專利名稱：SARS病毒的siRNA靶序列文庫與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種文庫與應(yīng)用，特別涉及一種siRNA靶序列文庫與應(yīng)用，尤其是涉及SARS病毒的siRNA靶序列文庫及在篩選抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用。
藥物分子與病毒某些部位分子的特異識別是藥物發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。這要求特異識別部位要具有一定的供識別用的信息量，同時(shí)這些部位對病毒的生命周期是重要的，受到攻擊后病毒將無法增殖。顯然病毒基因組RNA分子滿足上述條件。近年來發(fā)展起來的RNA干擾技術(shù)提供了攻擊病毒基因組RNA的有力工具。
1998年，美國科學(xué)家Andrew Fire和Craig Mello將體外轉(zhuǎn)錄得到的純化的雙鏈RNA注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA的基因抑制效果遠(yuǎn)高于單鏈RNA的效果，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNA interference，簡稱RNAi)(Fire A，Xu S，Montgomery M K，et al.Potent and specific geneticinterence by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature，1998，391(6669)806-811)。隨后，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。最近德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在著兩條相互獨(dú)立的干擾途徑較長的雙鏈RNA介導(dǎo)非特異干擾效應(yīng)，可以導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成抑制和RNA降解。長度為21到25個(gè)堿基的所謂小干擾RNA(siRNA，smallinterfering RNA)介導(dǎo)特異性干擾反應(yīng)，只降解與其負(fù)鏈高度互補(bǔ)的特定基因的mRNA(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.et al.，Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells，Nature，2001，411(6836)494)。目前，RNA干擾已經(jīng)成為基因組中基因功能研究的有力工具，用于關(guān)閉特定基因的表達(dá)。同樣，也成為疾病治療的重要藥物設(shè)計(jì)手段，在抗HIV(乙型肝炎病毒)和HCV(hepatitis C virus)的藥物設(shè)計(jì)方面已經(jīng)取得了進(jìn)展(Jacque，J.M.，Triques，K.，Stevenson，M.，Modulation of HIV-1 replicationby RNA interference，Nature，2002，418(6896)435；Wilson，J.A.，Jayasena，S.，Khvorova，A.et al.，RNA interference blocks gene expression and RNAsynthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003，100(5)2783)。SARS病毒作為正鏈RNA病毒，其增殖過程中的一些特點(diǎn)表明它應(yīng)該是RNA干擾的一個(gè)合適的應(yīng)用對象。
SARS病毒入侵宿主細(xì)胞，首先是病毒的包膜與宿主細(xì)胞膜融合，然后病毒的正鏈基因組RNA鏈進(jìn)入宿主細(xì)胞，并利用它為模版在宿主細(xì)胞的翻譯機(jī)構(gòu)中合成依賴RNA的RNA聚合酶。RNA聚合酶再以病毒正鏈RNA為模版互補(bǔ)合成出病毒負(fù)鏈RNA，病毒負(fù)鏈RNA在RNA聚合酶的作用下進(jìn)一步生產(chǎn)出正鏈病毒基因組RNA和病毒的其它重要蛋白質(zhì)的mRNA，然后利用宿主的翻譯機(jī)構(gòu)翻譯出蛋白質(zhì)(S，M，N，P)后組裝成病毒顆粒，完成增殖過程。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在的由siRNA介導(dǎo)的干擾效應(yīng)有很強(qiáng)的特異性，可以針對病毒增殖過程中產(chǎn)生的各種RNA發(fā)揮作用。
RNA是線性分子，由于可以通過回折使內(nèi)部堿基配對形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，RNA分子在細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)并非是一條線性鏈，而是具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)。RNA二級結(jié)構(gòu)中，配對的部分形成一段類似DNA的雙螺旋，稱為莖。不配對的部分稱為環(huán)，環(huán)上的堿基尚未參與配對，稱之為自由片段，如果僅僅打開4個(gè)以下的堿基對就可以成為自由片段，則稱為準(zhǔn)自由片段。莖部已經(jīng)配對堿基片段失去了與siRNA相互識別的能力，只有當(dāng)打開螺旋消除配對后才可能成為RNA干擾的作用位點(diǎn)。所以說，長度為21到25個(gè)堿基的自由片段與準(zhǔn)自由片段才可能是高效的RNA干擾靶點(diǎn)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供SARS病毒的siRNA靶序列文庫。
