專利名稱：一種從河豚中分離產(chǎn)生河豚毒素的微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生河豚毒素(TTX)的微生物，具體說是一種從河豚中分離產(chǎn)生河豚毒素(TTX)的微生物的方法。
背景技術(shù)：
由于河豚魚肉鮮美，愛食者大有人在，尤其在日本被奉為時(shí)尚，但因調(diào)制失誤而導(dǎo)致中毒事件屢有發(fā)生，引起食用者肢體麻木、癱瘓，甚至死亡；但在另一方面，利用TTX具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)驚、解痛等功效，在臨床已可作為局麻藥，以及可用于治療風(fēng)濕、關(guān)節(jié)炎、麻風(fēng)?。唤陙磉€發(fā)現(xiàn)可用于解毒、解痙、，對頭痛、破傷風(fēng)、霍亂、傷寒、哮喘、晚期癌癥均有療效，具有很大的開發(fā)價(jià)值；河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是自然屆所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經(jīng)毒素之一，毒力相當(dāng)于氰化鈉的1250倍，可高選擇性、高親和性地阻斷神經(jīng)興奮膜上的鈉離子通道。河豚毒素以往都是從河豚卵巢或肝臟中分離提取出來的生物活性物質(zhì)，但從河豚卵巢中提取TTX，不僅河豚魚捕撈困難，且自然資源有限，困難重重；長期以來，國內(nèi)外的科技工作者發(fā)現(xiàn)河豚毒素(TTX)不僅存在于河豚魚中，也存在于河豚魚共生存的微生物中，較多的發(fā)現(xiàn)認(rèn)為海洋細(xì)菌、放線菌能產(chǎn)生河豚毒素，但由于所得到的微生物產(chǎn)TTX含量低或產(chǎn)TTX遺傳性狀不穩(wěn)定，人工培養(yǎng)時(shí)其子代容易失去產(chǎn)TTX特性，因此至今應(yīng)用微生物源產(chǎn)生河豚毒素研究尚無法進(jìn)入到應(yīng)用階段。為此，從河豚魚中能分離純化得到其共生存的能產(chǎn)生TTX含量較高，能人工培養(yǎng)且產(chǎn)TTX遺傳穩(wěn)定的河豚卵巢微生物的方法，已為國內(nèi)外普遍關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)生TTX量高、遺傳性狀穩(wěn)定的從河豚中分離產(chǎn)生河豚毒素的微生物的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為1)選取健康的、新鮮的河豚；2)魚體擦洗消毒，解剖魚體，取出新鮮卵巢，加細(xì)胞分散液(例如無菌生理鹽水或0.2MOL磷酸緩沖液)研磨，獲得新鮮河豚卵巢提取液；3)對新鮮河豚卵巢提取液，分別在能分離純化產(chǎn)生河豚毒素的海洋細(xì)菌、放線菌的培養(yǎng)基上(是一種選擇性的培養(yǎng)基，其中添加了誘導(dǎo)物河豚卵巢提取液)保溫培養(yǎng)。
所述最好河豚為正值產(chǎn)卵期的河豚；最好為紅鰭東方豚；保溫培養(yǎng)的溫度為25~37℃；每1克新鮮卵巢加分散液0.5~1.5毫升；海洋細(xì)菌的培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.5-1.5％，蔗糖0.5-1.5％，牛肉膏0.1-0.5％，酵母膏0.1-0.5％，蛋白胨0.1-0.5％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量為海水或人工海水，瓊脂2％，PH6.5-7.5。
放線菌的培養(yǎng)基組成為A可溶性淀粉0.5-1.5％，蔗糖0.2-1.0％，甘露醇0.1-0.3％，KNO30.1％，K2HPO40.35％，MgSO4.7H2O 0.001％FeSO4.7H2O 0.001％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量為海水或人工海水，瓊脂2％，PH7.0～7.2；B葡萄糖0.5-1.5％，蔗糖0.5-1.5％，牛肉膏0.1-0.5％，酵母膏0.1-0.5％，蛋白胨0.1-0.5％，NaCl 1.0-3.5％，河豚卵巢提取液0.005-0.0151％，余量為海水(或人工海水)，瓊脂2％，PH6.5～7.5；培養(yǎng)基A或B臨用時(shí)，在已加熱融化的300ml培養(yǎng)基中需進(jìn)入3％重鉻酸鉀溶液1ml，再加入1％鏈霉素溶液0.5ml，及環(huán)丙沙星1-5滴，輕輕搖勻，然后倒分離純化用平皿。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.操作簡單，結(jié)果理想，分離效果好，能得到所需的菌株，總成功率在90％以上。
