專利名稱：一種具有電泳純的蚓激酶及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種自赤子愛勝蚓(Eisenia foelide)中提取的可用于缺血性腦血管疾病治療的蚓激酶及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
心腦血管病是嚴(yán)重危害人類健康和生命的主要疾病，血漿中含量最高的凝血因子纖維蛋白原(Fg，凝血因子I)，是心腦血管疾病的獨(dú)立危險因子。降低纖維蛋白原是治療腦梗等血栓性疾病主要的臨床手段，因此研制降纖藥物有重大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
目前臨床用于注射治療缺血性腦血管疾病的藥物有不少，包括鏈激酶、尿激酶、巴曲酶、組織型纖溶酶原激活劑等等。這些藥物有的抗原性強(qiáng)，治療效果不明顯，有的半衰期短，原材料來源困難，有的制備工藝復(fù)雜，價格昂貴，依賴進(jìn)口，而大多數(shù)此類藥物共同的缺點(diǎn)是具有出血毒性。
臨床常見的可用于降纖，抗栓的口服類藥物，如百奧蚓激酶膠囊(國藥準(zhǔn)字H11021129)，該藥是從赤子愛勝蚓中提取的含有多個纖溶活性蛋白同功酶組分的蚓激酶原料藥制備而成，目前已經(jīng)廣泛用于腦血栓的預(yù)防和治療，其療效和安全性已得到醫(yī)生和患者的肯定。但是口服藥物發(fā)揮作用時間較慢，且蛋白類藥物的最佳給藥途徑為注射給藥。由于蛋白同功酶理化性質(zhì)較接近而導(dǎo)致分離純化困難，并且這些同功酶有不同的含量、活性和毒性，如果選用了毒性大的組分，則很難制成安全的藥品，純度和毒性這兩個問題成為蚓激酶注射劑難以面世的主要困難。
各國的研究人員都在努力發(fā)展分離純化技術(shù)，力圖從蚯蚓中提取毒性低，溶栓性能好的高純度蛋白。日本人Mihara等從粉正蚓(Lumbricus rubellus)中純化出6個具有纖溶活性的蛋白酶組分(美國專利號4,568,545)，其小鼠靜脈注射半數(shù)致死量分別為33，38，114，135，88和27毫克/公斤，各組分毒性相差較大。但是，其分離純化工藝復(fù)雜，難以工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用陰離子交換層析及超濾法從赤子愛勝蚓中提取電泳純度的蚓激酶，并作為用于制備降纖藥物的原料。本發(fā)明采用的方法所涉及的離子交換介質(zhì)重復(fù)使用次數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于常見報道中純化蛋白質(zhì)常用的疏水層析和親和層析介質(zhì)，從而很好的降低了產(chǎn)品成本，利于工業(yè)放大。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供蚓激酶在制備低毒、高效的注射用降纖藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的蚓激酶是通過如下步驟制備得到的a.將赤子愛勝蚓粗提物或從赤子愛勝蚓中分離純化而得的口服用蚓激酶原料藥配制成上樣緩沖液；b.高載量或高流速的陰離子交換層析柱用緩沖液平衡，上樣并沖洗后，用含有0-1M的NaCl緩沖液梯度洗脫，收集蛋白峰；c.將步驟b中所獲的蛋白峰常規(guī)超濾濃縮脫鹽，或用Sephadex G-25進(jìn)行緩沖液替換并脫鹽；d.高分辨率的陰離子交換層析柱用緩沖液平衡，將步驟c中所獲樣品上樣并沖洗后，用0-1M的NaCl緩沖液梯度洗脫，收集蛋白峰，經(jīng)過常規(guī)超濾或Sephadex G-25層析脫鹽處理后即可得電泳純的蚓激酶。
其中步驟a、b、d中優(yōu)先采用磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris-HCl)或巴比妥-氯化鈉緩沖液；步驟b中優(yōu)先選用陰離子交換介質(zhì)商品名為Q Sepharose XL、Q Sepharose Fast Flow或DEAE Sepharose FastFlow；步驟b中優(yōu)先選用含0-0.5M的NaCl緩沖液梯度洗脫；步驟d中優(yōu)選陰離子交換介質(zhì)商品名為Q Sepharose High Performance；步驟d中優(yōu)選用含0-0.3MNaCl緩沖液梯度洗脫；步驟c、d中優(yōu)選裝有截留分子量為1K、3K或5K膜包的超濾系統(tǒng)，或含有相同截留分子量膜片的超濾杯。
