專利名稱：調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和發(fā)育生物學(xué)，涉及神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)基因的遺傳工程，以及利用反義RNA和RNA干擾等技術(shù)，以神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)基因及其產(chǎn)物作為干預(yù)干細(xì)胞分化發(fā)育的靶標(biāo)，從而調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，并能進(jìn)行自我更新、足以提供腦組織細(xì)胞的可再生細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能具有重要作用。神經(jīng)干細(xì)胞分化是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程。影響神經(jīng)干細(xì)胞分化的因子很多，如CNTF能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為膠質(zhì)細(xì)胞，而B(niǎo)DNF則促進(jìn)分化為神經(jīng)元。我們先前發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中特異表達(dá)的基因。特異性干預(yù)這些基因的表達(dá)的技術(shù)，對(duì)于研究這些基因的具體功能，以及特異性調(diào)控這些基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育、分化，非常重要。
由于神經(jīng)干細(xì)胞固有的體外分離培養(yǎng)困難的特點(diǎn)，目前對(duì)其所做的報(bào)道往往局限在分離培養(yǎng)技術(shù)上。還缺乏其他調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)基因的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的特異表達(dá)基因的技術(shù)。本發(fā)明的另一目的在于利用這些技術(shù)調(diào)控神經(jīng)發(fā)育。
本發(fā)明包括下列步驟分離和培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞；以神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育分化過(guò)程中特異表達(dá)的基因及其產(chǎn)物為靶標(biāo)，合成特異的核酸片段；以這些合成的核酸片段干預(yù)神經(jīng)干細(xì)胞的分化發(fā)育；研究調(diào)控的效果。具體的包括以下的方案神經(jīng)干細(xì)胞單克隆的獲得和細(xì)胞培養(yǎng)濃度的確定無(wú)菌條件下取E14的SD胎鼠的紋狀體，機(jī)械法將組織吹打成單細(xì)胞懸液，將初始細(xì)胞濃度設(shè)置為1×107個(gè)/毫升，然后在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行梯度稀釋，使用完全培養(yǎng)液，每孔100加入微升，設(shè)置12個(gè)復(fù)孔，以5倍梯度稀釋8次，放于37度5％CO2條件下培養(yǎng)，并連續(xù)觀察兩個(gè)星期。
觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞的初始濃度大于106個(gè)/毫升時(shí)，細(xì)胞不僅在孔底部成連片生長(zhǎng)，而且在培養(yǎng)液中形成大量的懸浮細(xì)胞團(tuán)，且細(xì)胞團(tuán)的體積較大。當(dāng)細(xì)胞的初始濃度約在105個(gè)/毫升時(shí)，細(xì)胞在底部連片生長(zhǎng)，只形成較少的懸浮細(xì)胞團(tuán)，且細(xì)胞團(tuán)的體積較?。粚⒓?xì)胞的初始濃度進(jìn)一步降低時(shí)，則觀察到單個(gè)的細(xì)胞、小片貼壁的細(xì)胞團(tuán)和較小的懸浮細(xì)胞團(tuán)，且它們之間的距離常常相隔較遠(yuǎn)。
用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞的培養(yǎng)無(wú)菌條件下取胎鼠的紋狀體，將組織吹打成單細(xì)胞懸液，以3×105個(gè)/毫升的細(xì)胞濃度，將細(xì)胞種植在添加了EGF和bFGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，然后將裝有培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，棄去原先的的培養(yǎng)液，換入新的完全培養(yǎng)液。以后以同樣方法每周更換一次培養(yǎng)液，即可獲得處于貼壁狀態(tài)下生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞。用此法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行傳代可連續(xù)傳代6個(gè)月以上。
