專利名稱：丙氨酸2,3－氨基變位酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙氨酸2，3-氨基變位酶核酸和氨基酸序列，具有可將α-丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞，以及利用這些細(xì)胞生產(chǎn)β-丙氨酸、泛酸、3-羥丙酸和其它有機(jī)化合物的方法。
背景技術(shù)：
有機(jī)化學(xué)制品諸如有機(jī)酸、酯和多元醇可用于合成塑料物質(zhì)和其它的產(chǎn)物。為了滿足對(duì)有機(jī)化學(xué)制品不斷增加的需求，人們正在開發(fā)更有效和節(jié)約成本的利用基于碳水化合物而非碳?xì)浠衔锏脑牧系纳a(chǎn)方法。例如，某些細(xì)菌已用于制備大量的用于聚乳酸生產(chǎn)的乳酸。
3-羥丙酸(3-HP)是有機(jī)酸。人們已經(jīng)描述了幾種化學(xué)合成途徑以生產(chǎn)3-HP，并且也已公開了生物催化途徑(Suthers等人的WO 01/16346)。3-HP具有用于特定合成的用途且可通過化學(xué)工業(yè)中已知的技術(shù)轉(zhuǎn)化為商業(yè)上重要的中間產(chǎn)物，例如經(jīng)脫水作用形成的丙烯酸、經(jīng)氧化形成的丙二酸、經(jīng)與醇進(jìn)行酯化反應(yīng)形成的酯，以及經(jīng)還原作用形成的1，3-丙二醇。
發(fā)明概述可從PEP或丙酮酸通過關(guān)鍵的β-丙氨酸中間產(chǎn)物來生物催化產(chǎn)生(

圖1)化合物3-羥丙酸(3-HP)。β-丙氨酸可以在細(xì)胞中通過5，6-二氫尿嘧啶和N-氨甲?；?丙氨酸、N-乙酰-β-丙氨酸、鵝肌肽或天冬氨酸，從肌肽、β-丙氨酰精氨酸、β-丙氨酰賴氨酸、尿嘧啶來合成(圖1和2)。然而，這些途徑相對(duì)的低效率的，因?yàn)樗鼈冃枰∮械那绑w或比3-HP更昂貴的起始化合物。
因此，如果α-丙氨酸可直接轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸，則利用生物催化途徑生產(chǎn)3-HP是更有效的(圖1)。令人遺憾的是，相互轉(zhuǎn)化α-丙氨酸和β-丙氨酸的酶還沒有被鑒定出來。如果鑒定出進(jìn)行轉(zhuǎn)化α-丙氨酸為β-丙氨酸例如丙氨酸2，3-氨基變位酶的酶活性，將是有利的。
在此公開了2，3-氨基變位酶核酸序列(例如SEQ ID NOS20和29)、氨基酸序列(例如SEQ ID NOS21和30)，及其保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的變體、片段、融合體和多態(tài)型。在一個(gè)實(shí)例中，多肽是包括SEQ ID NO21或30，或其保持丙氨酸2，3氨基變位酶活性的變體、片段或融合體的序列。在一個(gè)實(shí)例中，該多肽是突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶和/或賴氨酸5，6-氨基變位酶的氨基酸序列。所公開的序列可用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以使得該轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性，從而允許該細(xì)胞由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸。本發(fā)明公開了特異性結(jié)合丙氨酸2，3-氨基變位酶的結(jié)合劑。
本發(fā)明公開了具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性，允許將α-丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸的細(xì)胞。這種細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽胞桿菌(Bacillus)或埃希氏桿菌(Escherichia)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，該細(xì)胞是用賦予丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的突變賴氨酸2，3-氨基變位酶和/或突變的賴氨酸5，6-氨基變位酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括例如SEQ ID NO21或30的丙氨酸2，3-氨基變位酶。本發(fā)明所公開的細(xì)胞可用于生產(chǎn)核酸分子、多肽和有機(jī)化合物。該多肽可用于催化有機(jī)化合物的形成或可用作抗原來產(chǎn)生特異性的結(jié)合劑。
本發(fā)明公開了具有至少一種外源核酸，例如編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的核酸的生產(chǎn)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，該核酸序列包括SEQ ID NOS20或29(或其保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的片段、變體或融合體)。在另一個(gè)實(shí)例中，該核酸序列編碼SEQ ID NO21或30中所示的氨基酸序列(或其保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的片段、變體或融合蛋白)。生產(chǎn)細(xì)胞可用于表達(dá)具有酶活性，例如CoA轉(zhuǎn)移酶活性、β-丙氨酸氨裂解酶活性、3-羥丙?；?CoA(3-HP-CoA)脫水酶活性、谷氨酸脫氫酶、3-羥丙酰基-CoA水解酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶，和/或3-羥異丁?；?CoA水解酶活性的多肽。在另一個(gè)實(shí)例中，生產(chǎn)細(xì)胞被用于表達(dá)具有諸如β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶和3-HP脫氫酶和/或3-羥異丁酸脫氫酶的酶活性的多肽。本發(fā)明也公開了生產(chǎn)上述核酸序列編碼的多肽的方法。
本發(fā)明公開了一種鑒定具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞的方法。該方法包括在不含β-丙氨酸或泛酸的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)功能性缺失panD的細(xì)胞。例如，該細(xì)胞可由培養(yǎng)基來源的碳、氧、氫和氮生產(chǎn)α-丙氨酸，但不包括β-丙氨酸。鑒定能夠在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞，其中細(xì)胞生長(zhǎng)表明該細(xì)胞由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸，這表明該細(xì)胞具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。相反，缺少細(xì)胞生長(zhǎng)表明該細(xì)胞不能由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸，這表明該細(xì)胞不具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。在一個(gè)實(shí)例中，在培養(yǎng)用于篩選的細(xì)胞之前，用一或多種突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶和/或賴氨酸5，6-氨基變位酶轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明公開了生產(chǎn)具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽的方法。在一個(gè)實(shí)例中，該方法包括培養(yǎng)具有至少一種編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的外源核酸分子(例如SEQ ID NOS20和29)，能夠由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸的細(xì)胞。
本發(fā)明公開了幾種利用公開的具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞由β-丙氨酸產(chǎn)生3-HP的方法。在一個(gè)實(shí)例中，用一或多種由β-丙氨酸轉(zhuǎn)化為3-HP所必需的一或多種酶轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)例中，該方法包括從細(xì)胞純化β-丙氨酸，然后將β-丙氨酸與由β-丙氨酸轉(zhuǎn)化為3-HP所必需的多肽接觸。
在此所公開的細(xì)胞、丙氨酸2，3-氨基變位酶核酸和氨基酸序列(例如SEQ ID NOS20，21，29和30)以及方法可用于生產(chǎn)泛酸、3-HP及其衍生物，例如輔酶A(CoA)和其它有機(jī)化合物，例如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、聚合的3-HP、3-HP的共聚合物和其它化合物，例如丁酸、戊酸和其它化合物，3-HP的酯和丙二酸及其酯。3-HP在生物學(xué)和商業(yè)上都是重要的。例如，當(dāng)可由3-HP產(chǎn)生上述的衍生物時(shí)，在營(yíng)養(yǎng)工業(yè)中可使用3-HP作為食物、飼料添加劑或防腐劑。
用于編碼丙氨酸2，3氨基變位酶的核酸分子(例如SEQ ID NOS20和29)可用于工程改造具有生產(chǎn)3-HP以及諸如上述其它有機(jī)化合物的宿主細(xì)胞。丙氨酸2，3-氨基變位酶的肽(例如SEQ ID NOS21和30)可用于無細(xì)胞體系以產(chǎn)生3-HP以及諸如上述的其它有機(jī)化合物。在此描述的細(xì)胞可用于培養(yǎng)體系以生產(chǎn)大量的3-HP以及諸如上述的其它有機(jī)化合物。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了除丙氨酸2，3-氨基變位酶活性外，包括其它酶活性，諸如CoA轉(zhuǎn)移酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性和3-羥丙酰基-CoA脫水酶活性的細(xì)胞。此外，本發(fā)明公開了從這些細(xì)胞生產(chǎn)產(chǎn)物的方法。在一些實(shí)例中，該細(xì)胞也包括編碼一或多種具有谷氨酸脫氫酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性、3-羥丙?；?CoA水解酶、和/或3-羥異丁?；?CoA水解酶活性和丙氨酸脫氫酶或丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的多肽的一或多種外源核酸分子。在另一個(gè)實(shí)例中，該細(xì)胞也包括4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性和3-HP脫氫酶活性和/或3-羥基異丁酸脫氫酶活性。另外，該細(xì)胞可包括CoA水解酶活性、聚醇酸合酶活性和/或脂肪酶或酯酶活性。
在另一個(gè)實(shí)例中，包括丙氨酸2，3-氨基變位酶活性；CoA轉(zhuǎn)移酶活性；β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性；丙氨酸脫氫酶或丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性和3-HP-CoA脫水酶活性的細(xì)胞，生產(chǎn)例如3-HP和/或3-HP的酯，諸如3-羥丙酸甲酯、3-羥丙酸乙酯、3-羥丙酸丙酯和/或3-羥丙酸丁酯的產(chǎn)物。在一些實(shí)例中，該細(xì)胞進(jìn)一步包括谷氨酸脫氫酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性、3-羥丙?；?CoA水解酶和/或3-羥異丁?；?CoA水解酶活性。相應(yīng)地，本發(fā)明也提供生產(chǎn)一或多種這類產(chǎn)物的方法。這些方法包括在允許生產(chǎn)該產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)包括CoA轉(zhuǎn)移酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脫水酶活性和在某些實(shí)例中包括谷氨酸脫氫酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性、3-羥丙?；?CoA水解酶、3-羥異丁?；?CoA水解酶活性和/或丙氨酸脫氫酶或丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了除具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性外，具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、3-羥丙?；?CoA脫水酶活性和聚醇酸合酶活性的細(xì)胞。在一些實(shí)例中，這些細(xì)胞可包含編碼一或多種具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、3-羥丙?；?CoA脫水酶活性、丙氨酸脫氫酶或丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性和聚醇酸合酶活性的多肽的外源核酸分子。該細(xì)胞可用于，例如，生產(chǎn)諸如聚合的3-HP和3-HP的共聚合物和其它化合物，諸如丁酸酯、戊酸酯和其它化合物的產(chǎn)物。
在另一個(gè)實(shí)例中，該細(xì)胞除具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性外，具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、丙氨酸脫氫酶或丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性和聚醇酸合酶活性，從而可生產(chǎn)例如聚合的3-HP的產(chǎn)物。在一些實(shí)例中，這些細(xì)胞可包含編碼一或多種具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、和/或聚醇酸合酶活性的一或多種外源核酸分子。
本

發(fā)明內(nèi)容
的另一個(gè)方面提供了包括丙氨酸2，3-氨基變位酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、丙氨酸脫氫酶或丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性和脂肪酶或酯酶活性的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，該細(xì)胞也包括CoA水解酶活性。在一些實(shí)例中，該細(xì)胞包含編碼一或多種具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性、β-丙氨?；?輔酶A氨裂解酶活性、脂肪酶或酯酶活性和/或CoA水解酶活性的多肽的外源核酸分子。該細(xì)胞尤其可用于生產(chǎn)產(chǎn)物諸如丙烯酸酯(例如，丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯和丙烯酸丁酯)。
本發(fā)明公開了可生產(chǎn)1，3-丙二醇的細(xì)胞及其應(yīng)用的方法。1，3-丙二醇可通過利用具有酶活性的多肽，由3-HP-CoA或3-HP來生成。當(dāng)將3-HP-CoA轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇時(shí)，可使用具有氧化還原酶活性或者還原酶活性的多肽，例如具有乙?；㎞AD(+)氧化還原酶和醇NAD(+)氧化還原酶活性(例如，來自1.1.1.1和/或1.2.1.10的酶分類的酶)的多肽。當(dāng)從3-HP制備1，3-丙二醇時(shí)，可使用具有醛脫氫酶活性(例如，來自1.2.1-分類的酶)的多肽和具有乙醇脫氫酶活性(例如，來自1.1.1.-分類的酶)的多肽的組合物，例如醛脫氫酶(NAD(P)+)(EC 1.2.1.-)和乙醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)。
在一些實(shí)例中，產(chǎn)物在體外產(chǎn)生(在細(xì)胞外)。在其它的實(shí)例中，使用體外和體內(nèi)(在細(xì)胞內(nèi))方法的組合產(chǎn)生產(chǎn)物。在其它的實(shí)例中，產(chǎn)物是體內(nèi)產(chǎn)生的。對(duì)涉及體內(nèi)步驟的方法而言，細(xì)胞可以是分離培養(yǎng)的細(xì)胞或整個(gè)生物體，諸如轉(zhuǎn)基因植物、非人哺乳動(dòng)物或單細(xì)胞生物，諸如酵母和細(xì)菌(例如，乳桿菌、乳球菌、芽胞桿菌和埃希氏桿菌細(xì)胞)。在下文中這種細(xì)胞稱為生產(chǎn)細(xì)胞。由這些生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)物可以是有機(jī)產(chǎn)物，諸如β-丙氨酸、3-HP、泛酸和其衍生物，例如有機(jī)酸、多元醇(即1，3-丙二醇)、輔酶A(CoA)以及在此所述的丙氨酸2，3-氨基變位酶。
泛酸是一種很多動(dòng)物生長(zhǎng)和健康所必需的維生素，其涉及脂肪酸的合成和降解。此維生素的缺乏導(dǎo)致全身性的臨床不適。因此，使用在此所公開的方法生產(chǎn)的泛酸可以以治療有效量給藥于泛酸缺乏的受試者。生產(chǎn)泛酸的細(xì)胞和利用該公開的細(xì)胞由β-丙氨酸產(chǎn)生泛酸的方法是公開的。產(chǎn)生泛酸和/或CoA的生產(chǎn)細(xì)胞可用于表達(dá)α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.1.2.11)，α-酮泛酸還原酶(E.C.1.1.1.169)和泛酸合酶(E.C.6.3.2.1)來產(chǎn)生泛酸，或另外表達(dá)泛酸激酶(E.C.2.7.1.33)、4′-磷酸羥泛?；?1-半胱氨酸合成酶(E.C.6.3.2.5)、4’-磷酸羥泛?；腚装彼崦擊让?E.C.4.1.1.36)、ATP4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺苷轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.7.7.3)和脫磷酸-CoA激酶(E.C.2.7.1.24)來產(chǎn)生輔酶A。
附圖的簡(jiǎn)要描述圖1是經(jīng)β-丙氨酸的中間產(chǎn)物產(chǎn)生3-HP及其衍生物，以及由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸的途徑的圖解。
圖2是用于產(chǎn)生β-丙氨酸的途徑的圖解。
圖3是用于由β-丙氨酸產(chǎn)生輔酶A和泛酸的途徑的圖解。
圖4是枯草芽孢桿菌野生型的賴氨酸2，3-氨基變位酶(KAM，SEQ ID NO31)及其編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的突變形式(SEQ ID NO21)的序列對(duì)比。取代以粗體顯示。Fe-S簇-結(jié)合基序加下劃線，而推定的PLP-結(jié)合基序是斜體的。
圖5是牙齦卟啉單胞菌野生型的賴氨酸2，3-氨基變位酶(kam，SEQ ID NO28)及其編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的突變形式(aam，SEQID NO30)的序列對(duì)比。取代以粗體顯示。Fe-S簇-結(jié)合基序加下劃線，而推定的PLP-結(jié)合基序是斜體的。
圖6是枯草芽孢桿菌和牙齦卟啉單胞菌野生型的賴氨酸2，3-氨基變位酶(kam，SEQ ID NO31和28)，以及其編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的突變形式(aam，SEQ ID NO21和29)的序列對(duì)比。在相同位點(diǎn)的取代用粗體表示。
序列表在所附序列表的核酸和氨基酸序列中，用標(biāo)準(zhǔn)字體的縮寫表示核苷酸堿基，并用三字碼表示氨基酸。只顯示每個(gè)核酸序列的單鏈，但是可以理解通過對(duì)所顯示鏈的任何參考的互補(bǔ)鏈也包括在內(nèi)。
SEQ ID NOS1和2是用于克隆枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶(KAM)基因的PCR引物。
SEQ ID NO3是枯草芽孢桿菌KAM基因的核酸序列。
SEQ ID NOS4和5是用于擴(kuò)增pKD3的CAT基因的PCR引物。
