專利名稱：一種移植材料的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種移植材料的制造方法，尤其是一種應(yīng)用于生物體角膜基質(zhì)環(huán)(intrastromal corneal ring，ICR)植入手術(shù)的、利用組織工程學(xué)構(gòu)建的移植材料的制造方法。
角膜基質(zhì)環(huán)(intrastromal corneal ring，ICR)植入手術(shù)就是這樣一種新興的屈光手術(shù)。該技術(shù)將ICR植入生物體角膜基質(zhì)的周邊約2/3深度處，增加角膜周邊厚度，通過ICR力的擴(kuò)張作用，導(dǎo)致角膜中央?yún)^(qū)產(chǎn)生弧長(zhǎng)縮短效應(yīng)，使角膜曲率減小，屈光度減小，從而糾正屈光。其區(qū)別目前流行的屈光手術(shù)(RK、PRK和LASIK手術(shù))的主要特點(diǎn)在于，該手術(shù)不損傷角膜結(jié)構(gòu)的完整性，極大避免了這些手術(shù)后可能出現(xiàn)的危險(xiǎn)，具有有效、穩(wěn)定、可逆、預(yù)期性好、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，因此ICR植入技術(shù)很可能成為理想的屈光手術(shù)。
目前，ICR植入手術(shù)所使用的角膜基質(zhì)環(huán)ICR一般有一體開放式環(huán)型和兩段弧型兩形式，相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)可參考第6228114B1號(hào)美國(guó)專利。已經(jīng)商業(yè)化的ICR通常是采用與生物體適應(yīng)性較好的聚合體材料制成的透明環(huán)狀體，如美國(guó)專利第6511508B1、6228114B1號(hào)。例如，可采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制作成ICR，而相關(guān)地PMMA在角膜內(nèi)穩(wěn)定的理化性質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)。但是，所采用的聚合體材料，如PMMA，大多屬于非滲透性、非柔韌性以及無孔性材料，這類材料與生物體角膜之間不能達(dá)到真正的生物愈合，最終有可能導(dǎo)致角膜溶解、房水滲漏與植入物脫出等晚期并發(fā)癥。而且，此類聚合體材料(如PMMA)長(zhǎng)期存在生物體角膜內(nèi)可能導(dǎo)致的其他不良生物學(xué)反應(yīng)尚有待于進(jìn)一步觀察和研究。
由于ICR植入手術(shù)所需要的ICR材料來源的這種不安全因素，已經(jīng)成為制約該技術(shù)進(jìn)一步廣泛開展的嚴(yán)重障礙。
近來，隨著生命科學(xué)、材料科學(xué)以及相關(guān)物理、化學(xué)學(xué)科的發(fā)展，人們提出了一個(gè)新的概念——組織工程。它是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，研究開發(fā)修復(fù)、改善損傷組織結(jié)構(gòu)和功能的生物替代物的一門科學(xué)。其基本方法是將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的正常組織細(xì)胞吸附于一種生物相容性良好并可被機(jī)體降解吸收的生物支架，植入機(jī)體組織缺損部位，在支架材料逐步降解過程中，細(xì)胞繼續(xù)增殖并分泌基質(zhì)，最終形成相應(yīng)組織，達(dá)到修復(fù)組織缺損，重建功能的目的。
應(yīng)用組織工程技術(shù)重建組織，有望從根本上解決組織器官移植手術(shù)供體材料缺乏的問題。此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了軟骨、骨、肌腱、皮膚等各種組織。
因此，將組織工程角膜基質(zhì)作為ICR材料來源，綜合ICR植入技術(shù)和組織工程所提供的優(yōu)質(zhì)、可靠組織來源的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步完善ICR植入術(shù)式，就成為相關(guān)技術(shù)人士所關(guān)注及研究的課題。
本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)是該移植材料的制造方法包括以下步驟步驟一、制備生物支架；步驟二、分離培養(yǎng)生物體角膜基質(zhì)細(xì)胞；和步驟三、制備角膜基質(zhì)細(xì)胞-生物支架復(fù)合物，并預(yù)制角膜基質(zhì)組織。
本發(fā)明移植材料的制造方法進(jìn)一步包括步驟四，將步驟三中獲得的形成細(xì)胞-生物材料復(fù)合物植入生物體角膜基質(zhì)板層內(nèi)，獲得新生的組織工程角膜基質(zhì)組織。
步驟一包括取片狀直徑為14μm的非編織聚羥基乙酸(PGA)纖維3-7mg，剪成直徑為5mm的圓盤狀，在75％的酒精浸泡消毒30-45分鐘后，再用4℃無菌磷酸緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS；含青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml)反復(fù)沖洗3次，室溫下自然晾干。