本發(fā)明所提供的SARS病毒的siRNA靶序列文庫，包括序列表中SEQ ID No1-27或與序列表中SEQ ID No1-27限定的RNA序列具有95％以上同源性的核苷酸序列。
本發(fā)明將基因工程學(xué)及生物信息學(xué)有機(jī)結(jié)合，創(chuàng)造性地構(gòu)建了SARS病毒的siRNA靶序列文庫，該文庫可用于篩選抗SARS病毒藥物，具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。
在SARS基因組中，有若干個(gè)位置出現(xiàn)了與人的基因組中的片段相匹配的片段。作為特異降解RNA藥物的siRNA，應(yīng)該去掉那些可能與人基因組相匹配的片段，以保證對人是安全的。將SARS病毒基因組中的自由片段和準(zhǔn)自由片段與人類基因組聯(lián)配，剔除那些與人類基因組有較多(18個(gè)堿基以上)匹配的片段。
RNA中的堿基配對除了通常的A＝U和C＝G外，還允許U＝G配對，故病毒正鏈RNA與病毒負(fù)鏈RNA的A-U轉(zhuǎn)換導(dǎo)致U的位置和數(shù)量變化，造成它們的二級結(jié)構(gòu)可以有較大的差異。
一般的正鏈RNA病毒在增殖過程中，正鏈和亞基因組RNA的濃度要遠(yuǎn)大于負(fù)鏈的濃度，例如煙草花葉病毒，正負(fù)鏈的濃度可以相差100倍(Ishikawa.M，Meshi.T，Motoyoshi.F，et al.Specific Cessation of Minus Strand RNAAccumulation at an Early Stage of TMV Infection.J.Virol.，1991，65861-868)。如果SARS病毒的負(fù)鏈濃度遠(yuǎn)低于正鏈和其它亞基因組mRNA的濃度，則以SARS病毒負(fù)鏈RNA序列為目標(biāo)的RNA干擾，其抗病毒效果要優(yōu)于針對正鏈和亞基因組RNA的抗病毒效果。
研究發(fā)現(xiàn)，在3’端懸垂TT的siRNA具有較高的穩(wěn)定性(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.et al.，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediateRNA interference in cultured mammalian cells，Nature，2001，411(6836)494.)。這要求基因組上的靶片段的5’端為AA。
不同的SARS株之間存在一些位點(diǎn)的堿基變化(Results of multiple sequencealignment of 19 complete SARS coronavirus genome，athttp//antisars.cbi.pku.edu.cn/news/news.jsp？id＝114)，要得到廣譜的抗SARS藥物，應(yīng)該盡量選擇那些保守的位點(diǎn)。
根據(jù)上述考慮，制訂了尋找高效RNA干涉位點(diǎn)的評分標(biāo)準(zhǔn)和篩選方法1)在SARS病毒基因組中篩選長度20-25個(gè)堿基的自由片段，每呈現(xiàn)1次自由片段加1分，允許自由片段中包含小于4個(gè)堿基對的頸，每個(gè)堿基對減0.1分，該項(xiàng)總得分稱為呈現(xiàn)率；2)片段5’端為AA，加5分，該項(xiàng)得分稱為穩(wěn)定度；3)判斷候選靶片段中是否有突變位點(diǎn)，每有一個(gè)位點(diǎn)變化減1分，該項(xiàng)得分稱為保守度；所述選擇剔除規(guī)則，是將較高(10以上)呈現(xiàn)率的自由片段與人類基因組做聯(lián)配，剔除那些與人類基因組有較多(18個(gè)以上)匹配的片段。
根據(jù)上述評分標(biāo)準(zhǔn)和篩選規(guī)則，以SARS病毒多倫多株為基本材料，針對其病毒RNA正鏈和負(fù)鏈，從約6萬個(gè)候選片段中根據(jù)分值篩選出了27個(gè)高效siRNA作用靶序列。根據(jù)正鏈和負(fù)鏈分別列于表1和表2根據(jù)靶序列片段的堿基排列，可以很容易設(shè)計(jì)出與之相互作用的siRNA。以靶序列5’-AAUUUUAAUUCCUUUAUACUU-3’為例，其對應(yīng)的siRNA為5’-UUUUAAUUCCUUUAUACUUTT-3’3’-TTAAAAUUAAGGAAAUAUGAA-p-5’靶序列互補(bǔ)鏈5’端的p表示磷酸化，是高效發(fā)揮RNA干涉所需要的修飾(NykanenA，Haley B，Zamore P D.ATP requirements and small interferings RNA structure in theRNA interference pathway.Cell，2001，107(3)309-321)。由于在RNA中存在非正常的U＝G配對，所以，給定一條靶序列后可以設(shè)計(jì)出幾個(gè)不同的siRNA分子，正常配對的那個(gè)siRNA的識別效率會高些。
表1正鏈上高效siRNA作用靶序列

表2負(fù)鏈上的高效siRNA作用靶序列