SEQ ID NOS6和7是用于證實(shí)CAT基因正確的插入panD基因座的PCR引物。
SEQ ID NOS8和9是用于擴(kuò)增pKD3的CAT基因的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS10和11是用于在野生型的枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶基因中產(chǎn)生L103M突變的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS12和13是用于在野生型的枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶基因中產(chǎn)生M136V突變的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS14和15是用于在野生型的枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶基因中產(chǎn)生D339H突變的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS16-19，26，27和32是用于從糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)M3A克隆3-HP脫氫酶基因的引物的核酸序列。
SEQ ID NO20是丙氨酸2，3-氨基變位酶DNA的核酸序列。
SEQ ID NO21是丙氨酸2，3-氨基變位酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO22是β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶(ACL-1)cDNA的核酸序列。
SEQ ID NO23是β-丙氨?；?CoA氨裂解酶(ACL-1)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO24是CoA轉(zhuǎn)移酶cDNA的核酸序列。
SEQ ID NO25是CoA轉(zhuǎn)移酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO28是牙齦卟啉單胞菌KAM的氨基酸序列。
SEQ ID NO29是丙氨酸2，3-氨基變位酶的核酸序列。
SEQ ID NO30是丙氨酸2，3-氨基變位酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO31是枯草芽孢桿菌KAM的氨基酸序列。
SEQ ID NO33是來自糞產(chǎn)堿菌M3A的3-HP脫氫酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO34是來自糞產(chǎn)堿菌M3A的3-HP脫氫酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NOS35-37是用于克隆β-丙氨酸-CoA氨裂解酶(ACL-1和ACL-2)的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS38-40是用于從大腸桿菌克隆CoA轉(zhuǎn)移酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS41-48是用于產(chǎn)生包括ACL-1或ACL-2、CoA轉(zhuǎn)移酶和CoA水合酶基因的操縱子1和2的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS49-52是用于產(chǎn)生包括4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶和3-羥異丁酸脫氫酶基因的操縱子3的引物的核酸序列。
SEQ ID NO53是β-丙氨?；?CoA氨裂解酶(ACL-2)cDNA的核酸序列。
SEQ ID NO54是β-丙氨?；?CoA氨裂解酶(ACL-2)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NOS55-56是用于從pATH-2-2-1質(zhì)粒擴(kuò)增ATH-2操縱子的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS57-58是用于從pATD質(zhì)粒擴(kuò)增ATD操縱子的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS59-60是用于擴(kuò)增枯草芽孢桿菌丙氨酸2，3氨基變位酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS61-62是用于擴(kuò)增大鼠β-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS63-64是用于從糞產(chǎn)堿菌擴(kuò)增3-HP脫氫酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS65-66是用于從大鼠擴(kuò)增α-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的引物的核酸序列。
幾個(gè)實(shí)施方案的具體描述縮寫和術(shù)語(yǔ)提供下列術(shù)語(yǔ)和方法的說明以更好地描述本發(fā)明的內(nèi)容并且指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明的內(nèi)容。在此所使用的，包含”意味著“包括”并且單數(shù)形式的“一”或“一個(gè)”或“該”包括復(fù)數(shù)的參考，除非上下文另有清楚地規(guī)定。例如，“包含一種蛋白”指包括一或多種的這種蛋白，并且“包含該細(xì)胞”指包括一或多種細(xì)胞及其本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的等同物等。
除非另有解釋，否則在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同意義。盡管與在此所描述的相似或等效的方法和物質(zhì)可用于實(shí)施或檢測(cè)本發(fā)明的內(nèi)容，適當(dāng)?shù)姆椒ê臀镔|(zhì)描述如下。該物質(zhì)、方法和實(shí)施例只是說明性的而不是限制性的。所公開內(nèi)容的其它特性和優(yōu)點(diǎn)在下列發(fā)明詳述和權(quán)利要求中是顯而易見的。
丙氨酸2，3-氨基變位酶可在例如細(xì)胞中將α-丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸的酶。包括來自任何生物體例如原核生物的的任何丙氨酸2，3-氨基變位酶基因、cDNA或蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)例中，丙氨酸2，3-氨基變位酶是具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶或突變的賴氨酸5，6-氨基變位酶賴氨酸2，3-氨基變位酶(或在遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為賴氨酸2，3氨基變位酶的基因)可從任何生物體，例如原核生物，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)或大腸桿菌，并且使用本領(lǐng)域已知的任何方法突變來獲得。
在特定的實(shí)例中，丙氨酸2，3-氨基變位酶核酸序列包括SEQ IDNOS20或29中顯示的序列或其保持編碼具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的肽或蛋白質(zhì)的能力的片段、變體或融合體。在另一個(gè)實(shí)例中，丙氨酸2，3-氨基變位酶蛋白質(zhì)包括SEQ ID NOS21或30中顯示的氨基酸序列或其保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的片段、變體或融合體。
在另一個(gè)實(shí)例中，丙氨酸2，3-氨基變位酶序列包括全長(zhǎng)的野生型序列，例如SEQ ID NO21或30以及保持轉(zhuǎn)化α-丙氨酸為β-丙氨酸能力的短序列，例如SEQ ID NO21的氨基酸50-390，SEQ ID NO21的氨基酸101-339，SEQ ID NO30的氨基酸15-390和SEQ ID NO 30的氨基酸15-340。本說明書包括丙氨酸2，3-氨基變位酶的等位變體以及保持轉(zhuǎn)化α-丙氨酸為β-丙氨酸能力的任何變體、片段或融合序列。
丙氨酸2，3-氨基變位酶活性轉(zhuǎn)化α-丙氨酸為β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基變位酶的能力。在一個(gè)實(shí)例中，這種活性發(fā)生在細(xì)胞中。在另一個(gè)實(shí)例中，這種活性發(fā)生在體外。這種活性可使用本領(lǐng)域已知的任何方法來測(cè)定，例如在實(shí)施例6和9-11中描述的篩選分析和酶活測(cè)定方法。此外，具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的酶可通過將酶與α-丙氨酸或β-丙氨酸溫育并且通過高效液相色譜(例如使用Abe等人的方法，J.Chromatography B，712439，1998)確定反應(yīng)產(chǎn)物來鑒定。在一個(gè)實(shí)例中，它是在功能性缺失panD基因的大腸桿菌中轉(zhuǎn)化α-丙氨酸為β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基變位酶的能力。
抗體一種包括特異性結(jié)合(免疫反應(yīng))抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。實(shí)例包括多克隆抗體、單克隆抗體、人單克隆抗體或其免疫有效部分。
其包括免疫球蛋白分子及其免疫活性部分。自然產(chǎn)生的抗體(例如，IgG)包括四條多肽鏈，通過二硫鍵內(nèi)連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。然而，抗體的抗原-結(jié)合功能可通過天然存在的抗體的片段來實(shí)施。單克隆抗體的免疫有效部分包括，但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc和Fv部分(參見綜述，Better和Horowitz，酶學(xué)方法Methods.Enzymol.1989，178476-96)?？乖Y(jié)合片段的其它實(shí)例包括，但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段；(v)分離的互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)；和(vi)F(ab′)2片段，包含通過二硫鍵連接絞鏈區(qū)的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是通過分離基因編碼，可產(chǎn)生合成的接頭使它們能夠作為單個(gè)的蛋白質(zhì)鏈(已知為經(jīng)重組方法形成的單鏈Fv(scFv)。這種單鏈抗體也是包括在內(nèi)的。
″特異性結(jié)合″指特定試劑(″特異性結(jié)合試劑″)與特定的分析物特異性反應(yīng)的能力，例如特異地與抗體免疫反應(yīng)或特異結(jié)合特定的肽序列。該結(jié)合是在例如抗體分子和抗原決定子之間的非隨機(jī)結(jié)合反應(yīng)?？贵w的結(jié)合特異性一般決定于抗體區(qū)別結(jié)合特異抗原和獨(dú)立抗原的能力的參考點(diǎn)，并由此區(qū)別兩個(gè)不同的抗原，尤其具有兩個(gè)獨(dú)特表位的抗原。特異結(jié)合特定表位的抗體被認(rèn)為是″特異性抗體″。
可產(chǎn)生丙氨酸2，3-氨基變位酶多肽(例如SEQ ID NO21和/或30)、丙氨酸2，3-氨基變位酶多肽的片段(例如SEQ ID NO21的氨基酸50-390、例如SEQ ID NO21的氨基酸101-339或SEQ ID NO30的氨基酸15-390、例如SEQ ID NO30的氨基酸15-331)或其變體、融合體片段的單克隆或多克隆抗體。最佳地，針對(duì)多肽抗原上的一或多種表位的抗體將特異性地檢測(cè)那些多肽。也就是說，針對(duì)一個(gè)特定多肽的抗體將識(shí)別和結(jié)合那些特定多肽而基本上不會(huì)識(shí)別或結(jié)合其它多肽。測(cè)定抗體特異性地結(jié)合特定的多肽是通過大量標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定方法中的任何一種來基性的；例如，Western印跡(參見，例如Sambrook等人(ed.)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，vol.1-3，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，細(xì)約，1989)。
為了通過Western印跡測(cè)定抗體制劑(例如在抗丙氨酸2，3-氨基變位酶多肽，例如SEQ ID NO21或30的小鼠中產(chǎn)生的制劑)特異性檢測(cè)適合的多肽(例如，丙氨酸2，3-氨基變位酶多肽)，可從細(xì)胞提取總的細(xì)胞蛋白質(zhì)并通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來分離。分離的總細(xì)胞蛋白質(zhì)可隨后轉(zhuǎn)移至膜(例如，硝酸纖維)，并將該膜與抗體制劑溫育。洗滌膜除去非特異性結(jié)合的抗體后，可使用結(jié)合酶的合適的第二抗體(例如，抗-小鼠抗體)檢測(cè)特異性結(jié)合抗體的存在，所述的酶例如堿性磷酸酶，由于應(yīng)用5-溴-4-氯-3吲哚基磷酸鹽/硝基藍(lán)四氮唑通過免疫定位堿性磷酸酶而導(dǎo)致產(chǎn)生濃密的藍(lán)色-有色化合物。
從轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或野生型細(xì)胞獲得適合用作免疫原的基本上純的多肽可。最終制備的多肽的濃度可以通過例如在Amicon過濾裝置上調(diào)整到每毫升幾微克的水平。此外，從全長(zhǎng)多肽到只有9個(gè)氨基酸殘基范圍內(nèi)的多肽都可以用作免疫原。這種多肽可在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生，可使用標(biāo)準(zhǔn)方法化學(xué)來合成，或可通過將大的多肽切割成可被純化的小的多肽而獲得。當(dāng)出現(xiàn)在上下文主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子，例如MHC類I或MHC類II分子的免疫系統(tǒng)中時(shí)，只有9個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的多肽可以是免疫原性的。因此，具有至少9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，900，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350或更多的連續(xù)氨基酸殘基的丙氨酸2，3-氨基變位酶多肽的多肽能被用作生產(chǎn)抗體的免疫原。
可根據(jù)Kohler和Milstein(自然Nature 256495，1975)的傳統(tǒng)方法或其衍生的方法由鼠的雜交瘤來制備在此所公開的任何多肽的單克隆抗體。
通過用該多肽(或其片段、融合體或變體)免疫適合的動(dòng)物可制備包含在此所公開的任何多肽的異種表位抗體的多克隆抗血清，它可以是未改變的或?yàn)樘岣呙庖咴远揎椀?。有效免疫兔的方法可在Vaitukaitis等人(J.Clin.Endocrinol.Metab.33988-91，1971)中找到。
抗體片段可代替完整的抗體來使用并且可在原核宿主細(xì)胞中很容易地表達(dá)。制備和使用單克隆抗體的免疫有效部分也稱為″抗體片段″的方法是公知的，且包括Better和Horowitz(酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)178476-96，1989)、Glockshuber等人(生物化學(xué)(Biochemistry)291362-7，1990)、美國(guó)專利No.5,648,237(″功能性抗體片段的表達(dá)″)、美國(guó)專利No.4,946,778(″單多肽鏈結(jié)合分子″)、美國(guó)專利No.5,455,030(″使用單鏈多肽結(jié)合分子″)以及其中引用的參考文獻(xiàn)中所描述的方法。
抗原化合物、組合物或可在動(dòng)物體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生或T-細(xì)胞反應(yīng)的物質(zhì)，包括對(duì)動(dòng)物諸如注射或吸收給藥的組合物。與特異的體液或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物反應(yīng)的抗原包括通過異源免疫原誘導(dǎo)的抗原。術(shù)語(yǔ)“抗原”包括所有相關(guān)的抗原表位。
cDNA(互補(bǔ)的DNA)缺少中間的非編碼片段(內(nèi)含子)和決定轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列的DNA片段。cDNA可在實(shí)驗(yàn)室中通過逆轉(zhuǎn)錄來自細(xì)胞中提取的信使RNA而合成。
保守取代氨基酸殘基的一或多種氨基酸取代(例如1，2，5或10個(gè)殘基)具有相似的生物化學(xué)性質(zhì)。一般地，保守取代對(duì)所得到的多肽的活性只有很小的影響或沒有影響。例如，保守取代是在丙氨酸2，3-氨基變位酶肽的氨基酸取代基本上不影響該肽轉(zhuǎn)化α-丙氨酸為β-丙氨酸的能力。在特定的實(shí)例中，保守取代是在丙氨酸2，3-氨基變位酶肽的氨基酸取代，諸如在SEQ ID NO21或30中的保守取代，其不顯著地改變?cè)摰鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)化α-丙氨酸為β-丙氨酸的能力?？捎糜跍y(cè)定丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的方法在此是公開的(實(shí)施例6和9-11)。丙氨酸掃描可用于鑒定丙氨酸2，3-氨基變位酶肽中哪些氨基酸殘基可允許氨基酸取代。在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)丙氨酸或其它保守的氨基酸(例如如下所列出的)被一或多種天然氨基酸取代時(shí)，丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的改變不超過25％，例如不多于20％，例如不多于10％。
在一個(gè)實(shí)例中，肽中包括一個(gè)保守取代，諸如SEQ ID NO21或30中的保守取代。在另一個(gè)實(shí)例中，肽中包括10個(gè)或更少的保守取代，諸如5個(gè)或更少。多肽可通過使用例如定點(diǎn)誘變或PCR標(biāo)準(zhǔn)方法操作編碼該多肽的核苷酸序列來產(chǎn)生以包含一或多種保守取代?？蛇x擇地，可通過使用標(biāo)準(zhǔn)的肽合成法產(chǎn)生多肽使其包含一或多種保守取代。
取代的變體中至少氨基酸序列的一個(gè)殘基已經(jīng)被除去并且在其位置插入了不同的殘基。蛋白質(zhì)中可取代原始氨基酸并且被認(rèn)為是保守取代的氨基酸的實(shí)例包括Ser取代Ala；Lys取代Arg；Gln或His取代Asn；Glu取代Asp；Ser取代Cys；Asn取代Gln；Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn或Gln取代His；Leu或Val取代Ile；Ile或Val取代Leu；Arg或Gln取代Lys；Leu或Ile取代Met；Met、Leu或Tyr取代Phe；Thr取代Ser；Ser取代Thr；Tyr取代Trp；Trp或Phe取代Tyr；以及Ile或Leu取代Val。
關(guān)于保守取代的進(jìn)一步信息可在其它位置找到，Ben-Bassat等人(J.Bacteriol.169751-7，1987)，O′Regan等人(Gene 77237-51，1989)，Sahin-Toth等人(Protein Sci.3240-7，1994)，Hochuli等人(Bio/Technology61321-5，1988)，WO00/67796(Curd等人)以及在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書。
缺失核酸例如DNA的序列的去除，將兩側(cè)的區(qū)域連接在一起。
可檢測(cè)的能夠確定存在或出現(xiàn)。例如，如果由β-丙氨酸產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)到足夠可被測(cè)量，從α-丙氨酸到β-丙氨酸的生產(chǎn)就是可檢測(cè)的。