步驟二包括在無菌條件下取得生物體眼球，經(jīng)PBS清洗后，放入消毒盤內(nèi)；解剖該生物體眼球，分離角膜上皮層、角膜基質(zhì)層和角膜內(nèi)皮層組織；取出角膜基質(zhì)層組織放入4℃的PBS中清洗后，剪成1-2mm3大小的組織塊。將組織塊置入15ml離心管中，加入150-250u/ml II型膠原酶4-7ml，移入恒溫振蕩器內(nèi)，在37℃、振蕩頻率80-120次/分鐘的條件下振蕩40-70分鐘；收集角膜基質(zhì)細(xì)胞懸液，以1000r/min的速度離心5-8分鐘，棄去上清液，經(jīng)PBS反復(fù)沖洗、離心、棄去上清液，再加入培養(yǎng)液10ml，混勻，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，取細(xì)胞活力＞75％的角膜基質(zhì)細(xì)胞備用。將角膜基質(zhì)細(xì)胞和培養(yǎng)液的混合體放入5％CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
步驟二中使用的培養(yǎng)液為PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、 L-谷氨酰胺300μg/ml、維生素C50μg/ml、青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml。
步驟三包括在無菌條件下，用0.25％的胰蛋白酶和0.02％的乙烯二胺四乙酸(Ethylene Diamine-Tetraacidic Acid，EDTA)消化收集經(jīng)步驟二培養(yǎng)了5-8天的角膜基質(zhì)細(xì)胞，以1～4×107/ml的濃度30～50μl接種PGA，并加入相應(yīng)的培養(yǎng)液10ml，再放入5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日更換新鮮培養(yǎng)液。
步驟三中所使用的培養(yǎng)液為PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、 L-谷氨酰胺300μg/ml、維生素C50μg/ml、青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml的Ham’F-12培養(yǎng)液10ml。
本發(fā)明應(yīng)用組織工程技術(shù)將角膜基質(zhì)細(xì)胞接種于生物材料，形成細(xì)胞-生物材料復(fù)合物植入角膜基質(zhì)板層內(nèi)，獲得了新生的組織工程角膜基質(zhì)組織。經(jīng)組織工程獲得的角膜基質(zhì)具有與正常角膜基質(zhì)類似組織學(xué)結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)性能也與正常角膜相類似，具有良好的組織相容性。而且，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，組織工程技術(shù)構(gòu)建的角膜基質(zhì)組織逐漸呈現(xiàn)透明。一般在術(shù)后8周左右，生物支架材料基本降解完全，此時(shí)組織工程角膜基質(zhì)基本接近透明。
將由本發(fā)明獲得的角膜基質(zhì)組織植入生物體角膜基質(zhì)的周邊，增加角膜厚度、以治療屈光不正，相較現(xiàn)有技術(shù)中采用其它聚合體材料的ICR具有更可靠的效果、更穩(wěn)定、預(yù)期性更好。而且這種材料與角膜之間完全可以達(dá)到真正的生物愈合，徹底避免其他替代材料移植可能導(dǎo)致的角膜溶解、房水滲漏與植入物脫出等并發(fā)癥。
本發(fā)明移植材料的制造方法主要包括以下步驟步驟一、制備生物支架；步驟二、分離培養(yǎng)生物體角膜基質(zhì)細(xì)胞；和步驟三、制備角膜基質(zhì)細(xì)胞-生物支架復(fù)合物，并預(yù)制角膜基質(zhì)組織。本發(fā)明移植材料的制造方法進(jìn)一步包括步驟四，將步驟三中獲得的形成細(xì)胞-生物材料復(fù)合物植入生物體角膜基質(zhì)板層內(nèi)，獲得新生的組織工程角膜基質(zhì)組織。
以下通過具體的實(shí)驗(yàn)來對(duì)本發(fā)明的移植材料物制造方法進(jìn)行說明以20窩新西蘭大白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其中新生兔為5天年齡，母兔為60天年齡，體重約3.5-4.5公斤；將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
接下來進(jìn)行本發(fā)明的步驟一制備生物支架聚羥基乙酸Polyglicolic Acid(PGA)(參閱

圖1)。
取直徑為14μm的片狀非編織聚羥基乙酸(PGA)纖維5mg，剪成直徑為5mm的圓盤狀，在75％的酒精中浸泡消毒45分鐘后，用4℃無菌磷酸緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS含青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml)反復(fù)沖洗3次，室溫下自然晾干。然后放入直徑為100mm培養(yǎng)皿中，備用。
