專利名稱：含腺病毒E4orf4蛋白的靶向性抗腫瘤融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組人表皮生長因子一腺病毒早期轉錄區(qū)4第四開放讀碼框蛋白產物(E4orf4)融合蛋白、編碼這種融合蛋白的融合基因、含有該融合基因的表達載體、利用甲基營養(yǎng)型酵母進行分泌性表達這種重組融合蛋白的方法及含有該蛋白的醫(yī)藥組合物及其治療用途。
背景技術：
人腺病毒基因早期轉錄區(qū)4(E4)轉錄單元中至少包含7個開放讀碼框，其各自的產物無明顯的相似性。其中第四開放讀碼框(E4open reading frame 4，E4orf4)編碼的產物是一個由114個氨基酸組成的14kDa小分子蛋白，其氨基酸序列與任何已知蛋白沒有同源性。E4orf4蛋白具有一個高度保守的序列，為RXKRRXRRRR，它在氨基端還有一個富含脯氨酸的序列，有可能提供潛在的Src同源區(qū)3(SH3)結合位點。包括氨基端和羧基端區(qū)域在內，多肽鏈的任何小部分氨基酸缺失都會產生無功能和通常是不穩(wěn)定的突變體。在腺病毒感染早期，E4orf4基因就由E4啟動子轉錄產生mRNA。盡管在晚期E4啟動子停止轉錄，但細胞中的E4orf4蛋白始終保持一個穩(wěn)定的水平。這說明E4orf4蛋白在細胞內是高度穩(wěn)定的(Branton PEand Roopchand DE.Oncogene，2001；(20)7855-7865；Marcellus RC，Chan H，Paquette D et al.J Virol，2000；74(17)7869-7877)。
許多種病毒在它們的生活周期中都可誘導凋亡而殺死被感染的細胞。人腺病毒感染可形成一個誘導和抑制凋亡的復雜過程。腺病毒早期區(qū)1A(E1A)產物通過增強p53基因的活性及穩(wěn)定性，導致p53依賴的細胞凋亡。早期區(qū)1B(E1B)編碼55kDa、19kDa兩個蛋白，與E4orf6蛋白一起通過阻斷E1A的毒性作用抑制凋亡而產生大量病毒。進一步實驗發(fā)現，用p53缺失細胞感染腺病毒，表達完整E1A，仍可誘導細胞凋亡，提示這一過程是由在E1A反式激活區(qū)控制下表達的其它病毒產物所致。經過一系列實驗最終將細胞毒功能定位于E4orf4蛋白，在其它腺病毒蛋白不存在的情況下，E4orf4蛋白有高細胞毒性，誘導不依賴p53的細胞凋亡，表達E4orf4的pcDNA質粒可誘導腫瘤細胞的死亡率達80-90％，是僅有的可獨自殺死細胞的E4產物。腺病毒E4orf4蛋白是一種多功能的病毒調節(jié)蛋白，在體外實驗中，它能夠特異地引起轉化細胞的凋亡，而對正常細胞沒有影響；E4orf4蛋白所誘導的細胞凋亡是p53非依賴性的，其誘導凋亡作用的發(fā)揮，需要與蛋白磷酸酶2A的相互作用；E4orf4蛋白通過調節(jié)Src激酶的活性，引發(fā)細胞凋亡的細胞質表現(Maecellus RC，Tendom JG，Wu T et al.J.Virol.1996，706207-6215；Marcellus RC，Lavoie JN，Boivin D et al.J.Virol.1998，727144-7153；Shtricheman R，Sharf R，Barr H et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1999，9610080-10085)。
大量研究報道證實，在大多數腫瘤細胞如乳腺、肺、腦、膀胱、腎、前列腺等都有EGF受體的過量表達，而且它們的細胞株在體外的生長或移植后常受EGF抑制。有結果顯示，采用化學連接RNase 1與重組EGF，形成復合物EGF-RNase 1，對高表達EGF受體的乳腺癌和鱗狀細胞癌有劑量依賴型的細胞毒作用，即表達EGF受體越高的細胞系則細胞毒作用越明顯。最近Dmitriev等利用桿狀病毒表達體系表達了CAR-EGF融合蛋白(CAR，柯薩基病毒和腺病毒受體)，有效地通過EGF與EGF受體結合的靶向性作用，將腺病毒載體轉運至腫瘤細胞內，增加了報告基因的釋放(楊予安，黃秉仁，蔡良婉，等.中華醫(yī)學科學院學報.1996，18(3)171；Ueda M，PsarrasK，Jinno H et al.Breast Cancer 1997，4(4)253-255；Dmitriev I，Kashentseva E，Rogers BE et al.J.Virol.2000，74(15)6875-6884)。
由于人類腫瘤中高比例的p53基因突變以及這些腫瘤的常規(guī)治療預后往往不佳，因此發(fā)現一種治療p53突變腫瘤的新方法是非常有意義的嘗試。腺病毒是一種很有應用前途的基因治療載體，但鑒于腺病毒的基因治療在提供了諸多益處的同時，有關技術尚未完全成熟，在治療的安全性方面具有一定的風險性。因此，進一步探求利用腺病毒而進行治療的方法和藥物仍是腫瘤治療領域的研究熱點。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一種重組人表皮生長因子-腺病毒E4orf4融合蛋白，含有該融合蛋白的藥物組合物及其用于靶向性腫瘤治療的用途。在一個實施方案中，編碼本發(fā)明的融合蛋白的融合基因具有SEQ ID NO1的序列，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