DNA脫氧核糖核酸。DNA是包含多數(shù)生物體的遺傳物質(zhì)的長(zhǎng)鏈聚合物(一些病毒具有包含核糖核酸、RNA的基因)。DNA聚合物中的重復(fù)單位是4種不同的核苷酸，每個(gè)包括4個(gè)堿基中的一個(gè)，結(jié)合于附帶磷酸基的脫氧核糖核苷糖的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。三聯(lián)體的核苷酸被認(rèn)為是密碼子，DNA分子的密碼對(duì)應(yīng)于多肽的氨基酸。術(shù)語(yǔ)密碼子也用于指將DNA序列轉(zhuǎn)錄成mRNA中的3個(gè)核苷酸的相應(yīng)(和互補(bǔ)的)序列。
外源的在此所使用的關(guān)于核酸和特定細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)″外源的″指不是來源于在自然界中得到的特定細(xì)胞的任何核酸。因此，非天然存在的核酸一旦被引入細(xì)胞就相對(duì)于該細(xì)胞被認(rèn)為是外源的。天然存在的核酸也可以相對(duì)于特定細(xì)胞是外源的。例如，分離自人X的細(xì)胞的全部染色體一旦該染色體被引入人Y的細(xì)胞，相對(duì)于Y的細(xì)胞就是外源的核酸。
功能性缺失突變、部分的或完全的缺失、插入或其它變化使得基因序列抑制該基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，和/或使得該基因產(chǎn)物無功能。例如，大腸桿菌中panD的功能性缺失阻止通過由panD基因編碼的天冬氨酸脫羧酶由天冬氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸。大腸桿菌中panD的該功能性缺失使天冬氨酸脫羧酶失活從而導(dǎo)致大腸桿菌在缺乏β-丙氨酸或泛酸的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)受到抑制。
功能等效具有同等的功能。在上下文中，丙氨酸2，3-氨基變位酶分子的功能等效分子包括保持丙氨酸2，3-氨基變位酶功能的不同分子。例如，功能等效可通過丙氨酸2，3-氨基變位酶中的序列變化來提供，其中具有一或多種序列變化的肽保持未改變的肽的功能，因此它保持將α-丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸的能力。
序列變化的實(shí)例包括但不限于，保守取代、缺失、突變、移碼和插入。在一個(gè)實(shí)例中，給定的多肽結(jié)合抗體，而功能等效物是結(jié)合相同抗體的多肽。因此功能等效物包括與多肽一樣具有相同結(jié)合特異性的肽，而且可用作代替該多肽的試劑(例如在泛酸和3-HP的生產(chǎn)中)。在一個(gè)實(shí)例中功能等效物包括結(jié)合序列是不連續(xù)的，其中抗體結(jié)合線性表位的多肽。因此，如果肽序列是MKNKWYKPKR(SEQIDNO21的氨基酸1-10)，功能等效物包括不連續(xù)的表位，可表現(xiàn)為(**＝任何數(shù)目的插入氨基酸)NH2-**-M**K**N**K**W**Y**K**P**K**R-COOH。在該實(shí)例中，如果多肽的三維結(jié)構(gòu)是與結(jié)合SEQIDNO21的氨基酸1-10單克隆抗體結(jié)合的，則該多肽與SEQIDNO21的氨基酸1-10是功能等效的。
雜交根據(jù)互補(bǔ)的單鏈DNA和/或RNA形成雙分子的能力，檢測(cè)兩種核酸分子的核苷酸序列互補(bǔ)性的方法?？墒褂煤怂犭s交技術(shù)獲得本發(fā)明的分離核酸。簡(jiǎn)而言之，具有與丙氨酸2，3-氨基變位酶的一些同源性(例如與SEQIDNOS20和29或其變體或片段的同源性)的任何核酸可被用作探針，通過在中等至高度的嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交而鑒定類似的核酸。該核酸一旦被鑒定，隨后可被純化、測(cè)序和分析以確定它是否是具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的丙氨酸2，3-氨基變位酶。
雜交可通過Southern或Northern分析進(jìn)行以分別鑒定與探針雜交的DNA或RNA序列。該探針可被標(biāo)記，例如用生物素、熒光團(tuán)、地高辛、酶或例如32P的放射性同位素。待分析的DNA或RNA可在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維、尼龍或其它合適的薄膜上，以及使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)與探針雜交，那些技術(shù)在Sambrook等人(1989)分子克隆，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Plainview，紐約的7.39-7.52部分中有描述。一般地，探針長(zhǎng)度是至少大約20個(gè)核苷酸。例如，可使用包括丙氨酸2，3-氨基變位酶20個(gè)鄰近的核苷酸(例如SEQ ID NO20或29的20個(gè)鄰近的核苷酸)的探針鑒定相同的或相似的核酸。此外，可使用比20個(gè)核苷酸更長(zhǎng)或更短的探針。
本發(fā)明也提供了至少大約12個(gè)堿基長(zhǎng)度的分離的核酸序列(例如，至少大約13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，40，50，60，100，250，500，750，1000，1400，2000，3000，4000或5000個(gè)堿基長(zhǎng)度)以及在雜交條件下與丙氨酸2，3-氨基變位酶核酸序列例如SEQ ID NO20或29的正義或反義鏈雜交。雜交條件可以是中等或高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。
中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是于大約42℃，在包含25mM KPO4(pH7.4)、5×SSC、5×Denhart′s溶液、50μg/ml變性、超聲處理的鮭魚精DNA、50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯和1-15ng/ml探針(大約5×107，cpm/μg)的雜交溶液中進(jìn)行雜交，同時(shí)在大約50℃用包含2×SSC和0.1％十二烷基硫酸鈉的洗液進(jìn)行洗滌。
高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是于大約42℃，在包含25mM KPO4(pH7.4)、5×SSC、5×Denhart′s溶液、50μg/ml變性、超聲處理的鮭魚精DNA、50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯和1-15ng/ml探針(大約5×107，cpm/μg)的雜交溶液中進(jìn)行雜交，同時(shí)在大約65℃用包含0.2×SSC和0.1％十二烷基硫酸鈉的洗液進(jìn)行洗滌。
分離的″分離的″生物成分(例如核酸分子或蛋白質(zhì))大體上分離自或純化自生物體細(xì)胞中的其它生物成分，其中該成分，即其它的染色體和染色體外的DNA、RNA和蛋白質(zhì)是天然存在的?！宸蛛x的″核酸和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)的純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)也包含通過在宿主細(xì)胞重組表達(dá)的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸、蛋白質(zhì)和肽。
在一個(gè)實(shí)例中，分離的指天然產(chǎn)生的核酸其不與其獲自的天然存在的生物基因組連續(xù)相連(一側(cè)在5′末端，而另一側(cè)在3′末端)的序列連續(xù)相連。例如，分離的核酸可以是但不限于，任何長(zhǎng)度的重組DNA分子，而在天然存在的基因組中通常發(fā)現(xiàn)緊鄰重組DNA分子的兩側(cè)的核酸序列被除去或缺乏。因此，分離的核酸包括但不限于，作為分離的分子獨(dú)立于其它序列存在的重組DNA(例如，通過PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理的cDNA或基因組DNA片段)，以及整合到載體、自主復(fù)制的質(zhì)粒、病毒(例如，反向病毒、腺病毒或皰疹病毒)中，或整合到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA。此外，分離的核酸可包括雜交或融合核酸序列部分的重組DNA分子。
在一個(gè)實(shí)例中，關(guān)于核酸所使用的術(shù)語(yǔ)″分離的″也包括任何非天然存在的核酸，因?yàn)榉翘烊淮嬖诘暮怂嵝蛄性谧匀唤缰袥]有發(fā)現(xiàn)并且在天然存在的基因組中不具有緊鄰的序列。例如，非天然存在的核酸，如工程化的核酸被認(rèn)為是分離的核酸。工程化的核酸可使用常規(guī)的分子克隆或化學(xué)核酸合成技術(shù)來產(chǎn)生。分離的非天然存在的核酸可獨(dú)立于其它序列，或整合到載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒(例如，反向病毒、腺病毒或皰疹病毒)，或原核生物或真核生物的基因組DNA中。此外，分離的非天然存在的核酸可包括雜交或融合的核酸序列部分的重組DNA分子。
亮氨酸2，3-氨基變位酶可轉(zhuǎn)化α-亮氨酸為β-亮氨酸的酶。包括來自任何生物體的任何亮氨酸2，3-氨基變位酶基因、cDNA、RNA或蛋白質(zhì)，諸如來自原核生物或真核生物，例如來自大鼠、人、雞或生孢梭菌(Clostridium sporogenes)(Poston，J.Biol.Chem.2511859-63，1976)。本說明書包括亮氨酸2，3-氨基變位酶等位基因的變體，以及保持轉(zhuǎn)化α-亮氨酸為β-亮氨酸的能力的任何變體、片段或融合蛋白。
賴氨酸2，3-氨基變位酶可轉(zhuǎn)化α-賴氨酸為β-賴氨酸的酶。包括來自任何生物體的任何賴氨酸2，3-氨基變位酶基因、cDNA、RNA或蛋白質(zhì)，例如來自原核生物，例如枯草芽孢桿菌、耐放射異常球菌、近端梭菌、牙齦卟啉單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)或大腸桿菌。本說明書包括賴氨酸2，3-氨基變位酶等位基因的變體，以及保持轉(zhuǎn)化α-賴氨酸為β-賴氨酸的能力的任何變體、片段或融合序列。在一個(gè)實(shí)例中，包括通過在公共的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)，諸如GenBank中注明為賴氨酸2，3-氨基變位酶的基因編碼的多肽。
核酸包括RNA和DNA，包括但不限于，cDNA、基因組DNA和合成的(例如，化學(xué)合成)DNA。該核酸可以是雙鏈或單鏈的。其中單鏈的核酸可以是有義鏈或反義鏈。此外，核酸可以是環(huán)狀的或線性的。
寡核苷酸至少9個(gè)核苷酸的線性多核苷酸(例如DNA或RNA)序列，例如至少15、18、24、25、27、30、50、100或甚至200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
可操作地連接當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄刑幱谂c第二核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子與編碼序列可操作地連接。一般地，可操作地連接的DNA序列是鄰接的并且連接相同閱讀框中的兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域是必需的。
ORF(開放閱讀框)一系列的無任何終止密碼子的編碼氨基酸的核苷酸三聯(lián)體(密碼子)。這些序列通?？煞g成肽。
泛酸鹽或泛酸用于化妝品、醫(yī)藥和營(yíng)養(yǎng)品的商業(yè)上重要的維生素。在此術(shù)語(yǔ)泛酸和泛酸鹽可互換使用，并且不僅指游離酸而且也指D-泛酸的鹽類，例如鈣鹽、鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。泛酸鹽可使用在此所公開的細(xì)胞和方法通過化學(xué)合成或生物技術(shù)由β-丙氨酸來產(chǎn)生。
測(cè)定泛酸鹽的量的方法是已知的(例如參見Rieping等人的美國(guó)專利No.6,184,006和Eggeling等人的美國(guó)專利No.6,177,264)。例如，D-泛酸鹽的定量測(cè)定可通過使用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)(測(cè)試菌株植物乳桿菌ATCC 8014，產(chǎn)品目錄號(hào)3211-30-3；培養(yǎng)基Bacto泛酸鹽分析培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)室，Michigan，美國(guó))，產(chǎn)品目錄號(hào)0604-15-3)泛酸鹽分析來進(jìn)行。該指示菌株只在指示培養(yǎng)基中存在泛酸鹽時(shí)才生長(zhǎng)并且顯示依賴于培養(yǎng)基中泛酸鹽濃度的光度可測(cè)量的、線性的生長(zhǎng)。可使用泛酸鹽的半鈣鹽校準(zhǔn)(Sigma產(chǎn)品目錄號(hào)P2250)。光密度可在580nm的波長(zhǎng)確定。
肽的修飾本發(fā)明包括丙氨酸2，3-氨基變位酶肽以及合成的實(shí)施方案。此外，類似物(非肽的有機(jī)分子)、衍生物(從所公開的肽序列開始獲得的化學(xué)功能化的肽)和具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的變體(同系物)可用于在此所描述的方法中。在此所公開的肽包括可以是天然存在的L-和/或D-氨基酸等的氨基酸序列。
可通過多種化學(xué)技術(shù)來修飾肽，以產(chǎn)生具有與未修飾的肽本質(zhì)上活性相同，并任意具有其它所需特性的衍生物。例如，蛋白質(zhì)的羧基，無論是羧基末端或側(cè)鏈，可以藥物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子或酯化的鹽的形式提供，以形成C1-C6的酯，或轉(zhuǎn)化為通式為NR1R2的氨化物，其中R1和R2分別為H或C1-C16的烷基，或結(jié)合形成諸如5-或6-元環(huán)的雜環(huán)。肽的氨基，無論是氨基末端或側(cè)鏈，可以是藥物學(xué)上可接受的酸的加成鹽，諸如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、磺化甲苯、馬來酸、酒石酸的和其它有機(jī)鹽的形式，或可修飾為C1-C16烷基或二烷基氨基或進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氨化物。
肽側(cè)鏈的羥基可使用公知的技術(shù)轉(zhuǎn)化為C1-C16的烷氧基或C1-C16的酯。肽側(cè)鏈的苯基和酚環(huán)可用一或多種鹵素原子，諸如F、Cl、Br或I，或用C1-C16的烷基、C1-C6的烷氧基、羧酸及其酯，或該羧酸的氨化物來替換。肽側(cè)鏈的亞甲基可延伸至同系的C2-C4烯烴。硫醇可用許多公知的保護(hù)基諸如乙酰胺基團(tuán)中的任何一個(gè)來保護(hù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將認(rèn)識(shí)到用于將環(huán)狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)入所公開的肽的方法以選擇和提供結(jié)構(gòu)的構(gòu)象限制而導(dǎo)致穩(wěn)定性的增加。例如，可將C-或N-末端的半胱氨酸加入肽，使得當(dāng)氧化該肽時(shí)將包含產(chǎn)生環(huán)肽的二硫鍵。肽環(huán)化的其它方法包括形成硫醚和羧基和氨基末端的氨化物和酯。
多肽模擬物和有機(jī)模擬物的實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因此這種肽-和有機(jī)模擬物化學(xué)成分的三維結(jié)構(gòu)模仿肽主鏈和氨基酸側(cè)鏈成分的三維結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了本發(fā)明的具有可檢測(cè)的丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的蛋白質(zhì)的多肽-和有機(jī)模擬物。為了計(jì)算機(jī)模型應(yīng)用，藥效基團(tuán)是用于生物活性的結(jié)構(gòu)要求的理想化三維定義的。肽-和有機(jī)模擬物可通過現(xiàn)在的計(jì)算機(jī)模擬軟件(使用計(jì)算機(jī)輔助的藥物設(shè)計(jì)或CADD)設(shè)計(jì)來于適合各種藥效基團(tuán)。參見Walters，″藥物的計(jì)算機(jī)輔助模型″，Klegerman和Groves eds.，1993，Pharmaceutical Biotechnology，Interpharm PressBuffalo Grove，IL pp.165-174和Principles of Pharmacology，Munson(ed.)1995，Ch.102，用于CADD的技術(shù)說明。使用這種技術(shù)制備的模擬物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)例中，通過丙氨酸2，3-氨基變位酶或其變體、片段或融合體來產(chǎn)生模擬丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的模擬物。
多核苷酸任意長(zhǎng)度的線性核酸序列。因此，多核苷酸包括至少大約15，25，50，75，100，200或400(寡核苷酸)以及全長(zhǎng)cDNA的核苷酸分子。
探針和引物″探針″包括含有可檢測(cè)的標(biāo)記或報(bào)告分子的分離核酸。典型的標(biāo)記包括放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑、熒光團(tuán)和酶。用于標(biāo)記和指導(dǎo)選擇適合于多種目的標(biāo)記的方法在例如，Sambrook等人(ed.)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)2nd ed.，vol.1-3冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989，和Ausubel等人(ed.) Current Protocols in Molecular Biology，Greene Piblishing和Wiley-Interscience，紐約(定期更新)，1987中有討論。
″引物″一般是具有10個(gè)以上核苷酸(例如，具有大約10個(gè)核苷酸和大約100核苷酸之間的核酸分子)的核酸分子。引物可通過核酸雜交退火為互補(bǔ)的靶核酸鏈來形成引物和靶核酸鏈之間的雜交物，并隨后通過例如DNA聚合酶沿靶核酸鏈延伸?？墒褂靡飳?duì)擴(kuò)增核酸序列，例如通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其它的核酸擴(kuò)增方法。
用于制備和使用探針和引物的方法描述于例如，參考如Sambrook等人(ed.)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，vol.1-3，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989；Ausubel等人(ed.))，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing和Wiley-Interscience，紐約(定期更新)，1987；和Innis等人，PCR ProtocolsA Guideto Methods and Applications，學(xué)院出版社San Diego，1990。PCR引物對(duì)可來源于已知序列，例如，通過使用例如引物Primer的計(jì)算機(jī)程序(版本0.5，_1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，劍橋，Mass.)根據(jù)目的而設(shè)計(jì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解特定探針或引物的特異性隨長(zhǎng)度而增加，但是探針或引物是在全長(zhǎng)序列到短至5個(gè)連續(xù)的核苷酸序列的大小范圍內(nèi)。因此例如，20個(gè)連續(xù)核苷酸的引物退火，對(duì)于靶而言，比只有15個(gè)核苷酸的相應(yīng)引物具有更高的特異性。因此，為了獲得更大的特異性，可選擇的探針和引物包含，例如，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350，1400，1450，1500或更多連續(xù)的核苷酸。
