專利名稱：一種靛藍(lán)衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新穎靛藍(lán)衍生物及其制備方法，以及其作為二噁英拮抗劑在腫瘤預(yù)防中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人們整天暴露在形形色色、不同濃度的環(huán)境污染物之中，其中無處不在、惡名遠(yuǎn)揚(yáng)的是二噁英(dioxins)。二噁英是一類氯代含氧三環(huán)芳烴化合物，包括多氯代二苯并二噁英(polychlorinated dibenzodioxins，PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(polychlorinateddibenzofurnas，PCDFs)，共有210種同系物(75種PCDDs和135種PCDFs)，是劇毒環(huán)境污染物，其中2，3，7，8-四氯二苯并-對-二噁英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的人工產(chǎn)物。二噁英主要來源于與氯有關(guān)的農(nóng)藥及其它工業(yè)品的加工生產(chǎn)及城市垃圾焚燒、汽車尾氣的排放等。與其它有機(jī)污染物一樣，二噁英也具有環(huán)境滯留性，能在生物體內(nèi)蓄積并隨食物鏈的傳遞而不斷富集放大，最終進(jìn)入人體，威脅人類健康。大量的動物試驗及流行病學(xué)調(diào)查證明二噁英有致癌、致畸、生殖毒性、皮膚毒性、肝毒性、免疫毒性、發(fā)育毒性等多種毒性，其中主要毒性是致癌作用。目前，最毒的TCDD已被EPA和IARC(國際癌癥研究所)認(rèn)定為致癌物。
二噁英的致毒機(jī)制是首先與細(xì)胞漿中的芳烴受體(AhR)結(jié)合，激活芳烴受體，配體-受體復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核中的芳烴受體核轉(zhuǎn)位子蛋白(ARNT)結(jié)合，AhR/ARNT復(fù)合物然后與特異基因上游部位的增強(qiáng)子即二噁英反應(yīng)原件(dioxin responsive element，DRE)結(jié)合激活基因的轉(zhuǎn)錄。二噁英通過芳烴受體激活的基因表達(dá)包括細(xì)胞色素P4501A1和1A2，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、甲基醌氧化還原酶、醛脫羥酶等，其中最主要的是細(xì)胞色素P4501A1和1A2。細(xì)胞色素P4501A1和1A2的表達(dá)產(chǎn)物可將前致癌物轉(zhuǎn)化為致癌物，從而促進(jìn)機(jī)體癌癥的發(fā)生。
環(huán)境污染治理是防止二噁英危害的一個有效手段，同時，尋找二噁英的拮抗物質(zhì)用于預(yù)防二噁英中毒，亦是減輕甚至消除二噁英對人體健康危害的有效途徑。由于7-乙氧基異吩噁唑O-去乙基酶(7-ethoxyresorufin O-deethylase，EROD)是細(xì)胞色素P4501A1同功酶的標(biāo)志酶，因此EROD活性抑制劑將能成為二噁英拮抗劑。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)茶多酚對EROD活性有抑制作用，將可能預(yù)防二噁英的致癌毒性，國際上已發(fā)現(xiàn)了許多能抑制EROD活性的天然產(chǎn)物，例如Thonningia sanguinea的水提物、蛇麻草(Humulus lupulus)中的異戊基黃酮、β-紫羅蘭酮、1，8-桉樹腦(1，8-cineole)、(-)-薄荷醇[(-)-menthol]及松油醇(terpineol)、原兒茶酸、氯原酸、丹寧酸、沒食子酸鹽及水飛薊素(silybin)等酚類化合物、 天然香豆素、丹葉大黃素(rhapontigenin)等。這些化合物大多為常見的已知結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，尋找具有新穎分子結(jié)構(gòu)的活性天然產(chǎn)物仍是當(dāng)前本領(lǐng)域的研究重點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新穎的能抑制EROD活性的靛藍(lán)衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備靛藍(lán)衍生物的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述衍生物在預(yù)防癌癥的食品和藥物中的應(yīng)用本發(fā)明以菘藍(lán)葉為原料，提取分離得到的一種新穎的靛藍(lán)衍生物，對二噁英有拮抗作用，可用于癌癥的預(yù)防，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明新的靛藍(lán)衍生物用下述通式(I)表示 其中R表示氫或C1～C5的?；駽1～C5的烷基。
