，重組雞痘病毒免疫組100％，ILTV弱毒疫苗免疫組85％，雞痘病毒疫苗S-FPV-017免疫組70％，非免疫對(duì)照組40％。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該重組雞痘病毒疫苗對(duì)商品雞的免疫保護(hù)效果比現(xiàn)用的ILTV弱毒疫苗更好。
將重組病毒添加保護(hù)劑制備疫苗，進(jìn)一步檢測(cè)疫苗的安全性，在最小免疫劑量免疫的疫苗中，在免疫持續(xù)期內(nèi)，可以保護(hù)雞抵抗強(qiáng)毒的攻擊。
表達(dá)ILTV gB基因重組禽痘病毒的構(gòu)建，可以直接進(jìn)行疫苗的開發(fā)工作，而且為進(jìn)一步構(gòu)建多價(jià)載體疫苗提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。例如①在此基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步插入新城疫病毒的F基因，或傳染性支氣管炎病毒的S1基因等制備多價(jià)載體疫苗。②根據(jù)這些重組病毒的特點(diǎn)均可建立疫苗免疫和病毒自然感染動(dòng)物的鑒別診斷方法。
ILTVgB基因與單純皰疹病毒I型(HSV-1)病毒gB基因是同源基因，與HSV-1糖蛋白gB一樣，ILTV糖蛋白gB也是一種跨膜糖蛋白，是病毒感染所必需的，在病毒接觸和進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)起關(guān)鍵作用。HSV糖蛋白gB已經(jīng)被證明能夠引起體液抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，使免疫小鼠能夠抵抗HSV強(qiáng)毒的致死性攻擊；由痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒表達(dá)的HSV糖蛋白gB能保護(hù)小鼠抵抗HSV病毒的致死性攻擊。ILTV糖蛋白gB基因能編碼205ku的糖蛋白復(fù)合物，由ILTV糖蛋白gB制備的亞單位疫苗能保護(hù)雞100％抵抗臨床發(fā)病和83％抑制強(qiáng)毒復(fù)制。所有這些都表明，ILTVgB糖蛋白是主要保護(hù)性抗原，可作為研制亞單位疫苗、病毒活載體疫苗和DNA疫苗的候選抗原，以ILTVgB基因制備的DNA疫苗可以有效的保護(hù)SPF雞抵抗ILTV強(qiáng)毒的攻擊。
雞痘病毒(Fowlpox Virus，F(xiàn)PV)表達(dá)載體系統(tǒng)是繼痘苗病毒(VacciniaVirus，VV)以后發(fā)展起來的又一種動(dòng)物病毒載體。FPV作為活病毒載體有如下優(yōu)勢(shì)其基因組結(jié)構(gòu)龐大，比VV長(zhǎng)約1/3，能容納較大的外源基因而不喪失其感染性；被表達(dá)的外源蛋白能真實(shí)的被表達(dá)，如糖基化、羧基化等，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞免疫和體液免疫；其嚴(yán)格的細(xì)胞漿繁殖特性，避免了病毒基因重組導(dǎo)入宿主細(xì)胞染色體而導(dǎo)致細(xì)胞特性改變之憂，消除了重組病毒應(yīng)用對(duì)人畜的潛在威脅；重組FPV作為疫苗免疫方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)疫苗的成本低；非常穩(wěn)定，反復(fù)凍融并不引起病毒改變和失活。人們已經(jīng)研制了表達(dá)幾種禽病原的重組雞痘病毒和鴿痘病毒疫苗，它們包括禽流感的HA基因(Beard et al，1991；1992；Boyle et al，1986；Taylor et al，1988；Tripathy et al，1991)、新城疫的F和HN基因(Boursnell et al，1990；Iritani et al，1991；Letellieret al，1991；Ogawa，1990；Taylor et al，1990)、馬立克氏病的gB基因(Nazerianet al，1992)、傳染性法氏囊的VP2(Bayliss et al，199l；Heine et al，1993)基因等。與痘苗病毒不同，F(xiàn)PV感染范圍很窄，僅感染禽類，其宿主特異性使重組FPV(Recombinant FPV，rFPV)接種哺乳動(dòng)物后僅產(chǎn)生一過性感染(也即流產(chǎn)性感染)(Taylor et al，1988)，但仍然可在較廣范圍的動(dòng)物中正確表達(dá)外源基因，在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生構(gòu)象正確的抗原，從而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，并且安全、有效，尤其是對(duì)免疫缺陷和免疫低下的動(dòng)物更是理想的載體。所以，F(xiàn)PV不僅可以用于研制禽類的活病毒載體疫苗，而且也可以作為非復(fù)制型載體，研制哺乳動(dòng)物的活病毒載體疫苗。


圖1，pSY538質(zhì)粒圖譜圖2，pSY681質(zhì)粒圖譜圖3，pSC11質(zhì)粒圖譜圖4.表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建圖譜圖5.表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建圖譜圖6.表達(dá)傳染性支氣管炎病毒S1基因載體構(gòu)建示意圖本發(fā)明的
