專利名稱：抑制sars冠狀病毒侵染宿主細(xì)胞的多肽類藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗SARS冠狀病毒藥物，具體涉及抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細(xì)胞的多肽類抗病毒藥物。
背景技術(shù)：
SARS冠狀病毒是引起2003年在我國和世界范圍內(nèi)爆發(fā)的“非典型肺炎”的病原體，目前還沒有特效的藥物能夠治療。
SARS病毒是一種帶囊膜的冠狀病毒，其侵染細(xì)胞的第一步就是病毒囊膜與宿主細(xì)胞的融合。多肽類融合阻斷分子因其能夠阻斷病毒囊膜與宿主細(xì)胞的融合，在其他病毒藥物的開發(fā)研制中有著成功的經(jīng)驗(yàn)，如HIV囊膜蛋白GP41有兩段HR結(jié)構(gòu)域，分別形成三個(gè)N螺旋和三個(gè)C螺旋。在HIV侵入細(xì)胞的過程中，這三個(gè)N螺旋和三個(gè)C螺旋形成Coiled-coil六聚體結(jié)構(gòu)起著至關(guān)重要的作用。根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)的多肽類藥物T-20(商品名Fuzeon)已經(jīng)上市，它能夠有效地阻斷由GP41本身的α螺旋形成六聚體，從而阻斷HIV膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的融合。研究表明，T-20的阻斷能力強(qiáng)，對機(jī)體副作用低，是一種理想的藥物。
SARS囊膜蛋白SPIKE的結(jié)構(gòu)研究表明，在SPIKE蛋白中同樣存在能夠形成Coiled-coil結(jié)構(gòu)的兩段HR結(jié)構(gòu)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)一類阻斷SARS冠狀病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的抗病毒藥物。
本發(fā)明的技術(shù)方案是尋找可起到SARS冠狀病毒多肽類融合阻斷作用的物質(zhì)，通過該物質(zhì)與SARS囊膜蛋白Spike的相互作用，阻止SARS囊膜蛋白Spike的構(gòu)型改變，從而阻斷病毒囊膜與宿主細(xì)胞的融合，達(dá)到預(yù)防和治療SARS病毒感染的目的。
本發(fā)明提供的SARS冠狀病毒多肽類融合阻斷藥物的具有如下通式X-SEQ-Z其中，SEQ表示SARS冠狀病毒囊膜蛋白SPIKE中的多肽，所述多肽包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21個(gè)氨基酸序列。
在SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21個(gè)氨基酸序列的多肽中至少一個(gè)氨基酸殘基的連接使用非肽鍵連接方式，例如，以亞氨基、酯、肼、氨基脲或含氮化學(xué)鍵的形式連接；至少一個(gè)氨基酸殘基以D構(gòu)型存在；至少有一個(gè)氨基酸被另一個(gè)不同的氨基酸置換，所述置換方式是保守的和/或不保守的；所述多肽可以是SARS自然突變株相對應(yīng)氨基酸位置的同源物；所述多肽可以被包含在一段其它多肽中；所述多肽可以以單體，二聚體，三聚體和多聚體的形式存在。
X包括氨基、乙?；澳承┦杷鶊F(tuán)和大分子載體基團(tuán)；Z包括羧基、氨基及某些疏水基團(tuán)和大分子載體基團(tuán)；所述疏水基團(tuán)包括9-芴基甲氧羰基(9-fluorenyl methoxy-carbonyl)、芐氧羰基(carbobenzoxyl)1-二甲胺基萘-5-磺酰(dansyl)和叔丁氧羰基(t-butyloxy carbonyl)；所述大分子載體基團(tuán)是共軛脂肪酸(Lipid-fatty acid conjuate)、聚乙二醇或碳水化合物類基團(tuán)。
上述通式中，X和Z也可以不存在。即，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21個(gè)氨基酸序列也可用作阻斷SARS冠狀病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的抗病毒藥物。
本發(fā)明所述的多肽可以從真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)或固相化學(xué)合成的途徑得到。
在采用原核表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)中，先用PCR的方法擴(kuò)增SARS囊膜蛋白SPIKE的一段序列，將其克隆到表達(dá)載體上。誘導(dǎo)表達(dá)后，使用GlutathioneSepharose 4B系統(tǒng)純化得到多肽樣品。
化學(xué)合成可選用本技術(shù)領(lǐng)域人工合成多肽的常規(guī)操作方法。
經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)測試，本發(fā)明的多肽類藥物對于SARS冠狀病毒活病毒感染其易感細(xì)胞VeroE6具有阻斷能力，表明本發(fā)明的多肽類藥物可抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21個(gè)氨基酸序列所示的多肽中，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15采用原核表達(dá)系統(tǒng)得到，SEQ ID NO.16～21為人工合成得到。
實(shí)施例1大腸桿菌表達(dá)多肽1.SARS病毒樣本的總RNA的提取(1)用1ml trizol(GIBCO)抽提含有SARS病毒樣本；(2)加200μl氯仿，劇烈振蕩15秒；(3)室溫靜置3-5min，10000g4℃離心15min；
(4)吸出500μl水相，轉(zhuǎn)移到新管中；(5)加入500μl異丙醇，充分振蕩混勻；室溫靜置10min(6)10000g4℃離心10min，得到SARS病毒RNA沉淀。
2.SARS病毒SPIKE蛋白基因的克隆(1)將SARS病毒RNA基因組反轉(zhuǎn)錄為DNA反轉(zhuǎn)錄引物SPIKE蛋白antisense primer反轉(zhuǎn)錄酶MMLV-RT(promega)(2)通過PCR方法擴(kuò)增出SPIKE的DNA序列。
擴(kuò)增引物Sense5’-cgggatccaacgaacatgtttattttcttattatttc-3’antisense5’-cggaattcgtttatgtgtaatgtaatttgacaccc-3’(3)將PCR產(chǎn)物連接到pcDNA3.1+載體中連接方式BamHI，EcoRI雙切連接。
3.克隆得到下列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15的多肽的序列及其PCR引物如下SEQ ID NO.1NGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTAAATGGCATTGGAGTTACCTGC AGT TGA TGT TGT TGT AAGSEQ ID NO.2PDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQCCAGATGTTGATCTTGGCTTGAAGGTCAATGAGTGATTCSEQ ID NO.3GDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQGGCGACATTTCAGGCATTAACTTGAAGGTCAATGAGTGATTCSEQ ID NO.4ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWA TTT CAG GCA TTA ACG CTT C
CCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.5INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWATTAACGCTTCTGTCGTCAACCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.6VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWG TCG TCA ACA TTC AAA AAGCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.7IQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWA TTC AAA AAG AAA TTG ACC GCCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.8IDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWA TTG ACC GCC TCA ATG AGG TCCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.9ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKA TTT CAG GCA TTA ACG CTT CTTTTCCCAATTCTTGAAGSEQ ID NO.10INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKATTAACGCTTCTGTCGTCAACTTTTCCCAATTCTTGAAGSEQ ID NO.11VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKG TCG TCA ACA TTC AAA AAGTTTTCCCAATTCTTGAAGSEQ ID NO.12IQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKA TTC AAA AAG AAA TTG ACC GCTTTTCCCAATTCTTGAAGSEQ ID NO.13ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL
A TTT CAG GCA TTA ACG CTT CAAG GTC AAT GAG TGA TTC ASEQ ID NO.14INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLATTAACGCTTCTGTCGTCAACAAG GTC AAT GAG TGA TTC ASEQ ID NO.15VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLG TCG TCA ACA TTC AAA AAGAAG GTC AAT GAG TGA TTC A4，多肽的表達(dá)(1)將PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pGEX-6p-2載體(Amersham Pharmacia Biotech.27-4598-01)的sma I切點(diǎn)。
(2)將正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到JM109(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，用含抗生素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。
(3)過夜培養(yǎng)物1∶50接400ml新鮮培養(yǎng)基，2小時(shí)后加80ml 1M IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
(4)4℃，8000rpm 6min離心培養(yǎng)的細(xì)菌，加入15ml Lysis Buffer重懸沉淀，加入溶菌酶至終濃度為100mg/ml，置冰上30min，冰上超聲12次(300W，10s/10s)(5)4℃，12000rpm離心15min，取上清以5-10mgGST/ml的比例加入Glutathione Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech.17-0756-01)，在冰上結(jié)合1h，使樣品液過層析柱(Bio-Rad 74306)使用5倍體積的Hepes500洗滌GST柱子，之后使用10倍體積的Hepes100洗滌，再用0.5ml含10mMGSH的Hepes100洗滌柱料4次，收集流出液。
(6)在酶切Buffer終透析過夜，除去GSH，使用分光光度計(jì)定量(1OD280＝0.5mg/ml)，按照每100mg加入1ml(2units)preScissionProtease(Amersham Pharmacia Biotech.27-0843-01)，4℃酶切3h。以5-10mg GST/ml的比例加入Glutathione Sepharose 4B(Amersham PharmaciaBiotech.17-0756-01)，在冰上結(jié)合1h，使樣品液過層析柱(Bio-Rad74306)，收集流出液，使用0.5ml酶切Buffer再洗一次，收集流出液。
實(shí)施例2多肽抑制SARS病毒感染靶細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料及方法1病毒的獲取和培養(yǎng)取含有SARS病毒的上清加到長成單層的VeroE6細(xì)胞上，37℃感染1小時(shí)，加入DMEM+2％FBS，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)觀察CPE，待CPE完全時(shí)收獲上清。
2病毒滴度的測定將病毒上清連續(xù)稀釋，將只有一半細(xì)胞樣品出現(xiàn)CPE，而下一個(gè)稀釋度沒有CPE的稀釋度定為最大稀釋度。
3測定多肽對病毒的抑制活性每份測試細(xì)胞加入多肽樣品終濃度1μM，加入病毒200TCID50，24小時(shí)后觀察CPE判斷細(xì)胞是否被感染。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果所觀察到CPE細(xì)胞未被感染，證明受試多肽可阻斷SARS冠狀病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。
序列表<110>北京大學(xué)<120>抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細(xì)胞的多肽類藥物<130>03-01<160>19<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>38<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>1Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln1 5 10 15Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu20 25 30Thr Thr Thr Ser Thr Ala35<210>2<211>40<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>2Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val1 5 10 15Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu20 25 30Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln
35 40<210>3<211>35<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>3Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu1 5 10 15Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile20 25 30Asp Leu Gln35<210>4<211>46<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>4Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp1 5 10 15Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25 30Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp35 40 45<210>5
<211>43<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>5Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn1 5 10 15Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu20 25 30Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp35 40<210>6<211>39<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>6Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys1 5 10 15Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu20 25 30Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp35<2l0>7<211>36<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>7Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn
1 5 10 15Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile20 25 30Lys Trp Pro Trp35<210>8<211>32<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>8Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile1 5 10 15Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp20 25 30<210>9<211>37<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>9Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp1 5 10 15Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25 30Gln Glu Leu Gly Lys35
<210>10<211>34<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>10Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn1 5 10 15Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu20 25 30Gly Lys<210>11<211>30<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>11Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys1 5 10 15Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys20 25 30<210>12<211>27<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>12Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn1 5 10 15Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys20 25
<210>13<211>32<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>13Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp1 5 10 15Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25 30<210>14<211>29<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>14Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn1 5 10 15Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25<210>15<211>25<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>15Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys1 5 10 15
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25<210>16<211>35<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>16Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys1 5 10 15Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu20 25 30Ile Asp Leu35<210>17<211>35<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>17Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu1 5 10 15Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys20 25 30Trp Pro Trp35<210>18<211>36
<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>18Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val1 5 10 15Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu20 25 30Ala Ala Thr Lys35<210>19<211>36<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>19Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn1 5 10 15Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala20 25 30Leu Gly Lys Leu35<210>20<211>35<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>20Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys1 5 10 15
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu20 25 30Gln Tyr Ile35<210>21<211>35<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>21Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp1 5 10 15Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20 25 30Gln Glu Leu3權(quán)利要求
1.抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細(xì)胞的多肽類藥物，具有如下通式X-SEQ-Z式中，SEQ表示SARS冠狀病毒囊膜蛋白SPIKE中的多肽，所述多肽包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21個(gè)氨基酸序列；X包括氨基、乙酰基及疏水基團(tuán)和大分子載體基團(tuán)；Z包括羧基、氨基及疏水基團(tuán)和大分子載體基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1所述的多肽類藥物，其中所述多肽的至少一個(gè)氨基酸殘基的連接使用非肽鍵連接方式；所述非肽鍵連接方式包括以亞氨基、酯、肼、氨基脲或含氮化學(xué)鍵的形式連接。
3.權(quán)利要求1所述的多肽類藥物，其中所述多肽的至少一個(gè)氨基酸殘基以D構(gòu)型存在。
4.權(quán)利要求1所述的多肽類藥物，其中所述多肽的至少一個(gè)氨基酸被另一個(gè)不同的氨基酸置換，所述置換方式是保守的和/或不保守的。
5.權(quán)利要求1所述的多肽類藥物，其中所述多肽是SARS自然突變株相對應(yīng)氨基酸位置的同源物。
6.權(quán)利要求1所述的多肽類藥物，其中所述多肽被包含在一段其它多肽中。
7.權(quán)利要求1所述的多肽類藥物，其中所述多肽的形式包括單體、二聚體、三聚體和多聚體。
8.權(quán)利要求1所述的多肽類藥物在制備預(yù)防和治療SARS冠狀病毒藥物中的用途。
9.具有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的多肽。
10.權(quán)利要求9所述的多肽在制備預(yù)防和治療SARS冠狀病毒藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細(xì)胞的多肽類抗病毒藥物，所述藥物的通式為X－SEQ－Z，其中SEQ表示SEQ ID NO.1～SEQ ID N0.21所示的21個(gè)氨基酸序列。經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)測試，本發(fā)明的多肽類藥物可抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細(xì)胞。
文檔編號C12N15/63GK1566142SQ0314303
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者鄧宏魁, 丁明孝, 袁克湖, 慶婷婷, 陳堅(jiān), 熊梓鍇, 聶玉春, 王在, 易凌, 江鵬飛, 任立晨 申請人:北京大學(xué)