上述的結(jié)構(gòu)通式(I)由4個吲哚環(huán)連結(jié)而成，其中第1和第2個吲哚環(huán)通過C-2和C-2′間的雙鍵相連，第3與第4個吲哚環(huán)以C-2″與C-2間的單鍵相連，而第2與第3個吲哚環(huán)以C-3′與C-3″間的單鍵相連，C-3和C-3為酮基，C-2和C-2′間雙鍵的構(gòu)型為順式(Z型)。N-1上連接的不同取代基構(gòu)成了該結(jié)構(gòu)模式中的不同衍生物。
上述C1～C5的?；侵妇哂?～5個碳原子的直鏈或支鏈的?；缂柞；?、乙?；?、丙?；?、異丙酰基、丁酰基、異丁?；⑹宥□；?、戊?；?、異戊?；?、新戊?；?。上述的C1～C5的烷基是指具有1～5個碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基等。優(yōu)選的本發(fā)明化合物是其中R為氫的化合物稱為雙靛藍(lán)(bisindigotin)或R為乙?；幕衔锓Q為1-乙酰雙靛藍(lán)(1-acetylbisindigotin)或R為乙基的化合物稱為1-乙基雙靛藍(lán)(1-ethylbisindigotin)。
本發(fā)明其中R為氫的化合物是從植物菘藍(lán)(Isatis indigotica)葉中提取而得到的，制備方法包括以下步驟a.將菘藍(lán)(Isatis indigotica)的葉子用有機(jī)溶劑浸泡，所述的有機(jī)溶劑，例如醇類，如乙醇；酮類，如丙酮；醚類，如乙醚；鹵代烴，如氯仿或二氯甲烷；乙酸酯，如乙酸乙酯；烷烴類，如正己烷；環(huán)烷類，如環(huán)己烷，所述的菘藍(lán)葉是常用中藥材，又稱大青葉；b.上述提取物用有機(jī)溶劑脫脂，所述的有機(jī)溶劑可以選用石油醚、正己烷、環(huán)己烷；c.提取物脫脂后可以采用下述(1)或(2)的處理方法(1)脫脂后的提取物用氯仿萃取，將氯仿萃取物進(jìn)行色譜分離，得到R為氫的本發(fā)明化合物即雙靛藍(lán)(bisindigotin)，所述的色譜分離技術(shù)是本領(lǐng)域通常所采用的技術(shù)，常用的分離柱是硅膠柱、氧化鋁柱等，洗脫劑可以選用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正己烷、環(huán)己烷、苯等或它們的混合物，比如石油醚-氯仿-乙酸乙酯，可選擇任意的配比配制洗脫劑；(2)脫脂后的提取物用甲醇或乙醇反復(fù)溶解，不溶于甲醇或乙醇的部分與鹽酸羥氨反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用堿溶液溶解，不溶于堿溶液的部分經(jīng)水洗、干燥得到雙靛藍(lán)(bisindigotin)，所述的堿溶液可以優(yōu)選氫氧化鈉；R為C1～C5的?；谋景l(fā)明化合物可以上述R為氫的產(chǎn)品為原料，按照常規(guī)的化學(xué)方法?；频茫缭谌軇┤邕拎ぶ杏盟狒M(jìn)行?；?br> R表示C1～C5的烷基的本發(fā)明化合物可以上述R為氫的產(chǎn)品為原料，按照常規(guī)的化學(xué)方法烷基化而制得。
對上述的靛藍(lán)衍生物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，紫外光譜用Perkin-Elmer Lambda 35紫外-可見光分光光度儀以THF為溶劑測定；紅外光譜用WQF-410 FT-IR以KBr壓片測定；核磁共振氫譜(1H NMR，400MHz)、核磁共振碳譜(13C NMR，100MHz)及二維核磁共振譜(2D NMR)包括1H-1H COSY、13C-1H COSY、HMBC、NOESY等用Bruker DRX-400核磁共振儀以TMS為內(nèi)標(biāo)在DMSO-d6、CDCl3及THF-d6混合溶劑中測定；高分辨電噴霧質(zhì)譜(HRESIMS)用API Q-STAR Pulsari Q-TOF質(zhì)譜儀在正離子模式下測定；電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)用API 2000 LC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀直接進(jìn)樣在正離子模式下測定。測定結(jié)果見實施例。
細(xì)胞生物學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物對由TCDD誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞(HepG2)EROD活性有較強(qiáng)的抑制作用，其抑制作用與靛玉紅肟(indirubin-3′-monoxime)相當(dāng)(見圖1)，是一類新的二噁英拮抗劑，可用于癌癥的預(yù)防。