2.分離得到的微生物能產(chǎn)生具有較高含量的河豚毒素，且所獲菌株傳代10代以上，遺傳性狀穩(wěn)定。


圖1為TTX標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。
圖2為樣品RG-3B的HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例1從河豚卵巢中分離產(chǎn)生河豚毒素(TTX)的細(xì)菌的方法，可按照以下步驟操作(1)從海洋中選取健康的正值產(chǎn)卵期的紅鰭東方豚；(2)對新鮮的紅鰭東方豚魚體用酒精擦洗消毒，立即用無菌解剖刀、薄刀片及鑷子，迅速解剖魚體，準(zhǔn)確取出新鮮卵巢，加細(xì)胞分散液無菌生理鹽水或磷酸緩沖液，用石英沙研磨3-5min(能使卵巢中的微生物充分游離分散，而被分離出來)，獲得新鮮河豚卵巢提取液；(3)對新鮮河豚卵巢提取液，用平板稀釋法，以10-2，10-3、10-4濃度，在下列組成培養(yǎng)基的平皿上涂平板，然后放到28℃培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)；挑出單菌落分純(經(jīng)顯微鏡觀察，然后移殖到斜面上保藏，進(jìn)行產(chǎn)生河豚毒素(TTX)生物活性物質(zhì)檢測驗(yàn)證。
分離產(chǎn)生河豚毒素細(xì)菌培養(yǎng)基組成如下葡萄糖1％，蔗糖1％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.3％，河豚卵巢提取液0.01％，余量為海水(或人工海水)，瓊脂2％，PH7.0-7.2；
實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于，對新鮮河豚卵巢提取液，用平板稀釋法，以原液一滴及10-1、10-2濃度稀釋，在下列組成培養(yǎng)基的平皿上涂平板，然后放到28℃培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)；挑出單菌落分純(經(jīng)顯微鏡觀察，然后移殖到斜面上保藏，進(jìn)行產(chǎn)生河豚毒素(TTX)生物活性物質(zhì)檢測驗(yàn)證。
分離產(chǎn)生河豚毒素放線菌培養(yǎng)基組成為可溶性淀粉1％，蔗糖0.5％，甘露醇0.3％，KNO30.1％，K2HPO40.35％，MgSO4.7H2O 0.001％FeSO4.7H2O 0.001％，河豚卵巢提取液0.01％，余量為海水(或人工海水)，瓊脂2％，PH7.0~7.2；培養(yǎng)基臨用時(shí)，在已加熱融化的300ml培養(yǎng)基中需進(jìn)入3％重鉻酸鉀溶液1ml，再加入1％鏈霉素溶液0.5ml，及環(huán)丙沙星1-2滴，輕輕搖勻，然后倒分離純化用平皿。
實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于，分離產(chǎn)生河豚毒素放線菌的培養(yǎng)基組成改為葡萄糖1％，蔗糖1％，牛肉膏0.3％，酵母膏1％，蛋白胨0.3％，NaCL 2.5％，河豚卵巢提取液0.01％，余量為海水(或人工海水)，瓊脂2％，PH7.0-7.2；培養(yǎng)基臨用時(shí)，在已加熱融化的300ml培養(yǎng)基中需進(jìn)入3％重鉻酸鉀溶液1ml，再加入1％鏈霉素溶液0.5ml，及環(huán)丙沙星1-2滴，輕輕搖勻，然后倒分離純化用平皿。
實(shí)施例4本發(fā)明以從河豚卵巢中分離得到的產(chǎn)生河豚毒素(TTX)的芽孢桿菌RG-3B為例，RG-3B在搖瓶發(fā)酵68hr后，從中用薄層層析分離，取Rf＝0.77處硅膠帶樣品，加0.1ml醋酸洗脫，用15,000rpm離心去除硅膠，取上清進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果如圖1A及B；A為標(biāo)準(zhǔn)TTX，B為河豚卵巢中RG-3B產(chǎn)生的TTX樣品。
