專(zhuān)利名稱(chēng)：一種促使冰核活性細(xì)菌高表達(dá)冰核活性蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用Xanthomonas ampelinaTS206菌種發(fā)酵生產(chǎn)冰核活性細(xì)菌技術(shù)，促進(jìn)冰核活性細(xì)菌高表達(dá)冰核活性蛋白的技術(shù)方法，特別涉及使用這種技術(shù)培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌可以獲得具有高活性的高生物量的菌體細(xì)胞，為冰核活性細(xì)菌在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
通常情況下純水被冷卻至冰點(diǎn)(0℃)以下仍維持液體狀態(tài)不結(jié)冰，體積非常微小的純水溶液(≤10μl)甚至可冷卻至-35℃以下仍不結(jié)冰，這就是所謂的過(guò)冷現(xiàn)象。，在過(guò)冷的純水中，如果加入晶種或振動(dòng)產(chǎn)生穩(wěn)定的冰核后，依附在冰核上的冰晶便開(kāi)始成長(zhǎng)，最終形成巨大冰的晶體，于是水凍結(jié)成冰。七十年代人們發(fā)現(xiàn)在自然界中有少數(shù)幾種屬于Erwinia(歐文氏菌屬)、Pseudommonas(假單胞菌屬)及Xanthomonas(黃單胞菌屬)的革蘭氏陰性細(xì)菌，具有在較高溫度(-2℃～-7℃)下，使水結(jié)冰的能力，這類(lèi)細(xì)菌被稱(chēng)為冰核活性細(xì)菌。冰核活性細(xì)菌可產(chǎn)生一種特殊的蛋白質(zhì)——冰核活性蛋白，該蛋白是由ina基因編碼的，經(jīng)低溫和一些營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)表達(dá)的一種與細(xì)胞膜結(jié)合的糖蛋白復(fù)合物，它具有類(lèi)似冰晶的立體結(jié)構(gòu)，因此可以充當(dāng)模板的作用，促使冰晶提早形成。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)冰核活性蛋白作了大量的研究。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中C源的種類(lèi)對(duì)于冰核活性細(xì)菌的發(fā)酵生產(chǎn)有很大的影響。一般來(lái)講，在培養(yǎng)基中添加蔗糖和甘油可以提高細(xì)菌的冰核活性。培養(yǎng)基中的N源和一些微量元素是冰核活性細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的，但當(dāng)細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期時(shí)，N、P、S、Fe的缺乏和N與P的聯(lián)合缺乏均可以誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)較高的冰核活性蛋白產(chǎn)物，尤其是低N和低P水平能最有效的誘導(dǎo)A型冰核(活性最強(qiáng)類(lèi)型的冰核)的表達(dá)。另外在培養(yǎng)基中添加微量的元素也可以促進(jìn)冰核活性細(xì)菌表達(dá)冰核活性蛋白，1994年，Watanabe報(bào)道在培養(yǎng)基中添加4-羥基-3-硝基苯乙酸可以促進(jìn)冰核活性蛋白的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)室的高秀芝研究證明在培養(yǎng)基中添加絲裂霉素c可以促進(jìn)細(xì)菌表達(dá)冰核活性蛋白。
冰核活性細(xì)菌的最適生長(zhǎng)的溫度一般為28℃左右，但是較高的培養(yǎng)溫度會(huì)對(duì)細(xì)菌的冰核活性有較強(qiáng)的抑制作用。為了實(shí)現(xiàn)發(fā)酵獲得100％表達(dá)A型冰核活性蛋白，人們采用變溫技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)冰核活性蛋白，即用冰核活性細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌至對(duì)數(shù)期，然后在較低的溫度下培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌以便誘導(dǎo)細(xì)菌大量的表達(dá)A型冰核活性蛋白。采用這種技術(shù)培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌可以在不降低細(xì)菌發(fā)酵生物量的前提條件下生產(chǎn)高活性的冰核活性蛋白。
近十幾年來(lái)，科學(xué)家們開(kāi)始將冰核活性細(xì)菌應(yīng)用在低溫冷凍食品上。1992年希臘的Conslanlinidon H.A.等人和日本的Watanabe M.等人都在檸檬汁、鮮奶、咖啡、橙汁等液體食品中加入冰核活性細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)了這些食品原料的冷凍濃縮。在冷凍濃縮檸檬汁的研究中，顯示出濃縮汁的固形物回收率高，風(fēng)味營(yíng)養(yǎng)成分保持好，氣相色譜分析和感官評(píng)定均表明與鮮汁沒(méi)有差異。1995年Minjung等用P.syringae冷凍濃縮葡萄汁，冷凍溫度為-6℃，加入冰核細(xì)菌的樣品在-2.2℃就出現(xiàn)冰晶并開(kāi)始凍結(jié)，而不加的樣品則無(wú)結(jié)冰現(xiàn)象。這些結(jié)果表明了，該技術(shù)不僅提高了食品原料的產(chǎn)品品質(zhì)，而且使得香氣流失也低于傳統(tǒng)的低溫真空濃縮，特別表現(xiàn)出了濃縮速度快的優(yōu)點(diǎn)。