啟動(dòng)子一系列介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸調(diào)控序列。啟動(dòng)子包括鄰近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的必需核酸序列，例如，就聚合酶II型啟動(dòng)子來說的TATA元件。啟動(dòng)子還選擇性地包括位于離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多至數(shù)千個(gè)堿基的遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子或阻遏元件。
純化的術(shù)語(yǔ)純化的不要求絕對(duì)的純度；更確切些，它意味著相對(duì)的術(shù)語(yǔ)。因此，例如，純化的肽制劑是其中的肽或蛋白質(zhì)比細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境中的肽或蛋白質(zhì)更富集，因此該肽是基本上與可能與其伴隨的細(xì)胞組分(核酸、脂類、碳水化合物和其它多肽)分離的。在另一個(gè)實(shí)例中，純化的肽制劑是其中的肽基本上不受污染的，諸如可能按照肽的化學(xué)合成提供。
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)樣品重量的至少50％是由肽組成的，例如樣品的至少60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多是由肽組成時(shí)，丙氨酸2，3-氨基變位酶肽是純化的?？捎糜诩兓乖姆椒▽?shí)例，包括但不限于，Sambrook等人所公開的方法。(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港，紐約，1989，Ch.17)。蛋白質(zhì)純度的確定可通過，例如，蛋白質(zhì)樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后通過染色該聚丙烯酰胺凝膠顯示單個(gè)多肽的條帶；高壓液相色譜法；測(cè)序；或其它常規(guī)方法。
重組重組核酸是一種具有非天然存在的序列和/或通過人工組合兩個(gè)另外序列的單獨(dú)片段的序列。該人工組合物通常通過化學(xué)來合成或更通常地通過人工操作核酸的分離部分，例如通過遺傳工程技術(shù)來完成。也使用重組描述已經(jīng)被人工操作，但包含與在該核酸被分離的生物體中發(fā)現(xiàn)的序列相同的調(diào)節(jié)序列和編碼區(qū)域的核酸分子。
序列的同一性/相似性兩個(gè)或更多核酸序列，或兩個(gè)或更多氨基酸序列之間的同一性/相似性，是用序列之間的同一性或相似性表示的。序列的同一性可以通過同一性百分?jǐn)?shù)來測(cè)定；百分比越高，序列則越相同。序列的相似性可以相似性百分?jǐn)?shù)來測(cè)定(考慮了保守的氨基酸取代)；百分比越高，序列則越相似。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，核酸或氨基酸序列的同源物或正類似物具有相對(duì)高度的序列同一性/相似性。當(dāng)正類似的蛋白質(zhì)或cDNAs源自于關(guān)系更近的種屬(例如，人和小鼠的序列)時(shí)，與源自關(guān)系更遠(yuǎn)的種屬(例如，人和C.elegans序列)相比，這種同源性是更顯著的。
用于比較序列的比對(duì)的方法是本領(lǐng)域公知的。多種程序和序列比對(duì)的算法描述于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981；Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志J.Mol.Biol.48443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.852444，1988；Higgins和Sharp，Gene，73237-44，1988；Higgins和Sharp，CABIOS5151-3，1989；Corpet等人，Nuc.Acid Res.1610881-90，1988；Huang等人，Computer Appls.in the Biosciences8，155-65，1992；和Pearson等人，Meth.Mol.Bio.24307-31，1994.Altschul等人，J.Mol.Biol.Biol.215403-10，1990，提供序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的具體考慮事項(xiàng)。
NCBIBasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人，分子生物學(xué)雜志J.Mol.Bioi.215403-10，1990)可從幾個(gè)來源獲得，包括國(guó)家生物信息中心(NCBI醫(yī)藥的國(guó)家圖書館，38A樓，8N805室，Bethesda，MD 20894)和在國(guó)際互連網(wǎng)上，用于序列分析的程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。其它信息可在NCBI網(wǎng)址上找到。
使用BLASTN比較核酸序列，同時(shí)使用BLASTP比較氨基酸序列。為了比較兩個(gè)核酸序列，可如下設(shè)置選項(xiàng)-i設(shè)置為包含第一個(gè)待比較核酸序列的文件(例如，C\seq1.txt)；-j設(shè)置為包含第二個(gè)待比較核酸序列的文件(例如，C\seq2.txt)；-p設(shè)置為blastn；-o設(shè)置為任何所需的文件名(例如，C\output.txt)；-q設(shè)置為-1；-r設(shè)置為2；以及其它選項(xiàng)保持其缺省值。例如，可使用下列命令產(chǎn)生包含兩個(gè)序列間的比較的輸出文件C\B12seq-i c\seq1.txt-j c\seq2.txt-p blastn-o c\output.txt-q-1-r 2。
為了比較兩個(gè)氨基酸序列，可如下設(shè)置選項(xiàng)B12seq-i設(shè)置為包含第一個(gè)待比較氨基酸序列的文件(例如，C\seq1.txt)；-j設(shè)置為包含第二個(gè)待比較氨基酸序列的文件(例如，C\seq2.txt)；-p設(shè)置為blastp；-o設(shè)置為任何所需的文件名(例如，C\output.txt)；且其它選項(xiàng)保持其缺省值。例如，可使用下列命令產(chǎn)生包含兩個(gè)氨基酸序列間的比較的輸出文件C\B12seq-ic\seq1.txtjc\seq2.txt-p blastp-o c\output.txt。如果兩個(gè)比較的序列具有同源性，然后該指定的輸出文件將提供同源性的區(qū)域作為排列的序列。如果兩個(gè)比較的序列不具有同源性，然后該指定的輸出文件將不會(huì)提供排列的序列比對(duì)。
一旦比對(duì)，匹配的數(shù)目被通過計(jì)算相同的核苷酸或氨基酸殘基出現(xiàn)于在兩個(gè)序列中位置的數(shù)目來確定。序列同一性的百分?jǐn)?shù)通過匹配的數(shù)目除以已鑒定序列中闡明的序列長(zhǎng)度，或除以接合長(zhǎng)度(例如，來自己鑒定序列中闡明的100個(gè)連續(xù)的核苷酸或者氨基酸殘基)，然后將結(jié)果值乘以100來確定。例如，當(dāng)與具有1154個(gè)核苷酸的待測(cè)序列對(duì)比具有1166個(gè)匹配的核酸序列時(shí)，則與待測(cè)序列具有75.0百分?jǐn)?shù)的同一性(即，1166÷1554×100＝75.0)。序列同一性值的百分?jǐn)?shù)四舍五入為接近十分之一。例如，75.11、75.12、75.13和75.14四舍五入降至75.1，同時(shí)75.15、75.16、75.17、75.18和75.19四舍五入為75.2。長(zhǎng)度值總是整數(shù)。在另一個(gè)實(shí)例中，目標(biāo)序列包含與來自己鑒定的序列20個(gè)連續(xù)的核苷酸排列20個(gè)核苷酸的區(qū)域，如下包含具有與已鑒定的序列75百分?jǐn)?shù)的序列同一性的區(qū)域(即，15-20×100＝75)。
為了比較大于大約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列，使用Blast 2序列的功能，利用設(shè)置為缺省參數(shù)的缺省BLOSUM62矩陣，(缺口存在值為11，而每個(gè)殘基缺口值為1)。通常以對(duì)全長(zhǎng)氨基酸序列的對(duì)比序列，使用NCBI Basic Blast 2.0，用諸如nr或swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)的缺口blastp計(jì)算具有至少70％的序列同一性來表征同源性。通過blastn程序進(jìn)行的查詢搜索用DUST濾過(Hancock和Armstrong，1994，計(jì)算機(jī)的生物科學(xué)應(yīng)用Comput.Appl.Biosci.1067-70)。其它的程序使用SEG。此外，可進(jìn)行手工的序列比對(duì)。當(dāng)通過該方法評(píng)估時(shí)，具有更大相似性的蛋白質(zhì)可能顯示增加的同一性百分?jǐn)?shù)，諸如至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。
當(dāng)比對(duì)短的肽(少于約30個(gè)氨基酸)時(shí)，比對(duì)應(yīng)使用Blast 2序列功能，利用設(shè)置為缺省參數(shù)的PAM30矩陣(開放缺口9，延伸缺口罰分1)進(jìn)行。當(dāng)通過該方法評(píng)估時(shí)，具有更大相似性的蛋白質(zhì)對(duì)于參考序列可能顯示增加的同一性百分?jǐn)?shù)，諸如至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％，99％的序列同一性。當(dāng)比較小于全部序列的序列同一性時(shí)，同源性可能一般對(duì)于10-20個(gè)氨基酸的區(qū)域具有至少75％的序列同一性，以及可根據(jù)它們對(duì)于參考序列的同一性而具有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性。用于確定這種短區(qū)域的序列同一性的方法在NCBI網(wǎng)址上有描述。
兩種核酸分子關(guān)系緊密的指示是兩種分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下相互雜交。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴的并且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與丙氨酸2，3-氨基變位酶基因序列雜交的核酸分子通常在如上所述的條件下分別雜交于基于全部的丙氨酸2，3-氨基變位酶基因或選擇的部分基因的探針。
由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不顯示高度同一性的核酸序列可能仍然編碼相同的或相似的(保守的)氨基酸序列?？赏ㄟ^使用該簡(jiǎn)并性產(chǎn)生所有編碼本質(zhì)上相同的蛋白質(zhì)的多種核酸分子來產(chǎn)生核酸序列中的變化。這種同源的核酸序列可，例如，具有至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的通過該方法測(cè)定的序列同一性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可意識(shí)到這些序列同一性的范圍只是用于提供指導(dǎo)；獲得的強(qiáng)烈顯著的同源性超出所提供的范圍是有可能的。
兩種核酸序列是基本上相同的可選擇的(而非必要累積的)指示是第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽是免疫交叉反應(yīng)的。
特異性結(jié)合劑基本上只結(jié)合限定的靶，諸如目標(biāo)肽的試劑。例如，丙氨酸2，3-氨基變位酶結(jié)合劑包括抗丙氨酸2，3-氨基變位酶的抗體和基本上只結(jié)合丙氨酸2，3-氨基變位酶的其它試劑(例如肽或藥物)。可使用丙氨酸2，3-氨基變位酶蛋白質(zhì)(或其片段)的抗體來純化或鑒定這種蛋白質(zhì)。
轉(zhuǎn)化的例如通過分子生物學(xué)技術(shù)將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞。如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)化包含將核酸分子引入該細(xì)胞的所有技術(shù)，包括但不限于用病毒載體轉(zhuǎn)染，接合、用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化并且通過電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和粒子加速槍導(dǎo)入裸露的DNA。
變體、片段或融合蛋白質(zhì)本發(fā)明的丙氨酸2，3氨基變位酶蛋白質(zhì)，包括其變體、片段和融合體。編碼蛋白質(zhì)(例如SEQ ID NO20或29)、融合的丙氨酸2，3氨基變位酶蛋白質(zhì)或丙氨酸2，3氨基變位酶蛋白質(zhì)的片段或變體的DNA序列可被工程化以允許蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲和/或植物中表達(dá)。為了獲得表達(dá)，DNA序列可被改變并且可操作地連接到其它調(diào)節(jié)序列上。包含調(diào)節(jié)序列和蛋白質(zhì)的最終產(chǎn)物稱為載體。該載體可被導(dǎo)入真核、細(xì)菌、昆蟲和/或植物細(xì)胞。一旦在細(xì)胞內(nèi)部該載體允許蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
融合蛋白質(zhì)包括，例如丙氨酸2，3-氨基變位酶(或其變體、多態(tài)型、突變體或片段)，例如SEQ ID NO21或30，連接到不抑制所需的丙氨酸2，3氨基變位酶活性，例如不抑制轉(zhuǎn)化α-丙氨酸為β-丙氨酸的能力的其它氨基酸序列上的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)例中，另一個(gè)氨基酸序列不多于大約10，12，15，20，25，30或50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可意識(shí)到DNA序列可在多個(gè)方面被改變而不影響該編碼的蛋白質(zhì)的生物活性。例如，可使用PCR在編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的DNA序列中產(chǎn)生變化。這種變體可以是為用于表達(dá)該蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞所偏愛的密碼子，或促進(jìn)表達(dá)的其它序列變化而優(yōu)化的變體。
載體被導(dǎo)入細(xì)胞從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的核酸分子。載體可包括允許它在細(xì)胞中例如復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制的核酸序列。載體還可包括一或多種可選擇的標(biāo)記基因和其它本領(lǐng)域已知的遺傳元件。
丙氨酸2，3-氨基變位酶的核酸和多肽具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽被公開在此。在一個(gè)實(shí)例中，該多肽是突變的氨基變位酶氨基酸序列，例如賴氨酸2，3-氨基變位酶、亮氨酸2，3-氨基變位酶或賴氨酸5，6-氨基變位酶序列。具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽的實(shí)例顯示在SEQ ID NOS21和30中。然而，本發(fā)明還包含保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的SEQ IDNOS21和30的變體、融合體和片段?？墒褂玫钠蔚膶?shí)例包括，但不限于SEQ ID NO21的氨基酸50-390，50-350、60-350，75-340或100-339和SEQ ID NO30的氨基酸1-390、15-390，15-340或19-331?？杀蝗〈?，同時(shí)仍然保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的實(shí)例，包括但不限于SEQ ID NO21的V21I或V21L；Y71P；L17I；K361R；A410V；和/或Y430F或Y430W，和SEQ ID NO30的T40S；V96I或V96L；D102E；A252V；和/或L393V，以及其組合。
本發(fā)明提供了酶多肽，諸如丙氨酸2，3-氨基變位酶(例如SEQ ID NO21和/或30，及其保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的變體、片段和融合體)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可使用變化的酶序列，只要該酶保持所需的酶活性，例如丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。例如，所公開的內(nèi)容提供包含與例如丙氨酸2，3氨基變位酶序列的酶序列相同的至少15個(gè)連接的氨基酸的多肽?？梢岳斫獗景l(fā)明也提供包含多于至少15個(gè)氨基酸殘基(例如，至少16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50，75，100，150，200，250，300或更多氨基酸殘基)的氨基酸序列的多肽，和與在此所公開的或其它公開可利用的任何酶相同的多肽。
此外，本發(fā)明提供了酶的多肽，諸如丙氨酸2，3-氨基變位酶肽(例如，SEQ ID NO21和/或30)，其包括具有酶氨基酸序列變化的氨基酸序列。變體序列可包含單個(gè)插入、單個(gè)缺失、單個(gè)取代、多個(gè)插入、多個(gè)缺失、多個(gè)取代，或其任何組合(例如，單個(gè)缺失和多個(gè)插入一起)。這種多肽與諸如丙氨酸2，3-氨基變位酶序列的酶序列具有至少60，65，70，75，80，85，90，95，97，98或99％的序列同一性，只要通過該氨基酸序列編碼的肽保持所要求的酶活性。
具有變異氨基酸序列的多肽可保持酶活性，諸如丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。這種多肽可通過使用諸如定點(diǎn)誘變或PCR的標(biāo)準(zhǔn)方法操作編碼多肽的核苷酸序列來產(chǎn)生。一種類型的修飾包括一或多個(gè)氨基酸殘基的取代，諸如不超過10個(gè)氨基酸取代具有相似生物化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基，即保守取代。
更多實(shí)質(zhì)的變化可通過選擇較少保守的取代來獲得，例如，選擇在保持下列性質(zhì)中有顯著不同影響的殘基(a)在取代的區(qū)域內(nèi)多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象；(b)在靶位點(diǎn)多肽的電荷或疏水性；或(c)側(cè)鏈的體積。一般預(yù)期在多肽的功能上產(chǎn)生大的變化的取代是(a)親水殘基，例如，絲氨酸或蘇氨酸取代(或被)疏水的殘基，例如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸(取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸被(或通過)任何其它殘基取代；(c)具有正電側(cè)鏈的殘基，例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸取代(或被)負(fù)電殘基，例如谷氨酸或天冬氨酸(取代)；或(d)具有大的側(cè)鏈的殘基，例如苯丙氨酸取代(或被)不具有側(cè)鏈的殘基，例如甘氨酸(取代)。這些氨基酸取代(或其它缺失或加入)的效果可通過如同相關(guān)的天然多肽催化相同的產(chǎn)物分析該多肽催化相同底物轉(zhuǎn)化的能力而評(píng)估具有酶活性的多肽。因此，在此提供具有不超過5，10，20，30，40或50個(gè)保守取代的多肽。