細(xì)胞形態(tài)的觀察將不同培養(yǎng)時(shí)期的細(xì)胞培養(yǎng)物置于倒置顯微鏡下直接觀察拍照。
用間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞①原理已知抗體或抗原用熒光素做標(biāo)記物，檢查細(xì)胞或組織標(biāo)本上相應(yīng)的抗原或抗體，在熒光顯微鏡下，由于抗原抗體特異性結(jié)合，結(jié)合部位的熒光素因受激發(fā)光照射而發(fā)出明亮的熒光。從標(biāo)記物存在的位置和數(shù)量，可確定在組織細(xì)胞中的定位和分布。常見(jiàn)的標(biāo)記熒光素有異硫氰酸(FITC)和四乙基羅丹明(RB200)，前者發(fā)出熒光波長(zhǎng)為490-619納米(黃綠色熒光)。后者發(fā)射熒光波長(zhǎng)為540-660納米(橙紅色熒光)。FITC和RB200常用于標(biāo)記免疫熒光蛋白Ig。
②方法采用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的技術(shù)進(jìn)行鑒定。
RNAi實(shí)驗(yàn)線性DNA模板的制備
將上步制得的質(zhì)粒分別采用EcorRI和XhoI單酶切，酶切體系如下EcorRI單酶切Y+/TanqoTMBuffer 4微升樣品DNA5微升EcorRI 0.5微升水 11.5微升XhoI單酶切Y+/TanqoTMBuffer4微升樣品DNA5微升XhoI 0.5微升水 11.5微升將上述酶切體系混勻后置于37度溫育1小時(shí)。
凝膠電泳及條帶回收用前述同樣的方法進(jìn)行電泳，瓊脂糖凝膠的濃度為1.0％，將酶切液電泳證實(shí)質(zhì)粒已被切開(kāi)后，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收DNA。
RNA的合成(1)將貯存于-20度的MEGAscriptTMT3和T7試劑盒取出，將其中的T3和T7 RNA聚合酶取出直接置于冰上，四種核苷酸溶液(ATP，CTP，GTP和UTP)完全溶解后置于冰上，10*反應(yīng)緩沖液則溶解后置于室溫，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束放回-20度。
(2)按下述配方組裝20微升的反應(yīng)體系無(wú)菌雙蒸水 4微升ATP 2微升CTP 2微升GTP 2微升
UTP2微升10*反應(yīng)緩沖液 2微升切膠回收的DNA樣品 4微升T3(或者T7)RNA聚合酶2微升要注意按上述次序加入各成分。T7 RNA聚合酶對(duì)應(yīng)EcorRI單酶切制得的線性DNA片斷，T3 RNA聚合酶對(duì)應(yīng)XhoI單酶切制得的線性DNA片斷。
(3)將上述體系組裝好以后，輕輕混勻，短暫離心以使液體滯留在管底，然后將管置于37度下溫育4小時(shí)。
RNA的回收采用市場(chǎng)上可以購(gòu)買(mǎi)的試劑盒。按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
RNA的復(fù)性將每種外源DNA片斷對(duì)應(yīng)的兩個(gè)單鏈RNA片斷等量置于一起，充分混勻后，置于5升水中，升溫至90度并保持4分鐘，然后使其自然而緩慢的冷卻至室溫(約需4-5個(gè)小時(shí))，然后將所得雙鏈RNA保存在-20度。
反義RNA抑制人工合成這三個(gè)小序列，并將其導(dǎo)入細(xì)胞，即可達(dá)到抑制對(duì)應(yīng)基因表達(dá)的效果。
轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)在獲得了dsRNA和人工合成了反義DNA片斷之后，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，將這些片斷導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，觀察神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生的變化。
技術(shù)效果通過(guò)上述技術(shù)，我們成功地調(diào)控了與神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育和分化有關(guān)基因的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
神經(jīng)干細(xì)胞單克隆的獲得和細(xì)胞培養(yǎng)濃度的確定無(wú)菌條件下取E14的SD胎鼠的紋狀體，機(jī)械法將組織吹打成單細(xì)胞懸液，將初始細(xì)胞濃度設(shè)置為1×107個(gè)/毫升，然后在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行梯度稀釋，使用完全培養(yǎng)液，每孔100加入微升，設(shè)置12個(gè)復(fù)孔，以5倍梯度稀釋8次，放于37度5％CO2條件下培養(yǎng)，并連續(xù)觀察兩個(gè)星期。
觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞的初始濃度大于106個(gè)/毫升時(shí)，細(xì)胞不僅在孔底部成連片生長(zhǎng)，而且在培養(yǎng)液中形成大量的懸浮細(xì)胞團(tuán)，且細(xì)胞團(tuán)的體積較大。當(dāng)細(xì)胞的初始濃度約在105個(gè)/毫升時(shí)，細(xì)胞在底部連片生長(zhǎng)，只形成較少的懸浮細(xì)胞團(tuán)，且細(xì)胞團(tuán)的體積較?。粚⒓?xì)胞的初始濃度進(jìn)一步降低時(shí)，則觀察到單個(gè)的細(xì)胞、小片貼壁的細(xì)胞團(tuán)和較小的懸浮細(xì)胞團(tuán)，且它們之間的距離常常相隔較遠(yuǎn)。
根據(jù)觀察結(jié)果，我們認(rèn)為在細(xì)胞初始濃度很低時(shí)我們得到的細(xì)胞團(tuán)就是神經(jīng)干細(xì)胞的單克隆。隨著細(xì)胞初始濃度的升高，細(xì)胞團(tuán)之間由于間隔較小而傾向于粘附在一起，形成較大的細(xì)胞團(tuán)。經(jīng)隨后的免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)，那些貼壁的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)也是神經(jīng)干細(xì)胞?？紤]到轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的需要，我們將細(xì)胞濃度設(shè)置在3×105個(gè)/毫升左右，這樣既不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞密度太大，形成的細(xì)胞團(tuán)太大太多而影響實(shí)驗(yàn)觀察和轉(zhuǎn)化效率，也不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞密度太低而使獲得的細(xì)胞數(shù)量太少影響觀察效果。
不同細(xì)胞因子濃度對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響無(wú)菌條件下取E14的SD胎鼠的紋狀體，機(jī)械法將組織吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞的種植濃度為3×105個(gè)/毫升，基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組成為DMEM/F12(1∶1，v/v)，100u·mL-1的青霉素和鏈霉素，1％的B27。然后在下列不同濃度因子的條件下種植到96孔培養(yǎng)板中(每個(gè)條件設(shè)置8個(gè)復(fù)孔)，并置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
①不同的bFGF濃度對(duì)原代細(xì)胞生長(zhǎng)的影響培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液分別加入bFGF至終濃度為0，0.1，0.5，1，5，10，20，30，40，50納克/毫升，培養(yǎng)一周后觀察不同濃度的因子對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
②不同的EGF濃度對(duì)原代細(xì)胞生長(zhǎng)的影響培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液分別加入EGF至終濃度為0，0.1，0.5，1，5，10，20，30，40，50納克/毫升，培養(yǎng)一周后觀察不同濃度的因子對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
③不同條件對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞繼代培養(yǎng)的影響原代培養(yǎng)一周后，收集細(xì)胞，用槍頭吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/毫升，然后重復(fù)前述操作。
經(jīng)過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)EGF和bFGF都具有反應(yīng)性，這兩種細(xì)胞因子都可以刺激神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，刺激強(qiáng)度呈濃度相關(guān)性。對(duì)這兩種細(xì)胞因子而言，當(dāng)其濃度低于20納克/毫升時(shí)，可以明顯的觀察到細(xì)胞的生長(zhǎng)情況隨細(xì)胞因子的濃度增加而增加；當(dāng)其濃度高于20納克/毫升時(shí)，可以明顯的觀察到細(xì)胞的生長(zhǎng)情況隨細(xì)胞因子的濃度增加而減弱。用繼代培養(yǎng)的細(xì)胞所做的實(shí)驗(yàn)同樣觀察到這一現(xiàn)象。因而認(rèn)為這兩種細(xì)胞因子濃度為20納克/毫升時(shí)是適合細(xì)胞培養(yǎng)的最佳濃度。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，由于bFGF的供貨較慢，我們采用了10納克/毫升的濃度來(lái)作培養(yǎng)，而EGF采用了20納克/毫升的濃度。