再進(jìn)行步驟二分離培養(yǎng)生物體角膜基質(zhì)細(xì)胞。
采用注射過量戊巴比妥鈉的方法處死若干新生兔，在無菌條件下取出其眼球，經(jīng)PBS清洗后，放入消毒盤內(nèi)。在手術(shù)顯微鏡下，解剖分離所取眼球的角膜上皮層、角膜基質(zhì)層和角膜內(nèi)皮層組織；取出角膜基質(zhì)層組織放入4℃的PBS中清洗；然后，將角膜基質(zhì)層組織剪成2mm3大小組織塊。將剪好的組織塊放入15ml的離心管中，加入200u/ml II型膠原酶(Worthington，F(xiàn)reehold，NJ，MSA)5ml，再移入恒溫振蕩器內(nèi)，在37℃、振蕩頻率110次/分鐘的條件下，消化50分鐘；收集細(xì)胞懸液，以1000r/min速度離心5-8分鐘，棄去上清液；用PBS反復(fù)沖洗3次，離心，棄去上清液；加入條件培養(yǎng)液10ml。
所使用的培養(yǎng)液為PH7.40，含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，L-谷氨酰胺300μ，維生素C50μ，青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml的Ham′F-12(Gibco，Gland，Island，NY，MSA)培養(yǎng)液。
將角膜基質(zhì)細(xì)胞和培養(yǎng)液混勻，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，取細(xì)胞活力＞75％的角膜基質(zhì)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將角膜基質(zhì)細(xì)胞移入培養(yǎng)皿后，放入5％CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。隔日換液；原代細(xì)胞培養(yǎng)5-8天；備用。
在倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞原代細(xì)胞8小時(shí)后開始貼壁，24小時(shí)后，細(xì)胞逐漸向兩極伸展，呈梭型或不規(guī)則三角形。4天后，角膜基質(zhì)細(xì)胞排列呈放射狀或指紋狀走行。細(xì)胞內(nèi)顆粒少，未見空泡，細(xì)胞漿分布均勻，胞膜清晰。培養(yǎng)約7天后，細(xì)胞可鋪占培養(yǎng)皿底面積70％。
然后進(jìn)行步驟三制備角膜基質(zhì)細(xì)胞-生物支架復(fù)合物，并預(yù)制角膜基質(zhì)組織。
在無菌條件下，用0.25％胰蛋白酶和0.02％的乙烯二胺四乙酸(Ethylene Diamine-Tetraacidic Acid，EDTA)消化、收集原代培養(yǎng)7天的角膜基質(zhì)細(xì)胞；將得到的角膜基質(zhì)細(xì)胞以1×107/ml的濃度30μl接種PGA，并加入培養(yǎng)液10ml；放入5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日更換新鮮培養(yǎng)液。如此培養(yǎng)一周，預(yù)制角膜基質(zhì)組織，作為移植材料供角膜基質(zhì)環(huán)(ICR)植入手術(shù)用。。
所加入的培養(yǎng)液為PH7.40，含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，L-谷氨酰胺300μ，維生素C50μ，青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml的Ham′F-12培養(yǎng)液。
將角膜基質(zhì)細(xì)胞接種于PGA后，每天倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞在生物支架PGA中的生長(zhǎng)、增殖、基質(zhì)分泌和細(xì)胞形態(tài)變化狀況。取培養(yǎng)第6天的細(xì)胞-PGA復(fù)合物，PBS洗滌，2.5％的戊二醛固定，酒精梯度脫水，醋酸正戊酯置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡(SEM-520)觀察。
在光鏡下可見(參閱圖2及圖3)接種于PGA后的角膜基質(zhì)細(xì)胞呈圓形，均勻密布于PGA纖維表面及PGA纖維形成的孔隙中。第48小時(shí)，粘附在生物支架上的細(xì)胞沿PGA纖維縱軸方向向兩極伸展，細(xì)胞形態(tài)由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形。第6天，細(xì)胞分泌基質(zhì)并向鄰近PGA纖維支架拓展，鄰近細(xì)胞相互接觸直至連接成小片狀，形成拉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)充填于PGA纖維形成的孔隙中。