本發(fā)明的另一方面涉及編碼所述融合蛋白的融合基因，含有該融合基因的表達載體及工程菌株。根據本發(fā)明的一種遺傳工程菌株，命名為巴氏畢赤酵母GS115-3 EGF-E4orf4，已于2002年7月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心〔CGMCC〕，其保藏號為0771。


圖1重疊PCR構建α-因子前導肽-EGF-E4orf4基因片段；圖2重組質粒pUC-EGF-E4orf4的酶切鑒定電泳圖譜；圖3重組質粒pUC-EGF-E4orf4定點突變示意圖；
圖4質粒pAO815物理圖譜，pAO815由7709個核苷酸組成，其中堿基1-940為5’AOX1啟動子片段，堿基943-948為EcoRI位點，堿基950-1277為3’AOX1轉錄終止子(TT)，堿基4199-1665為HISORF，堿基4554-5310為3’AOX1片段，堿基6394-5740為C olE1起始，堿基7399-6539為氨芐青霉素抗性基因；圖5重組質粒pAO-EGF-E4orf4的構建圖；圖6重組質粒pAO-EGF-E4orf4的酶切鑒定電泳圖；圖7重組質粒pAO-3EGF-E4orf4的構建圖；圖8重組質粒pAO-3EGF-E4orf4的酶切鑒定電泳圖；圖9Mut+和Muts轉化子對比；圖10GS115-3EGF-E4orf4分泌EGF-E4orf4的SDS-PAGE電泳圖；圖11GS115-3EGF-E4orf4分泌EGF-E4orf4的Western Blot分析。
圖12重組EGF-E4orf4融合蛋白經陽離子交換層析純化后的結果；圖13MTT比色法檢測BT325細胞活力；圖14MTT比色法檢測MDA-MB-231細胞活力；圖15MDA-MB-231細胞培養(yǎng)72小時，流式細胞儀分析細胞凋亡的情況；圖16MDA-MB-231細胞與融合蛋白EGF-E4orf4(10μg/3×105細胞)共同培養(yǎng)72小時，流式細胞儀分析細胞凋亡的情況；圖17MDA-MB-231細胞與融合蛋白EGF-E4orf4(15μg/3×105細胞)共同培養(yǎng)72小時，流式細胞儀分析細胞凋亡的情況；
圖18MDA-MB-231細胞與融合蛋白EGF-E4orf4(20μg/3×105細胞)共同培養(yǎng)72小時，流式細胞儀分析細胞凋亡的情況；圖19MDA-MB-231細胞與融合蛋白EGF-E4orf4(25μg/3×105細胞)共同培養(yǎng)72小時，流式細胞儀分析細胞凋亡的情況。
具體實施方案根據本發(fā)明的一個方面，提供了一種重組人表皮生長因子(EGF)—腺病毒E4orf4融合蛋白，其從N端至C端依次為人表皮生長因子，接頭，和腺病毒E4orf4蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
根據本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的融合蛋白的融合基因。
本發(fā)明融合基因中優(yōu)選采用的是經人工合成的編碼51個氨基酸的EGF基因片段，該基因片段詳見中國專利申請?zhí)?7115284.5所述。本發(fā)明融合基因中的腺病毒的E4orf4蛋白基因序列優(yōu)選是經過修飾的編碼腺病毒A5的E4orf4蛋白基因序列，所述修飾的序列是經定點突變將第228位堿基由T突變?yōu)镚，從而消除了限制性內切酶BglII的酶切位點，但不改變氨基酸序列，以便于酵母多拷貝串聯表達載體的構建。在EGF與E4orf4兩個基因片段之間的接頭優(yōu)選是編碼由甘氨酸和絲氨酸組成的11個氨基酸的基因序列，使其能形成一個臂，以保證EGF和E4orf4蛋白能互不干擾，各自形成獨立的高級結構，行使正常的生物活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的編碼EGF-E4orf4融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO1所示。
根據本發(fā)明的再一方面，提供了包含本發(fā)明的融合基因的表達載體和含有該表達載體的工程菌。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達載體是可分泌性表達的整合型單拷貝或三拷貝EGF-E4orf4融合蛋白的表達載體，其是通過采用重疊PCR將編碼酵母α-因子前導肽的DNA片段與EGF-E4orf4融合蛋白的基因序列融合，并在α-因子前導肽前加入Kozak序列，再克隆到醇氧化酶啟動子(AOX1)下游構建而成。本發(fā)明的單拷貝和三拷貝表達載體例如為pAO-EGF-E4orf4和pAO-3EGF-E4orf4，如圖5和圖7所示。優(yōu)選地，本發(fā)明的工程菌是包含本發(fā)明的表達載體的甲基營養(yǎng)型酵母(又稱巴氏畢赤酵母)，特別是巴氏畢赤酵母GS115-3 EGF-E4orf4，其已于2002年7月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心〔CGMCC〕，其保藏號為0771。該菌株是以3拷貝載體轉化巴氏畢赤酵母株GS115后篩選出的整合型Mut+基因型菌株(GS115-3EGF-E4orf4)，經高密度培養(yǎng)及誘導表達后，該株可分泌EGF-E4orf4融合蛋白。分泌表達的EGF-E4orf4融合蛋白分子量與預測的相符。分別使用兔抗人EGF多克隆抗體及兔抗腺病毒E4orf4蛋白的抗血清進行Western Blot分析，證實特異表達蛋白條帶與兩個抗體均呈陽性反應，為由EGF和E4orf4兩部分組成的融合蛋白。利用柱層析分離純化表達蛋白，使提純純度達90％或更高。