本發(fā)明也公開了編碼具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽，例如包括SEQ ID NO20或29的序列的分離核酸。然而，本發(fā)明還包含保持編碼具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的蛋白質(zhì)或肽的SEQ IDNOS20和29的變體、融合體和片段。在一個(gè)實(shí)例中編碼具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性多肽的分離核酸被可操作地連接到啟動(dòng)子序列上，且可成為載體的一部分。該核酸可以是用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞并制備轉(zhuǎn)化細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物的重組核酸。
本發(fā)明公開了包括編碼具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性多肽(例如SEQ ID NO20和/或29或保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的其片段、融合體或變體)的至少一個(gè)外源核酸分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，這種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸。在另一個(gè)實(shí)例中，該細(xì)胞產(chǎn)生3-HP、泛酸、CoA和/或有機(jī)化合物諸如1，3-丙二醇。
編碼在此所公開的酶的核酸序列，諸如丙氨酸2，3-氨基變位酶(SEQ ID NO20和29)、賴氨酸2，3-氨基變位酶(SEQ ID NOS3和28)，以及β-丙氨?；鵆oA氨裂解酶SEQ ID NO22)、(以及在此所公開的任何其它酶)，可以包含編碼酶及其保持所需的酶活性的部分的全部核酸序列。例如，酶的核酸可以包含酶核酸序列的至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸?？梢岳斫獗景l(fā)明也提供了包含多于15個(gè)核苷酸(例如，至少16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，75，10，200，500或更多核苷酸)長(zhǎng)度的核苷酸序列，以及與諸如SEQ ID NO20和/或29所顯示丙氨酸2，3-氨基變位酶序列的酶序列任何部分相同的分離核酸。
此外，本發(fā)明提供了包含酶序列的變化，例如變異的丙氨酸2，3-氨基變位酶核酸序列的分離的酶核酸序列。變體可包含單個(gè)插入、單個(gè)缺失、單個(gè)取代、多個(gè)插入、多個(gè)缺失、多個(gè)取代，或其任何組合(例如，單個(gè)缺失和多個(gè)插入一起)，只要由此編碼的肽保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。這種分離的核酸分子可與例如丙氨酸2，3-氨基變位酶序列的酶序列具有至少60，70，75，80，85，90，92，95，97，98或99％的序列同一性，只要由該核酸編碼的肽保持所需要的酶活性，例如丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。例如，可對(duì)丙氨酸2，3-氨基變位酶核酸序列產(chǎn)生下列變異對(duì)于SEQ ID NO20，12位的″a″可用″g″取代；1050位的″g″可用″a″取代；255位的″a″可用″g″″t″或″c″取代；對(duì)于SEQ ID NO29，6位的″a″可用″g″″t″或″c″取代；66位的″t″可用″c″取代；以及315位的″g″可用″a″″t″或″c″取代。
特定種類的密碼子偏好和密碼子用法表可用于工程改造利用特定種屬的密碼子偏好的分離的核酸分子。例如，在此所公開的酶可以設(shè)計(jì)成具有特定的目的生物體優(yōu)先使用的密碼子。
本發(fā)明也提供了編碼酶的分離的核酸序列，例如丙氨酸2，3-氨基變位酶，其中該序列是至少大約12個(gè)堿基的長(zhǎng)度(例如，至少大約13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，40，50，60，100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，4000或5000個(gè)堿基長(zhǎng)度)并在雜交條件下與編碼酶的核酸的有義鏈或反義鏈雜交。雜交條件可以是中等或高度的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。
多肽和編碼多肽的核酸可通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA誘變技術(shù)來產(chǎn)生，例如M13引物誘變。這些技術(shù)的細(xì)節(jié)提供于Sambrook等人(ed.)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，vol.1-3，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989，CH.15中。核酸分子可包含編碼區(qū)域的變化以適合被導(dǎo)入分子的特定生物體對(duì)密碼子使用的偏好。
可選擇地，該編碼區(qū)域可通過利用遺傳密碼的簡(jiǎn)并性來改變編碼序列，同時(shí)以這種方式基本上改變了核酸序列，它仍然編碼具有相同氨基酸序列或基本上與天然的氨基酸序列相似的多肽。例如，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，丙氨酸通過4種核苷酸密碼子的三聯(lián)體編碼GCT、GCA、GCC和GCG。因此，開放閱讀框的核酸序列可以在丙氨酸位置變化為任何這些密碼子而不影響編碼多肽的氨基酸序列或該多肽的特性。基于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，核酸變體可來源于使用如在此所描述的標(biāo)準(zhǔn)DNA誘變技術(shù)，或通過核酸序列的合成的核酸序列。因此，本發(fā)明也包含編碼相同多肽但借助遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而在核酸序列方面不同的核酸分子。
具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞本發(fā)明公開了具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞。這種細(xì)胞可以由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸。在一個(gè)實(shí)例中，這種細(xì)胞具有取決于天然存在的突變，和/或該細(xì)胞染色體中引發(fā)的突變，例如通過將細(xì)胞暴露于化學(xué)或紫外的誘變，的丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。包括丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞可以是真核或原核的。這種細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，乳桿菌、乳球菌、芽胞桿菌、埃希氏桿菌、Geobacillus、棒狀桿菌(Corynebacterium)、梭狀芽胞桿菌、真菌、植物和酵母細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，植物細(xì)胞是植物，諸如轉(zhuǎn)基因植物的一部分。
在一個(gè)實(shí)例中，具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這種細(xì)胞可包括編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶，例如包含SEQ ID NO20或29的序列，或其保持編碼具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的蛋白質(zhì)的能力的變體、片段或融合體的至少一個(gè)外源核酸分子。在一個(gè)實(shí)例中，該外源的核酸分子是突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶，例如突變的原核的賴氨酸2，3-氨基變位酶。在特異的實(shí)例中，該突變的原核生物的賴氨酸2，3-氨基變位酶是突變的枯草芽孢桿菌、耐放射異常球菌、近端梭菌、糞產(chǎn)堿菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌或牙齦卟啉單胞菌的賴氨酸2，3-氨基變位酶。其它的賴氨酸2，3-氨基變位酶可通過使用本領(lǐng)域已知的方法鑒定，例如通過在BLAST上搜索相似的序列和/或通過使用雜交的方法。在特異的實(shí)例中，突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶是突變的枯草芽孢桿菌或突變的牙齦卟啉單胞菌賴氨酸2，3-氨基變位酶。在另一個(gè)實(shí)例中，外源的核酸分子是突變的賴氨酸5，6-氨基變位酶，例如突變的原核的賴氨酸5，6-氨基變位酶。可選擇地，外源的核酸分子是突變的亮氨酸2，3-氨基變位酶，或突變的賴氨酸5，6-氨基變位酶，例如突變的斯氏梭菌(C.sticklandii)賴氨酸5，6-氨基變位酶。
在特定的實(shí)例中，突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶是在L103、D339和/或M136位具有取代突變的枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶。例如，取代可包括L103M、L103K、L103R、L103E或L103S的取代。在另一個(gè)或附加的實(shí)例中，取代包括D339H、D339Q、D339T或D339N的取代。在又一個(gè)實(shí)例中，取代可包括L103M、M136V的取代，D339H的取代或其任意組合。
本發(fā)明公開了包括丙氨酸2，3-氨基變位酶活性以及其它酶活性的細(xì)胞?？墒褂眠@種細(xì)胞生產(chǎn)β-丙氨酸、3-HP、泛酸、CoA和有機(jī)酸、多元醇，諸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸酯、丙烯酸的酯、聚合的3-HP、3-HP和諸如丁酸的其它化合物的共聚合物、戊酸酯或鹽和其它化合物以及3-HP的酯。
在一個(gè)實(shí)例中，這種細(xì)胞也包括丙氨酸脫氫酶或丙酮酸/谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性或CoA合成酶、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脫水酶活性、谷氨酸脫氫酶活性、3-羥丙酰基-CoA水解酶或3-羥異丁酰-CoA水解酶活性。在另一個(gè)實(shí)例中，這種細(xì)胞也包括丙氨酸脫氫酶或丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性、4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、谷氨酸脫氫酶活性，以及3-HP或3-羥基異丁酸脫氫酶活性。在這些實(shí)例中，可使用細(xì)胞來產(chǎn)生3-HP。
在另一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞也包括丙氨酸脫氫酶或丙酮酸/谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脫水酶活性、谷氨酸脫氫酶活性，以及3-羥丙?；?CoA水解酶3-羥異丁酰-CoA水解酶活性。在另一個(gè)實(shí)例中，這種細(xì)胞也包括丙氨酸脫氫酶或丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性、4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、谷氨酸脫氫酶活性，以及3-HP或3-羥基異丁酸脫氫酶活性；以及脂肪酶或酯酶活性?？墒褂眠@種細(xì)胞生產(chǎn)3-HP的酯，諸如3-羥基丙酸甲酯、3-羥基丙酸乙酯、3-羥基丙酸丙酯、3-羥基丙酸丁酯或3-羥基丙酸2-乙基己基酯。
在另一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞也包括丙氨酸脫氫酶或丙酮酸/谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性、CoA合成酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脫水酶活性、谷氨酸脫氫酶活性；以及聚醇酸合酶活性。可使用這種細(xì)胞生產(chǎn)聚合的3-HP。
在又一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞也包括丙氨酸脫氫酶或丙酮酸/谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性、CoA合成酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、谷氨酸脫氫酶活性以及聚羥酸合酶活性?？墒褂眠@種細(xì)胞生產(chǎn)聚合的丙烯酸酯。
在另一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞也包括丙氨酸脫氫酶或丙酮酸/谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、谷氨酸脫氫酶活性，以及脂肪酶或酯酶活性，其中可使用該細(xì)胞生產(chǎn)丙烯酸的酯，例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯或丙烯酸丁酯。
可選擇地，這種細(xì)胞也包括丙氨酸脫氫酶或丙酮酸-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶活性、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脫水酶活性、谷氨酸脫氫酶活性、3-羥丙?；?CoA水解酶或3-羥異丁酰-CoA水解酶活性，以及醛或乙醇脫氫酶活性?？墒褂眠@種細(xì)胞生產(chǎn)1，3-丙二醇。
在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞也具有α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸還原酶(E.C.1.1.1.169)，以及泛酸合成酶(E.C.6.3.2.1)活性。可使用這種細(xì)胞生產(chǎn)泛酸。可選擇地或另外地，該細(xì)胞也具有泛酸激酶(E.C.2.7.1.33)、4′-磷酸羥泛酰基-1-半胱氨酸合成酶(E.C.6.3.2.5)、4′-磷酸羥泛?；腚装彼崦擊让?E.C.4.1.1.36)、ATP4‘-磷酸泛酰巰基乙胺腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.7.7.3)，以及脫磷酸-CoA激酶(E.C.2.7.1.24)活性?？墒褂眠@種細(xì)胞生產(chǎn)輔酶A(CoA)。
鑒定具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞的方法本發(fā)明公開了鑒定具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞的方法。該方法包括在含有α-丙氨酸而不是β-丙氨酸或泛酸的培養(yǎng)基中，或在其中細(xì)胞可由培養(yǎng)基來源的碳、氧、氫和氮產(chǎn)生α-丙氨酸，但不包括β-丙氨酸或泛酸的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)功能性缺失panD的細(xì)胞，例如原核細(xì)胞，以及鑒定能夠在缺乏β-丙氨酸或泛酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞。在特定的實(shí)例中，該細(xì)胞也是功能性缺失panF的。細(xì)胞的生長(zhǎng)表明細(xì)胞由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸，也表明該細(xì)胞具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。相反，如果細(xì)胞不在缺乏β-丙氨酸或泛酸得培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和/或生存，表明該細(xì)胞不能由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸，也表明該細(xì)胞不具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。
在一個(gè)實(shí)例中，功能性缺失panD的細(xì)胞用一或多種突變的氨基變位酶轉(zhuǎn)化，諸如包括突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶、突變的亮氨酸2，3-氨基變位酶和/或突變的賴氨酸5，6-氨基變位酶的文庫(kù)。在特定的實(shí)例中，該細(xì)胞在培養(yǎng)和篩選前用突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶的文庫(kù)轉(zhuǎn)化。酶賴氨酸2，3-氨基變位酶先前已經(jīng)從近端梭菌SB4(Chirpich等人，生物化學(xué)雜志J.Bio1.Chem.2451778-89，1970)和枯草芽孢桿菌(Chen等人，生物化學(xué)雜志Biochem.J.348539-49，2000)中克隆出來，并且已經(jīng)顯示催化賴氨酸和β-賴氨酸的相互轉(zhuǎn)化。突變的氨基變位酶，諸如突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶，可篩選其賦予的丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的能力。此外，盡管具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽先前沒有描述，這樣的酶可能存在于自然界中。因此，功能性缺失panD的細(xì)胞可用包括編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的基因的文庫(kù)轉(zhuǎn)化，并且通過賦予這些細(xì)胞在包含α-丙氨酸，或碳、氧、氫，和氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力以使得該細(xì)胞可產(chǎn)生α-丙氨酸，而不包含β-丙氨酸或泛酸來分離該基因。
在另一個(gè)實(shí)例中，該方法進(jìn)一步包括在突變的氨基變位酶中鑒定突變體，隨后鑒定該突變的氨基變位酶賦予該細(xì)胞丙氨酸2，3-氨基變位酶活性因而能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞。為了鑒定該突變，氨基變位酶的核酸或氨基酸可被測(cè)序并且與非突變的氨基變位酶序列相比，以鑒定賦予細(xì)胞丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的突變。
生產(chǎn)具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的肽的方法本發(fā)明公開了生產(chǎn)具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的丙氨酸2，3-氨基變位酶肽的方法。該方法包括在允許細(xì)胞生產(chǎn)丙氨酸2，3-氨基變位酶肽的條件下培養(yǎng)所公開的具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，該方法包括培養(yǎng)具有一或多種編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶(例如包括SEQ ID NO20和/或29或保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的其變體、融合體或片段的序列)的外源核酸分子的細(xì)胞，從而生產(chǎn)丙氨酸2，3-氨基變位酶。
本發(fā)明也公開了從α-丙氨酸制備β-丙氨酸的方法。在一個(gè)實(shí)例中，該方法包括在允許細(xì)胞由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸的條件下培養(yǎng)具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，該方法包括培養(yǎng)具有一或多種編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的外源核酸分子的細(xì)胞，以使得該丙氨酸2，3-氨基變位酶能夠由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸。在一個(gè)實(shí)例中，外源的核酸包括SEQ ID NO20和/或29或保持其丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的變體、融合體或片段的序列。