2000年陳慶森、劉劍虹等人從事了高活性冰核活性蛋白制劑在基圍蝦微凍保鮮的研究，取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，在食品原料如魚(yú)肉、蛋白質(zhì)、油脂中添加冰核活性細(xì)菌可使過(guò)冷卻程度減輕，溫度提高到-3～-4℃就可以?xún)鼋Y(jié)，總的冷卻時(shí)間降低33％。冰核活性細(xì)菌在低溫冷凍食品中的應(yīng)用不僅可提高凍結(jié)的溫度，縮短凍結(jié)所需時(shí)間，更重要的是可解決由于過(guò)冷卻現(xiàn)象而生成大的冰晶對(duì)冷凍食品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分造成過(guò)多損失的這樣長(zhǎng)期困擾低溫冷凍食品的問(wèn)題，同時(shí)也為制冷工業(yè)節(jié)約了大量的能源，可見(jiàn)冰核活性細(xì)菌的應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊，也是生物技術(shù)在食品科學(xué)和食品工業(yè)中的一項(xiàng)獨(dú)特的應(yīng)用。這些研究充分說(shuō)明，冰核活性細(xì)菌在冷凍技術(shù)上將產(chǎn)生巨大的潛能和開(kāi)發(fā)空間。
然而，絕大部分的冰核活性細(xì)菌都是植物致病菌，要將冰核活性細(xì)菌應(yīng)用到食品行業(yè)就不得不考慮其安全性的問(wèn)題。應(yīng)用的冰核活性細(xì)菌必須是衛(wèi)生、無(wú)毒性、無(wú)致病性的，這樣才符合食品安全性的要求。近年來(lái)，日本的厚生省批準(zhǔn)了將冰核活性細(xì)菌Xanthomonascamperstris INXC-1在高靜壓處理后可以應(yīng)用在食品加工行業(yè)。本技術(shù)使用的菌種也屬于Xanthonanas這一菌屬，與Xanthomonascamperstris INXC-1有很近的親緣關(guān)系，所以這種細(xì)菌也很有希望被應(yīng)用在食品生產(chǎn)行業(yè)。此外本技術(shù)所使用的菌種還具有穩(wěn)定性強(qiáng)，呈冰核活性高的特點(diǎn)。這些特點(diǎn)都使這種菌種有希望大規(guī)模的應(yīng)用在食品加工行業(yè)。
本發(fā)明目的在于提供一種促進(jìn)冰核活性細(xì)菌高表達(dá)冰核活性蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明所選用的菌種為本實(shí)驗(yàn)室分離純化所獲得的一種黃單胞細(xì)菌(Xanthomonas ampelinaTS206)，采用二級(jí)發(fā)酵工藝培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌。為了獲得大量的具有高冰核活性的菌體，首先要確定適合菌體生長(zhǎng)的C源、N源以及促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和表達(dá)冰核活性蛋白的促進(jìn)因子，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定這些因子在培養(yǎng)基中的最佳配比，以獲得最佳的培養(yǎng)基配方。改善細(xì)菌的培養(yǎng)條件對(duì)于獲得高產(chǎn)的具有高冰核活性的細(xì)菌也是至關(guān)重要的。利用最佳的培養(yǎng)基配方培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定冰核活性細(xì)菌的最適培養(yǎng)條件。
該發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌，所得的發(fā)酵液中的菌體濃度大于2.87×1010個(gè)/ml，通過(guò)離心沉淀的方法獲得的具有活性的菌體烘干后的干重大于9g/L。該項(xiàng)發(fā)明為將冰核活性細(xì)菌能夠應(yīng)用于工業(yè)化的生產(chǎn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明所建立的促使冰核活性細(xì)菌高表達(dá)冰核活性蛋白的技術(shù)的主要特點(diǎn)為①通過(guò)這種培養(yǎng)方法發(fā)酵獲得的冰核活性細(xì)菌具有很高的生物量，為今后提取冰核活性蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；②發(fā)酵獲得的菌體具有很高的冰核活性，為提取大量的冰核活性蛋白打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述。
實(shí)施例
通過(guò)無(wú)菌操作，將菌體在斜面上活化，斜面的主要成分為牛肉膏1％～20％、蛋白胨1％～20％、甘油3％～30％和瓊脂1％～2.5％。
將活化的菌種接入種子液培養(yǎng)4～48h，培養(yǎng)的溫度為15℃～40℃，液體培養(yǎng)基的裝液量為120～320ml/L，搖床轉(zhuǎn)速為140～200rpm。種子液的主要成分為牛肉膏1～10g/L，蛋白胨1～20g/L，甘油5～50g/L，pH值為3～11。
將種子以1％～5％的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)酵液的主要成分為酵母浸出粉5～40g/L，蔗糖5～50g/L，山梨醇1～10g/L，牛肉膏1～10g/L，蛋白胨1～20g/L，甘油5～50g/L，K2HPO41～10g/L，pH值為3～11。培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)的溫度15℃～40℃，液體培養(yǎng)基的裝液量120～320ml/L，培養(yǎng)的時(shí)間30～60h，搖床轉(zhuǎn)速150～220rpm。
