專利名稱：含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒及其產(chǎn)生方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種含原癌基因c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒以及它的產(chǎn)生方法和用途。
背景技術(shù)：
赤潮毒素主要有麻痹性貝毒(paralytic shellfish poisoning，PSP)、腹瀉性貝毒(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)、神經(jīng)性貝毒(neurotoxic shellfish poisoning，NSP)和記憶缺失性貝毒(amnesiashellfish poisoning，ASP)等。其中PSP是鈉通道阻斷劑，可以特異的與Na+通道結(jié)合。我國四大海域貝類PSP均有檢出。PSP毒素包括石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素(neo-STX)、膝溝藻毒素1-4(GTX1-4)和氨基甲酰-N-磺基毒素等。目前，國內(nèi)外已建立了多種PSP檢測分析技術(shù)。其中細(xì)胞分析方法是利用PSP毒素的毒理特征，即和Na+通道特異結(jié)合的原理來檢測毒素，其最大的優(yōu)點是直接利用了毒素的作用機理，因而不僅能夠給出毒素量的信息，更重要的是能夠反映毒素的毒力水平。細(xì)胞分析中最具潛力、最受人們關(guān)注的是以報告基因為基礎(chǔ)的細(xì)胞分析法。原癌基因c-fos是一種快速反應(yīng)基因(immediate-early gene，IEG)，作為快速、靈敏的生物標(biāo)記已用于藻類毒素檢測的研究。正常細(xì)胞中c-fos的表達量很低，但當(dāng)細(xì)胞受到傷害時，可以快速表達。在富含Na+通道的細(xì)胞中，Na+通道激活劑可以導(dǎo)致Na+通道持續(xù)開放，導(dǎo)致Na+內(nèi)流，從而誘導(dǎo)細(xì)胞中的c-fos基因快速表達。NSP自身是鈉通道激活劑；而PSP可以特異的與Na+通道結(jié)合，減少或降低由于Na+內(nèi)流而引起的細(xì)胞損傷。
Elizabeth R Fairey等在荷蘭Elsevier Science公司出版AnalyticalBiochemistry，1997，251129-132上公開了一種以c-fos啟動子為啟動子、熒光素酶(Luc)為報告基因的赤潮毒素細(xì)胞分析法。具體步驟如下1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系N2A細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基(37℃，95％空氣，5％CO2)中。
應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，將c-fos-Luc與攜帶新霉素抗性基因的質(zhì)粒pSV2-neo(ATCC)共轉(zhuǎn)染N2A細(xì)胞。2-3周后，用G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，挑取毒素STX存在下可誘導(dǎo)熒光素酶表達的陽性N2AC細(xì)胞。將N2AC細(xì)胞培養(yǎng)于含15％胎牛血清、200μl/ml新霉素的DMEM完全培養(yǎng)基(37℃，95％空氣5％CO2)中。
2、測定方法將N2AC細(xì)胞接種于96孔板上100μl無血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度為30000/孔。24h后加入不同劑量的5μM藜蘆定和毒素。吸去培養(yǎng)基，加入20μl細(xì)胞裂解液(1％Triton X-100，5mM Tris，0.4mM CDTA(反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸)，10％丙三醇，pH7.8，1mM DTT(二硫蘇糖醇)，在室溫下裂解20-30min.每孔加入100μl熒光素酶和ATP混合液(熒光素酶測定試劑，Promega公司)，10s后測定熒光強度。
該方法最大的優(yōu)點是直接利用了毒素的作用機理，因而不僅能夠給出毒素量的信息，更重要的是能夠反映毒素的毒力水平。用熒光素酶作報告基因來檢測毒素有許多優(yōu)點，如對樣品的要求不高，對設(shè)備和技術(shù)的要求不高，檢測的時間短，檢測的精確度也比較高等等。
但是由于實驗中所用熒光素酶的活性測定需要裂解細(xì)胞，不能活體檢測，提取酶的過程相對比較麻煩，因而不利于方法的推廣和利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是公開一種含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒，而該報告基因的活性測定不需要裂解細(xì)胞，能活體檢測，提取過程也方便。
本發(fā)明的又一目的是公開一種產(chǎn)生上述含c-fos啟動子和報告基因的質(zhì)粒的方法。
本發(fā)明的再一個目的是公開一種上述含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒的用途。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。以綠色熒光蛋白GFP為報告基因，構(gòu)建含c-fos啟動子和EGFP報告基因的pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒。
