專利名稱：一種酮類化合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酮類化合物及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種酮類化合物，利用微生物轉(zhuǎn)化制備該化合物的方法及以該化合物為活性成分的抗腫瘤藥物。
背景技術(shù)：
微生物轉(zhuǎn)化具有底物特異性高，產(chǎn)物立體選擇性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和、無污染等特點(diǎn)，目前已應(yīng)用于多種藥物如抗生素、維生素、甾體激素、氨基酸、芳基丙酸和前列腺素等的合成，也用于具有生理活性的新化合物的合成。具有式(II)結(jié)構(gòu)的梣酮(fraxinellone)于1930年由H.Thoms和C.Dambergis從白鮮(Dictamnus albus)中分離得到(H.Thoms and Constantin Dambergis，Arch.Pharm.1930，268，39)，1969年P(guān).Coggon等確定了該化合物的結(jié)構(gòu)及絕對構(gòu)型(P.Coggon，A.T.McPhail，R.Storer and D.W.Young，Chem.Commun.1969，828)。梣酮的藥理活性報(bào)道很少，其中抗受精作用由于有效劑量與半數(shù)致死量之間差距太小而被認(rèn)為沒有實(shí)用價(jià)值(Won Sick Woo，Eun Bang Lee，Sam Sik Kang，Kuk Hyung Shinand Hyung Joon Chi，Planta Medica 1987，399)。T.S.Wu等和S.M.Yu等報(bào)道梣酮是Ca2+通道電壓依賴性的阻斷劑，有抗血小板凝集和血管舒張作用。1997年S.Kim等首次報(bào)道梣酮、白鮮堿、前茵芋堿(preskimmianine)對肺淋巴腫瘤L1210有抑制作用，但梣酮的效果不如前茵芋堿(S.W.Kim，W.H.Yeo，Y.S.Ko and S.K.Kim，Saengyak Hakhoechi 28，209)。此外Z.L.Liu等報(bào)道梣酮和白鮮堿對赤擬谷盜(Tribolium castaneum)和玉米象(Sitophilus zeamais)有拒食作用(赤擬谷盜是面粉廠的重要害蟲，可使面粉霉變、結(jié)塊；玉米象是重要的第一食性儲糧害蟲)。梣酮在白鮮皮中含量較高，結(jié)構(gòu)中有多個官能團(tuán)。
式(II)發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的是提供一種新的具有抗腫瘤活性的酮類化合物。
本發(fā)明所提供的酮類化合物為梣黑酮(fraxinigerllone)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(I)所示 式(I)本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備式(I)化合物的方法。
一種制備式(I)化合物的方法，是用黑曲霉(Aspergillus niger)轉(zhuǎn)化梣酮，并自發(fā)酵液中提取梣黑酮(fraxinigerllone)。
黑曲霉(Aspergillus niger)可為AS 3.421等。可先將黑曲霉(Aspergillusniger)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再向處于對數(shù)生長期的黑曲霉發(fā)酵液中加入梣酮。所加入梣酮的量為50mg/L。
梣酮可先溶于與水互溶的有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇等，再經(jīng)黑曲霉轉(zhuǎn)化后得到產(chǎn)物。梣酮經(jīng)處于對數(shù)生長期的黑曲霉在26-30℃發(fā)酵3-5天后，可自此發(fā)酵液中提取式(I)化合物，提取的具體步驟為先除去菌體，去除菌體的菌液經(jīng)乙酸乙酯萃取后，除去溶劑，再經(jīng)柱層析分離，用石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，在石油醚-乙酸乙酯的組成比例為5∶1時得到梣黑酮(fraxinigerllone)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗腫瘤藥物。
本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物，以梣黑酮(fraxinigerllone)為活性成分。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明巧妙地利用黑曲霉的轉(zhuǎn)化功能，創(chuàng)造性地以梣酮為底物，獲得了一種新的具有抗腫瘤活的酮類化合物—梣黑酮，在制藥等領(lǐng)域?qū)⒌玫綇V泛應(yīng)用。