掃描電鏡觀察復(fù)合物體外培養(yǎng)第6天，角膜基質(zhì)細(xì)胞呈梭形或多角形，較扁平，細(xì)胞表面有細(xì)小絨毛與褶皺。細(xì)胞在PGA接觸部位伸出偽足，粘附和包繞PGA纖維。分泌基質(zhì)連接成片覆蓋沉積于PGA表面。
本發(fā)明還可包括步驟四角膜基質(zhì)細(xì)胞-PGA復(fù)合物構(gòu)建角膜基質(zhì)層組織。
將角膜基質(zhì)細(xì)胞-PGA復(fù)合物植入實(shí)驗(yàn)組母兔角膜基質(zhì)層內(nèi)。具體操作如下在母兔的耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)，麻醉平穩(wěn)后，常規(guī)消毒，用開瞼器開瞼，1#縫線懸吊上下直肌，手術(shù)顯微鏡下，自10點(diǎn)至2點(diǎn)，掀起角膜基質(zhì)瓣，其深度約達(dá)角膜全層的1/3～1/2，植入角膜基質(zhì)細(xì)胞-PGA復(fù)合物，基質(zhì)瓣復(fù)位，10-0縫線縫合切口。手術(shù)后持續(xù)觀察8周。
同時(shí)，對(duì)對(duì)照組的母兔采用與實(shí)驗(yàn)組母兔相同的手術(shù)方法，在其角膜基質(zhì)層內(nèi)植入PGA，設(shè)置角膜基質(zhì)細(xì)胞空白的生物材料對(duì)照組。手術(shù)后亦連續(xù)觀察8周。
如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組的母兔在手術(shù)后，細(xì)胞與生物材料復(fù)合物占據(jù)角膜中央，呈白色，不透明。第4周，PGA降解加速，中央角膜組織逐漸恢復(fù)透明，至第8周，角膜中央基本透明。
手術(shù)后第3、6、8周對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的母兔分別取材，用4％甲醛磷酸緩沖液固定組織24小時(shí)，石蠟包埋，組織學(xué)切片，H-E染色，進(jìn)行組織學(xué)切片觀察。
實(shí)驗(yàn)組第3周，聚羥基乙酸部分降解，新生組織逐漸形成(圖5)。第6周，聚羥基乙酸降解基本完全，新生角膜基質(zhì)樣組織大部形成，新生組織呈嗜酸性，染色偏紅與周圍組織存在明確分界線(圖6)。第8周，聚羥基乙酸降解吸收完全，新生角膜基質(zhì)樣組織基本形成，膠原與角膜表面平行，排列較整齊，新生組織與周圍組織染色相似，分界線不明顯。(圖7)。
對(duì)照組PGA植入后第8周，PGA充填區(qū)域遺留明顯組織缺損，正常組織與生物材料植入部位交界處見少量成纖維細(xì)胞增生，包繞未徹底降解的PGA，無明顯的組織形成，與實(shí)驗(yàn)組存在顯著差異(圖8)。
再進(jìn)行Western-blot檢測(cè)I型膠原表達(dá)。
取正常兔的角膜組織和實(shí)驗(yàn)組的母兔第8周新生組織約3mm3大小，PBS洗滌后，加入裂解液，4℃過夜。將獲取的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入鼠抗兔I型膠原抗體以及β-actin抗體為內(nèi)參照，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，加入DAB顯色劑顯色5分鐘。
Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組母兔第8周新生組織中基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)I型膠原如圖9所示。圖中左邊為第8周實(shí)驗(yàn)組母兔的角膜基質(zhì)組織；中間為正常兔的角膜基質(zhì)組織；右邊為體外培養(yǎng)的原代角膜上皮細(xì)胞。
接下來進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察和膠原纖維直徑分布統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
分離獲取實(shí)驗(yàn)組母兔第8周的新生角膜基質(zhì)組織和正常兔的角膜基質(zhì)組織，置于2.5％戊二醛液中固定24小時(shí)，再用1％鋨酸液固定1小時(shí)；然后，用50％、70％、80％、90％及100％酒精溶液梯度脫水，用l∶1丙酮包埋液滲透，EPON包埋；最后超薄切片、使用透射電鏡觀察。隨機(jī)抽取正常兔的角膜膠原纖維300次和實(shí)驗(yàn)組母兔的角膜組織膠原纖維363次，測(cè)得膠原纖維直徑進(jìn)行Student t統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)。
隨機(jī)抽取正常兔的角膜300次，測(cè)得膠原纖維直徑平均為(28.5±3.5)nm；隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組母兔的新生角膜組織膠原纖維363次，測(cè)得膠原纖維直徑平均為(29.0±4.7)nm。Student t統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示實(shí)驗(yàn)組母兔的新生角膜基質(zhì)組織和正常兔的角膜膠原纖維直徑分布無顯著差異(P＞0.05)。