用上述pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒載體體外轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞；篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；通過毒素對細(xì)胞鈉通道的阻滯或激活引起的細(xì)胞熒光蛋白表達的變化，即熒光強度的變化來檢測赤潮毒素(如GTX)。
因本發(fā)明中采用的報告基因是GFP，表達不受生物類型、基因型或細(xì)胞組織類型的限制，活性測定不需要裂解細(xì)胞，能進行活體檢測，對細(xì)胞無毒害、無需底物或共反應(yīng)因子，所以用本發(fā)明的pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒來檢測GTX赤潮毒素可彌補和克服熒光酶的缺陷，具有檢測方便，檢測結(jié)果可靠，適用范圍廣，能同時反映毒素水平與毒力的特點。


圖1是熒光報告基因表達強度與不同濃度GTX毒素的關(guān)系曲線。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步描述。綠色熒光蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)是源于水母(jellyfish)、海筆(sea pen，seapansy)等海洋無脊椎動物的一種蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)在體外經(jīng)適當(dāng)波長激發(fā)便可發(fā)出綠光，所發(fā)綠光可用普通熒光顯微鏡或熒光激活細(xì)胞分揀器檢測。作為報告基因，GFP的表達不受生物類型、基因型或細(xì)胞組織類型的限制，被認(rèn)為是一種在生物界較為“通用’’的基因。由于其檢測方便、對細(xì)胞無毒害、無需底物或共反應(yīng)因子，因而已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、病毒學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境檢測等領(lǐng)域?，F(xiàn)已在多種哺乳動物細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系、人體胚性腎細(xì)胞系、猿猴cos-1細(xì)胞系以及鼠NIH3 T3細(xì)胞系等)中表達成功。作為一種優(yōu)良的報告基因，GFP在藻毒素的檢測方面亦應(yīng)當(dāng)存在很好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的具體步驟為構(gòu)建含c-fos啟動子和EGFP報告基因的pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒；用上述pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞；篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。通過毒素對細(xì)胞鈉通道的阻滯或激活引起的細(xì)胞綠色熒光蛋白表達的變化，即熒光強度的變化來檢測赤潮毒素。
一、實驗材料1、菌株、質(zhì)粒1)菌株大腸桿菌E.coliDH5-α2)質(zhì)粒HP443質(zhì)粒由日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)系IshikawaToshio教授惠贈。
2、生化試劑1)VspI，EcoRI，T4-DNALigase等工具酶購自美國MD公司；RNaseA購自Sigma公司；DL2000 Marker，DL15000 Marker購自Takara公司；PCR引物由上海博亞生物工程公司合成。
2)Tris，EDTA，Trytone，Yeast Extract、G418、飽和酚等試劑購自寶泰克生物工程公司。
3)Gel Extraction Kit，PCR Purification Kit購自德國QIAGEN公司；Promix Taq PCR試劑盒購自Takara公司。
二、方法步驟1、重組質(zhì)粒pEGFP-c-fos的構(gòu)建1)pEGFP質(zhì)粒的大量擴增、抽提pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進行大量擴增；堿裂解法大量抽提pEGFP質(zhì)粒，電泳檢測質(zhì)粒純度和含量；用VspI、EcoRI對提取的質(zhì)粒pEGFP進行酶切，試劑盒凝膠回收大片段酶切產(chǎn)物；回收pEGFP載體，去磷酸化后用PCR純化試劑盒純化去磷酸化產(chǎn)物。
2)c-fos啟動子的擴增、酶切及純化根據(jù)已公布的人c-fos啟動子的序列，設(shè)計兩端引物引物1為上游5’端引物，其中包含22個c-fos啟動子5’端互補的堿基，一個VspI識別位點，4個保護堿基。