本發(fā)明的靛藍(lán)衍生物中的一個或多個，可作為有效成分或添加劑添加到食品、飲品、藥品、健康食品、食品補(bǔ)給劑以及食品組合物、飲品組合物、藥品組合物、健康食品組合物、食品補(bǔ)給劑組合物中，用于預(yù)防癌變。本發(fā)明的靛藍(lán)衍生物中的每個化合物可單獨使用亦用亦可隨意組合使用，亦可使用含有本發(fā)明靛藍(lán)衍生物的植物提取物、分部提取物和分離部位。


圖1靛藍(lán)衍生物對TCDD誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞EROD活性的抑制作用具體實施方式
實施例1雙靛藍(lán)的提取和分離之一把2kg菘藍(lán)葉干粉用95％乙醇反復(fù)浸泡直至浸出液幾無紅色為止，乙醇浸提液減壓濃縮至約1L，將該濃縮液與1Kg粒徑0.074～0.147mm的硅膠混合均勻，減壓干燥得深棕色于粉，將該干粉裝入色譜分離柱中，先用石油醚洗脫至流出液呈淡黃色，然后換用氯仿洗脫，收集紫紅色的氯仿流出液，濃縮至干，得到40g粘稠狀深紫色氯仿溶解部分。將氯仿溶解部分分多次上硅膠柱，用體積比5∶4∶1的石油醚-氯仿-乙酸乙酯洗脫，得到100mg雙靛藍(lán)。雙靛藍(lán)的分子式為C32H18N4O2；UV(THF)λmax(log ε)227(4.94)，261(4.78)，352(4.62)，568(4.38)nm；IR(KBr)vmax3390(NH)，1716(C＝O)，1614，1591，1574，1560，1549，1521，1481和1469(苯環(huán))cm-1；ESIMS(正離子模式)m/z491[M+H]+，462[M- CO]+，434[M-CO-CO]+；HRESIMS(正離子模式)m/z 491.1516[M+H]+(計算值C32H19N4O2，491.1508)；1H NMR(400MHz)、13C NMR(100MHz)、HMBC及NOESY見表1。
實施例2雙靛藍(lán)的提取和分離之二把4kg菘藍(lán)葉干粉用丙酮反復(fù)浸泡直至浸出液幾無紅色為止，丙酮浸提液減壓濃縮除去丙酮得深棕色糖漿狀物，將該糖漿狀物用石油醚反復(fù)溶解，石油醚不溶物再用甲醇反復(fù)溶解，直至甲醇溶出液近于無色為止，將甲醇不溶物干燥得1.2g黑色粉末狀粗雙靛藍(lán)。將1.2g粗雙靛藍(lán)置于一圓底燒瓶中，加入60mL吡啶、1g鹽酸羥氨，充分振蕩使溶解，加熱回流4小時，放涼，將反應(yīng)液倒入500mL 1mol/L鹽酸水中，過濾收集沉淀，將沉淀用200mL 1mol/L氫氧化鈉水溶解，過濾收集不溶物，用水洗至中性，干燥，得到450mg雙靛藍(lán)。測定結(jié)果同實施例31-乙酰雙靛藍(lán)的制備取30mg雙靛藍(lán)置于一10mL具蓋的試管中，加入5mL吡啶(或二甲基甲酰胺)、2mL乙酸酐、200mg對甲基苯磺酸(TsOH)，蓋緊試管蓋，置于90℃水浴鍋上加熱6小時，取下，冷卻至室溫，將反應(yīng)液傾入50mL水中，形成沉淀，過濾收集沉淀，水洗、干燥，得黑色固體。將該黑色固體上ODS反相低壓柱，用體積比為9∶1甲醇-水洗脫，收集紫紅色流出液，濃縮至干，得13mg黑色粉末狀1-乙酰雙靛藍(lán)。1-乙酰雙靛藍(lán)的分子式為C34H20N4O3；UV(THF)λmax(logε)261(4.73)，346(4.60)，561(4.28)nm；ESIMS(正離子模式)m/z533[M+ H]+，518[M+H-Me]+，462[M+H-Ac-CO]+；1H NMR(400MHz)、13C NMR(100MHz)、HMBC及NOESY見表2。
實施例41-乙基雙靛藍(lán)的制備取100mg 1-乙基雙靛藍(lán)，加20mL四氫呋喃(THF)使其溶解，于該THF溶液中，加入15％NaOH溶液15mL、十六烷基三甲基溴化銨(HTAB)100mg、溴乙烷0.2mL，該混合液在室溫下攪拌反應(yīng)直至在HPTLC上雙靛藍(lán)的紫色斑點幾近消失(約需72小時)，于一分液漏斗中分出THF層，用飽和NaCl水溶液洗6次，用無水硫酸鈉干燥，然后濃縮至干，得到黑色粉末。將該黑色粉末上ODS反相低壓柱，用體積比9∶1甲醇-水洗脫，收集紫紅色流出液，濃縮至干，得10mg黑色粉末狀1-乙基雙靛藍(lán)。1-乙基雙靛藍(lán)的分子式為C34H22N4O2；UV(THF)λmax(logε)261(4.77)，346(4.63)，563(4.31)nm；ESIMS(正離子模式)m/z 557[M+K]+，541[M+Na]+，519[M+H]+，461[M-Et-CO]+；1H NMR(400MHz)、13C NMR(100MHz)、HMBC及NOESY見表3。