最后，應(yīng)用綠色熒光蛋白(Green Fluorescence Protein，GFP)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)示蹤用組織工程技術(shù)構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)組母兔的角膜基質(zhì)組織。
在無菌條件下分離新生兔的角膜基質(zhì)層組織，加入1.5％II型膠原酶5ml，在37℃恒溫振蕩器內(nèi)消化40分鐘，收集細(xì)胞懸液，以1000r/min速度離心5分鐘，棄去上清液。再用PBS反復(fù)沖洗3次，離心，棄去上清液，加入條件培養(yǎng)液10ml(含10％FBS的F-12培養(yǎng)液)，混勻，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，取細(xì)胞活力＞85％的角膜基質(zhì)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
將角膜基質(zhì)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。隔日換液。4日后，棄去培養(yǎng)液，加入含PLNCX2-EGFP病毒液2ml以及終濃度8μg/μLPolybrene，200mg/L G418持續(xù)篩選一周。再在Nikon熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。
收集轉(zhuǎn)染PLNCX2-EGFP后的角膜基質(zhì)細(xì)胞，107/ml的濃度50μ1接種PGA，加入條件培養(yǎng)液10ml，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，構(gòu)建角膜基質(zhì)細(xì)胞-PGA復(fù)合物，隔日換液，培養(yǎng)一周。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞在生物支架PGA中的生長(zhǎng)、增殖、基質(zhì)分泌和細(xì)胞形態(tài)變化狀況。
將角膜基質(zhì)細(xì)胞-PGA復(fù)合物植入實(shí)驗(yàn)組母兔角膜基質(zhì)板層內(nèi)在兔的耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)，麻醉平穩(wěn)后，手術(shù)顯微鏡下，掀起角膜基質(zhì)瓣，植入角膜基質(zhì)細(xì)胞-PGA復(fù)合物，基質(zhì)瓣復(fù)位。術(shù)后第8周取材。冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察以及H-E染色觀察。
經(jīng)PT67細(xì)胞包裝產(chǎn)生的PLNCX2-EGFP具有完整的包膜蛋白。用此病毒可直接感染角膜基質(zhì)細(xì)胞，GFP在角膜基質(zhì)細(xì)胞中獲得有效表達(dá)，經(jīng)藍(lán)光(40nm)激發(fā)，熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光(508nm)。PLNCX2-EGFP轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)細(xì)胞與PGA形成的復(fù)合物體外培養(yǎng)過程中，在熒光顯微鏡下也可見GFP穩(wěn)定表達(dá)(圖10、11)。熒光顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組第8周組織學(xué)切片可檢測(cè)到含EGFP綠色熒光的組織工程化角膜基質(zhì)組織(圖12)。
本發(fā)明應(yīng)用組織工程技術(shù)將角膜基質(zhì)細(xì)胞接種于生物材料，形成細(xì)胞-生物材料復(fù)合物植入角膜基質(zhì)板層內(nèi)，獲得了新生的組織工程角膜基質(zhì)組織。經(jīng)組織工程獲得的角膜基質(zhì)具有與正常角膜基質(zhì)類似組織學(xué)結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)性能也與正常角膜相類似，具有良好的組織相容性。而且，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，組織工程技術(shù)構(gòu)建的角膜基質(zhì)組織逐漸呈現(xiàn)透明。一般在術(shù)后8周左右，生物支架材料基本降解完全，此時(shí)組織工程角膜基質(zhì)基本接近透明。
將由本發(fā)明獲得的角膜基質(zhì)組織植入生物體角膜基質(zhì)的周邊，增加角膜厚度、以治療屈光不正，相較現(xiàn)有技術(shù)中采用其它聚合體材料的ICR具有更可靠的效果、更穩(wěn)定、預(yù)期性更好。而且這種材料與角膜之間完全可以達(dá)到真正的生物愈合，徹底避免其他替代材料移植可能導(dǎo)致的角膜溶解、房水滲漏與植入物脫出等并發(fā)癥。
權(quán)利要求
1.一種移植材料的制造方法，包括以下步驟步驟一制備生物支架；步驟二分離培養(yǎng)生物體角膜基質(zhì)細(xì)胞；步驟三制備角膜基質(zhì)細(xì)胞-生物支架復(fù)合物、并預(yù)制角膜基質(zhì)組織。