另外，本發(fā)明在EGF-E4orf4融合蛋白第176個氨基酸的編碼序列末端連接有兩個終止子TAA和TGA，這種設計有利于基因表達產物的分離純化和基因轉錄的終止。而Kozak序列的加入為高效表達EGF-E4orf4融合蛋白提供了條件。
本發(fā)明的融合蛋白具有腫瘤靶向性，能特異性殺死腫瘤細胞尤其是p53基因缺陷的腫瘤，靶向性是利用大多數腫瘤細胞表面都有EGF受體的高表達，融合蛋白中含有EGF，通過EGF與EGF受體的結合，可將E4orf4蛋白帶入腫瘤細胞內，E4orf4是腺病毒中可獨自產生高細胞毒性的蛋白，其可誘導腫瘤細胞發(fā)生不依賴p53的凋亡，從而實現腫瘤的定向治療。本發(fā)明融合蛋白的活性如實施例部分所驗證。
本發(fā)明的另一方面涉及含有藥物有效量的EGF-E4orf4融合蛋白作為有效成分的藥物組合物。這種組合物含有制藥上可接受的載體、輔助劑、稀釋或填充劑。所述的藥物組合物可以注射給藥，或是經介入治療腫瘤局部給藥，總之以適合臨床需要用于腫瘤的治療。
以下將參照如下實施例進一步描述本發(fā)明。
實施例1重疊PCR構建α-因子前導肽-EGF-E4orf4基因片段本例中采用如下PCR引物引物1(31-mer)5’-GGAATTCACC ATGAGA TTT CCT TCA ATT TTT-3’EcoRIKozak引物2(45-mer)5’-ACC ACC ACC GGA ACC ACC ACC ACC TTC CCA CCACTT CAA GTC TCT-3’引物3(45-mer)5’-GGT TCC GGT GGT GGT GGT TCC TCC ATG GTT CTTCCA GCT CTT CCC-3’引物4(31-mer)5’-GGAATTCTCA TTACTG TAC GGA GTG CGC CGA-3’EcoRI 終止密碼其中引物1含有EcoRI酶切位點和Kozak序列，并與α-因子前導肽的5’端互補；引物2與EGF的3’端互補，并加入了部分編碼由甘氨酸和絲氨酸組成的氨基酸臂的序列；引物3與E4orf4的5’端互補，并加入了部分編碼由甘氨酸和絲氨酸組成的氨基酸臂的序列，這段序列與引物3互補；引物4與E4orf4的3’端互補，并加入了兩個終止子及EcoRI酶切位點。
以質粒pYA41EGF為模板(黃秉仁，張岱，遲來順，等.中國醫(yī)學科學院學報1989，11(5)331-337)，用引物1和引物2進行擴增，得到DNA片段含有EcoRI識別位點、Kozak序列、α-因子前導肽、EGF和8個由甘氨酸和絲氨酸組成的氨基酸臂。以質粒pUC-E4orf4為模板，用引物3和引物4擴增得到的DNA片段含有8個由甘氨酸和絲氨酸組成的氨基酸臂、E4orf4和E coRI識別位點。進一步以兩個DNA片段為模板，先進行退火，使兩端氨基酸臂的5個氨基酸的堿基互補，再用引物1和引物4進行擴增，即得到兩端為EcoRI識別位點、含有完整的α-因子前導肽-EGF-E4orf4基因片段。該基因片段經EcoRI酶切后連入pUC18質粒載體，所得重組克隆為pUC-EGF-E4orf4，見圖1。測序結果證實其與設計完全相符。
實施例2重組質粒pUC-EGF-E4orf4的酶切鑒定鑒定方法2μg重組質粒pUC-EGF-E4orf4加入EcoRI酶于37℃消化2h后，1.0％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色可見pUC18載體片段及編碼α-因子前導肽-EGF-E4orf4共261個氨基酸、2個終止子、Kozak序列及EcoRI位點的約800bp的DNA克隆片段。
該質粒的酶切鑒定見圖2，圖中泳道1λDNA/HindIII，片段從大到小依次為23130bp、9414bp、6557bp、4361bp、2322bp、2021bp、564bp。泳道2重組質粒pUC-EGF-E4orf4。泳道3pUC-EGF-E4orf4/EcoRI 2.69kb(載體)，800bp(插入片段)。泳道4DNA Marker DL2000，片段從大到小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
實施例3重組質粒pUC-EGF-E4orf4的定點突變因構建多拷貝表達載體時需要利用同尾酶BglII和BamHI進行表達單元的串聯連接，故外源基因片段中不能含有BglII和BamHI的切點。E4orf4基因片段中含有1個BglII識別位點，需通過定點突變將其去除，但不改變氨基酸序列。
定點突變采用Stratagene公司的試劑盒(QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit)，策略見圖3。定點突變的引物序列如下引物15’-CGG AGA CGC AGA TCG GTT TGT CAC GCC CGC-3’引物25’-GCG GGC GTG ACA AAC CGA TCT GCG TCT CCG-3’以實施例1得到的質粒pUC-EGF-E4orf4為模板，進行定點突變的PCR擴增后，轉化大腸桿菌DH5α，轉化子經DNA序列分析證實E4orf4基因第228位堿基由T變?yōu)镚。用EcoRI酶切突變后的pUC-EGF-E4orf4質粒，得到編碼α-因子前導肽-EGF-E4orf4的基因片段，與經EcoRI線性化的酵母表達載體pAO815(購自Invitrogen公司)連接得到重組質粒pAO-EGF-E4orf4(圖5)。