實施例5靛藍(lán)衍生物對TCDD誘導(dǎo)的EROD活性抑制作用的測定將人肝癌HepG2細(xì)胞株生長在DMEM培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基上另添加有10％小牛血清、50U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素。將細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上(2×104/孔)，用不同濃度的各種本發(fā)明的靛藍(lán)衍生物(雙靛藍(lán)、1-乙酰雙靛藍(lán)和1-乙基雙靛藍(lán))、靛玉紅肟及TCDD(0.5nmol/L)處理24小時，保溫培養(yǎng)之后，取除培養(yǎng)基，換含8μmol/L的7-乙氧基異吩噁唑(7-ethoxyresorufin，Sigma)和10μmol/L血液凝固防止劑(dicumarol，Sigma)的新培養(yǎng)基，在37℃下再培養(yǎng)60分鐘，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入一新96孔板上，每孔加入130μL無水乙醇，用多孔熒光測定儀在激發(fā)光/發(fā)射光(excitaion/emission)波長為530/590nm下測定試鹵靈關(guān)聯(lián)(resorufin-associated)的熒光。結(jié)果如圖1。
表1雙靛藍(lán)的1H和13C NMR及HMBC、NOESY數(shù)據(jù)*Position1H[m，J(Hz)]13C HMBC NOESY18.68 br s C-3，C-3a，C-7a H-72 127.83 198.23a 117.347.72 br d(8.0) 124.4 C-3，C-6，C-7a H-557.11 br t(8.0) 120.3 C-3a，C-7H-4，H-667.78 br t(8.0) 139.4 C-4，C-7aH-5，H-777.04 br d(8.0) 112.1 C-3a，C-5H-67a 160.12′ 138.43′ 151.33′a125.84′ 8.28 br d(8.0) 122.6 C-3′，C-6′，C-7′a H-5′5′ 7.31 br t(7.6) 122.6 C-3′a，C-7′H-4′，H-6′6′ 7.43 br t(8.0) 132.2 C-4′，C-7′aH-5′，H-7′7′ 6.96 br d(8.0) 111.8 C-3′a，C-5′H-6′7′a144.31″ 12.09 br sC-3″，C-3″a，C-7″a，C-2 H-7″2″ 114.13″ 108.53″a122.34″ 6.68 br d(8.0) 118.5 C-3″，C-6″，C-7″a H-5″5″ 6.79 br t(8.0) 120.0 C-3″a，C-7″H-6″，H-4″6″ 7.13 br t(8.0) 123.4 C-4″，C-7″aH-5″，H-7″7″ 7.74 br d(8.0) 113.1 C-3″a，C-5″H-6″7″a138.62 131.03 180.03a133.54 8.90 br d(8.0) 130.6 C-3，C-6，C-7a H-55 7.78 br t(8.0) 129.6 C-3a，C-7H-4，H-66 7.96 br t(8.0) 132.6 C-4，C-7aH-5，H-77 8.26 br d(8.0) 135.6 C-3a，C-5H-6，H-5′7a145.0*測定所用溶劑為DMSO-d6、CDCl3和THF-d8(體積比1∶1∶1)的混合物表2 1-乙酰雙靛藍(lán)的1H和13C NMR及HMBC、NOESY數(shù)據(jù)*Position1H[m，J(Hz)]13C HMBCNOESY2 136.13 195.03a120.04 7.98 br d(8.0)125.2 C-3，C-6，C-7a H-55 7.64 br t(8.0)127.2 C-3a，C-7 H-4，H-66 8.17 br t(8.0)141.1 C-4，C-7a H-5，H-77 8.68 br d(8.0)118.5 C-3a，C-5 H-67a152.92′ 139.63′ 151.23′a 126.64′ 8.32 br d(8.0)124.1 C-3′，C-6′，C-7′aH-5′5′ 7.39 br t(7.6)124.6 C-3′a，C-7′ H-4′，H-6′6′ 7.48 br t(8.0)134.0 C-4′，C-7′a H-5′，H-7′7′ 6.65 br d(8.0)111.2 C-3′a，C-5′ H-6′7′a 143.41″ 12.42 br s C-3″，C-3″a，C-7″a，C-2H-7″2″ 115.43″ 106.63″a 122.14″ 