專利名稱：趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及破碎趨磁細(xì)菌細(xì)胞，提取并純化納米磁性顆粒的方法，通過采用超聲波破碎、蔗糖密度梯度離心、超聲波打散并配合緩沖液洗滌和磁鐵吸附等方法，將趨磁細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)合成的磁性顆粒提取并純化，屬于納米生物技術(shù)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
趨磁細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)與研究豐富了微生物學(xué)的研究內(nèi)容。趨磁細(xì)菌(magneto-tactic bacteria)并不是一個(gè)分類學(xué)上的名詞，它是具有趨磁性的一類細(xì)菌的總稱。目前已知的趨磁細(xì)菌共有13種。在最新版的伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊中，這些趨磁細(xì)菌被分別納入Magnetospirillum(磁螺菌)和Magnetobacterium(磁桿菌)屬中，其中Magnetospirillum屬有兩個(gè)種，即M.magnetotacticum和M.gryphiswaldense(趨磁磁螺菌和格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌)，M.gryphiswaldense為該屬的模式種。作為一類新的微生物，為微生物分類學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)提供了一個(gè)新的研究領(lǐng)域。本發(fā)明所提到的趨磁細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)和研究對生物磁學(xué)和仿生學(xué)具有較大的意義。由于生活在地球上的生物總是要受到地磁場的影響，目前發(fā)現(xiàn)許多生物，從低等到高等生物，甚至人的大腦細(xì)胞中都因存在強(qiáng)磁性物質(zhì)而表現(xiàn)出一些特殊的生物功能，如信鴿與蜜蜂的導(dǎo)航、鰻魚和蝸牛的定向等。由于趨磁細(xì)菌具有結(jié)構(gòu)簡單，在自然界中大量存在等優(yōu)點(diǎn)，極有可能作為一種模式材料，用來了解高等生物產(chǎn)生這些特殊功能的機(jī)理，為仿生學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)，使之能在工程技術(shù)上加以模擬和仿制，從而在導(dǎo)航及定向等高新技術(shù)領(lǐng)域里加以應(yīng)用。
趨磁細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)和研究對地質(zhì)學(xué)具有一定的意義。地質(zhì)學(xué)的一個(gè)重要研究內(nèi)容是探索地磁場及鐵礦石的形成原因，趨磁細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)和研究將為這一研究領(lǐng)域開辟一條新的思路。有人推測趨磁細(xì)菌和鐵還原細(xì)菌一起參與了海洋沉積物的磁化和礦化過程(Farina，M.，et.al.1990；Lovley，D.R.，et.al.1987；Mann，S.，et.al.1990；Stolz，J.F.，et.al.1986)，海底趨磁細(xì)菌磁鐵化石的發(fā)現(xiàn)和Magnetic vibrio MV-1在厭氧條件下能合成磁性顆粒的現(xiàn)象進(jìn)一步地支持了這一假說。此外，我國學(xué)者在研究沉積物磁性勘查油氣法時(shí)也發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)油田土壤中都存在著趨磁細(xì)菌(閻桂林，1997)。