2.權(quán)利要求1所述的移植材料的制造方法，其特征在于步驟一包括取片狀直徑為14μm的非編織聚羥基乙酸(PGA)纖維3-7mg，剪成直徑為5mm的圓盤狀，在75％的酒精浸泡消毒30-45分鐘后，再用4℃無菌磷酸緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS；含青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml)反復(fù)沖洗3次，室溫下自然晾干。
3.如權(quán)利要求1所述的移植材料的制造方法，其特征在于步驟二包括在無菌條件下取得生物體眼球，經(jīng)PBS清洗后，放入消毒盤內(nèi)；解剖該生物體眼球，分離角膜上皮層、角膜基質(zhì)層和角膜內(nèi)皮層組織；取出角膜基質(zhì)層組織放入4℃的PBS中清洗后，剪成1-2mm3大小的組織塊。
4.如權(quán)利要求3所述的移植材料的制造方法，其特征在于步驟二還包括將組織塊置入15ml離心管中，加入150-250u/ml II型膠原酶4-7ml，移入恒溫振蕩器內(nèi)，在37℃、振蕩頻率80-120次/分鐘的條件下振蕩40-70分鐘；收集角膜基質(zhì)細(xì)胞懸液，以1000r/min的速度離心5-8分鐘，棄去上清液，經(jīng)PBS反復(fù)沖洗、離心、棄去上清液，再加入培養(yǎng)液10ml，混勻，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，取細(xì)胞活力＞75％的角膜基質(zhì)細(xì)胞備用。
5.如權(quán)利要求4所述的移植材料的制造方法，其特征在于步驟二進(jìn)一步包括將角膜基質(zhì)細(xì)胞和培養(yǎng)液的混合體放入5％CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求4或5所述的移植材料的制造方法，其特征在于步驟二所使用的培養(yǎng)液為PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、L-谷氨酰胺300μg/ml、維生素C50μg/ml、青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml。
7.如權(quán)利要求1所述的移植材料的制造方法，其特征在于步驟三包括在無菌條件下，用0.25％的胰蛋白酶和0.02％的乙烯二胺四乙酸(Ethylene Diamine-Tetraacidic Acid，EDTA)消化收集經(jīng)步驟二培養(yǎng)了5-8天的角膜基質(zhì)細(xì)胞，以1～4×107/ml的濃度30～50μl接種PGA，并加入相應(yīng)的培養(yǎng)液10ml，再放入5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日更換新鮮培養(yǎng)液。
8.如權(quán)利要求7所述的移植材料的制造方法，其特征在于步驟三中所使用的培養(yǎng)液為PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、L-谷氨酰胺300μg/ml、維生素C50μg/ml、青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml的Ham’F-12培養(yǎng)液10ml。
9.如權(quán)利要求1或8所述的移植材料的制造方法，其特征在于進(jìn)一步包括步驟四，將步驟三中獲得的形成細(xì)胞-生物材料復(fù)合物植入生物體角膜基質(zhì)板層內(nèi)，獲得新生的組織工程角膜基質(zhì)組織。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于一種用于生物體角膜基質(zhì)環(huán)(ICR)植入手術(shù)的移植材料的制造方法，包括以下步驟步驟一、制備生物支架；步驟二、分離培養(yǎng)生物體角膜基質(zhì)細(xì)胞；和步驟三、制備角膜基質(zhì)細(xì)胞－生物支架復(fù)合物、并預(yù)制角膜基質(zhì)組織；還可進(jìn)一步包括步驟四，將步驟三中獲得的形成細(xì)胞－生物材料復(fù)合物植入生物體角膜基質(zhì)板層內(nèi)，獲得新生的組織工程角膜基質(zhì)組織。將由本發(fā)明獲得的角膜基質(zhì)組織植入生物體角膜基質(zhì)的周邊，增加角膜厚度、以治療屈光不正，相較現(xiàn)有技術(shù)中采用其它聚合體材料的ICR具有更可靠的效果、更穩(wěn)定、預(yù)期性更好。而且這種材料與角膜之間完全可以達(dá)到真正的生物愈合，徹底避免其他替代材料移植可能導(dǎo)致的角膜溶解、房水滲漏與植入物脫出等并發(fā)癥。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1460715SQ0313659
公開日2003年12月10日 申請(qǐng)日期2003年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月22日
發(fā)明者曹誼林, 胡曉潔, 王敏 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院