用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞的培養(yǎng)無(wú)菌條件下取E14的SD胎鼠的紋狀體，機(jī)械法將組織吹打成單細(xì)胞懸液，以3×105個(gè)/毫升的細(xì)胞濃度，將細(xì)胞種植在添加了20納克/毫升EGF和10納克/毫升bFGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，然后將裝有培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，棄去原先的的培養(yǎng)液，換入新的完全培養(yǎng)液。以后以同樣方法每周更換一次培養(yǎng)液，即可獲得處于貼壁狀態(tài)下生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞。用此法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行傳代可連續(xù)傳代6個(gè)月以上。
細(xì)胞形態(tài)的觀察將不同培養(yǎng)時(shí)期的細(xì)胞培養(yǎng)物置于倒置顯微鏡下直接觀察拍照，如圖I。可見(jiàn)在體外培養(yǎng)情況下，神經(jīng)干細(xì)胞呈多形性，有圓形、扁平狀、梭狀、樹(shù)枝狀等等，且易于形成集落生長(zhǎng)。并且我們也發(fā)現(xiàn)，懸浮細(xì)胞團(tuán)和貼壁細(xì)胞團(tuán)可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。懸浮細(xì)胞團(tuán)在生長(zhǎng)一段時(shí)間以后，常常伸出一些分支貼附在瓶壁上。而經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)后，貼壁細(xì)胞團(tuán)有時(shí)會(huì)整個(gè)的懸浮到培養(yǎng)液中。這些變化并沒(méi)有伴隨著其他條件的改變，原因也未見(jiàn)報(bào)道。
蓋區(qū)域的半徑大大超過(guò)細(xì)胞團(tuán)的半徑；C.多量的細(xì)胞散在生長(zhǎng)，呈現(xiàn)出多種多樣的形態(tài)，有些細(xì)胞聚集成團(tuán)；D.細(xì)胞由一個(gè)嵴向外生長(zhǎng)，中心無(wú)明顯的細(xì)胞團(tuán)。
用間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞
②原理已知抗體或抗原用熒光素做標(biāo)記物，檢查細(xì)胞或組織標(biāo)本上相應(yīng)的抗原或抗體，在熒光顯微鏡下，由于抗原抗體特異性結(jié)合，結(jié)合部位的熒光素因受激發(fā)光照射而發(fā)出明亮的熒光。從標(biāo)記物存在的位置和數(shù)量，可確定在組織細(xì)胞中的定位和分布。常見(jiàn)的標(biāo)記熒光素有異硫氰酸(FITC)和四乙基羅丹明(RB200)，前者發(fā)出熒光波長(zhǎng)為490-619納米(黃綠色熒光)。后者發(fā)射熒光波長(zhǎng)為540-660納米(橙紅色熒光)。FITC和RB200常用于標(biāo)記免疫熒光蛋白Ig。
②方法(1)染色前將細(xì)胞種植到Poly-L-lysine包被的玻片上。Poly-L-lysine包被玻片的處理將載玻片置于0.5％的Hcl中，浸泡過(guò)夜，流水沖洗并用雙蒸水清洗，高溫滅菌，浸泡在多聚賴氨酸中并放于37度電熱培養(yǎng)箱中2-3h，去除多余多聚賴氨酸，并用0.02摩爾/升PBS漂洗。
(2)染色當(dāng)天，取出待染細(xì)胞，PBS漂洗兩次，每次5分鐘；(3)用4％多聚甲醛溶液室溫固定20min，吸除固定液；(4)PBS漂洗兩次，邊洗邊輕輕振蕩，每次10分鐘；(5)用含10％山羊血清和0.2％TritonX-100的0.02摩爾/升PBS封閉1h，然后用含1％山羊血清的0.02摩爾/升PBS洗一次；(6)加入一抗，常溫下孵育2h。
(7)PBS漂洗三次，每次10min，除去未反應(yīng)的非特異性吸附的抗體，減少背景染色。
(8)然后加入溶解在含1％山羊血清和0.025％疊氮化鈉的0.02摩爾/升PBS中的連有FITC熒光素的相應(yīng)的二抗，在黑暗中孵育30min。
(9)棄二抗，PBS漂洗三次，每次10min。
(10)甘油明膠封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。
③免疫熒光染色結(jié)果如圖II所示。據(jù)此我們認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中獲得的細(xì)胞就是神經(jīng)干細(xì)胞，包括懸浮狀態(tài)和貼壁狀態(tài)，單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)。