序列表<160>27<210>1<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>1aaacaauaauaaauuuuacug21<210>2<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>2uuguuucuguuaccuucucuu21<210>3<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>3aaucauuauuaaagacuguac21<210>4<211>23<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>4uacccagauccaucaagaauauu23<210>5<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>5uaucucaccuuauaauucaca21<210>6<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>6aauugccuuucuuuuacuauu21<210>7<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>7gacuacaaaagagaagcccca21<210>8<211>22<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>8aaccuucuacccaaaacuacaa22<210>9<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>9uuuucuuauuauuucuuacuc21<210>10<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>10auuauuaacaauucuacuaau21<210>11<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>11aaacaacuuagcucuaauuuu21<210>12<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>12auuaacaacacaguuuaugau21<210>13<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>13aauaugagcaauauauuaaau21<210>14<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>14aacgaacuaacuauuauuauu21<210>15<211>24<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>15aacgaacaugaaaauuauucucuu24<210>16<211>24<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>16aauuucuugaauuaccgcgacuac24<210>17<211>22<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>17aauugaucuaagaguaaaaaau22<210>18<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>18ugucaacacaaaguaaucacc21<210>19<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>19cucccuucgaauuguuauagu21<210>20<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>20aagacaucaaaaacaaaagug21<210>21<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>21acaccaucuaaagcuacaccc21<210>22<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>22aauuagauaagaguacaccaa21<210>23<211>21<2 12>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>23uagcaucacgaccacacacac21<210>24<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>24cuaguauaaaagaagaaucgg21<210>25<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>25aauuuuaauuccuuuauacuu21<210>26<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>26ccuucaauaacuaaauuuuca21<210>27<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>27agcuacacagauuuuaaaguu2權(quán)利要求
1.SARS病毒的siRNA靶序列文庫，包括序列表中SEQ ID No1-27或與序列表中SEQ ID No1-27限定的RNA序列具有95％以上同源性的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SARS病毒的siRNA靶序列文庫，其特征在于所述文庫由序列表中SEQ ID No1-27組成。
3.權(quán)利要求1所述的SARS病毒的siRNA作用靶序列文庫在篩選抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種SARS病毒的siRNA靶序列文庫與應(yīng)用，目的是提供一種可用于篩選抗SARS病毒藥物的siRNA靶序列文庫。本發(fā)明所提供的SARS病毒的siRNA靶序列文庫包括序列表中SEQ ID №1－27或與序列表中SEQ ID №1－27限定的RNA序列具有95％以上同源性的核苷酸序列。本發(fā)明的文庫可用于篩選抗SARS病毒藥物。
文檔編號C12Q1/68GK1465584SQ0314670
公開日2004年1月7日 申請日期2003年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者紀(jì)豐民, 羅遼復(fù) 申請人:北京交通大學(xué)