圖1為梣黑酮的1HNMR圖譜圖2為梣黑酮的EI-MS圖譜圖3為梣黑酮的13CNMR圖譜圖4為梣黑酮的DEPT圖譜圖5為梣黑酮的1H-1H COSY圖譜圖6為梣黑酮的HMQC圖譜圖7為梣黑酮的HMBC圖譜圖8為梣酮和梣黑酮對EC9706細(xì)胞系的抑制曲線圖9為梣酮和梣黑酮對A549細(xì)胞系的抑制曲線具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、梣黑酮(fraxinigerllone)的制備1)菌種活化將黑曲霉(Aspergillus niger)AS 3.421菌種接種于含有蔗糖(30g)、NaNO3(3g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、KCl(0.5g)、K2HPO4·3H2O(1.3g)、FeSO4·7H2O(0.06g)、瓊脂(20g)和蒸餾水1000ml的固體斜面上，在28℃，培養(yǎng)3天。
2)底物的轉(zhuǎn)化將黑曲霉(Aspergillus niger)AS 3.421從斜面接種到盛有50ml的無菌培養(yǎng)基(蔗糖(30g)、NaNO3(3g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、KCl(0.5g)、K2HPO4·3H2O(1.3g)、FeSO4·7H2O(0.06g)和蒸餾水1000ml)的250ml錐形瓶中，在28℃、180轉(zhuǎn)/分振搖48小時后得到菌液(I)，菌液(I)再以5ml/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入盛有50ml無菌培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，振搖24小時(達(dá)至對數(shù)期)后加入梣酮的丙酮溶液(12.5mg梣酮/0.4ml丙酮/瓶)。在28℃、180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)4天后，過濾菌體，濾液用乙酸乙酯萃取三次，合并濾液，減壓蒸除溶劑，得到浸膏。
3)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離將浸膏用硅膠柱層析分離(硅膠300-400目)，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，在石油醚-乙酸乙酯5∶1時得到淡黃色油狀的梣黑酮(fraxinigerllone)。
4)梣黑酮(fraxinigerllone)的鑒定通過波譜解析方法對上述得到的梣黑酮(fraxinigerllone)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果如圖1-7所示，表明得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確，為式(I)化合物，其中如圖1、3和4所示，將該化合物與梣酮的NMR譜相比較，表明梣黑酮的13CNMR譜中羰基(δ169.1)、C-3(δ82.4)的信號及1HNMR譜中3a-Me(δ0.90)、7-Me(δ2.13)的信號都與梣酮相符，說明C環(huán)和D環(huán)都沒有發(fā)生變化；梣黑酮的13CNMR譜與梣酮相比多出一個酯羰基(δ171.7)和一個連氧仲碳(δ71.1)的信號，少了一個雙取代雙鍵的信號，說明呋喃環(huán)上的一個雙鍵被氧化，EI-MS中m/z 248的分子離子峰確證以上基團(tuán)的存在，符合以上推論的結(jié)構(gòu)片段有兩個，如式(III)和式(IV) 式(III) 式(IV)具有結(jié)構(gòu)片段式(III)和式(IV)的化合物的1HNMR譜數(shù)據(jù)如表1所示表1、梣黑酮及其相關(guān)化合物的1HNMR數(shù)據(jù)式(III)化合物式(IV)化合物 梣黑酮H-4’(3’)7.10 5.58 7.59H-5’ 4.86 4.94將梣黑酮的1HNMR譜數(shù)據(jù)與以上結(jié)構(gòu)片段類似物比較后確定梣黑酮應(yīng)該擁有如式(IV)所示結(jié)構(gòu)片段。根據(jù)2D-NMR譜(如圖5、6、7所示)將式(IV)的碳?xì)溥M(jìn)行歸屬和表2，認(rèn)定該結(jié)構(gòu)是一個新化合物，將其命名為梣黑酮(fraxinigerllone)。
表2、化合物梣黑酮的NMR數(shù)據(jù)位號δCδH(J)H-H COSY HMBC1 169.1 - - -3 82.44.75brd(1.9) H-4’，H-5’ 3a-Me3a 42.7- - 3a-Me4 32.11.66-1.88m H-5，H-6 H-5，3a-Me1.57dt(13.0，3.4)5 18.31.66-1.88m H-4，H-6 H-4，H-66 32.12.28dd(19.6，6.6) H-4，H-5 H-52.19dd(10.4，7.0)7 126.5 - H-6 H-6，7a-Me7a 150.5 - H-6 H-62’171.7 - - H-4’