RNAi實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了導(dǎo)入長(zhǎng)鏈dsRNA的方法。下面首先介紹長(zhǎng)鏈dsRNA的合成。
如圖IV所示之pBluescriptII SK質(zhì)粒，已知外源片斷位于該質(zhì)粒的EcorRI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中采用EcorRI單酶切制得線性DNA片斷，然后用T7 RNA聚合酶進(jìn)行聚合，即可制得與外源片斷序列相同，但長(zhǎng)度略多幾十個(gè)堿基的單鏈RNA片斷。同時(shí)采用XhoI單酶切制得另一條線性DNA片斷，然后用T3 RNA聚合酶進(jìn)行聚合，即可制得與外源片斷序列相同，但長(zhǎng)度略多幾十個(gè)堿基的與前述單鏈序列互補(bǔ)的單鏈RNA片斷。將這兩種單鏈RNA片斷等量置于一起進(jìn)行復(fù)性，即可制得與質(zhì)粒中雙鏈外源DNA片斷序列相同的雙鏈RNA片斷(dsRNA，double-strand RNA)。在這個(gè)雙鏈RNA片斷的兩端各有幾十個(gè)堿基的單鏈，但這并不影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
線性DNA模板的制備將上步制得的質(zhì)粒分別采用EcorRI和XhoI單酶切，酶切體系如下EcorRI單酶切Y+/TanqoTMBuffer 4微升樣品DNA 5微升EcorRI 0.5微升水 11.5微升XhoI單酶切 Y+/TanqoTMBuffer 4微升樣品DNA 5微升XhoI0.5微升水 11.5微升將上述酶切體系混勻后置于37度溫育1小時(shí)。
凝膠電泳及條帶回收用前述同樣的方法進(jìn)行電泳，瓊脂糖凝膠的濃度為1.0％，將酶切液電泳證實(shí)質(zhì)粒已被切開(kāi)后，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收DNA。
膠回收步驟如下(1)用干凈的手術(shù)刀割下含需回收DNA的瓊脂塊，放入1.5ml離心管中。瓊脂塊的體積應(yīng)盡量小，但又盡量不要因此損失DNA。判定DNA片段的位置時(shí)，使用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光，在紫外光下照射的時(shí)間應(yīng)盡可能短。
(2)按每400μl/100mg瓊脂糖凝膠的比例加入Binding Buffer，置于50～60℃水浴中10分鐘，使膠徹底融化。加熱融膠時(shí)，每2分鐘混勻一次。加熱的時(shí)間可以延長(zhǎng)到15分鐘，以保證膠全部融化。
(3)將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放在2ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2分鐘。8,000rpm室溫離心1分鐘。
(4)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，加入500μl Wash Solution，8,000rpm室溫離心1分鐘。
(5)重復(fù)步驟4一次。
(6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，12,000rpm室溫離心15秒。
(7)將UNIQ-10柱放入一根新的1.5-ml無(wú)菌離心管中，在柱子膜中央加30μl滅過(guò)菌的雙蒸水，37℃放置2分鐘。
(8)12,000rpm室溫離心1分鐘，離心管中的液體即為回收的DNA片段。RNA的合成(1)將貯存于-20度的MEGAscriptTMT3和T7試劑盒取出，將其中的T3和T7 RNA聚合酶取出直接置于冰上，四種核苷酸溶液(ATP，CTP，GTP和UTP)完全溶解后置于冰上，10*反應(yīng)緩沖液則溶解后置于室溫，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束放回-20度。
(2)按下述配方組裝20微升的反應(yīng)體系無(wú)菌雙蒸水 4微升ATP 2微升CTP 2微升GTP 2微升UTP 2微升10*反應(yīng)緩沖液2微升切膠回收的DNA樣品4微升T3(或者T7)RNA聚合酶 2微升要注意按上述次序加入各成分。T7 RNA聚合酶對(duì)應(yīng)EcorRI單酶切制得的線性DNA片斷，T3 RNA聚合酶對(duì)應(yīng)XhoI單酶切制得的線性DNA片斷。
(3)將上述體系組裝好以后，輕輕混勻，短暫離心以使液體滯留在管底，然后將管置于37度下溫育4小時(shí)。
RNA的回收(1)向每個(gè)20微升反應(yīng)體系中加入25微升LiCl溶液(2)混勻后放于-20度冷凍1小時(shí)(3)然后在4度環(huán)境下以14000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，以沉淀RNA(4)小心的除去上清液，加入1毫升70％乙醇于4度洗滌雙鏈RNA沉淀一次，然后在4度環(huán)境下以14000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，以便最大程度的去除未結(jié)合的單核苷酸。
(5)小心的除盡上清液，將雙鏈RNA沉淀重懸于無(wú)菌雙蒸水中，放-20度保存。
RNA的復(fù)性