在特定的實(shí)例中，該細(xì)胞功能性缺失panD或panD和panF。
產(chǎn)生3-HP、泛酸及其衍生物的途徑本發(fā)明公開了涉及通過丙氨酸2，3-氨基變位酶，例如使用所公開的丙氨酸2，3-氨基變位酶序列和所公開的具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的丙氨酸細(xì)胞從α-丙氨酸生產(chǎn)β-丙氨酸的方法和材料。此外公開了涉及由β-丙氨酸產(chǎn)生泛酸和3-HP，以及CoA和例如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸鹽、丙烯酸的酯、聚合的3-HP、3-HP和其它化合物的共聚合物，諸如丁酸酯、戊酸酯及其它化合物，以及3-HP的酯的其它有機(jī)化合物的方法和材料。具體地，本發(fā)明提供了用于由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基變位酶的核酸(諸如SEQID NO20和29)、多肽(例如SEQ ID NO21和30)、宿主細(xì)胞，以及方法和材料，其中可使用α-丙氨酸更有效地制備β-丙氨酸泛酸和3-HP及其衍生物，諸如CoA和諸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸鹽、丙烯酸的酯、聚合的3-HP和3-HP的酯的有機(jī)化合物。
可使用幾個(gè)代謝途徑從已經(jīng)由α-丙氨酸產(chǎn)生的β-丙氨酸生產(chǎn)有機(jī)化合物(圖1和3)。
3-HP和其衍生物的途徑如圖1所示，β-丙氨酸可通過使用具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性(EC 2.8.3.1)或CoA合酶活性(E.C.6.2.1.-)的多肽轉(zhuǎn)化為β-丙氨?；?CoA。β-丙氨酸可從α-丙氨酸通過宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化α-丙氨酸為β-丙氨酸的內(nèi)源多肽，和/或通過使用用重組的丙氨酸2，3-氨基變位酶，諸如包括SEQID NO20和/或29或其保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的片段、變體或融合體的序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞來產(chǎn)生。β-丙氨酰基-CoA可隨后通過使用具有β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性(EC 4.3.1.6)的多肽轉(zhuǎn)化為烯丙酰-CoA。烯丙酰-CoA可隨后通過使用具有3-HP-CoA脫水酶活性(EC 4.2.1.-)的多肽轉(zhuǎn)化為3-羥丙?；?CoA(3-HP-CoA)。3-HP-CoA可隨后通過幾個(gè)酶轉(zhuǎn)化為3-HP，這幾個(gè)酶包括但不限于具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性(EC 2.8.3.1)的多肽、具有3-羥丙?；?CoA水解酶活性(EC 3.1.2.-)的多肽，和具有3-羥異丁酰-CoA水解酶活性(EC 3.1.2.4)的多肽，可使用這些酶將3-HP-CoA轉(zhuǎn)化為3-HP。
如圖1所示，可通過利用具有4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽從β-丙氨酸產(chǎn)生3-HP，其中從β-丙氨酸產(chǎn)生丙二酸半醛。該丙二酸半醛可用具有3-HP脫氫酶活性(EC 1.1.1.59)的多肽或具有3-羥基異丁酸脫氫酶活性(EC 1.1.1.31)的多肽轉(zhuǎn)化為3-HP。
3-HP的衍生物可如圖1所示從β-丙氨酸來產(chǎn)生。所得的3-HP-CoA可通過具有多醇酸合酶活性(EC 2.3.1.-)的多肽轉(zhuǎn)化為聚合的3-HP。可選擇地或另外地，3-HP-CoA可通過具有氧化還原酶活性或還原酶活性的多肽轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。
所得到的烯丙酰-CoA可通過具有多醇酸合酶活性(EC 2.3.1.-)的多肽轉(zhuǎn)化為聚合的丙烯酸?？蛇x擇地或另外地，烯丙酰-CoA可通過具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性和/或CoA水解酶活性的多肽轉(zhuǎn)化為丙烯酸；并且所得的丙烯酸可通過具有脂肪酶或酯酶活性的多肽轉(zhuǎn)化為丙烯酸的酯。
所得到的3-HP可通過具有脂肪酶或酯酶活性(EC 3.1.1.-)的多肽轉(zhuǎn)化為3-HP的酯?？蛇x擇地或另外地，可通過具有醛脫氫酶活性的多肽和具有乙醇脫氫酶活性的多肽的組合從3-HP產(chǎn)生1，3-丙二醇。
泛酸及其衍生物的途徑如圖3所示，可通過轉(zhuǎn)化β-丙氨酸為泛酸具有α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸還原酶(E.C.1.1.1.169)和泛酸合酶(E.C.6.3.2.1)活性的肽從β-丙氨酸來產(chǎn)生泛酸。
泛酸的衍生物可從β-丙氨酸產(chǎn)生如下。所得到的泛酸可被通過具有泛酸激酶(E.C.2.7.1.33)、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶(E.C.6.3.2.5)、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脫羧酶(E.C.4.1.1.36)、ATP4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.7.7.3)和脫磷酸-CoA激酶(E.C.2.7.1.24)活性的多肽轉(zhuǎn)化為CoA。
酶具有賴氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽以及編碼該多肽的核酸可以從多種種屬中獲得，包括但不限于近端梭菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、耐放射異常球菌、牙齦卟啉單胞菌、嗜熱產(chǎn)液菌(Aquifex aolicus)，或流感嗜血桿菌。例如，具有賴氨酸2，3-氨基變位酶活性的氨基酸序列顯示在枯草芽孢桿菌的SEQ ID NO31和牙齦卟啉單胞菌的SEQ ID NO28中。
在另一個(gè)實(shí)例中，編碼具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽的核酸顯示于枯草芽孢桿菌的SEQ ID NO20(相應(yīng)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO21)，以及顯示于牙齦卟啉單胞菌的SEQ ID NO29(相應(yīng)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO30)。此外，其它具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽和編碼這種多肽的核酸，可使用在此描述的方法獲得。例如，可使用丙氨酸2，3-氨基變位酶變體編碼如上所述具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽。
具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽和編碼這種多肽的核酸可從多種種屬中獲得，包括但不限于，埃氏巨球型菌、丙酸梭菌、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和大腸桿菌。例如，編碼具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的核酸顯示于埃氏巨球型菌的SEQ ID NO24。此外，具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽(SEQ ID NO25)和編碼這種多肽的核酸(SEQ ID NO24)可如在此所描述的獲得。例如，可使用CoA轉(zhuǎn)移酶變體編碼具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。例如，可對(duì)CoA轉(zhuǎn)移酶的核酸序列(SEQ ID NO24)進(jìn)行下列變化49位的″a″可用″c″取代；590位的″a″可用″atgg″取代；可在393位的″g″前插入″aaac″；或736位的″gaa″可被缺失?？梢岳斫庑蛄斜碇兴谐龅男蛄锌砂S多變化和任何類型變化的組合，只要該肽保持CoA轉(zhuǎn)移酶活性。此外，可對(duì)顯示于SEQ ID NO25的CoA轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列進(jìn)行下列變化17位的″k″可用″p″或″h″取代；125位的″v″可用″i″或″f″取代。
具有β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性的多肽和編碼這種多肽的核酸可從包括但不限于丙酸梭菌的多種種屬中獲得。例如，編碼具有β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性的多肽復(fù)合物的核酸可從如實(shí)施例10中所描述的丙酸梭菌獲得。編碼β-丙氨?；鵆oA氨裂解酶的核酸可包含如SEQ ID NO22中列出的序列。此外，具有β-丙氨酰基CoA氨裂解酶活性的多肽(SEQ ID NO23)以及編碼這種多肽的核酸(SEQ ID NO22)可如在此所描述的獲得。例如，可使用顯示于SEQ ID NO22的β-丙氨?；?CoA氨裂解酶序列的變體編碼具有β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性的多肽。
具有3-羥丙酰基-CoA脫水酶活性(也稱為烯丙?；?CoA水合酶活性)的多肽和編碼這種多肽的核酸可獲自包括但不限于，橙色綠屈撓菌(Chloroflexus auranticus)、皺褶假絲酵母(Candida Rugosa)、深紅紅螺菌(Rhodosprillium rubrum)和莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulates)。例如，編碼具有3-羥丙?；?CoA脫水酶活性的多肽的核酸在WO02/42418中公開。
具有谷氨酸脫氫酶活性的多肽和編碼這種多肽的核酸可從多種種屬獲得。
具有3-羥丙酰基-CoA或3-羥異丁酰-CoA水解酶活性的多肽和編碼這種多肽的核酸可從包括但不限于熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑家鼠(Rattus rattus)和人(Homo sapiens)的多種種屬獲得。例如，編碼具有3-羥異丁?；?CoA水解酶活性的多肽的核酸可從人屬獲得并且已經(jīng)具有如GenBank登錄號(hào)U66669所列出的序列。
具有4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、3-HP脫氫酶活性和3-羥基異丁酸脫氫酶活性的多肽以及編碼這種多肽的核酸可從多種種屬獲得。
具有多醇酸合酶活性的多肽和編碼這種多肽的核酸可從包括但不限于，類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、食酸叢毛單胞菌(Comamonas acidororans)、(Ralstonia eutropha)和食油假單胞菌(Pseudomonas oleovorans)的多種種屬獲得。例如，編碼具有多醇酸合酶活性的多肽的核酸可從類球紅細(xì)菌和如GenBank登錄號(hào)X97200列出的序列獲得。關(guān)于多醇酸合成酶的輔助信息可在Song等人(Biomacromolecules 1433-9，2000)中找到。
具有乙酰化醛NAD(+)氧化還原酶活性(EC1.2.1.10)的多肽和編碼這種多肽的核酸可從但不限于大腸桿菌的多種種屬獲得。例如，編碼具有?；娜┟摎涿富钚缘亩嚯牡暮怂峥色@自大腸桿菌且具有GenBank登錄號(hào)Y09555所示的序列。
醛NAD(+)氧化還原酶活性和醇NAD(+)氧化還原酶活性可通過如上所述兩種不同的多肽攜帶，或通過單個(gè)多肽攜帶，例如來自大腸桿菌的多官能的醛乙醇脫氫酶(EC1.2.1.10)(Goodlove等人Gene 85209-14，1989；GenBank登錄號(hào)No.M33504)。
具有醛脫氫酶(NAD(P)+)(EC1.2.1.-)活性的多肽和編碼這種多肽的核酸可從包括但不限于，啤酒酵母的多種種屬中獲得。例如，編碼具有醛脫氫酶活性的多肽的核酸可從啤酒酵母(S.cerevisiae)中獲得并具有GenBank登錄號(hào)No.Z75282所示的序列(Tessier等人，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.16429-34，1998)。
具有乙醇脫氫酶活性(EC1.1.1.1)的多肽和編碼這種多肽的核酸可從包括但不限于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)的多種種屬中獲得。例如，編碼具有乙醇脫氫酶活性的多肽的核酸可從運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中獲得并具有GenBank登錄號(hào)No.M32100所示的序列。
具有脂肪酶活性的多肽和編碼這種多肽的核酸可從包括但不限于，皺褶假絲酵母、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)和白色假絲酵母(Candida albicans)的多種種屬獲得。例如，編碼具有脂肪酶活性的多肽的可從皺褶假絲酵母中獲得并具有GenBank登錄號(hào)A81171所示的序列。
具有α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和泛酸合酶活性的多肽和編碼這種多肽的核酸可從包括但不限于大腸桿菌的多種種屬獲得。例如，編碼具有α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和泛酸合酶活性的多肽的核酸可從大腸桿菌中獲得并具有GenBank登錄號(hào)L17086所示的序列。
具有α-酮泛酸還原酶、泛酸激酶、4′-磷酸泛醇酰-L-半胱氨酸合成酶、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脫羧酶、ATP4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶和脫磷酸-CoA激酶活性的多肽和編碼這種多肽的核酸可從包括但不限于大腸桿菌的多種種屬中獲得。例如，編碼具有α-酮泛酸還原酶泛酸激酶、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脫羧酶、ATP4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶和脫磷酸-CoA激酶活性的多肽的核酸可從大腸桿菌中獲得并具有GenBank登錄號(hào)NC000913所列出的序列。
術(shù)語(yǔ)″具有酶活性的多肽″是指催化其它物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)而在完成該反應(yīng)的過程中本身并不被破壞或改變的任何多肽。一般地，具有酶活性的多肽催化從一或多種底物形成一或多種產(chǎn)物。這種多肽可具有任何類型的酶活性包括但不限于，酶活性或與下列酶相關(guān)的酶活性，諸如丙氨酸2，3-氨基變位酶、脫水酶/水合酶、3-羥丙?；?CoA脫水酶/水合酶、丙氨酸脫氫酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、3-羥丙?；?CoA水解酶、3-羥異丁酰-CoA水解酶、CoA水解酶、多醇酸合酶、β-丙氨酸氨裂解酶、4-氨基丁酸或β-丙氨酸-2-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、3-HP脫氫酶、3-羥基異丁酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、脂肪酶、酯酶、乙?；㎞AD(+)氧化還原酶、醇NAD(+)氧化還原酶、醛脫氫酶、醇脫氫酶羥甲基轉(zhuǎn)移酶、還原酶、合酶、激酶、合成酶、脫羧酶、α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、α-酮泛酸還原酶、泛酸合成酶、泛酸激酶、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脫羧酶、ATP4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶、脫磷酸-CoA激酶、乙?；㎞AD(+)氧化還原酶、醇NAD(+)氧化還原酶、醛脫氫酶(NAD(P)+)、醇脫氫酶和腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶。
制備3-HP、泛酸及其衍生物的方法圖1和3中描述的途徑所提供的每個(gè)步驟都可在細(xì)胞內(nèi)(體內(nèi))或細(xì)胞外(體外，例如，在容器或柱中)進(jìn)行。此外，有機(jī)化合物產(chǎn)物可通過體內(nèi)合成和體外合成的組合來產(chǎn)生。另外，體外步驟可經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)或酶促反應(yīng)來進(jìn)行。
例如，可使用在此提供的細(xì)胞或微生物進(jìn)行圖1和3中提供的步驟，或可使用包含具有所顯示的酶活性的多肽的提取物進(jìn)行圖1和3提供的步驟。此外，可使用化學(xué)處理進(jìn)行圖1和3中的轉(zhuǎn)化。例如，可通過水解將烯丙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丙烯酸。其它的化學(xué)處理包括但不限于，將丙烯酸轉(zhuǎn)化為丙烯酸酯的反式酯化作用。
多肽的表達(dá)在此所描述的多肽，諸如圖1中所列出的酶可以在宿主細(xì)胞或組合的宿主細(xì)胞中分別生產(chǎn)。此外，具有特定酶活性的多肽可以是天然存在或非天然存在的多肽。天然存在的多肽是具有在自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列，包括野生型和多態(tài)型多肽的任何多肽。天然存在的多肽可獲自包括但不限于，動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)、植物、真菌和細(xì)菌的任何種屬。非天然存在的多肽是具有未在自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的任何多肽。因此，非天然存在的多肽可以是天然存在的多肽的突變形式或工程化的多肽。例如，具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的非天然存在的多肽可以是具有賴氨酸2，3-氨基變位酶活性，以及至少一些丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的天然存在的多肽的突變體(例如SEQID NO21和/或30)。多肽可以通過例如序列的添加、缺失、置換或其組合來進(jìn)行突變。
本發(fā)明公開了遺傳改變的細(xì)胞，可使用該細(xì)胞實(shí)施在這里所描述途徑中的一個(gè)或多個(gè)步驟或可使用該遺傳改變的細(xì)胞用于后續(xù)的在體外生產(chǎn)所公開的多肽。例如，單獨(dú)的微生物可包含編碼為實(shí)施圖1和3中描述的步驟所必需的每一多肽的外源核酸。這種細(xì)胞可包含許多外源核酸分子。例如，特定的細(xì)胞可包含1、2、3或4種不同的外源核酸分子，其中每種編碼如圖1所示將丙酮酸轉(zhuǎn)化成為3-HP所必需的多肽，或當(dāng)包含編碼為轉(zhuǎn)化烯丙酰-CoA成為3-HP所必需的多肽的外源核酸時(shí)，特定的細(xì)胞可內(nèi)源地生產(chǎn)為轉(zhuǎn)化丙酮酸成為烯丙酰-CoA所必需的多肽。
此外，單個(gè)外源核酸分子可編碼一個(gè)或多于一個(gè)的多肽。例如，單個(gè)外源核酸分子可包含編碼2、3乃至4種不同多肽的序列。進(jìn)一步地，在此所描述的細(xì)胞可包含特定外源核酸分子，例如特定酶的單拷貝或多拷貝(例如，大約5，10，20，35，50，75，100或150個(gè)拷貝)。在此所描述的細(xì)胞可包含多于一個(gè)特定的外源核酸。例如，特定的細(xì)胞可包含大約50個(gè)拷貝的外源核酸分子X和大約75個(gè)拷貝的外源核酸分子Y。