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建如下1.ILTVgB基因的克隆以ILTV王崗株DNA為模板，利用合成的引物(上游引物5’-GGAGGATCCATGGCTAGCTTGAAA-3’，位于起始密碼子之前；下游引物5’-TACTGTGAATTCTAATGTCA TTTTA-3’，位于終止子之后，兩引物間包含完整的gB基因閱讀框架，在上下游引物的5’端引入EcoRI酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃/5分鐘，94℃/1分鐘，54℃/50秒，72℃/3分鐘，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5分鐘。反應(yīng)體系為50μl反應(yīng)體系中加5μl 10×buffer、2U TaqDNA聚合酶、2μl引物(10pmol/μl)、4μl dNTPs(200umol/L)、1μlILTV DNA、35μl滅菌去離子水。反應(yīng)完畢后取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，以0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增的ILTV gB基因大小為2.7kb。
將擴(kuò)增的片段用EcoRI酶切后，連接到pUC119質(zhì)粒載體上，形成重組質(zhì)粒pUC119gB，測(cè)序結(jié)果表明ILTV王崗株gB基因的閱讀框架長(zhǎng)2619bp，編碼873個(gè)氨基酸。gB基因的編碼蛋白在其氨基端含有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，在羧基端從690到761位氨基酸中有一段為嵌膜序列，其胞外區(qū)有8個(gè)糖基化位點(diǎn)，而從762位到873位的正電荷區(qū)是一個(gè)胞內(nèi)區(qū)，因此該蛋白為一跨膜蛋白。2.含gB基因的雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC119gB中2.7kb的gB基因通過EcoRI位點(diǎn)亞克隆到pSY538質(zhì)粒雞痘病毒早晚期啟動(dòng)子EP2LP2下游處，EcoRI酶切，可切出3.2kb的pSY538載體帶和2.7kb的gB基因條帶，BglII酶切該重組子，可以切出0.687kb和5.1kb的兩條帶，將其命名為pSY638；然后，將來自pSC11質(zhì)粒的痘苗病毒啟動(dòng)子Pl1控制下的大腸桿菌LacZ基因用PstI，XbaI雙酶切，Klenow補(bǔ)平，通過平端連接克隆到pSY638質(zhì)粒的SmaI位點(diǎn)，NotI酶切得到6kb的LacZ+gB片段帶和3.2kb的pSY538載體帶，將載體命名為pSY738，再將含LP2EP2-gB基因和Pl1-LacZ基因的NotI片段從pSY738質(zhì)粒中切下，接著我們?cè)賹SY738中含gB基因和LacZ基因的NotI片段克隆到pSY681的NotI位點(diǎn)中，通過用NotI酶切該重組子，可以切成6kb的LacZ+gB片段帶和5.8kb pSY681載體帶，將所獲得的雞痘病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒命名為pSY781。3.雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的制備取10日齡的SPF雞胚，先后用碘酒棉和酒精棉消毒氣室部位，無(wú)菌取出雞胚，用Hank’s液洗滌胚體，去頭、四肢和內(nèi)臟，剪成2mm大小的組織塊，用0.25％胰酶溶液(4ml/胚)在37℃水浴中消化12分鐘左右，然后倒掉胰酶，用Hank’s液洗滌2~3次后，再加入適量的營(yíng)養(yǎng)液(DMEM)，吹打分散細(xì)胞，用6層紗布過濾，制成每毫升含活細(xì)胞數(shù)106-107個(gè)的細(xì)胞懸液，分裝為5ml/60mm平皿，制成CEF單層細(xì)胞。4.雞痘弱毒(S-FPV-017)種毒的制備雞痘病毒是通過以0.01PFU/Cell的劑量感染雞胚成纖維細(xì)胞。感染前，用Hank’s液洗滌細(xì)胞盡量除去培養(yǎng)液中殘余的牛血清，然后在37℃溫箱中讓病毒液在細(xì)胞上吸附2小時(shí)，并且每半小時(shí)搖動(dòng)病毒液一次讓其充分吸附，2小時(shí)后倒去感染液，加入含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放在37℃溫箱中培養(yǎng)3-4天。待第4天細(xì)胞病變(CPE)達(dá)100％時(shí)將培養(yǎng)基和細(xì)胞一起收獲，凍融三次后儲(chǔ)存于-70℃，即為雞痘病毒種毒，其滴度為106PFU/ml。5.轉(zhuǎn)染和重組雞痘病毒的篩選含ILTV糖蛋白gB基因的重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pSY781的純化，參照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification System說明書。將用上述方法制備80％單層的CEF細(xì)胞，用Hank’s液洗滌，然后用S-FPV-017疫苗株(3PFU/cell)感染該細(xì)胞，在37℃感作2小時(shí)，其間每20分鐘搖動(dòng)病毒感作液一次，然后倒掉感染液，洗滌細(xì)胞；轉(zhuǎn)染方法按TfxTM-50脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行，將5μg(1μg/μl)純化重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(pSY781)加入50μl到150mmol/L NaCl溶液中，充分混勻，制成溶液A；同時(shí)，取10μl TransfectionReagent加到150mmol/L NaCl溶液中，充分混勻，制成溶液B。立即將溶液A、B充分混合均勻，室溫靜置10分鐘后，加到已經(jīng)被S-FPV-017疫苗株感染的CEF細(xì)胞上，37℃感作1小時(shí)，倒掉轉(zhuǎn)染液，加入含5％牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)至72小時(shí)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，收取該細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次作為轉(zhuǎn)染種毒。