6.40 br d(8.0)118.0 C-3″，C-6″，C-7″aH-5″5″ 6.80 br t(8.0)121.7 C-3″a，C-7″ H-6″，H-4″6″ 7.16 br t(8.0)124.8 C-4″，C-7″a H-5″，H-7″7″ 7.81 br d(8.0)114.6 C-3″a，C-5″ H-6″7″a 139.82 131.93 180.83a 133.64 8.86 br d(8.0)131.4 C-3，C-6，C-7aH-55 7.87 br t(8.0)131.2 C-3a，C-7 H-4，H-66 8.04 br t(8.0)134.2 C-4，C-7a H-5，H-77 8.27 br d(8.0)136.4 C-3a，C-5 H-6，H-57a 145.7CH3-Ac 1.76 s22.8CO-Ac 169.8*測定所用溶劑為DMSO-d8和THF-d8(體積比1∶1)的混合物表3 1-乙基雙靛藍(lán)的1H和13C NMR及HMBC、NOESY數(shù)據(jù)*Position1H[m，J(Hz)]13C HMBCNOESY2 136.53 198.33a 117.14 7.75 br d(8.0) 125.2 C-3，C-6，C-7a H-55 7.10 br t(8.0) 120.7 C-3a，C-7 H-4，H-66 7.89 br t(8.0) 141.4 C-4，C-7a H-5，H-77 7.14 br d(8.0) 109.7 C-3a，C-5 H-67a 159.62′ 139.33′ 151.83′a126.34′ 8.28 br d(8.0) 123.7 C-3′，C-6′，C-7′aH-5′5′ 7.36 br t(7.6) 124.2 C-3′a，C-7′ H-4′，H-6′6′ 7.50 br t(8.0) 133.7 C-4′，C-7′a H-5′，H-7′7′ 6.86 br d(8.0) 112.3 C-3′a，C-5′ H-6′7′a144.61″ 12.42 br sC-3″，C-3″a，C-7″a，C-2H-7″2″ 114.83″ 107.13″a122.74″ 6.51 br d(8.0) 118.9 C-3″，C-6″，C-7″a，C-3″aH-5″5″ 6.82 br t(8.0) 121.4 C-3″a，C-7″ H-6″，H-4″6″ 7.15 br t(8.0) 124.6 C-4″，C-7″a H-5″，H-7″7″ 7.77 br d(8.0) 114.4 C-3″a，C-5″ H-6″7″a139.52 132.63 180.83a132.748.84 br d(8.0) 131.3 C-6，C-7a，C-3H-557.87 br t(8.0) 131.0 C-3a，C-7 H-4，H-668.02 br t(8.0) 134.2 C-4，C-7a H-5，H-778.26 br d(8.0) 136.4 C-3a，C-5 H-6，H-5′7a145.6CH2-Et3.12，3.28m 37.8 H-7CH3-Et0.65 t 13.8 H-7，H-7’*測定所用溶劑為DMSO-d6和THF-d8(體積比1∶1)的混合物
權(quán)利要求
1.下述通式(I)化合物 其中R表示氫或C1～C5的?；駽1～C5的烷基。
2.按照權(quán)利要求1的化合物，其中R為氫。
3.按照權(quán)利要求1的化合物，其中R為乙?；蛞一?。
4.權(quán)利要求2的化合物的制備方法，該方法包括以下步驟a.將菘藍(lán)(Isatis indigotica)的葉子用有機(jī)溶劑浸泡提?。籦.上述提取物用有機(jī)溶劑脫脂；c.提取物脫脂后采用下述(1)或(2)的處理方法(1)用氯仿萃取，氯仿萃取物進(jìn)行色譜分離，得到R為氫的本發(fā)明化合物即雙靛藍(lán)；(2)用甲醇或乙醇反復(fù)溶解，不溶于甲醇或乙醇的部分與鹽酸羥氨反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用堿溶液溶解，不溶于堿溶液的部分經(jīng)水洗、干燥得到雙靛藍(lán)。
5.權(quán)利要求1～3中任意一項的化合物作為二噁英拮抗劑在制備預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1～3中任意一項的化合物作為二噁英拮抗劑在制備預(yù)防腫瘤的食物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新穎的通式(I)的靛藍(lán)衍生物，其中R表示氫或C
文檔編號A23L1/30GK1569833SQ0313306
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月23日
發(fā)明者麥乃岐, 黃岳順, 魏孝義 申請人:香港浸會大學(xué), 中國科學(xué)院華南植物研究所