近兩年來，天文物理學(xué)上有一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)就是在火星隕石(ALH84001)中發(fā)現(xiàn)了磁性顆粒(Thomas-Keprta，K.L.，et.al.2001；Friedmann，E.L.，et.al.2001；Scott，E.R.1999；Mckay，D.S.，et.al.1996)。這些顆粒的大小為10-100nm，都是單磁疇晶的，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小與地球上趨磁細(xì)菌形成的磁性顆粒十分相似?？茖W(xué)家由此推測火星上很可能有生命現(xiàn)象存在，并把以上發(fā)現(xiàn)作為一個(gè)很重要的證據(jù)。
在一定條件下，趨磁細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)合成并積累Fe3O4顆粒，它們顆粒大小均勻、一般直徑為納米級(40-50nm)，并具有穩(wěn)定晶型，如八面立方體，平截六棱柱體，彈頭體等(Spring，S.，et al.，1995)。每個(gè)磁性顆粒都有脂蛋白膜包被，因此又被稱為磁小體(magnetosome)。其外膜為磷脂雙分子層，這種雙分子層脂膜由外膜、中膜和內(nèi)膜構(gòu)成。經(jīng)化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，98％的膜成分為脂類，只有2％為蛋白。脂類包括三種1)中性脂類，2)游離脂肪酸，3)糖脂，硫脂和磷脂。這三種脂類在膜的總脂中所占比例分別為8％、30％和62％。其中磷脂類的主要成分是磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺。研究證明，這種磷脂雙分子層脂膜表面帶負(fù)電荷，而且隨著環(huán)境中pH的提高，負(fù)電荷電位也逐漸增加。正是由于膜表面負(fù)電荷的存在，使磁性顆粒間彼此互相排斥，從而防止了納米磁性顆粒間最容易發(fā)生的團(tuán)聚現(xiàn)象(Tanaka，T.，et al.，2000)。
趨磁細(xì)菌產(chǎn)生的這種納米磁性顆?？勺鳛槊篙d體而用于固定化酶生產(chǎn)；作為抗體載體而用于高靈敏度的免疫檢測；作為核酸載體而用于基因轉(zhuǎn)移、基因治療及作為藥物載體而用于靶向治療等。但由于趨磁細(xì)菌的生長對環(huán)境要求比較苛刻，人工培養(yǎng)困難，對細(xì)菌磁性顆粒的應(yīng)用尚局限在實(shí)驗(yàn)室水平。目前為止，尚未見到有關(guān)這種磁性顆粒工業(yè)化生產(chǎn)和專門提取純化的文獻(xiàn)報(bào)道及專利。除了用于酶載體和抗體載體外，若要將其用于基因治療和腫瘤的靶向治療，首先必需獲得高純度的，不含免疫原性物質(zhì)的和膜完整的磁性顆粒。在其用于酶載體和抗體載體的研究文獻(xiàn)中，只有少量涉及這種磁性顆粒提取的內(nèi)容，其中主要是關(guān)于破壁的方法，有以下幾種1)用溶菌酶或NaOH破壁；2)用細(xì)胞壓榨儀破壁；3)超聲波破壁。破壁后采用磁場分離的方法收集磁性顆粒，直接用于對純度要求不高的酶載體和抗體載體。由于納米磁性顆粒的吸附性質(zhì)，上述幾種方法都無法除去有免疫原性的一些物質(zhì)，再者用溶菌酶和NaOH破壁提取的磁性顆粒的膜已被破壞，容易引起團(tuán)聚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，采用本發(fā)明所述方法得到的純化磁性顆粒，其分散均勻，外膜完整，回收率高。
本發(fā)明所述趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，包括以下步驟步驟一，超聲波破碎趨磁細(xì)菌細(xì)胞壁；步驟二，蔗糖密度梯度離心，分離磁性顆粒與細(xì)胞碎片；步驟三，用超聲波打散與緩沖液洗滌磁性顆粒，以除去磁性顆粒表面所吸附的物質(zhì)；步驟四，傾去上清液，加緩沖液后保存。
如上所述的趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，所述步驟一中，超聲波破碎趨磁細(xì)菌的細(xì)胞，是在冰浴條件下，使胞內(nèi)磁性顆粒釋放出來，然后通過磁鐵吸取收集磁性顆粒。
如上所述的趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，所述步驟二中的蔗糖密度梯度離心，將磁性顆粒沉淀懸浮于無菌的70％蔗糖溶液，振蕩均勻，在離心管內(nèi)加入80％蔗糖溶液，將磁性顆粒懸浮液加至80％蔗糖液面之上，采用水平轉(zhuǎn)頭，20℃，6000r/min，離心5分鐘至15分鐘。