在另一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞可包含編碼具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽(或其保持丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的變體、片段或融合體)的外源核酸分子，例如SEQ ID NO20和/或29。這種細(xì)胞可具有任何可檢測(cè)水平的丙氨酸2，3-氨基變位酶活性，包括通過β-丙氨酸的代謝產(chǎn)物，例如泛酸的產(chǎn)生來檢測(cè)的活性。例如，包含編碼具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽的外源核酸分子的細(xì)胞可具有大于約每克干細(xì)胞重量每小時(shí)形成1μgβ-丙氨酸的比活性的丙氨酸2，3-氨基變位酶活性(例如，大于每克干細(xì)胞重量每小時(shí)形成大約10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，200，250，300，350，400，500或更多μg的β-丙氨酸)?？蛇x擇地，細(xì)胞可具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性以使得來自1×106的細(xì)胞的細(xì)胞抽提物具有大于每毫克總蛋白每分鐘形成大約1ngβ-丙氨酸(例如，大于每毫克總蛋白每分鐘形成大約10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，200，250，300，350，400，500或更多ng的β-丙氨酸)的比活性。
可使用在此所描述的任何方法鑒定和獲得編碼具有酶活性的多肽的核酸分子。例如，編碼具有酶活性的多肽的核酸分子可使用常規(guī)的分子克隆或化學(xué)核酸合成方法和技術(shù)，包括PCR來鑒定和獲得。此外，可使用根據(jù)遺傳密碼將核酸序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列的標(biāo)準(zhǔn)核酸測(cè)序技術(shù)和軟件程序確定特定核酸是否與已知的酶性多肽具有任何序列同源性?？墒褂美鏜EGALIGN(DNASTAR，Madison，WI，1997)的序列比對(duì)軟件比較多種序列。
此外，編碼已知酶性多肽的核酸分子可使用常規(guī)的分子克隆技術(shù)(例如，定位誘變)來突變。可能的突變包括但不限于，缺失、插入和堿基替換以及缺失、插入和堿基替換的組合。進(jìn)一步地，可使用核酸和氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，GenBank)鑒定編碼具有酶活性多肽的核酸序列。簡(jiǎn)而言之，可使用任何與具有酶活性的多肽具有一些同源性的氨基酸序列，或任何與編碼具有酶活性多肽的序列具有一些同源性的核酸序列作為查詢而搜索GenBank。隨后可分析該鑒定的多肽以確定它們是否顯示酶活性。
此外，可使用核酸雜交技術(shù)來鑒定和獲得編碼具有酶活性的多肽的核酸分子。簡(jiǎn)而言之，可使用任何編碼已知的酶性多肽的核酸分子、或其片段作為探針以在中等至高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下通過雜交而鑒定相似的核酸分子。這種相似的核酸分子隨后可被分離、測(cè)序和分析以確定該編碼的多肽是否具有酶活性。
也可使用表達(dá)克隆技術(shù)來鑒定和獲得編碼具有酶活性的多肽的核酸分子。例如，可使用與已知的特定酶性多肽相互作用的底物來篩選包含酶性多肽的噬菌體顯示文庫(kù)。噬菌體顯示文庫(kù)可如所描述的產(chǎn)生(Burritt等人，生物化學(xué)分析Anal.Biochem.2381-13，1990)，或可從的商品供應(yīng)商諸如Novagen(Madison，WI)處獲得。
進(jìn)一步地，可使用多肽測(cè)序技術(shù)鑒定和獲得編碼具有酶活性多肽的核酸分子。例如，可通過凝膠電泳分離純化的多肽，并且通過例如氨基酸微測(cè)序技術(shù)確定其氨基酸序列。一旦確定，可使用該氨基酸序列來設(shè)計(jì)退火的寡核苷酸引物?？墒褂猛嘶鸬墓押塑账嵋锿ㄟ^PCR獲得編碼該多肽的核酸。一旦獲得，該核酸可被測(cè)序、克隆到合適的表達(dá)載體中，并導(dǎo)入微生物中。
可使用任何方法將外源核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞。例如，熱休克、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔、接合作用、原生質(zhì)體的融合和生物傳輸是用于將核酸導(dǎo)入細(xì)菌和酵母細(xì)胞的常規(guī)方法。(參見，例如，Ito等人，J.Bacterol.1531638，1983；Durrens等人，Curr.Genet.187-12，1990；Sambrook等人分子克隆實(shí)驗(yàn)室指手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國(guó)，第二版，1989；和Becker和Guarente，Methods in Enzynology 194182-7，1991)。其它用于從外源核酸分子表達(dá)氨基酸序列的方法包括但不限于，構(gòu)建核酸以使得調(diào)控元件促進(jìn)編碼多肽的核酸序列的表達(dá)。一般地，調(diào)控元件是調(diào)節(jié)其它DNA序列在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的DNA序列。因此，調(diào)控元件包括但不限于，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等?？墒褂萌魏晤愋偷膯?dòng)子從外源核酸分子表達(dá)氨基酸序列。啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于，組成型啟動(dòng)子、組織-特異性的啟動(dòng)子和對(duì)特定刺激(例如，光、氧、化學(xué)濃度)反應(yīng)或無反應(yīng)的啟動(dòng)子。用于將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法也是已知的，例如使用病毒載體。
本發(fā)明的特定細(xì)胞內(nèi)包含的外源核酸分子可以任何形式保持在細(xì)胞內(nèi)部。例如，外源核酸分子可整合到細(xì)胞的基因組中或保持游離狀態(tài)。也就是說，細(xì)胞可以是穩(wěn)定或瞬時(shí)的轉(zhuǎn)染子。微生物可包含單或多拷貝(例如，，大約5，10，20，35，50，75，100或150個(gè)拷貝)的特定外源核酸分子，諸如編碼酶的核酸。
通過宿主細(xì)胞制備有機(jī)酸及相關(guān)的產(chǎn)物可使用在此提供的核酸和氨基酸序列與細(xì)胞一起來生產(chǎn)β-丙氨酸、泛酸和3-HP及其衍生物諸如CoA其，以及有機(jī)化合物諸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、3-HP的酯和聚合的3-HP。這種細(xì)胞可來自于任何種屬，諸如在國(guó)家健康研究所的分類學(xué)網(wǎng)頁(yè)內(nèi)所列出的。該細(xì)胞可以是真核或原核的。例如，遺傳改變的細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，人類、鼠的和牛的細(xì)胞)，植物細(xì)胞(例如，，玉米、小麥、稻和大豆細(xì)胞)，真菌細(xì)胞(例如，曲霉(Aspergillus)和根霉(Rhizopus)細(xì)胞)，酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞(例如，乳桿菌、乳球菌、芽胞桿菌、埃希氏桿菌和梭菌細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞是一種微生物。術(shù)語(yǔ)″微生物″指任何微觀的生物體包括但不限于，細(xì)菌、藻類、真菌和原生動(dòng)物。因此，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、啤酒酵母、Kluveromyces lactis、Candida blankii、皺褶假絲酵母和巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)是微生物并且可如在此所描述的使用。在另一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞是較大的生物體的一部分，諸如植物，諸如轉(zhuǎn)基因植物?？杀皇褂枚搔?丙氨酸制備3-HP、泛酸或其它有機(jī)化合物的植物的實(shí)例包括但不限于遺傳工程化的植物農(nóng)作物諸如玉米、稻、小麥和大豆。
在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞被遺傳改變以使得產(chǎn)生特定的有機(jī)化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞由β-丙氨酸產(chǎn)生3-HP和/或泛酸，諸如圖1和3中所顯示的途徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞產(chǎn)生3-HP和/或泛酸的衍生物，諸如CoA，以及有機(jī)化合物，諸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、3-HP的酯和聚合的3-HP。
在一個(gè)實(shí)例中，被遺傳改變以合成特定有機(jī)化合物的細(xì)胞含有一或多種編碼具有特異酶活性的多肽的外源核酸分子。例如，微生物可包含編碼具有3-羥丙酰基-CoA脫水酶活性的多肽的外源核酸。在該情況下，烯丙酰-CoA可轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生3-HP的3-羥丙酸-CoA?？商峁┙o細(xì)胞一種編碼具有催化化合物產(chǎn)生的酶活性多肽的該細(xì)胞不產(chǎn)生的的外源核酸分子。可選擇地，可供給細(xì)胞編碼具有催化化合物產(chǎn)生的酶活性多肽的該細(xì)胞通常產(chǎn)生的外源核酸分子。在該情況下，遺傳改變的細(xì)胞可生產(chǎn)更多的化合物，或比不具有該遺傳改變的類似細(xì)胞更有效地生產(chǎn)該化合物。
在另一個(gè)實(shí)例中，公開了包含編碼具有導(dǎo)致3-HP、泛酸和/或其衍生物的生成的酶活性多肽的外源核酸分子的細(xì)胞。產(chǎn)生的產(chǎn)物可從該細(xì)胞分泌出來，而不需要破壞細(xì)胞膜來回收該有機(jī)化合物。在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞以至少大約每升100mg的產(chǎn)物濃度(例如，至少大約1g/L、5g/L、10g/L、25g/L、50g/L、75g/L、80g/L、90g/L、100g/L或120g/L)產(chǎn)生3-HP、泛酸和/或其衍生物。當(dāng)確定特定細(xì)胞中諸如3-HP、泛酸和/或其衍生物的化合物的產(chǎn)率時(shí)，可使用任何方法。參見，例如，Applied Environmental Microbiology 59(12)4261-51993)。本發(fā)明內(nèi)容范圍內(nèi)的細(xì)胞可以利用各種碳源。
細(xì)胞可包含一或多種編碼具有導(dǎo)致3-HP、泛酸和/或其衍生物，例如CoA、1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸-酯、3-HP-酯以及包含3-HP的聚合物和共聚物生成的酶活性多肽的外源核酸分子。鑒定包含外源核酸的細(xì)胞的方法是公知的。這種方法包括但不限于，PCR和核酸雜交技術(shù)，例如Northern和Southern分析(參見在此所描述的雜交)。有時(shí)，可使用免疫組織-化學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)通過檢測(cè)由特定核酸分子編碼的多肽的表達(dá)確定細(xì)胞是否包含特定的核酸。例如，可使用對(duì)多肽具有特異性的抗體確定特定細(xì)胞是否包含編碼該多肽的核酸。進(jìn)一步地，可使用生物化學(xué)技術(shù)通過檢測(cè)由于具有酶活性多肽的表達(dá)而產(chǎn)生的有機(jī)產(chǎn)物而確定細(xì)胞是否包含編碼具有酶活性多肽的特定核酸分子。例如，在將編碼具有3-羥丙?；?CoA脫水酶活性多肽的外源核酸導(dǎo)入不正常表達(dá)這種多肽的細(xì)胞后檢測(cè)到3-HP可表明該細(xì)胞不僅包含導(dǎo)入的外源核酸分子而且該導(dǎo)入的外源核酸分子表達(dá)編碼的多肽。用于檢測(cè)存在特異性酶活性或特定有機(jī)產(chǎn)物的方法是公知的，例如，有機(jī)化合物諸如3-HP的存在可通過Sullivan和Clarke(J.ASSOC.Offic.Agr.Chemists，38514-8，1955)所描述的來測(cè)定。
具有減少的多肽活性的細(xì)胞本發(fā)明公開了具有減少的多肽活性的遺傳改變細(xì)胞。在此使用的關(guān)于細(xì)胞和特定多肽的活性的術(shù)語(yǔ)″減少的″或″降低的″是指比在相同種屬的可比較細(xì)胞中所測(cè)量的活性水平要低。例如，如果可比較的微生物具有至少一些酶活性X，則缺乏酶活性X的特定微生物具有減少的酶活性X。
細(xì)胞可具有任意類型減少的多肽活性包括但不限于，酶、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)體、受體、信號(hào)分子等。例如，細(xì)胞可包含破壞具有panD活性多肽的調(diào)控和/或編碼序列的外源核酸分子。破壞panD可以阻止細(xì)胞產(chǎn)生β-丙氨酸。
減少的多肽活性可以是多肽濃度下降，多肽的比活性下降或其組合的結(jié)果。可使用許多不同的方法產(chǎn)生具有減少的多肽活性的細(xì)胞。例如，可使用常規(guī)的誘變或敲除技術(shù)工程化細(xì)胞使其具有被破壞的調(diào)控序列或多肽編碼序列。(Methods in Yeast Genetics(1997版本)，Adams，Gottschling，Kaiser，和Sterns，冷泉港出版社，1998；Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976640-5，2000)?？蛇x擇地，可使用反義技術(shù)減少特定多肽的活性。例如，可工程改造細(xì)胞使其包含編碼反義分子的cDNA從而阻止多肽的翻譯。術(shù)語(yǔ)″反義分子″包括任何包含與內(nèi)源多肽的編碼鏈相應(yīng)的核酸分子或核酸類似物(例如，肽核酸)。反義分子也可具有側(cè)接序列(例如，調(diào)控序列)。因此，反義分子可以是核糖酶或反義的寡核苷酸。核糖酶可具有任何通用結(jié)構(gòu)，包括但不限于，發(fā)夾、錘頭或斧頭狀結(jié)構(gòu)，提供分子切割RNA。進(jìn)一步地，可用基因沉默來減少特定多肽的活性。
可使用任何方法鑒定具有減少的多肽活性的細(xì)胞。例如，可使用在此所描述的酶活分析鑒定具有減少酶活性的細(xì)胞。
經(jīng)體外技術(shù)制備有機(jī)酸及相關(guān)產(chǎn)物可單獨(dú)或與細(xì)胞聯(lián)合使用純化的具有酶活性的多肽來生產(chǎn)泛酸、3-HP和/或其衍生物，諸如CoA，以及有機(jī)化合物諸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、3-HP的酯和聚合的3-HP。例如，可使用包括具有3-羥丙酰基-CoA脫水酶活性的基本上純的多肽的制劑催化3-HP的前體3-HP-CoA的生成。
進(jìn)一步地，可單獨(dú)或與純化的多肽和/或細(xì)胞聯(lián)合使用包含具有酶活性的多肽的無細(xì)胞抽提物以生產(chǎn)泛酸、3-HP和/或其衍生物。例如，可使用包括具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的無細(xì)胞抽提物來由β-丙氨酸形成β-丙氨?；?CoA，同時(shí)可使用包含多肽的微生物生產(chǎn)3-HP，其中該多肽具有催化由β-丙氨?；?CoA形成3-HP所需的反應(yīng)所必需的酶活性。在另一個(gè)實(shí)例中，可使用包括α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸還原酶(E.C.1.1.1.169)，以及泛酸合酶(E.C.6.3.2.1)的無細(xì)胞抽提物從β-丙氨酸形成泛酸?？墒褂萌魏畏椒▉砩a(chǎn)無細(xì)胞抽提物。例如，可使用滲壓休克、超聲處理和/或重復(fù)的凍融循環(huán)，隨后通過過濾和/或離心作用來從完整細(xì)胞生產(chǎn)無細(xì)胞抽提物。
可使用細(xì)胞、純化的多肽，和/或無細(xì)胞抽提物生產(chǎn)3-HP，依次化學(xué)處理來產(chǎn)生另一種化合物。例如，可使用微生物生產(chǎn)3-HP，同時(shí)使用化學(xué)方法將3-HP改變?yōu)檠苌?，諸如聚合的3-HP或3-HP的酯。同樣地，可使用化學(xué)方法利用在此所描述的細(xì)胞、基本上純的多肽和/或無細(xì)胞抽提物生產(chǎn)特定的化合物，該化合物依次被轉(zhuǎn)化為3-HP或其它有機(jī)化合物(例如，1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、3-HP的酯以及聚合的3-HP)。例如，可通過化學(xué)方法生產(chǎn)烯丙酰-CoA，同時(shí)可使用微生物將烯丙酰-CoA轉(zhuǎn)化為3-HP。
類似地，可使用細(xì)胞、純化的多肽和/或無細(xì)胞抽提物生產(chǎn)泛酸，該泛酸依次被化學(xué)處理來生產(chǎn)另一種化合物。例如，可使用微生物生產(chǎn)泛酸，同時(shí)使用化學(xué)方法將泛酸改變?yōu)檠苌?，諸如CoA。同樣地，可使用化學(xué)方法，利用在此所描述的細(xì)胞、基本上純的多肽和/或無細(xì)胞抽提物來產(chǎn)生特定的化合物，該化合物依次被轉(zhuǎn)化為泛酸或其它化合物(例如，CoA)。例如，可使用化學(xué)方法生產(chǎn)泛酸，同時(shí)可使用微生物將泛酸轉(zhuǎn)化為CoA。
細(xì)胞發(fā)酵來生產(chǎn)有機(jī)酸本發(fā)明公開了生產(chǎn)泛酸、3-HP和/或其衍生物的方法，通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞，諸如微生物以生產(chǎn)泛酸、3-HP和/或其衍生物。通常，培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)條件可適合微生物生長(zhǎng)到充足的密度并有效的產(chǎn)生產(chǎn)物。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)的方法，可使用例如在別處所描述的任何方法(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第二版，編輯Demain和Davies，ASM出版社；Principles of Fermentation Technology，Stanbury和Whitaker，Pergamon)。
簡(jiǎn)而言之，包含具有例如葡萄糖碳源的合適培養(yǎng)基的大罐(例如，100加侖、200加侖、500加侖、或以上的罐)被接種特定的微生物。接種后，培養(yǎng)該微生物以允許產(chǎn)生生物量。一旦達(dá)到所需的生物量，可將包含微生物的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入第二個(gè)罐。這第二個(gè)罐可以是任何大小的。例如，第二個(gè)罐可以是比第一個(gè)罐大的、小的，或一樣大小的。通常，第二個(gè)罐比第一個(gè)大，以使得可將另外的培養(yǎng)基加入第一個(gè)罐中的發(fā)酵液。此外，第二個(gè)罐內(nèi)的培養(yǎng)基可與第一個(gè)罐中使用的培養(yǎng)基相同或不同。例如，第一個(gè)罐可以包含具有木糖的培養(yǎng)基，而第二個(gè)罐包含具有葡萄糖的培養(yǎng)基。
一旦轉(zhuǎn)移，可培養(yǎng)該微生物以允許生產(chǎn)泛酸、3-HP和/或其衍生物。一旦生產(chǎn)，可使用任何方法來分離所生成的產(chǎn)物。例如，可使用常規(guī)的分離技術(shù)從發(fā)酵液除去生物量，并且可使用常規(guī)的分離方法(例如，提取、蒸餾和離子交換方法)從無微生物的發(fā)酵液獲得泛酸、3-HP和/或其衍生物?？蛇x擇地，該產(chǎn)物可在當(dāng)它正在生產(chǎn)時(shí)被分離，或它可在該產(chǎn)物的生產(chǎn)階段已經(jīng)被終止后從發(fā)酵液中分離。
從所公開的生物合成途徑產(chǎn)生產(chǎn)物由圖1和3中任何步驟產(chǎn)生的化合物可被化學(xué)轉(zhuǎn)化為其它有機(jī)化合物。例如，3-HP可被加氫來形成有價(jià)值的聚酯單體，1，3-丙二醇。有機(jī)酸諸如3-HP可利用例如用于氫化琥珀酸和/或乳酸的任何方法來進(jìn)行氫化。例如，3-HP可利用金屬催化劑來加氫。在另一個(gè)實(shí)例中，3-HP可被脫水以形成丙烯酸?？墒褂萌魏畏椒ㄟM(jìn)行脫水反應(yīng)。例如，可在存在催化劑(例如，金屬或無機(jī)酸催化劑)時(shí)加熱3-HP以形成丙烯酸。也可利用具有氧化還原酶活性的多肽(例如，酶分類1.1.1.-的酶)在體外或體內(nèi)產(chǎn)生1，3-丙二醇。
