專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因植物gus報告基因組化檢測的改進方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因植物的篩選鑒定方法，尤其是一種轉(zhuǎn)基因植物GUS報告基因組化檢測的改進方法，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
β-葡萄糖苷酸酶的組織化學(xué)檢測法最初用在該酶作為內(nèi)源性酶在哺乳動物體內(nèi)的組織定位。高等植物體內(nèi)不含有β-葡萄糖苷酸酶。Jefferson最早將編碼該酶的基因(GUS)從大腸桿菌中克隆出來，構(gòu)建進植物表達載體中用于轉(zhuǎn)化高等植物，獲得了轉(zhuǎn)GUS基因的植物，并在植物組織中檢測到該基因的表達產(chǎn)物-β-葡萄糖苷酸酶。從此以后，GUS被廣泛地用作植物基因工程中的報告基因，用來篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株。其方法簡單，且只要檢測條件適當，幾乎無背景干擾。
β-葡萄糖苷酸酶可將無色的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)水解生成一種穩(wěn)定的5，5’-二溴-4，4’-二氯靛藍染料，使具有GUS活性的部位呈現(xiàn)藍色。目前普遍使用的GUS組化檢測反應(yīng)體系為100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，0.5mM K4Fe(CN)6，0.5mM K3Fe(CN)6，10mM EDTA，0.1％Triton X-100，1.0mg/ml X-G1uc，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為24小時。長期以來，該反應(yīng)體系一直為相關(guān)領(lǐng)域所采用。
本專利申請的發(fā)明人在多年的植物轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)，這樣的檢測條件和反應(yīng)體系對植物細胞有一定程度的損傷，在檢測過程中經(jīng)常出現(xiàn)有相當一部分被檢測的組織塊褐化，這表明這些組織細胞已死亡。由于GUS的表達受底物的誘導(dǎo)，因此在沒有活性的細胞中，GUS的表達受到影響。這就可能造成漏檢，影響了檢測結(jié)果的準確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對以上現(xiàn)有GUS組化檢測方法存在的問題，提出一種可以避免對植物細胞活力傷害的轉(zhuǎn)基因植物GUS報告基因組化檢測的改進方法，從而提高檢測的準確率。
經(jīng)過反復(fù)試驗，不斷摸索，本專利申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有GUS組化檢測方法存在上述問題的原因主要有1、37℃溫度過高。當然，如果檢測溫度過低(如室溫)，則GUS酶活性降低，也不利于檢測。反復(fù)選擇試驗證明，適當降低溫度并適當延長時間，大多數(shù)植物細胞可保持一定的活力，且GUS酶活無明顯降低。
2、檢測液中100mM磷酸鈉對植物細胞有一定程度的傷害，如將磷酸鈉改為磷酸鉀，同時適當降低其濃度，可提高植物細胞的存活力。但是，緩沖液中離子濃度過低(如20mM)會使緩沖液的緩沖能力降低，可能導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。
3、氧化催化劑的濃度不夠高，適當增加作為氧化催化劑的鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀濃度可提高檢測的靈敏度。
在此認識基礎(chǔ)上，形成了本發(fā)明的以下技術(shù)方案一種轉(zhuǎn)基因植物GUS報告基因組化檢測的改進方法，包括以下步驟1、配制GUS組化檢測液75～85mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，1.5～2.5mMK4Fe(CN)6，1.5～2.5mM K3Fe(CN)6，8～12mM EDTA，0.08～0.012％Triton X-100，0.8～1.2mg/ml X-Gluc；
2、無菌條件下，切取待檢植物組織塊，浸在上述檢測液中；3、反應(yīng)體系置于29～31℃環(huán)境(如水浴、恒溫箱)中，保溫40～60小時；4、觀察反應(yīng)體系中的組織塊顏色，如組織塊呈現(xiàn)藍色，則說明該樣品為GUS轉(zhuǎn)基因陽性。如果檢測的組織為葉片，可用乙醇脫去葉綠素后再觀察。
實踐證明，采用本發(fā)明的技術(shù)方案后，可以有效避免對植物細胞的損傷，幾乎不再出現(xiàn)有被檢測組織塊褐化的現(xiàn)象，從而大大降低了了漏檢率，明顯提高了了檢測結(jié)果的準確性。