將上述轉(zhuǎn)染種毒按10-1、10-2、10-3稀釋度接種CEF單層細(xì)胞，37℃感作2小時(shí)，感染之后倒掉感染液，加入含1％低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)72小時(shí)，待出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，再用含X-gal(250μg/ml)DMEM營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行染色，37℃培養(yǎng)，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑，挑取該藍(lán)斑，放入1ml DMEM液中，凍融3次進(jìn)行新一輪的蝕斑純化，共進(jìn)行6輪蝕斑純化。
將ILTV王崗株的gB基因通過PCR方法擴(kuò)增出來克隆到雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體中，將此載體和雞痘病毒弱毒疫苗病毒共同感染CEF細(xì)胞，通過藍(lán)斑篩選獲得含gB基因的重組雞痘病毒。
將表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因重組雞痘病毒(rFPV-ILTV gB)經(jīng)翅皮下注射接種(5×105PFU/羽)六周齡的SPF雞，免疫后四周以致死劑量雞傳染性喉氣管炎病毒王崗強(qiáng)毒株進(jìn)行喉內(nèi)接種攻毒。結(jié)果該重組雞痘病毒免疫的雞與雞傳染性喉氣管炎病毒弱毒疫苗免疫的雞一樣，對(duì)于ILTV王崗強(qiáng)毒株的攻擊都獲得了100％對(duì)死亡的保護(hù)和70％對(duì)發(fā)病的保護(hù)。ELISA方法檢測(cè)結(jié)果表明，該重組病毒不僅能在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定繁殖子代病毒，而且也能穩(wěn)定地表達(dá)插入重組病毒中的外源糖蛋白gB基因，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB和雞痘病毒的抗體。ILTV王崗強(qiáng)毒株攻擊后的雞的ILTV病毒分離和PCR檢測(cè)結(jié)果都表明，該重組病毒不僅能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，而且也能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)ILTV的細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而保護(hù)該重組病毒免疫雞抵抗ILTV強(qiáng)毒的攻擊。
用重組病毒(rFPV-ILTV gB)(5×105PFU/羽)經(jīng)翅皮下注射接種六周齡的商品雞。接種后4周以致死劑量的雞傳染性喉氣管炎病毒王崗強(qiáng)毒株進(jìn)行喉內(nèi)接種攻毒。攻毒后的死亡保護(hù)率為，重組雞痘病毒免疫組100％，ILTV弱毒疫苗免疫組85％，雞痘病毒疫苗S-FPV-017免疫組70％，非免疫對(duì)照組40％。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該重組雞痘病毒疫苗對(duì)商品雞的免疫保護(hù)效果比現(xiàn)用的ILTV弱毒疫苗更好。
將重組病毒添加保護(hù)劑制備疫苗，進(jìn)一步檢測(cè)疫苗的安全性，在最小免疫劑量免疫的疫苗中，在免疫持續(xù)期內(nèi)，可以保護(hù)雞抵抗強(qiáng)毒的攻擊。
取純化病毒液200ul，加Trizol試劑400ul，劇烈震蕩，室溫靜置10min后；加400ul三氯甲烷，震蕩搖勻后，室溫靜置10min 12500rpm離心10min；取上清移入另一EP管加入兩倍體積異戊醇混勻后，室溫靜置20min，12500rpm離心10min沉淀核酸，真空抽干，重溶于25.5ul DEPC水中。
將RT-PCR擴(kuò)增的1.7kb大小的S1基因片段用BamHI酶切后，連接到pUC19質(zhì)粒載體上，進(jìn)行序列測(cè)序，IBV S1基因的閱讀框架長(zhǎng)1700bp，編碼510個(gè)氨基酸。2.重組病毒的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pUC119S1中1.7kb的S1基因通過BamHII位點(diǎn)亞克隆到pSY538質(zhì)粒中的雞痘病毒早晚期啟動(dòng)子LP2EP2下游處，鑒定方向后將其命名為pSY638；然后，將來自pSC11質(zhì)粒的痘苗病毒啟動(dòng)子P11控制下的大腸桿菌LacZ基因用PstI，XbaI雙酶切，之后用Klenow補(bǔ)平，通過平端連接克隆到pSY638質(zhì)粒的SmaI位點(diǎn)，將載體命名為pSY738，再將含LP2EP2-S1基因和P11-LacZ基因的NotI片段從pSY738質(zhì)粒中切下，克隆到pSY681的NotI位點(diǎn)中，所獲得的雞痘病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒命名為pSY781。該載體含有痘苗病毒啟動(dòng)子P11控制下的大腸桿菌LacZ基因和LP2EP2控制下的S1基因。