將每種外源DNA片斷對(duì)應(yīng)的兩個(gè)單鏈RNA片斷等量置于一起，充分混勻后，置于5升水中，升溫至90度并保持4分鐘，然后使其自然而緩慢的冷卻至室溫(約需4-5個(gè)小時(shí))，然后將所得雙鏈RNA保存在-20度。
電泳觀察dsRNA的合成結(jié)果制取1.2％的瓊脂糖凝膠，制膠方法同前，但是在制膠之前預(yù)先將電泳槽和封好的凝膠灌制平臺(tái)浸泡在0.1％的DEPC中并置于37度環(huán)境下過(guò)夜，在制膠前再用雙蒸水將殘留于電泳槽和制膠槽中的DEPC沖去，電泳結(jié)果如圖V。
從圖中可見(jiàn)，dsRNA片斷的大小與將質(zhì)粒進(jìn)行EcorRI和XhoI雙酶切所得片斷的大小近似，且三個(gè)片斷相互之間的相對(duì)位置相同，因而認(rèn)為獲得了正確的dsRNA片斷。
反義RNA抑制的準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)采取直接將外源DNA小片斷導(dǎo)入細(xì)胞的方法來(lái)達(dá)到反義RNA抑制的效果。
從Genbank查得NM_013389、AF155655、D45370的序列見(jiàn)附錄I，它們?cè)谌旧w上的位置如附錄II所示，分別位于7p13(NM_013389)、12q23.2(AF155655)、10q23.2(D45370)，且都是單拷貝基因，對(duì)于沉默基因，研究該基因的功能提供了重要背景。
由于這些序列都是mRNA序列，根據(jù)讀框，我們?cè)O(shè)計(jì)了20bp長(zhǎng)的與mRNA序列互補(bǔ)的DNA片段，這些小片段可以與對(duì)應(yīng)的mRNA前體5′端結(jié)合，從而抑制mRNA的加帽反應(yīng)，加速mRNA的降解。
每個(gè)基因的對(duì)應(yīng)DNA片段序列如下。
NM_013389GGC CTC CGC CAT CCC AGG TC；AF155655CGT CCT CAT CCA TCT CCT CA；D45370TTG CTT GCC ATG GCT TCG GG。
人工合成這三個(gè)小序列，并將其導(dǎo)入細(xì)胞，即可達(dá)到抑制對(duì)應(yīng)基因表達(dá)的效果。
轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
在獲得了dsRNA和人工合成了反義DNA片斷之后，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，將這些片斷導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，觀察神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生的變化。
轉(zhuǎn)化步驟(1)獲取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的神經(jīng)干細(xì)胞。
(2)將細(xì)胞從瓶壁上吹打下來(lái)，并繼續(xù)吹打以獲得盡可能多的單個(gè)細(xì)胞。
(3)用無(wú)菌的尼龍網(wǎng)過(guò)濾除去未吹打散的較大的細(xì)胞團(tuán)，留下單個(gè)的細(xì)胞以及由較少細(xì)胞組成的小細(xì)胞團(tuán)，以利于提高轉(zhuǎn)化效率。
(4)將過(guò)濾液離心，離心速度1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間5分鐘，使溶液中的細(xì)胞沉淀。
(5)倒去上清液，并吸去殘留瓶口的液滴，將細(xì)胞沉淀重懸于電轉(zhuǎn)化緩沖液中。
(6)取10微升重懸液與等量0.4％臺(tái)盼藍(lán)混勻，置于血球計(jì)數(shù)板上，一分鐘后計(jì)數(shù)。
(7)用2mm-gap的電擊杯，每杯放入15微升的dsRNA或DNA樣品。
(8)以每杯400微升放入細(xì)胞重懸液，稍加抖動(dòng)以混勻，注意杯中不要產(chǎn)生氣泡。
(9)將杯放入電轉(zhuǎn)化儀中電擊，電擊條件為80伏特，脈沖時(shí)間為80微秒。
(10)電擊完畢，將電擊杯置于室溫5分鐘(11)用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至4毫升，混勻，以1毫升/孔放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。
(12)將細(xì)胞置于37度5％CO2條件下培養(yǎng)。
電擊實(shí)驗(yàn)中要注意細(xì)胞放在電轉(zhuǎn)化緩沖液中的時(shí)間總計(jì)不能超過(guò)30分鐘。細(xì)胞的濃度在實(shí)驗(yàn)一般控制在1×105個(gè)/毫升以上，但不宜超過(guò)1×106個(gè)/毫升。過(guò)高的細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率會(huì)帶來(lái)負(fù)影響，且更重要的是影響以后的實(shí)驗(yàn)觀察。對(duì)細(xì)胞的吹打次數(shù)不能太少，否則細(xì)胞多數(shù)處于成團(tuán)狀態(tài)，影響電擊轉(zhuǎn)化的效率。但是吹打次數(shù)過(guò)多又會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)?yè)p傷，影響細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)中采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)即是為了觀察細(xì)胞的損傷程度。在實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞吹打后的存活率一般在90％以上。
