專利名稱:重組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-白喉毒素融合蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的重組細(xì)胞毒素,尤其是涉及人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、白喉毒素的靶向毒素融合蛋白及其制備方法。
正常組織和腫瘤組織的一個(gè)顯著不同,是正常組織中新生血管很少,而大小超過(guò)2.0mm3的腫瘤,其生長(zhǎng)主要依賴于新生血管的形成。二者增生率的差異,為細(xì)胞毒素分子選擇性地作用于腫瘤提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。
VEGF(vascular endotherial growth factor,VEGF)是一種特異性刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子,主要作用是刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移和抑制凋亡。其功能表現(xiàn)為誘導(dǎo)血管生成和增加血管通透性。目前已發(fā)現(xiàn)四種VEGF家族成員,即VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D。VEGF-A與VEGF-B均可結(jié)合于相同的酪氨酸激酶flt-1受體,VEGF-A還可與flk-1/KDR受體結(jié)合,在血管的發(fā)生和形成過(guò)程中起主要調(diào)節(jié)作用。
通常所說(shuō)的VEGF為VEGF-A,基因定位于6號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶(6p12),該基因長(zhǎng)約14kb,由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,因不同的拼接方式產(chǎn)生5種異構(gòu)體,分別含206,189,165,145和121個(gè)氨基酸。五種異構(gòu)體中VEGF165和VEGF121最為豐富。
1993年Brown等和Plate等運(yùn)用原位雜交表明flt-1和flk-1/KDR受體在腫瘤血管表面高度表達(dá),而相鄰正常組織的血管上皮細(xì)胞中VEGF的受體幾乎無(wú)法檢測(cè)出,因此VEGF可以用來(lái)將毒素多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至增生的腫瘤組織中(Brown,L.F.,Berse,B.,Jackman,R.W.,et al.1993,Expression of vascular permeability factor(vascularendothelial growth factor)and its receptors in adenocarcinomas of the gastrointestinaltract.Cancer Res.,53,4727-4735.and Plate,K.H.,Breier,G.,et al.1993,Up-regulationof vascular endothelial growth factor and its cognate receptors in a rat glioma model oftumor angiogenesis.Cancer Res.,53,5822-5827.)。
白喉毒素((diphotheria toxin,DT)是一種常用的細(xì)胞毒素,其結(jié)構(gòu)和功能研究得較為清楚,具有極高的毒素活性,通過(guò)阻斷延伸因子EF2(elongation factor2,EF2)進(jìn)入相應(yīng)活性部位,可對(duì)真核細(xì)胞的蛋白合成產(chǎn)生不可逆的抑制或阻斷作用。
靶向毒素的構(gòu)建有兩種方法,一種為化學(xué)偶聯(lián)法,但是該方法所得靶向毒素容易引入氨基酸標(biāo)簽,改變毒素分子活性,帶上非天然蛋白序列的靶向毒素應(yīng)用于人體也容易引起免疫反應(yīng)。另外,化學(xué)偶聯(lián)法難以準(zhǔn)確控制巰基化的定位和程度,從而可能產(chǎn)生異源性分子;毒素與配體的隨機(jī)連接,容易發(fā)生受體和配體的空間阻礙;產(chǎn)量低,必須制備和純化大量的蛋白用于偶聯(lián),代價(jià)高昂。
另一種方法為基因融合法,該方法克服了化學(xué)偶聯(lián)的不足,近年來(lái)得到越來(lái)越多的應(yīng)用,具體為將毒素與靶向分子通過(guò)一段連接多肽(Linker)構(gòu)建為融合毒素,為了方便純化,常用能與金屬螯合柱結(jié)合的His標(biāo)簽,但His標(biāo)簽不是天然的蛋白序列,最后要用凝血酶等把它切去,但不可能切的干凈,這樣所得到的產(chǎn)物容易引起免疫反應(yīng)。Linker的設(shè)計(jì)一直是個(gè)難題,因?yàn)橐WC融合毒素的兩個(gè)構(gòu)成部分同時(shí)發(fā)揮各自的作用,Linker要有一定的長(zhǎng)度保證兩邊的蛋白分子不會(huì)在空間上彼此影響;氨基酸的選擇也不好選擇,如果Linker氨基酸選擇不當(dāng),容易帶高靜電,難以保證理想的效果。
本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的采用基因工程的方法,構(gòu)建一種靶向毒素融合蛋白,其包括白喉毒素多肽片段、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子多肽片段以及位于兩者之間的中間連接肽序列(
圖1)。
其中,所述的白喉毒素氨基酸片段較好的為白喉毒素N端385-390個(gè)氨基酸序列,最好的為白喉毒素N端389個(gè)氨基酸序列。所述的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子氨基酸片段較好的為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-A,最好的為VEGF165。所述的中間連接肽序列較好的是由6-15個(gè)甘氨酸或絲氨酸組成的,最好的是由Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser組成。
本發(fā)明靶向毒素融合蛋白是的構(gòu)建和制備)包括以下步驟1.構(gòu)建1)白喉毒素基因片段和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所用引物引入了編碼中間連接肽的核苷酸及酶切位點(diǎn);2)上述PCR產(chǎn)物酶切后回收目的片段,然后連接轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒。2.制備1)上述得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌,在適宜的培養(yǎng)條件下表達(dá)。