實施例4重組質粒pAO-EGF-E4orf4的酶切鑒定pAO815載體AOX1啟動子下游既第944bp處為EcoRI克隆位點，重組質粒pAO-EGF-E4orf4經EcoRI酶切后，可見一約800bp的插入片段。重組質粒pAO-EGF-E4orf4需經酶切鑒定篩選出正向克隆，在α-因子前導肽的第24位堿基處有PstI切點，pAO815載體的第6858位堿基處亦有一個PstI切點，重組質粒pAO-EGF-E4orf4經PstI酶切后，正向克隆可獲得1.8kb及6.7kb的兩個片段，反向克隆則為2.6kb及5.9kb的兩個片段。
該質粒的酶切鑒定電泳結果見圖6，圖中泳道1DNA分子量標記DL2000，片段從大到小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。泳道2pAO-EGF-E4orf4/EcoRI，7.7kb(載體)，800bp(插入片段)。泳道3pAO-EGF-E4orf4/PstI，6.7kb，1.8kb。泳道4pAO-EGF-E4orf4。泳道5λDNA/HindIII，片段從大到小依次為23130bp、9414bp、6557bp、4361bp、2322bp、2021bp、564bp。
實施例5三拷貝表達載體pAO-3EGF-E4orf4的構建將實施例3得到的pAO-EGF-E4orf4用BglII和BamHI切出含AOX1啟動子、α-因子前導肽-EGF-E4orf4編碼順序及AOX1終止子的片段，使之體外自連后再用BglII和BamHI酶切，此時反應體系中只有BglII與BamHI連接成的二聚體，即片段兩端分別為BglII及BamHI的片段不能被再次切開。將此反應物連入堿性磷酸酶處理過的pAO-EGF-E4orf4的BamHI位點，轉化DH5α受體菌，重組子DNA酶切篩選鑒定后可獲得含同方向的三拷貝EGF-E4orf4表達單元的重組pAO-3EGF-E4orf4。質粒構建圖見圖7，質粒酶切鑒定圖譜見圖8。
pAO815以BglII及BamHI酶切后將產生由大至小4028bp，2405bp，1279bp三個片段；pAO-EGF-E4orf4以BglII及BamHI酶切后將產生由大至小4028bp，2405bp，2079bp三個片段，最后一個片段系因800bp片段插入1279片段而來。pAO-3EGF-E4orf4以BglII及BamHI酶切后將產生由大至小6237bp，4028bp，2405bp三個片段，6237bp片段系2079bp片段的三倍體。
圖8中泳道1λDNA/HindIII，片段從大到小依次為23130bp、9414bp、6557bp、4361bp、2322bp、2021bp、564bp。泳道2pAO815/BglII+BamHI，片段從大到小依次為4028bp，2405bp，1279bp。泳道3pAO-EGF-E4orf4/BglII+BamHI，片段從大到小依次為4028bp，2405bp，2079bp。泳道4pAO-3EGF-E4orf4/BglII+BamHI，片段從大到小依次為6237bp，4028bp，2405bp。
實施例6宿主菌的制備、轉化及工程菌的篩選采用甲基營養(yǎng)型酵母(即Pichia pastoris，巴氏畢赤酵母)作為表達宿主。甲基營養(yǎng)型酵母有許多優(yōu)點(1)含特有的AOX1(醇氧化酶)啟動子，用甲醇可以嚴格地調控表達。(2)有完備的發(fā)酵方法，可以高密度連續(xù)培養(yǎng)，蛋白表達產量高。(3)生存能力強，易于處理，可以在廉價的非選擇性培養(yǎng)基中生長。為此，本發(fā)明采用的經實施例5得到的多拷貝EGF-E4orf4表達載體pAO-3EGF-E4orf4，它的轉化、篩選和表達過程如下。
實施例6至9中使用的材料為10X YNB134g含硫酸銨但不含氨基酸的酵母堿基溶于1000ml水，無菌過濾后備用。
500X生物素(0.02％生物素)20mg VitH溶于100ml水，無菌過濾后，4℃儲存?zhèn)溆谩?br> 10X D(20％葡萄糖)200g葡萄糖溶于1000ml水，無菌過濾后，4℃儲存?zhèn)溆谩?br> 10X M(5％甲醇)5ml甲醇溶于95ml水，無菌過濾后，4℃儲存?zhèn)溆谩?br> 10X GY(10％甘油)100ml甘油溶于900ml水，高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?br> 1M磷酸鹽緩沖液，pH6.0混合132ml 1M K2HPO4，868ml 1MKH2PO4。
BMG及BMMY100mM磷酸緩沖液pH6.0，1.34％YNB，1％甘油或0.5％甲醇，0.00004％生物素，BMMY中還含有1％酵母提取物，2％蛋白胨。
YPD培養(yǎng)基1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。
MD及MM1.34％YNB，0.00004％生物素，2％葡萄糖或0.5％甲醇。
表達載體3EGF-E4orf4的制備及線性化具體步驟中等量質粒DNA的制備50ml含100μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基中接種含該表達載體的菌株后，37℃搖床培養(yǎng)過夜，離心收集菌體后，用QIAGEN公司的質粒純化試劑盒提取純化質粒DNA。