本發(fā)明涉及的從赤子愛勝蚓中分離純化的上述方法中獲得的蚓激酶，具有如下生化特性(1)包含兩主要組分A和B，分子量分別為24000±1000和24000±1000；(2)組分A和B的等電點(diǎn)分別為4.5±1.0和4.0±1.0；(3)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳為單一條帶；
(4)高效液相凝膠過濾色譜為單一峰；(5)小鼠靜脈注射半數(shù)致死量為55～65毫克/公斤；(6)該酶組分的纖溶活性為120000±24000蚓激酶單位/毫克。
本發(fā)明的方法是根據(jù)蚓激酶是酸性蛋白酶的特點(diǎn)，先用高載量或高流速的陰離子交換介質(zhì)對目標(biāo)蛋白進(jìn)行捕獲，然后采用高分辨率的陰離子交換介質(zhì)進(jìn)一步細(xì)分。該制備方法簡單，重復(fù)性好，易放大，所用層析介質(zhì)均可多次使用，有利于作為工業(yè)放大的藥物制備。所獲蚓激酶可達(dá)電泳純，在毛細(xì)管等電聚焦測定蚓激酶等電點(diǎn)和MALDI-TOF-MS測定蚓激酶分子量時，蚓激酶中的兩組分表現(xiàn)出的生化性質(zhì)極為相近，經(jīng)測定蚓激酶毒性低(半數(shù)致死量為60.13毫克/公斤)，纖溶活性高(比活力為120000±24000蚓激酶單位/毫克)，安全有效，適用于制備靜脈注射用凍干粉針和水針。


圖1.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蚓激酶純度其中泳道1為10μg樣品的電泳情況；泳道2為分子量標(biāo)記；泳道3為20μg樣品的電泳情況。
圖2.高效液相凝膠過濾色譜測定蚓激酶純度圖3.聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蚓激酶純度圖4.毛細(xì)管等電聚焦測定蚓激酶的組分A的等電點(diǎn)圖5.毛細(xì)管等電聚焦測定蚓激酶的組分B的等電點(diǎn)圖6.基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定蚓激酶的組分A的分子量圖7.基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定蚓激酶的組分B的分子量具體實施方式
本發(fā)明在制備蚓激酶過程中所用層析介質(zhì)均為安法瑪西亞有限公司產(chǎn)品。
實施例1取5克北京百奧藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的口服蚓激酶原料藥，批號20010913-3，比活力為12090.8單位/毫克，用pH7.5的0.02M磷酸鹽緩沖液充分溶解并定容到100毫升，0.45μm微孔濾膜過濾取濾液。20毫升的DEAESepharose Fast Flow陰離子交換層析柱用pH7.5的0.02M磷酸鹽緩沖液平衡，上樣20毫升后沖洗一個柱體積，用0-0.5M NaCl磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，洗脫時間為30分鐘，收集有纖溶活性的蛋白峰約15毫升。將5次DEAESepharose Fast Flow陰離子交換層析柱層析所得樣品合并后用3K超濾杯脫鹽并濃縮，用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化鈉緩沖液替換到體積為10毫升。分兩次用20毫升Q Sepharose HP陰離子層析柱層析，Q Sepharose HP陰離子交換層析柱用pH8.0的0.02M巴比妥—氯化鈉緩沖液平衡，上樣后沖洗一個柱體積，用含0-0.3M NaCl的巴比妥—氯化鈉緩沖液梯度洗脫，洗脫時間40分鐘，收集0.15-0.20M NaCl范圍內(nèi)的活性洗脫單峰共計22毫升，用SephadexG-25柱脫鹽，所得樣品再用1K超濾杯濃縮即得40毫克電泳純蚓激酶。該制備方法在多次小試和中試試驗中均表現(xiàn)了良好的重現(xiàn)性和可放大性。