2)離心收集菌體,超聲裂解后經(jīng)洗滌得到包涵體。
3)裂解包涵體,然后依次經(jīng)透析、離子交換柱層析和凝膠過(guò)濾層析后得到純化的融合蛋白。3.活性鑒定將一定濃度融合蛋白DT389-VEGF165加入表達(dá)VEGF165受體的EC細(xì)胞培養(yǎng),鏡下觀察到隨時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)脫落、病變、壞死。而不表達(dá)VEGF165受體的L929細(xì)胞及僅加入PBS的EC細(xì)胞生長(zhǎng)正常,表明特異性的VEGF165受體是靶向毒素發(fā)揮細(xì)胞毒作用的中間環(huán)節(jié)。
在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,靶向毒素DT389-VEGF165濃度從0.5mg/ml開(kāi)始倍比稀釋,發(fā)現(xiàn)在250ug/ml濃度以上時(shí)細(xì)胞在6h后即開(kāi)始出現(xiàn)脫落,從125ug/ml濃度以下開(kāi)始,細(xì)胞在24h左右才開(kāi)始出現(xiàn)病變,在72h后,在390ng/ml濃度以上細(xì)胞均出現(xiàn)病變。
MTT染色表明,重組靶向毒素DT389一VEGF165從125ug/ml倍比稀釋至390ng/ml,作用于細(xì)胞72h后,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)出較明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系(圖4)。
本發(fā)明所得到的靶向毒素的靶細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞,其遺傳性質(zhì)穩(wěn)定不易變異,血管內(nèi)皮細(xì)胞與血液鄰接,藥物易于到達(dá)。VEGF165為定向載體,可以產(chǎn)生選擇性的細(xì)胞毒性效果。將毒素和VEGF構(gòu)建為一條多肽單鏈,可以避免產(chǎn)生異源分子,在大腸桿菌中高效表達(dá)并降低生產(chǎn)成本。毒素分子的選擇方面,由于DT具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,因此在臨床應(yīng)用時(shí)能以較低的毒素劑量獲得治療效果。雖然多數(shù)人在兒童時(shí)期已經(jīng)主動(dòng)免疫獲得了DT的中和抗體,但由于DT的毒性很強(qiáng),單個(gè)的DTA片段進(jìn)入細(xì)胞即可使之致死,因此對(duì)治療劑量不會(huì)有太大的影響。在抗血管生成的治療方面主要有兩類藥物,一類是抑制新生血管生成,另一類是血管定向的靶向藥物,即以VEGF受體為靶向的融和毒素。前者在腫瘤生長(zhǎng)初期具有抑制效果,但對(duì)于發(fā)展到一定程度的腫瘤,只能阻止其進(jìn)一步增大,不能達(dá)到令其縮小的目的。后者能夠破壞腫瘤的血管,是更有前景的治療手段,除了適用于各種實(shí)體瘤的治療外,在視網(wǎng)膜疾病、艾滋病等方面亦有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-3ZF質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRI和BamHI酶切后連接,測(cè)序鑒定正確。實(shí)施例2 VEGF165片段的擴(kuò)增VEGF165全基因,PCR擴(kuò)增,在引物兩端分別加入酶切位點(diǎn)BamHI和PstI,5’帶有部分連接肽序列。5’端引物如序列表中SEQ ID NO.3,3’端引物如序列表中SEQ ID NO.4。
擴(kuò)增產(chǎn)物與T-Easy載體連接,測(cè)序鑒定正確。實(shí)施例3 白喉毒素389擴(kuò)增片段和VEGF165擴(kuò)增片段的連接分別以BamHI和PstI酶切DT389-3ZF和VEGF-Teasy,回收目的片段,連接得到DT3g9-VEGF-3ZF連接產(chǎn)物,在DT389與VEGF之間有一段編碼(GGGS)2的連接序列。實(shí)施例4 融合基因的表達(dá)將DT389-VEGF-3ZF和原核表達(dá)質(zhì)粒PBV220載體(《含PRPL啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用》。病毒學(xué)報(bào)1990年6月第6卷第2期Vol.6No.2June 1990,111-116)以EcoRI與PstI酶切后連接得到DT389-VEGF-220,其序列如序列表中的SEQ ID NO.5。轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α表達(dá),具體條件為將含表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌種接種至LB培養(yǎng)基,30℃振搖至OD600=0.4,按1∶50接種新鮮LB培養(yǎng)基,30℃振搖至OD600=0.4,轉(zhuǎn)至42℃繼續(xù)振搖6小時(shí),誘導(dǎo)產(chǎn)生白喉毒素389-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165融合蛋白,其序列如序列表中的SEQ ID NO.6。實(shí)施例5 融合蛋白的純化1)表達(dá)菌液5000rpm 4℃離心10分鐘,棄上清;2)超聲裂解沉淀,分別以TrisCl,PBS,3M鹽酸胍洗滌包涵體;3)按1g10ml加入8M尿素溶解包涵體,室溫放置2小時(shí);4)10000rpm離心10分鐘,取上清;5)以2M尿素+50mMTrisCl(pH8.0)+1mMGSH+10mMGSSG復(fù)性體系復(fù)性,4℃復(fù)性24小時(shí);6)以20mMTrisCl(pH8.0)透析24小時(shí);7)以離子交換層析對(duì)復(fù)性產(chǎn)物純化,最后過(guò)凝膠過(guò)濾層析得到純化蛋白。