取10μg pAO-3EGF-E4orf4用BglII完全酶切后，酚-氯仿-異戊醇抽提、乙醇沉淀、冷凍干燥備用。
實施例7pAO-3EGF-E4orf4轉化宿主菌巴氏畢赤酵母GS115(his4-)購自Invitrogen公司，將之接種于YPD板上，30℃培養(yǎng)2天，分離出單克隆。單克隆再接種于5mlYPD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600約為1.3-1.5，離心收集菌體，消毒冷卻水漂洗、離心后混懸于1ml冰冷的1M山梨醇溶液。取80μl宿主菌與經實施例6制備好的5μl 10μg線性化的pAO-3EGF-E4orf4混合于電打孔杯中，0℃預冷5分鐘。設置Bio-Rad基因打孔儀(Gene-pluserII)程序，使產生7500V/cm，10ms的電脈沖以完成轉化。立即加入1ml冰冷的1M山梨醇于電打孔杯中，取200μl鋪MD培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)至重組子出現。
實施例8篩選Mut+和Muts轉化子甲基營養(yǎng)型酵母含有兩個AOX基因，分別為AOX1，AOX2基因。將表達載體用不同的酶切(如BglII，NotI或SalI，StuI等)后線性化，使之整合于酵母基因組的AOX1或HIS4基因的位置。當酵母的AOX1基因被替換而丟失后，就產生了Muts表型(methanolutilization slow)，它們將利用弱的AOX2基因啟動合成AOX，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長緩慢。而野生型的酵母在含甲醇的培養(yǎng)基中生長正常，被稱為Mut+表型。
準備好MD-瓊脂糖板和MM-瓊脂糖板。在將GS115-Albumin(His+Muts)及GS115-Gal(His+Mut+)兩個菌株作為對照的情況下，用無菌牙簽將實施例7所獲轉化子從MM板到MD板依次對稱接種到兩種平板上，30℃培養(yǎng)，觀察轉化子的生長情況。Muts表型在含甲醇的培養(yǎng)基中生長緩慢，Mut+表型在含甲醇的培養(yǎng)基中生長正常，見圖9。挑取His+Mut+的轉化子作為遺傳工程菌株，命名為GS115-3EGF-E4orf4，觀察EGF-E4orf4表達情況。
實施例9EGF-E4orf4的表達應用搖瓶培養(yǎng)實施例8獲得的遺傳工程菌株GS115-3EGF-E4orf4。以單克隆或-80℃保存的菌種接種于25mlBMG培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)18-24h，至OD600＝10～12，離心收集菌體，轉接至250mlBMMY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，每24h以1％濃度追加甲醇進行誘導表達，最佳誘導表達時間確定為96～120h。離心收集培養(yǎng)上清，進行EGF-E4orf4融合蛋白的檢測。
實施例10重組EGF-E4orf4融合蛋白的檢測經上述實施例9得到的重組EGF-E4orf4融合蛋白，用SDS-PAGE蛋白電泳分析。使用Bio-Rad蛋白電泳裝置，灌制15％分離膠，收集的培養(yǎng)上清，加入蛋白電泳樣品緩沖液，100℃變性5min后上樣電泳，100V恒壓，電泳至溴酚蘭出膠，停止電泳，用硝酸銀染色。
結果見圖10，參照蛋白分子量標準，EGF-E4orf4融合蛋白的分子量約為20kD，符合氨基酸組成的EGF-E4orf4融合蛋白的分子量。圖10中泳道1GS115-3 EGF-E4orf4表達上清，箭頭所示為EGF-E4orf4融合蛋白條帶。泳道2蛋白低分子量標準，片段從大到小依次為43kD、29kD、18.4kD、14.3kD、6.2kD。
還進行了Westem Blot分析。將重組EGF-E4orf4融合蛋白先經SDS-PAGE電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上，先分別加入兔抗人EGF多克隆抗體(購自Santa Cruz公司)或兔抗E4orf4蛋白抗血清(本發(fā)明人依常規(guī)方法制備)與硝酸纖維素膜孵育，室溫1h，漂洗后再加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體，室溫1h，漂洗后采用ECL化學發(fā)光顯色法檢測。
結果見圖11，可見EGF-E4orf4融合蛋白與人EGF抗體呈陽性反應。圖11中泳道1蛋白低分子量標準，片段從大到小依次為43kD、29kD、18.4kD、14.3kD、6.2kD。泳道2-3GS115-3EGF-E4orf4表達上清，一抗為兔抗人EGF多克隆抗體。泳道4GS115-3EGF-E4orf4表達上清，一抗為兔抗E4orf4抗血清，箭頭所示為EGF-E4orf4融合蛋白條帶。