引物2為下游3’端引物，其中包含21個與c-fos啟動子3’端互補的堿基，一個EcoRI識別位點，3個保護堿基Primer15’-TATAATTAATTTCTCATTCTGCGCCGTTCCCG-3’Primer25’-AAAGAATCCCCGCCGGCTCAGTCTTGGCTT-3’以含c-fos啟動子的HF443質(zhì)粒為模板，利用Takara公司的Promix Taq試劑盒進行PCR擴增。反應(yīng)條件95℃，預(yù)變性5min，94℃40s；60℃，1min；72℃，1min，在PCR儀上進行30個循環(huán)，72℃延伸7min；反應(yīng)結(jié)束后，各取5μl反應(yīng)產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測；取200μl PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，用QIAGEN公司凝膠回收試劑盒回收；將回收的PCR產(chǎn)物，用VspI和EcoRI雙酶切。
3)連接反應(yīng)將雙酶切的pEGFP載體和c-fos啟動子片斷于在1.5ml的離心管中進行連接反應(yīng)，16℃連接30min。
4)篩選重組子連接液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化子的平板上隨機挑取10個菌落，擴增培養(yǎng)后用堿裂解法少量提取質(zhì)粒備用。酶切、PCR、測序鑒定。
2.可穩(wěn)定表達pEGFP-c-fos的BIU-87細(xì)胞株的建立1)細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)于含15％新生牛血清、100U/ml青霉素、25μg/ml鏈霉素的RMPI 1640完全培養(yǎng)基(37℃，95％空氣5％CO2，飽和濕度)中，并使之維持單層貼壁生長，2天換液一次，用血清瓶大量培養(yǎng)BIU-87細(xì)胞，在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時取少量細(xì)胞進行傳代，其他細(xì)胞進行實驗。
2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及抗性克隆的篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的前一天用0.25％胰酶和0.4％EDTA消化并記數(shù)細(xì)胞，使每瓶細(xì)胞濃度大約為1～2×105。分別溶解1～2μg DNA質(zhì)粒和5μl的Lipofect AMINE 2000于50μl的不含血清的培養(yǎng)基中，室溫溫育5min后混合20min。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用1ml的D-Hank’s液清洗細(xì)胞后，在培養(yǎng)瓶中加入2ml的RMPI 1640(不含雙抗，不含血清)。將DNA-Lipofect AMINE2000的混合物加入到RMPI 1640中，來回輕輕搖動混合均勻。37℃中溫育。在無血清溫育6h后，在培養(yǎng)體系中加入400μl的小牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)12～24h。次日用胰酶消化細(xì)胞，計數(shù)，使細(xì)胞濃度約為1～5×104。取一24孔培養(yǎng)板，按每孔1ml分別接種于各孔中。等細(xì)胞貼壁完全后，向每孔中加入G418篩選3～4周，直至抗性細(xì)胞克隆形成?？剐钥寺∩珊螅瑪U大培養(yǎng)，一部分凍存起來，一部分繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
3、赤潮毒素GTX的檢測取一24孔培養(yǎng)板，分別接種1ml濃度為1×105/ml的可穩(wěn)定表達pEGFP-c-fos的BIU-87細(xì)胞，共7孔。等細(xì)胞貼壁完全后，先向每孔加入約100ng/ml的烏頭堿，30min后在向每孔依次加入不同濃度的PSP毒素GTX。12h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，并拍照。采用美國Media Cybernetics公司的Image-pro Plus專業(yè)圖像分析軟件對各濃度組圖片熒光強度進行分析統(tǒng)計，建立綠色熒光表達強度與不同濃度GTX毒素的關(guān)系曲線。
結(jié)果顯示，綠色熒光的表達強度與不同濃度GTX毒素的關(guān)系曲線大致成“V”字形。當(dāng)GTX濃度小于50ng/ml時，熒光強度隨著GTX濃度的增加逐漸減弱；大于50ng/ml時熒光強度隨著GTX濃度的增加逐漸增強，與圖像觀察的結(jié)果相吻合。GTX對細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達存在一定的劑量依賴關(guān)系，特別是在低濃度范圍內(nèi)(小于50ng/ml)，GTX對綠色熒光蛋白表達的抑制作用更為靈敏、準(zhǔn)確，GTX納克級的變化都會引起熒光強度的改變。說明利用該熒光報告基因的表達強度與不同濃度GTX毒素的關(guān)系曲線，可以用本發(fā)明的重組質(zhì)粒對赤潮毒素GTX進行定量的檢測。
權(quán)利要求
1.一種含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒，其特征是所述報告基因為EGFP基因。
