專利名稱：一種植物果糖1，6－二磷酸醛縮酶編碼基因保守區(qū)的克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因保守區(qū)的快速克隆方法。
背景技術(shù)：
果糖1，6-二磷酸醛縮酶是植物碳素代謝中催化六碳糖和三碳糖相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，對植物能量的儲存與釋放起著重要作用。同時它也參與了植物對外界環(huán)境因子(如鹽度、光強)變化的應(yīng)答反應(yīng)。已經(jīng)獲得的果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基有很多，如煙草(Yamada，S.，Komori，T.，Hashimoto，A.，Kuwata，S.，Imaseki，H.andubo，T.Differential expression of plastidic aldolase genes in Nicotiana plantsunder salt stress.Plant Sci.154(1)，61-69(2000))，豌豆(Razdan，K.Heinrikson，R.L.，Zurcher-Neely，H.，Morris，P.W.and Anderson，L.E.Chloroplast and cytoplasmicenzymesisolation and sequencing of cDNAs coding for two distinct pea chloroplastaldolases JOURNAL Arch.Biochem.Biophys.298(1)，192-197(1992))。目前對其研究大多限于生理生化水平，而對基因結(jié)構(gòu)的研究還十分有限。其中編碼基因的獲得是關(guān)鍵。目前對于未知序列基因的克隆還存在著一定的難度，所需周期長、背景多、程序負責(zé)，直接影響到對基因結(jié)構(gòu)和功能的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因保守區(qū)的快速克隆方法。
本發(fā)明提出的植物果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因保守區(qū)的克隆方法，包括設(shè)計兩對兼并引物，用于巢式PCR方法，對植物果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因的第一鏈cDNA進行擴增；該兼并引物的序列為XF15’-atc/t ctc/t ttc/t gag gag ac-3’XF25’-ggc/t atc/t aag/a gtt/a gac aag gg-3’XR15’-gtt cat c/ggc a/gtt caa/g gtt-3’XR25’-acc atg t/cta/g ggc ttg/c aa/g g ag-3’其中，XF1和XR1是一對，XF2和XR2是第二對。這兩對兼并引物，具有序列表中序列X的核苷酸序列或?qū)⑿蛄蠿的兼并核苷酸序列以N或其他核苷酸取代。
本發(fā)明方法中，還包括從植物中提取果糖1，6-二磷酸醛縮酶總RNA或mRNA，并反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA，以及對擴增產(chǎn)物的接插載體，轉(zhuǎn)化等，與常規(guī)克隆方法相同。
由本發(fā)明得到的DNA片段與果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因同源，翻譯得到的氨基酸序列與果糖1，6-二磷酸醛縮酶高度同源，通常，其同源度達60％以上，有些同源度達80％以上，甚至更高。
利用上述兼并引物序列克隆植物果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因保守區(qū)一般可在3天內(nèi)完成，具體步驟如下6)提取植物總RNA或mRNA，并反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA；7)通過巢式PCR方法利用兼并引物對第一鏈cDNA進行擴增；8)將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接插入克隆載體；9)轉(zhuǎn)化大腸桿菌；10)對所得到的陽性克隆進行序列分析。
本發(fā)明分離鑒定出的植物果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因的保守序列，可用于果糖1，6-二磷酸醛縮酶全長cDNA的克隆。
隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，可通過控制應(yīng)用本發(fā)明克隆到的果糖1，6-二磷酸醛縮酶全長cDNA在植物體內(nèi)表達，控制植物對瓦解環(huán)境因子(如鹽度、光強)的反應(yīng)，從而提高植物在逆境中的生存能力。
具體實施例方式
實施例1、克隆雪松果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因保守區(qū)的序列，包括以下步驟1)提取雪松葉片總RNA2)以oligo(dT)為引物，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA；3)采用前述二對兼并引物XF1和XF2，XR1和XR2，通過巢式PCR方法對第一鏈cDNA進行擴增；4)將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離，割膠回收，并連接入T-載體；5)轉(zhuǎn)化大腸桿菌；6)對所得到的陽性克隆進行序列分析；7)所得序列經(jīng)分析，確定與果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因同源，翻譯得到的氨基酸序列與果糖1，6-二磷酸醛縮酶同源高達60％以上，其氨基酸序列見SEQ ID NO.1。SEQ ID NO.1gikvdkglvp lagsndeswc qgldglasrc aayyqqgarf akwrtvvsip tgpsalavkeaawglaryaa iaqdnglvpi vepeimldge hgidrtfevs lkvwsevffy laennvl fegillkpsmvtp gaeckdrasp etvaqytlsl lrrrippsvp gimflsggqs eveatlnlnamnqapnpwhv sfsyaralqn tclktwagrp envdaaqkvl lvrakansla qlgkysaegesaeskegmfv kgyty
權(quán)利要求
1.一種植物果糖1，6-二磷酸醛縮酶編碼基因保守區(qū)的克隆方法，其特征在于包括設(shè)計兩對兼并引物，用于PCR方法，對果糖1，6-二磷酸醛縮酶的編碼基因的第一鏈cDNA進行擴增，該兼并引物的序列為XF15’-atc/t ctc/t ttc/tgag gag ac-3’XF25’-ggc/t atc/t aag/a gtt/a gac aag gg-3’XR15’-gtt cat c/ggc a/gtt caa/g gtt-3’XR25’-acc atg t/cta/g ggc ttg/c aa/g g ag-3’其中，XF1和XR1是一對，XF2和XR2是第二對。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆方法，其特征在于所述引物具有序列表中序列X的核苷酸序列，或?qū)⑿蛄蠿的兼并核苷酸序列以N或其它核苷酸取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆方法，具體步驟如下1)提取植物總RNA或mRNA，并反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA；2)通過巢式PCR方法利用兼并引物對第一鏈cDNA進行擴增；3)將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收，連接插入克隆載體；4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌；5)對所得到的陽性克隆進行序列分析。
全文摘要
本發(fā)明為一種普遍適用的植物果糖1，6－二磷酸醛縮酶編碼基因保守區(qū)的快速克隆方法。其中，包括設(shè)計了二對兼并引物XF1和XF2，XR1和XR2，用于巢式PCR方法，對其第一鏈cDNA進行擴增。PCR得到的DNA片段與果糖1，6－二磷酸醛縮酶編碼基因同源，翻譯得到的氨基酸序列與果糖1，6－二磷酸醛縮酶高度同源。該序列可用于植物果糖1，6－二磷酸醛縮酶全長cDNA的克隆。
文檔編號C12P19/34GK1514008SQ0314181
公開日2004年7月21日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者張小寧, 鐘揚, 南蓬, 沈大棱 申請人:復(fù)旦大學(xué), 上海生物信息技術(shù)研究中心