如上所述的趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，所述步驟四中加入10ml 0.2M PB磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，4℃保存。
如上所述的趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，可采用多次離心，分批回收磁性顆粒帶。
本發(fā)明采取了超聲波破碎、蔗糖密度梯度離心、超聲波打散并配合緩沖液洗滌和磁鐵吸附回收、電子顯微鏡觀察檢測等手段，提純了趨磁細(xì)菌磁性顆粒；并將純化后的磁性顆粒分別采用能譜、紫外-可見分光光度計(jì)、蒽酮法等方法進(jìn)行檢測，都沒有檢測到雜質(zhì)。純化后的磁性顆粒，經(jīng)電子顯微鏡觀察(放大8萬倍)發(fā)現(xiàn)分散均勻，且外膜完整。經(jīng)冷凍干燥處理后，最終獲得磁性顆粒的回收率可達(dá)30-40mg/L培養(yǎng)液。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。本發(fā)明所述方法的步驟詳細(xì)說明如下1)超聲波破碎趨磁細(xì)菌細(xì)胞壁在冰浴條件下，超聲波破碎趨磁細(xì)菌的細(xì)胞，使胞內(nèi)磁性顆粒釋放出來，然后通過磁鐵吸取收集磁性顆粒。
2)蔗糖密度梯度離心，分離磁性顆粒與細(xì)胞碎片由于磁性顆粒內(nèi)含有Fe3O4晶體，因此需要提高蔗糖的濃度。選擇了70％和80％兩個(gè)濃度的蔗糖溶液作為離心介質(zhì)，每次離心的條件為20℃，6000r/min，離心5分鐘。如上樣量較大時(shí)，可選擇增加離心次數(shù)的方法，分批回收磁性顆粒帶。
3)用超聲波打散與緩沖液洗滌磁性顆粒，以除去磁性顆粒表面所吸附的物質(zhì)細(xì)菌納米磁性顆粒小，易吸附其他物質(zhì)，因此在破壁后，尚有部分細(xì)胞碎片粘附在磁性顆粒表面。這些碎片必須去除。實(shí)驗(yàn)表明，超聲波打散洗滌法，能夠有效地將這些磁性顆粒表面所吸附的物質(zhì)除去。在洗滌過程中也發(fā)現(xiàn)，隨著洗滌次數(shù)的增多，懸浮液中的顆粒肉眼可見度逐漸降低，直至完全分散，懸浮液呈透明狀態(tài)。
4)傾去上清液，加入10ml 0.2M PB磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，4℃保存。
實(shí)施例例1細(xì)胞破碎和磁鐵吸附回收磁性顆粒培養(yǎng)液于4℃，5000r/min離心30min，去掉上清液，將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至一燒杯，加入10mM HEPES通用緩沖液(pH7.4，先滅菌)，振蕩懸浮，置冰浴中進(jìn)行超聲波破碎細(xì)胞；燒杯底部固定一塊磁鐵(約2000guass)，靜置20-30min，或更長時(shí)間(視樣品量而定)，待磁性顆粒全部聚集在燒杯底部形成大量黑色沉淀后，去上清液，就可以進(jìn)行下一步處理了。
例2蔗糖密度梯度離心分離趨磁螺菌的磁性顆粒與細(xì)胞碎片磁鐵吸附完畢，去上清液，將磁性顆粒沉淀懸浮于無菌的70％蔗糖溶液，振蕩均勻。在離心管內(nèi)先加入80％蔗糖溶液，將磁性顆粒懸浮液加至80％蔗糖液面之上，采用水平轉(zhuǎn)頭，20℃，6000r/min，離心5分鐘至15分鐘。如果樣品較多，每離心5分鐘后，可先將磁性顆粒帶吸出，再離心5分鐘，依此類推。
例3超聲波打散與緩沖液洗滌多次，達(dá)到純化磁性顆粒的目的將聚集在2種濃度蔗糖界面的磁性顆粒帶吸出，置一干凈容器內(nèi)，加入10mMHEPES通用緩沖液(pH7.4)，冰浴條件下，超聲波打散，目的是將粘附在磁性顆粒表面的細(xì)胞碎片去除，經(jīng)磁鐵吸附，使磁性顆粒聚集底部，去上層溶液，加入新鮮緩沖液，超聲波擊打，此過程反復(fù)15次以上。洗滌完畢，將磁性顆粒懸浮于無菌的PB磷酸鹽緩沖液，4℃保存。
例4紫外-可見分光光度計(jì)、蒽酮法、能譜、電子顯微鏡檢測磁顆采用紫外-可見分光光度計(jì)檢測懸浮磁性顆粒的溶液，結(jié)果見表1。