實施例11.重組EGF-E4orf4融合蛋白的分離純化將實施例9得到的含有重組EGF-E4orf4融合蛋白的酵母表達上清，采用Pharmacia公司的FPLC系統，進行陽離子交換層析純化。層析柱XK26，層析介質SP Sepharose Fast Flow(strong cation)，柱體積50ml。酵母表達上清用6-7倍體積緩沖液A(50mMNaAC/HAC，pH4.0)稀釋，用0.45μm的微孔濾膜過濾；用5個柱體積的緩沖液A平衡介質后，上樣，流速5ml/min，用緩沖液A將上樣峰洗至基線后，調整流速至3ml/min，用不同鹽濃度的緩沖液B(B10.5M NaCL，50mM NaAC/HAC，pH4.0；B21.0M NaCL，50mM NaAC/HAC，pH4.0；B31.5M NaCL，50mM NaAC/HAC，pH4.0)進行分步洗脫，分管收集洗脫峰，SDS-PAGE蛋白電泳鑒定。用0.5M和1.0M NaCl，50mM醋酸緩沖液，pH4.0，可將大部分雜蛋白洗脫，隨后用1.5M NaCl，50mM醋酸緩沖液，pH4.0洗脫，可得到較好的純化效果。收集經電泳鑒定后含有融合蛋白的洗脫液，透析脫鹽，PEG-10000濃縮，用0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃保存，并作蛋白定量。見圖12。
圖12中泳道1融合蛋白EGF-E4orf4酵母表達上清。泳道2蛋白低分子量標準，片段從大到小依次為43kD、29kD、18.4kD、14.3kD。泳道3陽離子交換層析收集的洗脫液，箭頭所示為重組EGF-E4orf4融合蛋白。
實施例12.MTT比色實驗測定重組EGF-E4orf4融合蛋白對細胞活力的影響活細胞的線粒體脫氫酶能將染料MTT(二甲基噻唑藍二苯基四唑溴鹽)轉變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙镔|(formazan)顆粒，后者被有機溶劑DMSO溶解后所呈現的色度(用OD值表示)，能夠反映出活細胞的代謝水平。死細胞則無此酶活性。因此在一定細胞數目范圍內，MTT結晶物的形成量與活細胞數成正比。在本例中，即利用此實驗測試融合蛋白對細胞活力的影響。
具體地，用0.25％胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基吹打成單細胞懸液，以每孔5000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl，37℃，5％CO2培養(yǎng)，20-24小時待細胞完全貼壁后，棄去上清，更換為含5％胎牛血清的培養(yǎng)基，每孔200μl，37℃，5％CO2培養(yǎng)。用PBS將實施例11得到的融合蛋白EGF-E4orf4從1ng-15μg/ml的濃度作系列稀釋，EGF標準品作為對照，按照與融合蛋白EGF-E4orf4等分子比作對應的濃度稀釋，每孔依次加入稀釋好的連續(xù)梯度融合蛋白EGF-E4orf4溶液和等分子比對應的EGF溶液，每個濃度設3個平行孔，重復2板，與細胞共同孵育，37℃，5％CO2培養(yǎng)2-3天。每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃，5％CO2繼續(xù)孵育4--5小時，小心吸去孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入100μl DMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上測定各孔在波長570nm的光吸收值。將OD值求均值，輸入SPSS分析軟件，結果以自動生成的曲線圖表示，橫坐標顯示刺激物濃度，為融合蛋白E4orf4的終濃度(ng/ml)，縱坐標為OD值。
圖13中可見BT325細胞(人腦神經膠質瘤細胞，由北京天壇醫(yī)院建株)與融合蛋白EGF-E4orf4共同培養(yǎng)44小時，從2.5μg/ml到12.5μg/ml的較高濃度下，細胞活力持續(xù)下降，在融合蛋白達到12.5μg/ml即本實驗所用融合蛋白的最高濃度處，細胞活力降至最低，OD570為O.183，遠遠低于未加刺激物的陰性對照組細胞活力，其OD570為0.276，表現完全不同于加入EGF的陽性對照組細胞，此時加入對應分子數濃度的EGF組細胞的活力仍舊維持在一個較高的水平上，出現兩條活力曲線分離的現象。這一結果證明融合蛋白EGF-E4orf4可以在EGF的介導下進入BT325細胞，并且當其濃度積累到較高水平時，能夠對BT325細胞產生明顯的細胞毒作用。
圖14中可見MDA-MB-231細胞(人乳腺癌細胞，ATCCNumberHTB-26)與融合蛋白EGF-E4orf4共同培養(yǎng)68小時，從濃度加至500ng/ml起，細胞活力降至最低，低于未加刺激物的對照細胞組，在以后的刺激物濃度下(2.5μg/ml-15μg/ml)，細胞活力始終低于或接近于未加刺激物的對照細胞組，而EGF對照組的細胞活力則始終高于未加刺激物組，表明融合蛋白EGF-E4orf4可以抑制MDA-MB-231細胞的活力。