dsRNA的轉(zhuǎn)化結(jié)果按上述轉(zhuǎn)化方法將三個(gè)基因的dsRNA片斷轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞，用雙蒸水轉(zhuǎn)化作為對(duì)照，轉(zhuǎn)化后連續(xù)觀察七天。經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，有時(shí)可觀察到細(xì)胞貼壁現(xiàn)象增多，有時(shí)觀察到貼壁現(xiàn)象減少，多數(shù)情況下觀察不到變化。
反義RNA抑制的結(jié)果將前述人工合成的DNA短鏈導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，同樣用雙蒸水轉(zhuǎn)化作為對(duì)照，轉(zhuǎn)化后連續(xù)觀察七天。我們觀察到轉(zhuǎn)化了AF155655的小片段的神經(jīng)干細(xì)胞的貼壁現(xiàn)象明顯增加，轉(zhuǎn)化組與未轉(zhuǎn)化組的比較如圖VI所示(放大50倍)。轉(zhuǎn)化D45370小片段的細(xì)胞則同樣出現(xiàn)了上述變化，但是并無(wú)AF155655的片斷引起的變化顯著。而在轉(zhuǎn)化了NM_013389的小片段的細(xì)胞中未觀察到與對(duì)照組的區(qū)別。重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上述現(xiàn)象并非隨機(jī)出現(xiàn)。
將前述人工合成的DNA短鏈導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，同樣用雙蒸水轉(zhuǎn)化作為對(duì)照，轉(zhuǎn)化后連續(xù)觀察七天。我們觀察到轉(zhuǎn)化了AF155655的小片段的神經(jīng)干細(xì)胞的貼壁現(xiàn)象明顯增加，轉(zhuǎn)化組與未轉(zhuǎn)化組的比較如圖VI所示(放大50倍)。轉(zhuǎn)化D45370小片段的細(xì)胞則同樣出現(xiàn)了上述變化，但是并無(wú)AF155655的片斷引起的變化顯著。而在轉(zhuǎn)化了NM_013389的小片段的細(xì)胞中未觀察到與對(duì)照組的區(qū)別。重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上述現(xiàn)象并非隨機(jī)出現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)控與神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的方法，該方法包括下列步驟a選擇擬調(diào)控的基因；b根據(jù)擬調(diào)控基因序列，設(shè)計(jì)、合成相應(yīng)的核酸片段；c單獨(dú)用合成的序列或者包含該序列的載體轉(zhuǎn)化所需要調(diào)控的宿主細(xì)胞；d檢驗(yàn)調(diào)控的效果。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中調(diào)控的基因是AF155655。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中調(diào)控的基因是D45370。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中調(diào)控技術(shù)主要利用RNA干擾。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中調(diào)控技術(shù)主要利用反義RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了調(diào)控與神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育有關(guān)的基因表達(dá)的技術(shù)。本發(fā)明也提供了鈣技術(shù)相應(yīng)的表達(dá)載體、核酸序列。本發(fā)明提供了實(shí)施該技術(shù)的詳細(xì)步驟。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1488756SQ0315046
公開(kāi)日2004年4月14日 申請(qǐng)日期2003年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月21日
發(fā)明者文鐵橋 申請(qǐng)人:上海大學(xué)