蛋白質(zhì)、DNA和RNA分別在280nm、260nm和230nm處有最大吸收峰，由表1.可以看出上清液在此3處波長的吸光值均已低至接近于零，這說明在該上清液中蛋白質(zhì)、DNA和RNA的含量已低至無法檢測，磁性顆粒懸液不含蛋白和核酸。
表1.紫外分光光度法測定上清液中蛋白、核酸含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

蒽酮法測定上清液中殘留糖濃度此蒽酮法適用于0.01mg/ml以上濃度的糖溶液的測定，表2證明，經(jīng)多次洗滌，上清液中殘留糖已除去。
表2.蒽酮法測定上清液中殘留糖濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過能譜(電壓300kv，能量分辨率154ev，元素分析范圍B4～U92)檢測磁性顆粒。能譜分析表明，在磁性顆粒懸液整個(gè)體系中，除無法通過能譜檢測的H元素外，只有C、O、Fe、Na、P五種元素的存在，整個(gè)體系中并不存在其他雜質(zhì)元素?？梢姡?jīng)過一系列洗滌過程，磁性顆粒表面已無其他雜質(zhì)；無論檢測1個(gè)磁性顆粒，6個(gè)磁性顆?；蚨鄠€(gè)磁性顆粒，都得到同樣的結(jié)果。
電子顯微鏡觀察洗滌15次的磁性顆粒。磁性顆粒分散均勻，外膜完整。
最后應(yīng)說明的是以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，其特征在于包括以下步驟，步驟一，超聲波破碎趨磁細(xì)菌細(xì)胞壁；步驟二，蔗糖密度梯度離心，分離磁性顆粒與細(xì)胞碎片；步驟三，用超聲波打散與緩沖液洗滌磁性顆粒，以除去磁性顆粒表面所吸附的物質(zhì)；步驟四，傾去上清液，加緩沖液后保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，其特征在于所述步驟一中超聲波破碎趨磁細(xì)菌的細(xì)胞，是在冰浴條件下，使胞內(nèi)磁性顆粒釋放出來，然后通過磁鐵吸取收集磁性顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，其特征在于所述步驟二中的蔗糖密度梯度離心，將磁性顆粒沉淀懸浮于無菌的70％蔗糖溶液，振蕩均勻，在離心管內(nèi)加入80％蔗糖溶液，將磁性顆粒懸浮液加至80％蔗糖液面之上，采用水平轉(zhuǎn)頭，20℃，6000r/min，離心5分鐘至15分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，其特征在于所述步驟四中，加入10ml 0.2M PB磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，4℃保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，其特征在于如上所述的趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，可采用多次離心，分批回收磁性顆粒帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種趨磁細(xì)菌納米磁性顆粒的提取和純化方法，包括以下步驟，首先，超聲波破碎趨磁細(xì)菌細(xì)胞壁；然后，蔗糖密度梯度離心，分離磁性顆粒與細(xì)胞碎片，用超聲波打散與緩沖液洗滌磁性顆粒，以除去磁性顆粒表面所吸附的物質(zhì)；最后，傾去上清液，加入緩沖液，保存。本發(fā)明采取了超聲波破碎細(xì)胞、蔗糖密度梯度離心、超聲波打散并配合緩沖液洗滌和磁鐵吸附回收、電子顯微鏡觀察檢測等手段，提純了趨磁細(xì)菌磁性顆粒；純化后的磁性顆粒，經(jīng)電子顯微鏡觀察(放大8萬倍)發(fā)現(xiàn)分散均勻，且外膜完整，經(jīng)冷凍干燥處理后，最終獲得磁性顆粒的回收率可達(dá)30－40mg/L培養(yǎng)液。
文檔編號C12P1/04GK1580267SQ03153488
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月14日
發(fā)明者李穎, 姜偉, 付剛, 李季倫 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)