實施例13.流式細胞儀檢測細胞凋亡在細胞凋亡過程中，由于胞漿和染色質濃縮，細胞核裂解，產生凋亡小體，導致細胞光散射性質發(fā)生變化。與活細胞或壞死細胞相比，凋亡細胞具有特殊的光散射類型-低前向散射和高側向散射。流式細胞儀能夠測定細胞光散射的變化，因此廣泛應用于細胞凋亡的觀察、檢測和分析。根據MTT比色實驗的結果，以MDA-MB-231細胞的活力降至最低點時融合蛋白所需的濃度為起點，以能夠基本飽和細胞表面EGFR的融合蛋白的濃度為終點，在這個范圍內設置一系列連續(xù)的融合蛋白濃度(10μg/3×105個細胞-25μg/3×105個細胞)，與MDA-MB-231細胞共同培養(yǎng)，L15培養(yǎng)基含5％FBS，培養(yǎng)72小時后用流式細胞儀檢測細胞的變化。結果見圖15-19，可以看出融合蛋白EGF-E4orf4能夠使MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡。在一定濃度范圍內，細胞凋亡的程度與融合蛋白的濃度成正相關的關系。隨著融合蛋白從無到有，細胞凋亡也從無到有；融合蛋白從10μg升至25μg，細胞從少量出現凋亡到細胞明顯凋亡，直至細胞進入凋亡晚期。由此可得出結論融合蛋白EGF-E4orf4能夠誘導MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡，而且MDA-MB-231細胞對融合蛋白的細胞毒作用相對敏感，在融合蛋白較低濃度的時候細胞凋亡就表現得很明顯。
如圖15所示MDA-MB-231細胞未加融合蛋白培養(yǎng)72小時，92.1％的細胞生長狀態(tài)良好。
如圖16所示MDA-MB-231細胞與融合蛋白EGF-E4orf4(10μg/3×105細胞)共同培養(yǎng)，已經有少量的細胞發(fā)生凋亡，約占15.4％。
如圖17所示MDA-MB-231細胞與融合蛋白(15μg/3×105細胞)共同培養(yǎng)，有28.2％的細胞脫離細胞周期，細胞發(fā)生明顯的凋亡。而且，從圖上還可以看出細胞早期凋亡的特征，即G0/G1峰之前出現一個由凋亡細胞產生的坡度或者稱為亞峰。這是因為在凋亡早中期，細胞核DNA發(fā)生斷裂，被降解成為核小體整數倍大小的DNA片段而產生的。箭頭所示為亞二倍體峰。
如圖18所示MDA-MB-231細胞與融合蛋白(20μg/3×105細胞)共同培養(yǎng)，可見有19.1％的細胞發(fā)生凋亡。
如圖19所示當融合蛋白的濃度達到25μg/3×105細胞，有27.0％的MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡。此時細胞凋亡已進入晚期，細胞核DNA被降解成為核小體大小的DNA碎片，導致在很低的PI光吸收值處有一個高峰，箭頭所示。
序列表<110>中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所<120>含腺病毒E4orf4蛋白的靶向性抗腫瘤融合蛋白<130>I20021081CB<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>540<212>DNA<213>融合基因<220>
<221>CDS<222>(1)..(528)<223>
<400>1aac tcc gac tcc gaa tgt cca ttg tcc cac gac ggt tac tgt ttg cac48Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His1 5 10 15gac ggt gtt tgt atg tac atc gaa gct ttg gac aag tac gcc tgt aac96Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn20 25 30tgt gtt gtt ggt tac atc ggt gaa aga tgt caa tac aga gac ttg aag144Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys35 40 45tgg tgg gaa ggt ggt ggt ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc tcc atg gtt192Trp Trp Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Met Val50 55 60ctt cca gct ctt ccc gct cct ccc gtg tgt gac tcg cag aac gaa tgt240Leu Pro Ala Leu Pro Ala Pro Pro Val Cys Asp Ser Gln Asn Glu Cys65 70 75 80gta ggt tgg ctg ggt gtg gct tat tct gcg gtg gtg gat gtt atc agg288Val Gly Trp Leu Gly Val Ala Tyr Ser Ala Val Val Asp Val Ile Arg85 90 95gca gcg gcg cat gaa gga gtt tac ata gaa ccc gaa gcc agg ggg cgc336Ala Ala Ala His Glu Gly Val Tyr Ile Glu Pro Glu Ala Arg Gly Arg100 105 110ctg gat gct ttg aga gag tgg ata tac tac aac tac tac aca gag cga384Leu Asp Ala Leu Arg Glu Trp Ile Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Thr Glu Arg115 120 125gct aag cga cga gac cgg aga cgc aga tcg gtt tgt cac gcc cgc acc432Ala Lys Arg Arg Asp Arg Arg Arg Arg Ser Val Cys His Ala Arg Thr130 135 140tgg ttt tgc ttc agg aaa tat gac tac gtc cgg cgt tcc att tgg cat480Trp Phe Cys Phe Arg Lys Tyr Asp Tyr Val Arg Arg Ser Ile Trp His