參照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification System說明書對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行純化。制備雞胚成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到80％單層時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，先用S-FPV-017疫苗株(3PFU/cell)感染該細(xì)胞，在37℃感作2小時(shí)，其間每20分鐘搖動(dòng)病毒感作液一次，然后倒掉感染液，洗滌細(xì)胞；之后加入配制好的轉(zhuǎn)染液，37℃感作1小時(shí)，倒掉轉(zhuǎn)染液，加入含5％牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)至72小時(shí)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，收取該細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次作為轉(zhuǎn)染種毒。
將上述轉(zhuǎn)染種毒按10-1、10-2、10-3稀釋度接種CEF單層細(xì)胞，37℃感作2小時(shí)，感染之后倒掉感染液，加入含1％低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)72小時(shí)，待出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，再用含X-gal(250μg/ml)DMEM營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行染色，37℃培養(yǎng)，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑，挑取該藍(lán)斑，放入1ml DMEM液中，凍融3次進(jìn)行新一輪的蝕斑純化，共進(jìn)行6輪蝕斑純化。3.重組雞痘病毒的鑒定為了分離雞痘病毒的DNA，用0.1PFU/Cell的劑量感染單層雞胚成纖維細(xì)胞，放在37℃溫箱中培養(yǎng)4-6天，待CPE達(dá)到100％時(shí)，刮細(xì)胞到培養(yǎng)基中加入PBS后，補(bǔ)充10％SDS至終濃度0.4％，蛋白酶K至終濃度140μg/ml，37℃消化3-4小時(shí)，分別用等體積的飽和酚，等體積的飽和酚/氯仿(1∶1)，等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次，于水相中加入2倍體積的100％冷乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc(pH4.8)，混勻，-20℃冰箱過夜，12000g離心4℃離心20分鐘，棄上清，用70％冷乙醇洗滌沉淀，真空干燥，沉淀用滅菌的TE(10mmol/LTris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA)置于-20℃冰箱中備用。PCR試驗(yàn)所使用的上游引物為PS1 5’TTT TAT AAT TTA ACA GTT AGC GTA 3’(430-453)；下游引物為PS2 5’TAA CAA CAC GTT GCC TTA CCA CTA 3’(1072-1095)。兩引物擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度為689bp；反應(yīng)條件為95℃/5分鐘，94℃/30秒，50℃/30秒，72℃/1分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分。在0.8％的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。2.2 Western blot檢測(cè)糖蛋白gB的表達(dá)用rFPV-S1和S-FPV-017感染雞胚成纖維細(xì)胞，待產(chǎn)生細(xì)胞病變達(dá)100％后，倒掉培養(yǎng)液，用PBS(pH7.4)洗細(xì)胞二次。加入等體積的2倍SDS凝膠電泳加樣緩沖液，將樣品置于沸水中煮5min裂解細(xì)胞，準(zhǔn)備上樣。分別配制10％分離膠，5％的濃縮膠，待其聚合后，上樣電泳，同時(shí)加蛋白Marker作為對(duì)照，在BIO-RAD垂直電泳槽上80V電泳，待染料移至底部時(shí)停止電泳，用于Westernblot印跡。
將6張濾紙、一張醋酸纖維素膜(NC)剪成與凝膠同樣大小，在轉(zhuǎn)移緩沖液(48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS)中浸泡3-5min。將3張3MM濾紙對(duì)齊依次放置NC、凝膠，再依次放置另三張濾紙，放置每一層時(shí)均要除去它們之間的氣泡，然后在TRANS-BLOT SD(Semi-dry Transfer Cell，BIO-RID)轉(zhuǎn)印裝置中22V電轉(zhuǎn)印45min(NC膜側(cè)靠正極，膠側(cè)靠負(fù)極)。將NC膜蛋白Marker切下用0.25％考馬斯亮藍(lán)(0.25％R250，40％甲醇，10％冰乙醇)速染5sec，之后用脫色液(40％甲醇，10％乙酸)脫色，待蛋白Marker顯示后，終止脫色。