序列表SEQ ID NO.1序列特征(A)長(zhǎng)度29bp;(B)類型核酸;(C)鏈性單鏈;(D)拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)線性分子類型寡核苷酸序列描述CGGAATTCAT ATGGGCGCTG ATGATGTTGSEQ ID NO.2序列特征(A)長(zhǎng)度35bp;(B)類型核酸;(C)鏈性單鏈;(D)拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)線性分子類型寡核苷酸序列描述CGGGATCCTC CACCAGGTGC ATGCATGCGT TTTATSEQ ID NO.3序列特征(A)長(zhǎng)度39bp;(B)類型核酸;(C)鏈性單鏈;(D)拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)線性分子類型寡核苷酸序列描述GGGATCCGGT GGAGGATCTG CACCCATGGC AGAAGGAGGSEQ ID NO.4序列特征(A)長(zhǎng)度27bp;(B)類型核酸;(C)鏈性單鏈;(D)拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)線性分子類型寡核苷酸序列描述CCTGCAGTCA CCGCCTCGGC TTGTCACSEQ ID NO.5序列特征(A)長(zhǎng)度1674bp;(B)類型核酸;(C)鏈性單鏈;(D)拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)線性分子類型cDNA序列描述ATG GAA AAC TTT TCT TCG TAC CAC GGG ACT AAA CCT GGT TAT GTA GAT TCC ATTCAA AAA GGT ATA CAA AAG CCA AAA TCT GGT ACA CAA GGA AAT TAT GAC GAT GATTGG AAA GGG TTT TAT AGT ACC GAC AAT AAA TAC GAC GCT GCG GGA TAC TCT GTAGAT AAT GAA AAC CCG CTC TCT GGA AAA GCT GGA GGC GTG GTC AAA GTG ACG TATCCA GGA CTG ACG AAG GTT CTC GCA CTA AAA GTG GAT AAT GCC GAA ACT ATT AAGAAA GAG TTA GGT TTA AGT CTC ACT GAA CCG TTG ATG GAG CAA GTC GGA ACG GAAGAG TTT ATC AAA AGG TTC GGT GAT GGT GCT TCG CGT GTA GTG CTC AGC CTT CCCTTC GCT GAG GGG AGT TCT AGC GTT GAA TAT ATT AAT AAC TGG GAA CAG GCG AAAGCG TTA AGC GTA GAA CTT GAG ATT AAT TTT GAA ACC CGT GGA AAA CGT GGC CAAGAT GCG ATG TAT GAG TAT ATG GCT CAA GCC TGT GCA GGA AAT CGT GTC AGG CGATCA GTA GGT AGC TCA TTG TCA TGC ATA AAT CTT GAT TGG GAT GTC ATA AGG GATAAA ACT AAG ACA AAG ATA GAG TCT TTG AAA GAG CAT GGC CCT ATC AAA AAT AAAATG AGC GAA AGT CCC AAT AAA ACA GTA TCT GAG GAA AAA GCT AAA CAA TAC CTAGAA GAA TTT CAT CAA ACG GCA TTA GAG CAT CCT GAA TTG TCA GAA CTT AAA ACCGTT ACT GGG ACC AAT CCT GTA TTC GCT GGG GCT AAC TAT GCG GCG TGG GCA GTAAAC GTT GCG CAA GTT ATC GAT AGC GAA ACA GCT GAT AAT TTG GAA AAG ACA ACTGCT GCT CTT TCG ATA CTT CCT GGT ATC GGT AGC GTA ATG GGC ATT GCA GAC GGTGCC GTT CAC CAC AAT ACA GAA GAG ATA GTG GCA CAA TCA ATA GCT TTA TCG TCTTTA ATG GTT GCT CAA GCT ATT CCA TTG GTA GGA GAG CTA GTT GAT ATT GGT TTCGCT GCA TAT AAT TTT GTA GAG AGT ATT ATC AAT TTA TTT CAA GTA GTT CAT AATTCG TAT AAT CGT CCC GCG TAT TCT CCG GGT CAT AAA ACG CAT GCA CCT GGT GGAGGA TCC GGT GGA GGA TCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT CAT CACGAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAGACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAGCCA TCC TGT GTG CCC CTG ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTGGAG TGT GTG CCC ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAACCT CAC CAA GGC CAG CAC ATA GGA GGG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGTGAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGCTCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCCTGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGTACT TGC AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG TGA CTG CAG GCA TGC AAG CTT GAG TATSEQ ID NO.6序列特征(A)長(zhǎng)度549個(gè)氨基酸;(B)類型氨基酸;(C)拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)線性分子類型蛋白質(zhì)序列描述Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser IleGln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Tbr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp AspTrp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser ValAsp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr TyrPro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile LysLys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr GluGlu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu ProPhe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala LysAla Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly GlnAsp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg ArgSer Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg AspLys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn LysMet Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr LeuGlu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys ThrVal Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala ValAsn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr ThrAla Ala 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Cys Asp Lys Pro Arg Arg
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白,其特征在于,該融合蛋白包括白喉毒素氨基酸片段、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子氨基酸片段以及位于兩者之間的中間連接肽序列。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的白喉毒素氨基酸片段為白喉毒素N端385-390個(gè)氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的中間連接肽序列由6-15個(gè)甘氨酸或絲氨酸組成。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的白喉毒素氨基酸片段為白喉毒素N端385-390個(gè)氨基酸序列,所述的中間連接肽序列由6-15個(gè)甘氨酸或絲氨酸組成的。
5.如權(quán)利要求1或5所述的融合蛋白,其特征在于,所述的白喉毒素氨基酸片段為白喉毒素N端389個(gè)氨基酸。
6.如權(quán)利要求1或5所述的融合蛋白,其特征在于,所述的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子氨基酸片段為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF165。
7.如權(quán)利要求1或5所述的融合蛋白,其特征在于,所述的中間連接肽序列為Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser。
8.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的白喉毒素氨基酸片段為白喉毒素N端389個(gè)氨基酸,所述的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子氨基酸片段為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF165,所述的中間連接肽序列為Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser。
9.一種制備如權(quán)利要求1或5或9所述融合蛋白的方法,包括以下步驟(1)將白喉毒素片段和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所用引物因引入了編碼中間連接肽的核苷酸及酶切位點(diǎn);(2)將上述PCR產(chǎn)物酶切后回收目的片段,然后連接轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒;(3)將上述得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌,在適宜的培養(yǎng)條件下表達(dá);(4)離心收集菌體,超聲裂解后經(jīng)洗滌得到粗制包涵體;(5)依次經(jīng)透析、離子交換和凝膠過(guò)濾后得到純化的融合蛋白。
10.如權(quán)利要求1或5或9所述的融合蛋白,用于制備實(shí)體瘤治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的重組免疫毒素及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建了一種靶向毒素融合蛋白,其含有白喉毒素氨基酸片段、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子氨基酸片段以及中間的連接肽。該融合蛋白的制備方法包括1)構(gòu)建含有目標(biāo)的質(zhì)粒;2)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá);3)離心收集菌體,超聲裂解經(jīng)洗滌得到粗制包涵體。4)透析、離子交換和凝膠過(guò)濾。本發(fā)明靶向毒素融合蛋白細(xì)胞毒強(qiáng),應(yīng)用劑量少,生產(chǎn)成本低;對(duì)生長(zhǎng)初期腫瘤和一定發(fā)展程度的腫瘤均具有抑制效果;適用于各種實(shí)體瘤、視網(wǎng)膜疾病、艾滋病等。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1477129SQ0314808
公開(kāi)日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2003年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者張智清, 柴映爽, 姚立紅, 陳愛(ài)珺 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制