2.一種按權(quán)利要求1所述的含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒的產(chǎn)生方法，其特征是該質(zhì)粒的具體重組步驟為1)pEGFP質(zhì)粒的大量擴增、抽提用pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進行大量擴增；堿裂解法大量抽提pEGFP質(zhì)粒，電泳檢測質(zhì)粒純度和含量；用VspI、EcoRI對提取的質(zhì)粒pEGFP進行酶切，試劑盒凝膠回收大片段酶切產(chǎn)物；回收pEGFP載體，去磷酸化后用PCR純化試劑盒純化；2)c-fos啟動子的擴增、酶切及純化根據(jù)人c-fos啟動子的序列，設(shè)計兩端引物引物1為上游5’端引物，其中包含22個c-fos啟動子5’端互補的堿基，一個VspI識別位點，4個保護堿基；引物2為下游3’端引物，其中包含21個與c-fos啟動子3’端互補的堿基，一個EcoRI識別位點，3個保護堿基Primer1’-TATAATTAATTTCTCATTCTGCGCCGTTCCCG-3’Primer25’-AAAGAATCCCCGCCGGCTCAGTCTTGGCTT-3’以含c-fos啟動子的HF443質(zhì)粒為模板，利用Promix Taq試劑盒進行PCR擴增；反應(yīng)條件95℃，預(yù)變性5min，94℃40s；60℃，1min；72℃，1min，在PCR儀上進行30個循環(huán)，72℃延伸7min；反應(yīng)結(jié)束后，各取5μl反應(yīng)產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測；取200μl PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，用凝膠回收試劑盒回收；將回收的PCR產(chǎn)物，用VspI和EcoRI雙酶切；3)連接反應(yīng)將雙酶切的pEGFP載體和c-fos啟動子片斷于在1.5ml的離心管中進行連接反應(yīng)，16℃連接30min；4)篩選重組子連接液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化子的平板上隨機挑取10個菌落，擴增培養(yǎng)后用堿裂解法少量提取質(zhì)粒備用；酶切、PCR、測序鑒定。
3.一種按權(quán)利要求1所述的含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒的用途，其特征是該重組質(zhì)粒用于檢測GTX貝毒毒素，具體的應(yīng)用步驟如下1)可穩(wěn)定表達pEGFP-c-fos的BIU-87細(xì)胞株的建立(1)細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)于含15％新生牛血清、100U/ml青霉素、25μg/ml鏈霉素的RMPI 1640完全培養(yǎng)基(37℃，95％空氣5％CO2，飽和濕度)中，并使之維持單層貼壁生長，2天換液一次，用血清瓶大量培養(yǎng)BIU-87細(xì)胞，在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時取少量細(xì)胞進行傳代，其他細(xì)胞進行實驗；(2)轉(zhuǎn)染及抗性克隆的篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的前一天用0.25％胰酶和0.4％EDTA消化并記數(shù)細(xì)胞，使每瓶細(xì)胞濃度大約為1～2×105/ml；分別溶解1～2μg DNA質(zhì)粒和5μl的Lipofect AMINE 2000于50μl的不含血清的培養(yǎng)基中，室溫溫育5min后混合20min；棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用1ml的D-Hank’s液清洗細(xì)胞后，在培養(yǎng)瓶中加入2ml不含雙抗、不含血清的RMPI 1640；將DNA-Lipofect AMINE2000的混合物加入到RMPI 1640中，來回輕輕搖動混合均勻；37℃中溫育；在無血清溫育6h后，在培養(yǎng)體系中加入400μl的小牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)12～24h；次日用胰酶消化細(xì)胞，計數(shù)，使細(xì)胞濃度約為1～5×104；取一24孔培養(yǎng)板，按每孔1ml分別接種于各孔中；等細(xì)胞貼壁完全后，向每孔中加入G418篩選3～4周，直至抗性細(xì)胞克隆形成；抗性克隆生成后，擴大培養(yǎng)，一部分凍存起來，一部分繼續(xù)傳代培養(yǎng)；2)赤潮毒素GTX的檢測取一24孔培養(yǎng)板，分別接種1ml濃度為1×105的可穩(wěn)定表達pEGFP-c-fos的BIU-87細(xì)胞，共7孔；等細(xì)胞貼壁完全后，先向每孔加入約100ng/ml的烏頭堿，30min后在向每孔依次加入不同濃度的被測PSP毒素GTX；12h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，并拍照；用專業(yè)圖像分析軟件對各濃度組圖片進行分析統(tǒng)計；將統(tǒng)計結(jié)果與圖1所示的綠色熒光表達強度與不同濃度GTX毒素的關(guān)系曲線進行比較；定量得出被測GTX赤潮毒素的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含原癌基因c－fos啟動子和報告基因的pEGFP－c－fos重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和用途。該重組質(zhì)粒檢測GTX赤潮毒素，檢測方便、對細(xì)胞無毒害、無需底物或共反應(yīng)因子，檢測結(jié)果可靠，適用范圍廣。
文檔編號C12Q1/68GK1492047SQ0314048
公開日2004年4月28日 申請日期2003年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月11日
發(fā)明者劉潔生, 楊維東, 吳春利 申請人:暨南大學(xué)