實施例2取10克北京百奧藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)口服蚓激酶原料藥，批號20010913-3，比活力為12090.8單位/毫克，用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化鈉緩沖液充分溶解并定容到100毫升，0.45μm微孔濾膜過濾取濾液。20毫升的Q Sepharose XL陰離子交換層析柱用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化鈉緩沖液平衡，上樣25毫升后沖洗一個柱體積，用0-1M NaCl的巴比妥—氯化鈉緩沖液梯度洗脫，洗脫時間為50分鐘，收集有纖溶活性的蛋白峰約20毫升。將4次Q Sepharose XL陰離子交換層析柱層析所得樣品合并后用3K超濾杯脫鹽并濃縮，用pH8.0的0.02M Tris-HCl緩沖液替換到體積為12毫升。分三次用20毫升Q Sepharose HP陰離子交換層析柱層析，Q Sepharose HP陰離子交換層析柱用pH8.5的0.02M Tris-HCl緩沖液平衡，上樣后沖洗一個柱體積，用0-0.3M NaCl Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，洗脫時間40分鐘，收集0.20-0.25M NaCl范圍內(nèi)的活性洗脫單峰共計28毫升。用1K超濾杯濃縮脫鹽即得75毫克電泳純蚓激酶。
實施例3取50克北京百奧藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)口服蚓激酶原料藥，批號2002120，比活力為15507.6單位/毫克，用pH7.5的0.02M磷酸鹽緩沖液充分溶解并定容到1000毫升，0.45μm微孔濾膜過濾取濾液。300毫升的QSepharose XL陰離子交換層析柱用pH7.5的0.02M磷酸鹽緩沖液平衡，上樣500毫升后沖洗一個柱體積，用0-0.5M NaCl磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，洗脫時間為75分鐘，收集有纖溶活性的蛋白峰約300毫升。將2次Q Sepharose XL陰離子交換層析柱層析所得樣品合并后用5K超濾系統(tǒng)濃縮，用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化鈉緩沖液替換到體積為200毫升。分五次用300毫升QSepharose HP陰離子交換層析柱層析，Q Sepharose HP陰離子交換層析柱用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化鈉緩沖液平衡，上樣后沖洗一個柱體積，用0-0.3M NaCl巴比妥—氯化鈉緩沖液梯度洗脫，洗脫時間1.5小時，收集0.10-0.15M范圍內(nèi)的活性洗脫單峰共計1200毫升。用1K超濾系統(tǒng)濃縮脫鹽即得400毫克電泳純蚓激酶。
實施例4對實施例1中純化所得蚓激酶的鑒定如下(1)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為10％，電泳濃縮時間1小時，電壓80V；電泳分離時間為2小時，電壓200V，蚓激酶YJM-IV上樣量分別為10μg和20μg，所用標(biāo)樣的分子量為97400，66200，42700，31000，14400。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色僅得到單一條帶，該結(jié)果顯示蚓激酶為電泳純，電泳圖如圖1所示。
(2)高效液相凝膠過濾色譜用高效液相凝膠過濾色譜，進(jìn)一步對蚓激酶進(jìn)行鑒定。凝膠柱為SEC250(7.8×300mm)，用pH6.8，0.2M的磷酸鹽緩沖液，以1.0毫升/分鐘的流速洗脫，所得主峰面積為99.8％，層析圖譜見圖2。
高效液相凝膠過濾色譜試驗結(jié)果進(jìn)一步證實蚓激酶有很高的純度。
(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠濃度為12％，電泳濃縮時間2小時，電壓200V；蚓激酶上兩個平行樣，上樣量為5μg，電泳結(jié)束后用1％硝酸銀染色，蚓激酶顯色為兩條帶，電泳圖如圖3所示，主帶為組分A，次帶為組分B。兩組分百分含量分別為90±5％，10±5％。
(4)毛細(xì)管等電聚焦測定蚓激酶的等電點(diǎn)用毛細(xì)管等電聚焦法測定蚓激酶中組分A和組分B的等電點(diǎn)。采用Beckman公司P/ACE5000型毛細(xì)管電泳儀，27cm×50Hm毛細(xì)管。電壓13.75KV，聚焦2分鐘，壓力遷移。陽極液91mmol/l磷酸凝膠液，陰極液20mmol/lNaOH溶液，檢測280nm，柱溫20℃。分別測定蚓激酶中組分A和組分B的等電點(diǎn)為4.72和3.78，圖譜見圖3，4。