獲得的發(fā)酵也可以通過(guò)離心沉淀的方法獲得有活性的菌體。離心的轉(zhuǎn)速為2000～6000rpm，時(shí)間為10～30min。
實(shí)施例1所獲產(chǎn)品的主要技術(shù)指標(biāo)為獲得發(fā)酵液菌體濃度≥2×109～4×1011cell/ml，菌體的干重可以達(dá)到9克以上。將具有冰核活性的菌懸液稀釋到OD600＝0.1后，在-3℃下1min內(nèi)的凍滴率應(yīng)≥90％。
通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)所獲得的產(chǎn)品不僅菌體的含量高，而且菌體細(xì)胞具有很高的冰核活性(達(dá)到90％～100％)，這項(xiàng)技術(shù)為將冰核活性蛋白應(yīng)用在食品行業(yè)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種促使冰核活性細(xì)菌高表達(dá)冰核活性蛋白的方法，其特征在于使用具有冰核活性的菌種，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)和黃單胞菌屬(Xanthomonas)。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)基和改善培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌的發(fā)酵條件，從而獲得高產(chǎn)量并具有高冰核活性的冰核活性細(xì)菌的菌體。通過(guò)利用本專(zhuān)利的方法培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌可以通過(guò)離心沉淀菌體的方法獲得冰核活性細(xì)菌，發(fā)酵液的菌濃大于2.87×1010個(gè)/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，本發(fā)明所使用的菌種由發(fā)明人分離和保藏(該菌種從天津地區(qū)油菜葉表分離獲得)，該菌種的主要特征為在肉湯培養(yǎng)基平板上菌落為黃色，桿狀，革蘭氏染色為陰性，極生鞭毛，不發(fā)酵葡萄糖，不還原硝酸鹽，氧化酶陰性，經(jīng)鑒定為Xanthomonas屬，再根據(jù)該菌種具有脲酶活性和相應(yīng)碳源利用譜，推測(cè)該菌種為X.anpelima[源自天津市蔬菜葉表冰核活性細(xì)菌的調(diào)查與分離鑒定《食品科學(xué)》2000，21(11)54-56]。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，培養(yǎng)獲得高表達(dá)冰核活性蛋白的冰核活性細(xì)菌采用二級(jí)發(fā)酵生產(chǎn)工藝，即原菌種活化、一級(jí)種子、二級(jí)發(fā)酵的工藝過(guò)程。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述，培養(yǎng)獲得高表達(dá)冰核活性蛋白的冰核活性細(xì)菌首先要尋找適合菌種發(fā)酵生產(chǎn)的C源、N源以及促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和表達(dá)冰核活性的各種促進(jìn)因子，最后優(yōu)化各個(gè)營(yíng)養(yǎng)組分在培養(yǎng)基中的比例，以便獲得最適宜冰核活性細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。其特點(diǎn)在于培養(yǎng)基的組份為酵母浸出粉5～40g/L，蔗糖5～50g/L，山梨醇1～10g/L，牛肉膏1～10g/L，蛋白胨1～20g/L，甘油5～50g/L，K2HPO41～10g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，培養(yǎng)獲得高表達(dá)冰核活性蛋白的冰核活性細(xì)菌還要改善細(xì)菌的培養(yǎng)條件，找出最佳的綜合培養(yǎng)條件。其特征在于培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基的pH值為3～11，培養(yǎng)的溫度為15℃～40℃，液體培養(yǎng)基的裝液量為30～80ml/250ml，接種量為1％～5％，培養(yǎng)的時(shí)間為30～60h，搖床轉(zhuǎn)速為140～200rpm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述，用上述方法培養(yǎng)冰核活性細(xì)菌可以獲得高產(chǎn)量、高冰核活性的細(xì)菌。其特點(diǎn)在于培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液的菌體濃度為2.87×1010個(gè)/ml。用離心沉淀的方法可以獲得有高冰核活性的菌體。烘干菌體獲得的菌體干重大于9g/L。
全文摘要
將冰核活性蛋白應(yīng)用于食品的凍結(jié)和低溫保鮮過(guò)程中，可提高被凍結(jié)物料的過(guò)冷點(diǎn)，縮短冷凍時(shí)間，從而節(jié)省大量能源，同時(shí)可以大大地提高凍結(jié)物料的品質(zhì)。本發(fā)明采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，獲得了具有高冰核活性和高生物量的冰核活性細(xì)菌的菌體蛋白質(zhì)。為冰核活性細(xì)菌在食品行業(yè)的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1480536SQ0315029
公開(kāi)日2004年3月10日 申請(qǐng)日期2003年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月24日
發(fā)明者陳慶森, 宋麗萍, 閻亞麗, 劉健 申請(qǐng)人:天津商學(xué)院