145 150 155 160gac act acg acc aac acg atc tcg gtt gtc tcg gcg cac tcc gta cag528Asp Thr Thr Thr Asn Thr Ile Ser Val Val Ser Ala His Ser Val Gln165 170 175taatgagaat tc 540<210>2<211>176<212>PRT<213>融合基因<400>2Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His1 5 10 15Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn20 25 30Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys35 40 45Trp Trp Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Met Val50 55 60Leu Pro Ala Leu Pro Ala Pro Pro Val Cys Asp Ser Gln Asn Glu Cys65 70 75 80Val Gly Trp Leu Gly Val Ala Tyr Ser Ala Val Val Asp Val Ile Arg85 90 95Ala Ala Ala His Glu Gly Val Tyr Ile Glu Pro Glu Ala Arg Gly Arg100 105 110Leu Asp Ala Leu Arg Glu Trp Ile Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Thr Glu Arg115 120 125Ala Lys Arg Arg Asp Arg Arg Arg Arg Ser Val Cys His Ala Arg Thr130 135 140Trp Phe Cys Phe Arg Lys Tyr Asp Tyr Val Arg Arg Ser Ile Trp His145 150 155 160Asp Thr Thr Thr Asn Thr Ile Ser Val Val Ser Ala His Ser Val Gln165 170 17權利要求
1.一種重組人表皮生長因子(EGF)一腺病毒E4orf4融合蛋白，其從N端至C端依次為人表皮生長因子，接頭，和腺病毒E4orf4蛋白。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，其由51個氨基酸殘基的人表皮生長因子、11個氨基酸殘基的接頭和腺病毒A5的E4orf4蛋白組成。
3.一種融合基因，其具有編碼權利要求1或2的融合蛋白的核苷酸序列。
4.如權利要求3所述的融合基因，其具有SEQ ID NO1的序列。
5.含有至少一個拷貝的權利要求3或4的融合基因的表達載體。
6.如權利要求5的表達載體，其為圖5所示的質粒pAO-EGF-E4orf4。
7.如權利要求5的表達載體，其為圖7所示的質粒pAO-3EGF-E4orf4。
8.包含權利要求3或4的融合基因或者權利要求5-7任一項的表達載體的宿主細胞。
9.如權利要求8的宿主細胞，其為甲基營養(yǎng)型酵母細胞。
10.如權利要求9的宿主細胞，其為巴氏畢赤酵母GS115-3EGF-E4orf4，保藏號為CGMCC0771。
11.一種生產權利要求1或2的融合蛋白的方法，包括在適于表達的條件下培養(yǎng)權利要求8-10任一項的宿主細胞，以及分離和純化所表達的融合蛋白。
12.一種藥物組合物，其包含權利要求1或2的融合蛋白和藥學可接受的載體。
13.權利要求1或2的融合蛋白在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的應用。
14.如權利要求13的應用，其中所述的惡性腫瘤是p53基因缺失的腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明包括重組人表皮生長因子－腺病毒E4orf4融合蛋白、編碼這種融合蛋白的融合基因、含有該融合基因的表達載體、利用甲基營養(yǎng)型酵母進行分泌性表達這種重組融合蛋白的方法及含有該蛋白的藥物組合物及其治療用途。
文檔編號C12N15/62GK1583794SQ0315456
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月18日 優(yōu)先權日2003年8月18日
發(fā)明者陳虹, 黃秉仁, 王欣, 馬曉驪 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所