由于本發(fā)明突破了成規(guī)的禁錮，經(jīng)周密的綜合分析，采取了優(yōu)化檢測液配方、和檢測反應(yīng)條件等一系列改進技術(shù)措施，因此與現(xiàn)有技術(shù)相比，可以明顯提高篩選鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株的準確率。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明。
實施例一本實施例的轉(zhuǎn)基因植物GUS報告基因組化檢測用于棉花轉(zhuǎn)基因研究中，可以快速篩選鑒定轉(zhuǎn)基因陽性株，具體過程如下1、優(yōu)化配制GUS組化檢測液80mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，2mMK4Fe(CN)6，2mM K3Fe(CN)6，10mM EDTA，0.1％Triton X-100，1.0mg/mlX-Gluc。用0.45μm過濾器過濾滅菌。分裝保存于20℃冰箱中，有效期為6個月。
2、將收獲的種子剝殼后浸于H2O230％溶液中滅菌20分鐘，用無菌水清洗2-3遍，然后播種于MS培養(yǎng)基上。當胚根長到3cm左右時，在超凈工作臺中于根尖頂端分生組織部位切取1mm厚的組織塊5-7塊，將組織塊轉(zhuǎn)到0.5ml無菌管中，加20μl GUS組化檢測液。
3、在30℃中保溫48小時。
4、對來自轉(zhuǎn)基因陽性植株的樣品，均可觀察到典型的藍色反應(yīng)。在顯微鏡下觀察這些呈藍色反應(yīng)的根尖分生區(qū)切片，可以看到其基本分生組織細胞中都有染色點。
實施例二當前，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到推廣應(yīng)用。由于抗蟲棉中含有殺蟲的Bt基因和GUS報告基因，因此可用本發(fā)明的方法來進行抗蟲棉種子純度鑒定和棉田植株真?zhèn)舞b定。
種子純度鑒定步驟與實施例一基本相同。棉田植株真?zhèn)舞b定步驟有所不同之處是步驟2對于從棉田中取來的植物組織如葉片，應(yīng)先用自來水沖洗干凈，再用75％酒精消毒30秒鐘，然后用2.5％次氯酸鈣溶液處理15分鐘，取出后用無菌水清洗3次，用無菌濾紙吸去表面水分，切成2mm2左右大小的組織塊，轉(zhuǎn)到無菌管中，再加入GUS組化檢測液，進行GUS轉(zhuǎn)基因真?zhèn)舞b定。
以上實施例經(jīng)多次試驗，反復(fù)驗證，未發(fā)現(xiàn)被檢測組織塊褐化的現(xiàn)象，說明有效避免了對植物細胞的損傷，檢測結(jié)果準確、可靠。
除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物GUS報告基因組化檢測的改進方法，其特征在于包括以下步驟A、配制GUS組化檢測液75～85mM磷酸鉀緩沖液，1.5～2.5mMK4Fe(CN)6，1.5～2.5mM K3Fe(CN)6，8～12mM EDTA，0.08～0.012％Triton X-100，0.8～1.2mg/ml X-Gluc；B、無菌條件下，切取待檢植物組織塊，浸在上述檢測液中；C、反應(yīng)體系置于29～31℃環(huán)境中，保溫40～60小時；D、觀察反應(yīng)體系中的組織塊顏色，如組織塊呈現(xiàn)藍色，則說明該樣品為GUS轉(zhuǎn)基因陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因植物GUS報告基因組化檢測的改進方法，其特征在于所述步驟A中各組份分別為，80mM磷酸鉀緩沖液，2mM K4Fe(CN)6，2mM K3Fe(CN)6，10mM EDTA，0.1％Triton X-100，1.0mg/ml X-Gluc。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因植物GUS報告基因組化檢測的改進方法，其特征在于所述步驟C中反應(yīng)體系置于30℃環(huán)境中，保溫48小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因植物GUS報告基因組化檢測的改進方法，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該方法具體操作步驟為A、配制GUS組化檢測液75～85mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，1.5～2.5mMK
文檔編號C12Q1/68GK1515694SQ0315283
公開日2004年7月28日 申請日期2003年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月26日
發(fā)明者張震林, 周寶良, 陳松, 張香桂 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院