(5)用質(zhì)譜測定蚓激酶的分子量用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分別測定蚓激酶中組分A和組分B的分子量為24177和24227，圖譜見圖5，6。
(6)比活力測定通過纖維平板法(國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-053)-20012)測定蚓激酶的比活力為120,000蚓激酶單位/毫克。
(7)蚓激酶-I的半數(shù)致死量(LD50)測定。按國家新藥審評要求，采用Bliss法測定蚓激酶-I的半數(shù)致死量。昆明小鼠尾靜脈注射給藥，給藥劑量為32.8mg/kg-100.0mg/kg，劑距為0.8，共6個劑量，測得半數(shù)致死量為60.13mg/kg。
權(quán)利要求
1.一種具有電泳純的蚓激酶，它是由如下步驟制得的a.將從赤子愛勝蚓中所得的粗提物或從赤子愛勝蚓中分離純化而得的口服用蚓激酶原料藥配制成上樣緩沖液；b.高載量或高流速陰離子交換層析柱用緩沖液平衡，上樣并沖洗后，用含有0-1M的NaCl緩沖液梯度洗脫，收集蛋白峰；c.將步驟b中所獲的蛋白峰超濾濃縮脫鹽，或用Sephadex G-25進(jìn)行緩沖液替換并脫鹽；d.高分辨率陰離子交換層析柱用緩沖液平衡，將步驟c中所獲樣品上樣并沖洗后，用0-1M的NaCl緩沖液梯度洗脫，收集蛋白峰經(jīng)過超濾或Sephadex G-25層析脫鹽處理后獲得電泳純的蚓激酶。
2.如權(quán)利要求1所述的具有電泳純的蚓激酶，其特征在于，所述的步驟a、b、d中所采用的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液或巴比妥-氯化鈉緩沖液。
3.如權(quán)利要求1所述的具有電泳純的蚓激酶，其特征在于，所述的步驟b中用含0-0.5M的NaCl緩沖液梯度洗脫。
4.如權(quán)利要求1所述的具有電泳純的蚓激酶，其特征在于，所述的步驟d中用含0-0.3M的NaCl的緩沖液梯度洗脫。
5.如權(quán)利要求1所述的具有電泳純的蚓激酶，其特征在于，所述的步驟b中陰離子交換介質(zhì)為Q Sepharose Fast Flow或Q Sepharose XL或DEAESepharose Fast Flow。
6.如權(quán)利要求1所述的具有電泳純的蚓激酶，其特征在于，所述的步驟d中陰離子交換介質(zhì)為Q Sepharose High Performance。
7.如權(quán)利要求1所述的具有電泳純的蚓激酶，其特征在于，所述的步驟c、d中超濾用裝有截留分子量為1K或3K或5K膜包的超濾系統(tǒng)，或含有相同截留分子量膜片的超濾杯。
8.一種權(quán)利要求1所述的方法制備的具有電泳純的蚓激酶，具有如下生化特性(1)包含兩主要組分A和B，分子量分別為24000±1000和24000±1000；(2)組分A和B的等電點(diǎn)分別為4.5±1.0和4.0±1.0；(3)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳為單一條帶；(4)高效液相凝膠過濾色譜為單一峰；(5)小鼠靜脈注射半數(shù)致死量為55～65毫克/公斤；(6)該酶組分的纖溶活性為120000±24000蚓激酶單位/毫克。
9.一種權(quán)利要求1或8所述的具有電泳純的蚓激酶在用于制備降纖藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種自赤子愛勝蚓中提取的具有電泳純的蚓激酶，可用于缺血性腦血管疾病的治療。采用的分離制備方法主要包括陰離子交換層析、超濾法、凝膠過濾脫鹽，所獲蛋白酶可達(dá)電泳純，可用于制備靜脈注射用凍干粉針和水針的原料。本發(fā)明制備方法簡單，重復(fù)性好，易放大。用本發(fā)明的制備方法所獲得的蚓激酶毒性低，纖溶活性高，安全有效。
文檔編號C12N9/64GK1506459SQ0314669
公開日2004年6月23日 申請日期2003年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者劉建蓉, 梅運(yùn)紅, 李樹東, 侯全民 申請人:北京百奧藥業(yè)有限責(zé)任公司