3’ 130.5- - H-3，H-5’4’ 148.07.59d(1.6)H-3，H-5’ H-3，H-5’5’ 71.1 4.94t(1.9)H-3，H-4’ H-3，H-4’3a-Me 20.8 0.90s - H-37-Me 18.6 2.13s - H-6實(shí)施例2、梣黑酮(fraxinigerllone)抗腫瘤活性測試應(yīng)用食管癌細(xì)胞EC9706和肺癌細(xì)胞A549，采用MTT染色法(樣品用無毒劑量的DMSO溶解)進(jìn)行體外活性測試。以僅加入同等濃度的DMSO的細(xì)胞為對照，測定100μg/ml梣酮和87μg/ml梣黑酮對EC9706細(xì)胞系和A549細(xì)胞系的抑制效果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為6次重復(fù)的平均值。結(jié)果如表3、表4、圖8和圖9所示，表明新化合物梣黑酮(fraxinigerllone)對EC9706和A549有抑制效果，當(dāng)其濃度為87μg/ml時三天抑制率分別達(dá)到19.92％和32.04％。
表3、梣酮和梣黑酮對EC9706細(xì)胞系的抑制效果時間(天)對照(OD490nm) 100μg/ml梣酮(OD490nm)87μg/ml梣黑酮(OD490nm)1 0.464±0.013 0.514±0.033 0.444±0.0132 0.654±0.011 0.724±0.030 0.559±0.0203 0.813±0.011 0.786±0.024 0.651±0.019*注*表示與對照相比P＜0.05表4、梣酮和梣黑酮對A549細(xì)胞系的抑制效果時間(天)對照(OD490nm) 100μg/ml梣酮(OD490nm)87μg/ml梣黑酮(OD490nm)1 0.478±0.013 0.534±0.019 0.424±0.0052 0.699±0.038 0.774±0.029 0.518±0.0263 0.979±0.021 0.946±0.010 0.666±0.030**注**表示與對照相比P＜0.0權(quán)利要求
1.式(I)化合物 式(I)。
2.一種制備式(I)化合物的方法，是用黑曲霉(Aspergillus niger)轉(zhuǎn)化梣酮，并自發(fā)酵液中提取式(I)化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述黑曲霉為黑曲霉(Aspergillusniger)AS 3.421。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于先將黑曲霉(Aspergillus niger)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再向所述處于對數(shù)生長期的黑曲霉發(fā)酵液中加入梣酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所加入梣酮的量為50mg/L培養(yǎng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述梣酮先溶于能與水互溶的有機(jī)溶劑中，再加入到黑曲霉發(fā)酵液中，其中優(yōu)選的有機(jī)溶劑為丙酮。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述梣酮經(jīng)所述處于對數(shù)生長期的黑曲霉在25-30℃發(fā)酵3-5天后，自此發(fā)酵液中提取式(I)化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述自發(fā)酵液中提取式(I)化合物的過程為，先去除菌體，除去菌體后的菌液經(jīng)乙酸乙酯萃取后，除去溶劑，再經(jīng)柱層析分離，石油醚-乙酸乙酯洗脫得到式(I)化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述石油醚-乙酸乙酯的組成比例為5∶1。
10.一種以式(I)化合物為活性成分的抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酮類化合物及其制備方法與應(yīng)用。其目的是提供一種新的具有抗腫瘤活性的酮類化合物。本發(fā)明所提供的酮類化合物是式(I)化合物。其制備方法是黑曲霉(Aspergillus niger)轉(zhuǎn)化梣酮，并自發(fā)酵液中提取式(I)化合物。本發(fā)明還提供了以式(I)化合物為活性成分的抗腫瘤藥物。
文檔編號C12P17/04GK1590554SQ0315593
公開日2005年3月9日 申請日期2003年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月27日
發(fā)明者張榮慶, 謝莉萍, 楊若林, 賈鐵留, 王洪鐘, 鄭桂蘭 申請人:清華大學(xué)