權(quán)利要求
1.一種從河豚中分離產(chǎn)生河豚毒素的微生物的方法，其特征在于1)選取健康的、新鮮的河豚；2)魚體擦洗消毒，解剖魚體，取出新鮮卵巢，加細(xì)胞分散液研磨，獲得新鮮河豚卵巢提取液；3)對新鮮河豚卵巢提取液，分別在能分離純化產(chǎn)生河豚毒素的海洋細(xì)菌、放線菌的培養(yǎng)基上保溫培養(yǎng)。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述河豚為正值產(chǎn)卵期的河豚。
3.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述河豚為紅鰭東方豚。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述保溫培養(yǎng)的溫度為25~37℃。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞分散液的加入量為每1克新鮮卵巢加分散液0.5~1.5毫升。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述海洋細(xì)菌的培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.5-1.5％，蔗糖0.5-1.5％，牛肉膏0.1-0.5％，酵母膏0.1-0.5％，蛋白胨0.1-0.5％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量為海水或人工海水，瓊脂2％，PH6.5-7.5。
7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述放線菌的培養(yǎng)基組成為A可溶性淀粉0.5-1.5％，蔗糖0.2-1.0％，甘露醇0.1-0.3％，KNO30.1％，K2HPO40.35％，MgSO4·7H2O 0.001％ FeSO4·7H2O 0.001％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量為海水或人工海水，瓊脂2％，PH7.0～7.2。
8.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述放線菌的培養(yǎng)基組成為B葡萄糖0.5-1.5％，蔗糖0.5-1.5％，牛肉膏0.1-0.5％，酵母膏0.1-0.5％，蛋白胨0.1-0.5％，NaCl 1.0-3.5％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量為海水(或人工海水)，瓊脂2％，PH6.5～7.5。
9.按權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述放線菌的培養(yǎng)基A或B臨用時(shí)，在已加熱融化的300ml培養(yǎng)基中需進(jìn)入3％重鉻酸鉀溶液1ml，再加入1％鏈霉素溶液0.5ml，及環(huán)丙沙星1-5滴，輕輕搖勻，然后倒分離純化用平皿。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生河豚毒素(TTX)的微生物，具體說是一種從河豚中分離產(chǎn)生河豚毒素(TTX)的微生物的方法；具體操作為1)選取健康的、新鮮的河豚；2)魚體擦洗消毒，解剖魚體，取出新鮮卵巢，加細(xì)胞分散液研磨，獲得新鮮河豚卵巢提取液；3)對新鮮河豚卵巢提取液，分別在能分離純化產(chǎn)生河豚毒素的海洋細(xì)菌、放線菌的培養(yǎng)基上保溫培養(yǎng)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)操作簡單，結(jié)果理想，分離效果好，能得到所需的菌株，總成功率在90％以上；分離得到的微生物能產(chǎn)生具有較高含量的河豚毒素，且所獲菌株傳代10代以上，遺傳性狀穩(wěn)定。
文檔編號C12P17/18GK1552884SQ03133530
公開日2004年12月8日 申請日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月30日
發(fā)明者胡江春, 薛德林, 馬成新, 劉全永, 王書錦 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所