將NC膜置于平皿內(nèi)，加入封閉液(5％脫脂乳溶于PBS中，0.02％疊氮鈉，0.02％Tween-20)室溫下作用2h。將NC膜放入封閉液稀釋的一抗中(傳染性支氣管炎陽(yáng)性血清，1∶100稀釋)作用1h。用PBS洗膜三次，每次10min；再將NC膜轉(zhuǎn)入洗滌液(150mmol/L NaCl，50mmol/LTris-HCl pH7.5)中室溫洗10min，將NC膜放入稀釋的酶標(biāo)兔抗雞IgG(稀釋液1％BSA，150mmol/LNaCl，50mmol/LTris-Cl pH7.5)酶標(biāo)兔抗雞IgG(1∶10000稀釋)室溫下輕輕振蕩作用1h。取出NC膜于洗滌液中沖洗3次，每次10min，將NC膜浸入10ml堿性磷酸酶緩沖液中避光顯色5-15min，待檢測(cè)的目的片段顯示后，可以看到有特異的片段出現(xiàn)后，終止反應(yīng)。
經(jīng)過PCR和Western-Blot分析證明重組雞痘病毒中含有IBV的S1基因，并獲得了表達(dá)。
ILTV gB基因核苷酸序列ATGGCTAGCTTGAAAATGCTGATCTGCGTGTGCGTGGCAATCCTGATCCCATCTACCCTATCTCAAGATTCACACGGAATTGCTGGAATAATAGACCCTCATGATACAGCCAGCATGGATGTTGGAAAAATCTCTTTCTCCGAAGCCATTGGGTCGGGGGCACCGAAAGAACCCCAGATTAGAAACAGAATTTTTGCGTGCTCATCTCCAACTGGCGCCAGTGTTGCGAGGCTTGCCCAGCCACGACATTGTCACCGACATGCCGATTCGACTAACATGACTGAAGGAATTGCCGTAGTCTTCAAGCAAAACATTGCCCCGTACGTCTTTAATGTGACTCTATACTATAAACATATAACCACAGTTACTACGTGGGCATTATTCTCAAGACCCCAAATAACAAATGAGTACGTGACCAGGGTTCCAATAGACTATCATGAAATTGTCAGGATTGATCGATCGGGAGAATGCTCATCCAAAGCAACGTATCATAAAAATTTCATGTTTTTTGAAGCTTACGACAATGATGAAGCAGAAAAAAAATTGCCCCTGGTTCCATCACTGTTAAGATCAACTGTCTCCAAGGCGTTTCATACAACTAACTTTACTAAGCGACATCAAACCCTGGGATACCGAACGTCTACATCGGTCGACTGTGTTGTGGAATATCTACAGGCTAGATCTGTATACCCGTATGATTACTTTGGAATGGCGACAGGTGATACAGTAGAAATTTCTCCTTTTTATACCAAAAACACGACCGGACCAAGGCGTCACAGTGTCTACAGAGACTATAGATTTCTCGAAATCGCAAATTATCAAGTCAGGGATTTGGAAACCGGACAAATAAGACCCCCTAAAAAAAGAAACTTTCTAACAGATGAACAATTCACTATAGGCTGGGATGCAATGGAAGAAAAGGAATCTGTATGTACTCTCAGTAAATGGATTGAAGTCCCGGAAGCAGTTCGTGTTTCGTACAAAAACAGTTACCACTTTTCACTTAAAGATATGACTATGACGTTCTCGTCCGGAAAACAACCTTTTAACATCAGCAGGCTTCATTTGGCTGAATGCGTTCCTACCATAGCCTCGGAGGCCATAGATGGCATCTTTGCCAGAAAGTATAGTTCGACTCATGTCCGTTCTGGGGACATCGAATACTATCTCGGTAGTGGCGGATTTCTGATCGCATTTCAGAAACTCATGAGCCATGGCTTGGCTGAAATGTACCTAGAAGAGGCACAAAGACAAAATCATCTCCCGAGAGGGAGAGAGCGTCGCCAAGCCGCAGGTCGCCGCACGGCGTCGCTGCAGTCTGGACCTCAGGGTGATAGAATTACTACCCACAGTTCTGCAACATTTGCCATGTTACAATTTGCATACGACAAAATCCAAGCCCATGTTAACGAGCTTATCGGAAATTTGTTGGAAGCGTGGTGTGAGCTTCAGAACCGCCAACTGATTGTATGGCACGAGATGAAGAAACTAAACCCGAACTCACTGATGACATCTTTGTTCGGACAACCTGTAAGCGCCAGGCTATTGGGAGACATCGTAGCGGTATCAAAATGTATAGAAATTCCAATCGAAAATATTAGGATGCAGGATTCCATGCGCGTGCCAGGGGACCCAACCATGTGCTATACCAGACCAGTACTTATTTTCAGGTATTCGTCCTCCCCTGAGTCACAGTTTTCTGCGAACTCAACAGAAAACCACAATCTTGACATATTAGGCCAACTCGGAGAACATAATGAAATTTTACAAGGGCGGAATTTGATAGAACCATGCATGATCAATCACAGACGGTACTTTCTGTTGGGAGAAAACTACCTTCTTTACGAAGACTATACATTTGTTAGACAAGTAAATGCTTCCGAGATCGAAGAAGTGAGCACATTCATCAACTTGAACGCCACTATACTAGAAGATTTGGACTTTGTGCCCGTCGAAGTATACACTCGCGAGGAACTCAGAGATACTGGGACTTTAAACTATGATGATGTGGTCAGATATCAAAATATITATAACAAAAGGTTCAGAGACATTGACACTGTAATACGTGGAGATAGGGGAGATGCAATCTTTAGAGCAATAGCAGATTTTTTTGGCAACACTCTTGGAGAAGTAGGAAAGGCATTGGGAACTGTAGTGATGACAGCCGCGGCAGCAGTAATTTCTACAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTAACCCGTTCGCCGCACTCGGAATTGGGATAGCGGTGGTGGTGAGCATTATTTTAGGACTGCTGGCGTTCAAATATGTAATGAACCTGAAATCAAACCCAGTTCAGGTTCTGTTCCCAGGCGCAGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCCTCTAGACGTTACTACAAGGATGAGGAGGAGGTTGAGGAGGATAGTGATGAGGACGACAGGATACTTGCCACCAGAGTTCTGAAAGGCCTTGAGCTTCTACACAAGGATGAACAGAAAGCTCGAAGACAGAAAGCGCGGTTTTCTGCTTTTGCTAAAAATATGAGAAACCTATTTCGCAGAAAACCCCGAACCAAGGAAGATGACTACCCCCTGCTCGAATACCCTTCGTGGGCAGAAGAAAGCGAAGACGAATAAILTV gB基因編碼氨基酸序列MASLKMLICVCVAILIPSTLSQDSHGIAGIIDPHDTASMDVGKISFSEAIGSGAPKEPQIRNRIFACSSPTGASVARLAQPRHCHRHADSTNMTEGIAVVFKQNIAPYVFNVTLYYKHITTVTTWALFSRPQITNEYVTRVPIDYHEIVRIDRSGECSSKATYHKNFMFFEAYDNDEAEKKLPLVPSLLRSTVSKAFHTTNFTKRHQTLGYRTSTSVDCVVEYLQARSVYPYDYFGMATGDTVEISPFYTKNTTGPRRHSVYRDYRFLEIANYQVRDLETGQIRPPKKRNFLTDEQFTIGWDAMEEKESVCTLSKWIEVPEAVRVSYKNSYHFSLKDMTMTFSSGKQPFNISRLHLAECVPTIASEAIDGIFARKYSSTHVRSGDIEYYLGSGGFLIAFQKLMSHGLAEMYLEEAQRQNHLPRGRERRQAAGRRTASLQSGPQGDRITTHSSATFAMLQFAYDKIQAHVNELIGNLLEAWCELQNRQLIVWHEMKKLNPNSLMTSLFGQPVSARLLGDIVAVSKCIEIPIENIRMQDSMRVPGDPTMCYTRPVLIFRYSSSPESQFSANSTENHNLDILGQLGEHNEILQGRNLIEPCMINHRRYFLLGENYLLYEDYTFVRQVNASEIEEVSTFINLNATILEDLDFVPVEVYTREELRDTGTLNYDDVVRYQNIYNKRFRDIDTVIRGDRGDAIFRAIADFFGNTLGEVGKALGTVVMTAAAAVISTVSGIASFLSNPFAALGIGIAVVVSIILGLLAFKYVMNLKSNPVQVLFPGAVPPAGTPPRPSRRYYKDEEEVEEDSDEDDRILATRVLKGLELLHKDEQKARRQKARFSAFAKNMRNLFRRKPRTKEDDYPLLEYPSWAEESEDE新城疫病毒F基因核苷酸序列圖CTGGCACTGAGCTGTGTCCGTCTGACAAATTCTCTCGATGGAAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTAGTAACGGGAGACAAAGCAGTCAACATATACACCTCATCTCAGACAGGGTCAATAATAGTCAAGTTACTCCCAAATATGCCTAAGGATAAAGAGGCGTGTGCAAAAGCCCCGTTGGAGGCATACAACAGGACACTGACTGCTTTGCTCACCCCCCTTGGTGATTCTATCCGCAGGATACAAGAGTCTGCGACTACGTCCGGAGGAAGGAGGCAGAGACGCTTTATAGGTGCCATTATCGGCAGTGTAGCTCTTGGGGTTGCCACAGCTGCCCAGATAACAGCAGCCTCAGCTCTGATACAAGCCAACCAGAATGCTGCCAACATCCTCCGGCTTAAAGAGAGCATTGCTGCAACTAATGAAGCTGTACATGAAGTCACTGACGGATTATCGCAACTAGCAGTGGCAGTTGGGAAGATGCAGCAGTTTGTTAATGACCAGTTTAATAACACAGCTCAGGAATTGGACTGTATAAAAATTACACAGCAGGTTGGTGTAGAACTCAACCTGTACCTAACTGAATTGACTACAGTATTCGGGCCACAAATCACTTCCCCTGCCTTAACTCAGCTGACTATCCAGGCGCTTTACAATCTAGCTGGTGGTAAGATGGATTATTTGTTGACTAAGTTAGGTGTTGGGAACAACCAACTCAGCTCATTAATCGGTAGCGGCTTGATCACCGGTAACCCTATTCTGTACGATTCACAGACTCAACTCTTAGGTATACAGGTAACTTTACCCTCAGTCGGTAACCTAAATAATATGCGTGCTACCTACTTGGAGACCTTGTCTGTAAGCACAACCAAGGGATTTGCCTCAGCACTTGTCCCAAAAGTGGTGACACAGGTCGGGTCTGTGATAGAGGAACTTGACACCTCATACTGTGTAGAGACCGATTTGGATTTATATTGTACAAGAATAGTGACATTCCCTATGTCTCCTGGTATTTATTCCTGTCTGAGCGGTAATACATCAGCTTGCATGTATTCAAAGACTGAAGGTGCACTTACTACGCCATATATGACTATCAAGGGCTCAGTTATTGCCAATTGCAAGATAACAACATGCAGATGTGCAGACCCTCCGGGTATCATATCGCAAAATTATGGAGAAGCTGTGTCTCTAATAGATAGGCACTCATGCAATGTCTTATCCTTAGACGGGATAACTTTGAGGCTCAGTGGAGAATTTGACGTAACTTATCAAAAGAATATCTCAATATTAGATTCTCAGGTAATAGTGACAGGCAATCTCAATATCTCAACTGAACTTGGGAATGTCAACAACTCGATAAGTAATGCTTTGGATAAGTTAGAGGAAAGCAATAGCAAACTTGACAAAGTCAATGTCAAGCTGACCGGCACGTCTGCTCTCATTACCTATATAGTTTTAACTATCATATCTCTTGTTTGTGGTATACTTAGCCTGGTTCTAGCATGCTATCTGATGTATAAGCAAAAGGCGCAACAAAAGACCTTATTATGGCTTGGGAATAATACCCTAAATCAGATGAGGGCCACTACAAGAATCTGA根據(jù)新城疫病毒F基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列圖LALSCVRLTNSLDGRPLAAAGIVVTGDKAVNIYTSSQTGSIIVKLLPNMPKDKEACAKAPLEAYNRTLTALLTPLGDSIRRIQESATTSGGRRQRRFIGAIIGSVALGVATAAQITAASALIQANQNAANILRLKESIAATNEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVNDQFNNTAQELDCIKITQQVGVELNLYLTELTTVFGPQITSPALTQLTIQALYNLAGGKMDYLLTKLGVGNNQLSSLIGSGLITGNPILYDSQTQLLGIQVTLPSVGNLNNMRATYLETLSVSTTKGFASALVPKVVTQVGSVIEELDTSYCVETDLDLYCTRIVTFPMSPGIYSCLSGNTSACMYSKTEGALTTPYMTIKGSVIANCKITTCRCADPPGIISQNYGEAVSLIDRHSCNVLSLDGITLRLSGEFDVTYQKNISILDSQVIVTGNLNISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTGTSALITYIVLTIISLVCGILSLVLACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLNQMRATTRI.傳染性支氣管炎病毒S1基因核苷酸序列圖ATGTTGGGGAAGTCACTGTTTTTAGTGACCATTTTGTGTGCACTATGTAGTGCAAATTTGTTCGATCCTGCCAATTATGTGTACTACTACCAAAGTGCCTTTAGGCCTTCAAATGGGTGGCATTTGCAAGGGGGTGCTTATGCAGTAGTGAATTCTTCTAATTATGCTAATAATGCAGGTTCTGCATCTGAGTGCACTGTTGGTGTTATTAAGGATGTCTATAATCAAAGTGCGGCTTCCATAGCTATGACAGCACCTCTTCAGGGTATGGCTTGGTCTAAGTCACAATTTTGTAGTGCACACTGTGACTTTTCTGAAATTACAGTTTTTGTCACACATTGTTATAGTAGTGGATCAGGGTCTTGTCCTATAACAGGCATGATTGCACGTGGTCATATTCGTATTTCTGCAATGAAAAATGGTTCTTTATTTTATAATTTAACAGTTAGCGTATCTAAATACCCTAATTTTAAATCTTTTCAATGTGTTAACAACTTCACATCTGTTTATTTAAATGGTGATCTTGTTTTTACTTCCAACAAAACTACTGATGTTACGTCAGCAGGTGTCTATTTTAAAGCAGGTGGACCTGTAAATTATAGTATTATGAAAGAATTTAAGGTTCTTGCTTACTTTGTTAATGGTACAGCACAAGATGTAATTTTGTGTGATAACTCCCCCAAGGGTTTGCTAGCTTGTCAATATAACACTGGCAATTTTTCAGATGGCTTTTATCCTTTTACTAATAGTACTTTAGTTAGGGAAAAGTTCATTGTCTATCGTGAAAGTAGTGTTAATACTACTTTGGCGTTAACTAATTTCACTTTTACTAATGTAAGTAATGCACAGCCTAATAGTGGCGGTGTTCATACTTTTCATTTATATCAAACACAAACAGCTCAGAGTGGTTATTATAATTTTAATTTGTCATTTCTGAGTCAGTTTGTGTATAAGGCAAGTGATTATATGTATGGGTCTTACCACCCTATTTGTGCTTTTAGACCAGAAACCATTAATAGTGGTTTGTGGTTTAATTCCTTGTCAGTTTCTCTTACTTATGGACCCCTACAGGGAGGGTATAAGCAATCTGTTTTTAGTGGTAAGGCAACGTGTTGTTATGCCTACTCTTATAATGGCCCAAGGGCATGTAAAGGTGTTTATTCAGGTGAATTAAGCAGGGATTTTGAATGTGGATTGCTGGTTTATGTTACTAAGAGTGATGGCTCTCGTATACAGACTAGAACGGAGCCCTTAGTATTAACGCAACACAATTATAATAATATTACTTTAGATAAGTGTGTTGCCTATAATATATATGGCAGAGTAGGCCAAGGTTTTATTACTAATGTGACTGATTCTGTTGCTAATTTTAGTTATTTAGCAGATGGTGGGTTAGCTATTTTAGATACGTCGGGTGCCATAGATGTTTTTGTTGTACAGGGCAGCTATGGTCTTAATTATTACAAGGTTAATCCTTGTGAAGATGTTAACCAACAGTTTGTAGTGTCTGGTGGCAATATAGTTGGCATT傳染性支氣管炎病毒S1蛋白氨基酸序列圖MLGKSLFLVTILCALCSANLFDPANYVYYYQSAFRPSNGWHLQGGAYAVVNSSNYANNAGSASECTVGVIKDVYNQSAASIAMTAPLQGMAWSKSQFCSAHCDFSEITVFVTHCYSSGSGSCPITGMIARGHIRISAMKNGSLFYNLTVSVSKYPNFKSFQCVNNFTSVYLNGDLVFTSNKTTDVTSAGVYFKAGGPVNYSIMKEFKVLAYFVNGTAQDVILCDNSPKGLLACQYNTGNFSDGFYPFTNSTLVREKFIVYRESSVNTTLALTNFTFTNVSNAQPNSGGVHTFHLYQTQTAQSGYYNFNLSFLSQFVYKASDYMYGSYHPICAFRPETINSGLWFNSLSVSLTYGPLQGGYKQSVFSGKATCCYAYSYNGPRACKGVYSGELSRDFECGLLVYVTKSDGSRIQTRTEPLVLTQHNYNNITLDKCVAYNIYGRVGQGFITNVTDSVANFSYLADGGLAILDTSGAIDVFVVQGSYGLNYYKVNPCEDVNQQFVVSGGNIVGI
權(quán)利要求
1，一種表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，是一種抗傳染性喉氣管炎和其它禽病毒病的重組雞痘病毒活載體疫苗，其特征是將雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和/或其它禽病毒主要保護(hù)性抗原基因插入雞痘病毒弱毒基因組中構(gòu)建重組雞痘病毒活載體疫苗。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特征是含有傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因全部編碼框(ORF)，該ORF含有2619個(gè)堿基，編碼873個(gè)氨基酸；
3，根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特征是插入的傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因的上游有雞痘病毒早晚期啟動(dòng)子(LP2EP2)。
4，根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特征是含有傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因；
5，根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特征是插入的傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因的上游分別連有雞痘病毒早晚期啟動(dòng)子(LP2EP2)；
6，根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特征是含有傳染性支氣管炎病毒S1基因病
7，根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特征是插入的傳染性支氣管炎病毒S1基因的上游連有雞痘病毒早晚期啟動(dòng)子(LP2EP2)；
8，根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特征是將傳染性喉氣管炎病毒gB基因和/或其它禽病毒主要保護(hù)性抗原基因插入到雞痘病毒基因組一1.7Kb的EcoRI片段中。
9，一種表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒在預(yù)防雞痘及傳染性喉氣管炎和/或其它禽病毒病方面的應(yīng)用。
全文摘要
表達(dá)喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒及其應(yīng)用，剛出殼的雛雞個(gè)體很小，但面臨的病毒性疾病很多，多種疫苗同時(shí)注射常常不堪重負(fù)。本發(fā)明的內(nèi)容包括將雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和/或其它禽病毒主要保護(hù)性抗原基因插入雞痘病毒弱毒基因組中構(gòu)建重組雞痘病毒活載體疫苗，它利用雞痘病毒弱毒作為載體構(gòu)建可以表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB基因和/或其它禽病毒病主要保護(hù)性抗原基因的重組禽痘病毒活載體疫苗，外源病毒基因在禽痘病毒早晚期啟動(dòng)子LP
文檔編號(hào)C12P21/02GK1472315SQ0313245
公開日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者童光志, 王云峰, 張紹杰, 智海東, 劉勝旺, 仇華吉, 王玫 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所