在另一個(gè)實(shí)例中，可用泛酸形成輔酶A?？捎镁哂蟹核峒っ?E.C.2.7.1.33)、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶(E.C.6.3.2.5)、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脫羧酶(E.C.4.1.1.36)、ATP4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.7.7.3)，和脫磷酸-CoA激酶(E.C.2.7.1.24)活性的多肽生產(chǎn)輔酶A。
1，3-丙二醇的制備本發(fā)明公開了用于生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法和細(xì)胞。1，3-丙二醇可從3HP-CoA或3-HP來產(chǎn)生?？赏ㄟ^克隆編碼具有氧化還原酶/脫氫酶型活性的酶的基因工程改造產(chǎn)生3-HP-CoA或3-HP的細(xì)胞或微生物來制備1，3-丙二醇。
例如，可在存在具有乙?；㎞AD+)氧化還原酶和醇NAD(+)氧化還原酶活性的酶時(shí)將3-HP-CoA轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。這種轉(zhuǎn)化可在體內(nèi)、體外或其組合來進(jìn)行。這些活性可通過單個(gè)多肽或通過兩種不同的多肽來攜帶。單個(gè)酶包括來自大腸桿菌的多功能醛-乙醇脫氫酶(EC 1.2.1.10)Goodlove等人，Gene 85209-14，1989；GenBank登錄號(hào)No.M33504)。具有乙酰化醛NAD(+)氧化還原酶EC1.2.1.10)或醇NAD(+)氧化還原酶EC 1.1.1.1)的單一活性的酶已經(jīng)被描述。來自大腸桿菌的編碼?；┟摎涿傅幕?GenBank登錄號(hào)No.Y09555)和來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的編碼乙醇脫氫酶的基因(GenBank登錄號(hào)No.M32100)已被分離并測(cè)序。編碼這些酶的基因可通過眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)克隆到生產(chǎn)3-HP-CoA的生物體或細(xì)胞中。這些酶在產(chǎn)生3-HP-CoA的生物體或細(xì)胞中的表達(dá)將賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)化3-HP-CoA為1，3-丙二醇的能力。這些酶對(duì)于3-HPCoA的底物特異性可利用眾所周知的技術(shù)，諸如易錯(cuò)PCR或突變基因大腸桿菌菌株來變化或改進(jìn)。
可通過將3-HP與具有醛脫氫酶(NAD(P)+)(EC 1.2.1.)和乙醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)活性的酶接觸來實(shí)現(xiàn)3-HP到1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)化可在體內(nèi)、體外或其組合來進(jìn)行。例如，在生產(chǎn)3-HP的微生物或細(xì)胞中克隆和表達(dá)這些基因?qū)①x予細(xì)胞或生物體轉(zhuǎn)化3-HP為1，3-丙二醇的能力。這些酶對(duì)于3-HP-CoA的底物特異性可利用如上所述眾所周知的技術(shù)變化改進(jìn)。
利用高效液相色譜法(HPLC)分析發(fā)酵期間或在體外分析中生成的1，3-丙二醇。色譜分離可通過使用Bio-Rad87H離子交換柱實(shí)現(xiàn)。將0.01N硫酸的流動(dòng)相以0.6ml/min的流速通過并且保持柱的溫度為45-65℃。樣品中存在的1，3-丙二醇可使用折光率檢測(cè)器(Skraly等人，Appl.Environ.Microbiol.6498-105，1998)來檢測(cè)。
實(shí)施例1克隆枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶(KAM基因)為了鑒定產(chǎn)生用于丙氨酸的β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基變位酶，對(duì)進(jìn)行相似反應(yīng)但不接受丙氨酸β-丙氨酸作為底物的酶進(jìn)行隨機(jī)突變并隨后進(jìn)行篩選以鑒定具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的突變的酶。本實(shí)施例描述了從枯草芽孢桿菌(SEQ ID NO3和31)克隆賴氨酸2，3-氨基變位酶(E.C.5.4.3.2)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解類似的方法可用于從任何所需的生物體中克隆賴氨酸2，3-氨基變位酶。
選擇枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶是因?yàn)閾?jù)報(bào)道它對(duì)空氣是穩(wěn)定的，因此允許在厭氧和需氧的條件下用于篩選活性。此外，因?yàn)樵撁副冉怂缶馁嚢彼?，3氨基變位酶具有較低的特異活性，可減少超表達(dá)活性賴氨酸2，3-氨基變位酶或丙氨酸2，3-氨基變位酶對(duì)大腸桿菌宿主的有害效應(yīng)。
為了克隆編碼賴氨酸2，3-氨基變位酶的枯草芽孢桿菌KAM基因，使用下列的方法?？莶菅挎邨U菌ATCC 6051從ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA)獲得，使用Genomic Tip 20/G(Qiagen，Valencia，CA)按照制造商推薦的方法制備染色體DNA。通過PCR擴(kuò)增KAM基因的引物是以完整的枯草芽孢桿菌基因組序列(GenBank登記號(hào)NoNC000964)為基礎(chǔ)來設(shè)計(jì)的，而該序列在Chen等人(Biochem.J.348539-49，2000)和美國(guó)專利No.6,248,874中公開。使用PCR引物GCGCGAGGAGGAGTTCATATGAAAAACAAATGGTATAAAC(SEQ ID NO1)，和CGGGCACCGCTTCGAGGCGGCCGCACCATTCGCATG(SEQ IDNO2)，其中加下劃線的核苷酸是用來將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中的NdeI和NotI位點(diǎn)。
PCR反應(yīng)液(總體積100μl)包含0.5μg枯草芽孢桿菌染色體DNA、0.2μM的每種引物(SEQ ID NOS1和2)、10μL10×Pfu Turbo反應(yīng)緩沖液(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)、0.2mM的每種三磷酸核苷酸和5個(gè)單位的Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)。該P(yáng)CR反應(yīng)在95℃加熱2分鐘，然后經(jīng)受95℃ 30秒、58℃ 30秒，72℃ 2分鐘的30個(gè)循環(huán)，隨后在72℃另外保持10分鐘。
所得到的PCR產(chǎn)物通過加入3μl的顆粒染色共沉淀劑(Novagen，Inc.Madison，WI)，100μl 5M的乙酸銨和400μl乙醇沉淀。重懸反應(yīng)液用NdeI和NotI(New England Biolabs，Inc.Beverly，MA)消化，用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化，以及用快速DNA連接試劑盒(Roche Molecμlar Biochemicals，Indianapolis，IN)連接到用相同的酶消化的pET-22b(+)(Novagen)或pPRONde中以分別產(chǎn)生質(zhì)粒pET-KAM1和pPRO-KAM1。質(zhì)粒pPRONde是pPROLar.A122(Clontech Laboratories，Inc.，PaloAlto，CA)的衍生物，其中NdeI位點(diǎn)使用Stratagene的QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖型ㄟ^寡核苷酸-定點(diǎn)誘變構(gòu)建于起始ATG密碼子。這些載體中的賴氨酸2，3-氨基變位酶的表達(dá)受pET22(b)中的T7啟動(dòng)子或pPRO-Nde中的混合lac/ara啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。將連接物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，并通過測(cè)序來驗(yàn)證克隆?？莶菅挎邨U菌KAM基因顯示在SEQ ID NO3(氨基酸序列顯示在SEQ ID NO31中)中，并且如下所述進(jìn)行誘變處理，以鑒定具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的突變體。
實(shí)施例2枯草芽孢桿菌KAM基因的體外誘變?yōu)榱嗽隗w外向枯草芽孢桿菌KAM基因(SEQ ID NO3)中導(dǎo)入突變，使用易錯(cuò)PCR的方法。類似的方法可用于將突變導(dǎo)入任何編碼賴氨酸2，3-氨基變位酶的KAM基因，諸如來自放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)的KAM基因(GenBank登記號(hào)NoRDR02336)，其與枯草芽孢桿菌KAM蛋白序列，近端梭菌(Clostridium subterminale)(GenBank登錄號(hào)NoAF159146)或牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)(不完全基因組，基因組研究機(jī)構(gòu)，參見實(shí)施例5)有52％的同一性。
在一個(gè)方法中，如下使用GeneMorph PCR Mutagenesis試劑盒(Stratagene)。用10、1、0.1或0.01ng的模板pET-KAM1 DNA和125ng的每種T7啟動(dòng)子引物及T7終止子引物(Novagen產(chǎn)品目錄中所給出的序列)按照制造商所推薦的，建立50μl的反應(yīng)物，94℃加熱30秒，經(jīng)受94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 2分鐘的30個(gè)循環(huán)，隨后在72°另外保持10分鐘。
所得到的PCR產(chǎn)物用3μl的顆粒染色共沉淀劑(Novagen)，50μl5M的乙酸銨、200μl乙醇沉淀，用NdeI和NotI重懸、消化，并且將120ng各種誘變的PCR產(chǎn)物用快速DNA連接試劑盒(Roche MolecμlarBiochemicals)連接到用相同的內(nèi)切核酸酶消化的pPRONde中。連接混合物用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI(New England Biolabs)消化以線性化剩余的未插入的載體DNA，如所描述的用乙醇沉淀，并且被轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)的ElectroMax DH10B大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。來自每一文庫(kù)的包含15,000-20,000克隆的卡那霉素-抗性的轉(zhuǎn)化體被從選定的平板上刮下并且使用Plasmid Midi試劑盒(Qiagen)制備誘變的質(zhì)粒文庫(kù)。
在第二個(gè)方法中，基于Xu等人(BioTechniques 271102-8，1999)的Mn-dITP PCR方法，使用pET-KAM1 DNA作為模板和與T7啟動(dòng)子和T7終止子區(qū)域同源的引物進(jìn)行初始輪的錳-誘導(dǎo)的易錯(cuò)PCR。該反應(yīng)混合物(50μL)包含具有2mM MgCl2的1×TaqPCR緩沖液、100ng的DNA、40μM MnCl2、0.2μM的各種引物、200μM的各種dNTP和5個(gè)單位的Taq聚合酶(Roche Molecμlar Biochemicals)。PCR程序包括在94℃下2分鐘的起始變性；94℃ 30秒，54℃ 1分鐘和72℃ 2.25分鐘的20個(gè)循環(huán)；以及72℃ 7分鐘的最終延伸。
以3微升的PCR產(chǎn)物作為使用dITP在擴(kuò)增期間增加錯(cuò)配的第二輪PCR的模板。第二輪PCR混合物(100μL)包含具有2mM MgCl2的1×Taq聚合酶PCR緩沖液、40μM的dITP、0.2μM的各引物、200μM的各種dNTP和10個(gè)單位的TaqDNA聚合酶。PCR程序與用于第一輪的程序相同，但是由30個(gè)循環(huán)組成。PCR產(chǎn)物在1％TAE-瓊脂糖凝膠上分離并使用QIAquick凝膠純化方法(Qiagen)純化。純化的PCR產(chǎn)物用限制酶NdeI和NotI消化并且連接到已經(jīng)用相同的酶消化的pPRO-Nde載體中，凝膠純化，并且用蝦堿性磷酸酶(Roche)去磷酸。連接反應(yīng)使用T4 DNA連接酶(New England BioLabs)于16℃進(jìn)行16小時(shí)，其后加入另外體積的1×連接緩沖液和連接酶，并且該反應(yīng)在室溫下再繼續(xù)2小時(shí)。
用QIAquick PCR純化柱純化連接反應(yīng)液并在30μL的水中洗提。將2微升的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ElectromaxTMDH10BTM(Life Technologies，Inc.)細(xì)胞并且接種到包含25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。對(duì)照連接表明背景水平(沒有插入的載體)小于3％。進(jìn)行重復(fù)的轉(zhuǎn)化以獲得大約40,000個(gè)克隆。從平板上刮下克隆并使用Qiagen MiniSpin質(zhì)粒方法來制備質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA用乙酸銨和乙醇沉淀以提高它在轉(zhuǎn)化入所篩選的宿主前的濃度。質(zhì)粒DNA也從單個(gè)克隆中分離并測(cè)序以獲得估計(jì)的突變率。該方法的平均突變率是1.3個(gè)改變的核苷酸/Kb。
在第三個(gè)方法中，基于Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl.228-33，1992)的方法進(jìn)行誘變PCR。該方法使用包含21.2mM MgCl2、2.0mM MnCl2、3.2mM dTTP和3.2mM dCTP的誘變緩沖液的多種稀釋液。除具有1.5mM的MgCl2的1×Taq PCR緩沖液、0.25μM的各個(gè)引物、200μM的各個(gè)dNTP、50ng的pET-KAM1模板DNA和10個(gè)單位的Taq DNA聚合酶(Roche)外，加入下列體積的誘變緩沖液以分離PCR反應(yīng)物(每個(gè)的終體積為100μL)0、1.56、3.13、6.25、12.5和25μL。PCR程序包括94℃ 2分鐘的起始變性；94℃ 30秒，54℃ 1分鐘和72℃ 2.25分鐘的30個(gè)循環(huán)；和72℃ 7分鐘的最終延伸。
PCR后，通過加入EDTA至終濃度為5mM、SDS至0.5％和蛋白酶K至50μg/mL處理反應(yīng)物以除去Taq聚合酶(MatsμMura和Ellington，PCR Mutagenic PCR of Protein-Coding Genes for In Vitro Evolution.Methods in Molecμlar Biology.，Vol 182In Vitro Mutagenesis，2nded.Ed.J.Braman Hamana.Press Inc.Totowa，NJ，2001)。將反應(yīng)物加熱至65℃ 15分鐘并且如上所述用凝膠純化。第一個(gè)四步處理產(chǎn)生了充足的克隆的PCR產(chǎn)物。消化PCR產(chǎn)物，連接入pPRO-Nde并且轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ElectromaxTMDH10BTM細(xì)胞中。從單個(gè)克隆中分離質(zhì)粒DNA并測(cè)序以獲得估計(jì)的突變率。1-4處理的平均突變率在0-0.47％間變化(每Kb0-4.7個(gè)改變的核苷酸)。進(jìn)行重復(fù)轉(zhuǎn)化以獲得所選處理的大約50,000個(gè)克隆。從平板上刮下克隆并使用Qiagen MiniSpin質(zhì)粒方法制備質(zhì)粒DNA。用乙酸銨和乙醇沉淀質(zhì)粒DNA以增加它在轉(zhuǎn)化入所篩選的宿主前的濃度。
實(shí)施例3枯草芽孢桿菌KAM基因的體內(nèi)誘變?yōu)榱嗽隗w內(nèi)將突變導(dǎo)入枯草芽孢桿菌KAM基因(SEQ ID NO3)，將pPRO-KAM1傳遞到大腸桿菌XL1 Red(Stratagene)突變菌株中。將大約50ng的質(zhì)粒pPRO-KAM1按照制造商的指導(dǎo)轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的XL1-Red細(xì)胞并且將轉(zhuǎn)化體接種到包含25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。隨機(jī)選擇大約200個(gè)轉(zhuǎn)化體，從轉(zhuǎn)化平板上刮下并接種到2份包含25μg/ml卡那霉素的5ml LB肉湯中。一份在30℃，另一份在37℃生長(zhǎng)過夜。
將各份的一小等分樣品接種到包含25μg/ml卡那霉素的新鮮LB肉湯中，同時(shí)從1.5ml各個(gè)培養(yǎng)物中使用QiaSpin Mini試劑盒(Qiagen)提取誘變處理的質(zhì)粒DNA。過夜生長(zhǎng)和質(zhì)粒DNA提取被重復(fù)2次或更多次，從兩種不同的溫度和增加暴露于突變菌株的3個(gè)循環(huán)而產(chǎn)生誘變處理的質(zhì)粒文庫(kù)。質(zhì)粒DNAs在轉(zhuǎn)化入所選擇的菌株之前，通過乙醇沉淀進(jìn)行濃縮。
實(shí)施例4大腸桿菌ΔpanD∷CAT菌株的構(gòu)建為了鑒定編碼可實(shí)現(xiàn)丙氨酸2，3-氨基變位酶反應(yīng)的多肽的基因，需要有效的篩選或選擇所需的活性。因此，通過識(shí)別使用β-丙氨酸合成依次為輔酶A(CoA)和?；d體蛋白(ACP)的成分的泛酸的大腸桿菌而改進(jìn)了篩選方法。CoA和ACP是活生物機(jī)體中主要的?；d體，并且對(duì)生長(zhǎng)是必不可少的。
在大腸桿菌中，β-丙氨酸的主要途徑來自于由panD基因編碼的天冬氨酸脫羧酶(E.C.4.1.1.11)催化的反應(yīng)中的天冬氨酸(圖3)。panD的功能性缺失突變導(dǎo)致β-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷以及生長(zhǎng)抑制，這可通過加入外源的泛酸或β-丙氨酸，或通過從另外的來源生產(chǎn)β-丙氨酸來緩解。
兩個(gè)大腸桿菌菌株被用于在β-丙氨酸合成中兩者都缺乏的篩選。菌株DV1(#6865，大腸桿菌遺傳原種中心，New Haven CT；Vallari和Rock，J.Bacteriol 164136-42，1985)是通過化學(xué)物誘變作用制備的，panF和panD兩個(gè)基因都變得無功能的宿主(染色體)突變的大腸桿菌突變體。panF基因編碼從培養(yǎng)基對(duì)泛酸的攝取，因此panD和panF的組合為用于生長(zhǎng)的β-丙氨酸提供了更嚴(yán)格的必要條件。因此，盡管DV1菌株是已知的，其用于選擇具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞的用途以前并非已知的。
另一個(gè)選擇的菌株，BW25113ΔpanD∷CAT，包括panD基因座的缺失，以阻止能夠在無外源的β-丙氨酸時(shí)panD突變的回復(fù)突變。這些通過CAT基因進(jìn)入panD基因座而具有被賦予氯霉素抗性標(biāo)記的插入物的菌株，被通過Datsenko和Wanner(Proc.Natl.ACAD.Sci.美國(guó)976640-5，2000)的基因失活方法，使用大腸桿菌遺傳原種中心的大腸桿菌菌株BW25113/pKD46和BW25141/pKD3來構(gòu)建。
pKD3的CAT基因被使用引物TATCAATTCGTTACAGGCGATACATGGCACGCTTCGGCGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO4)和GATGTCGCGGCTGGTGAGTAACCAGCCGCAGGGATAACAACATATGAATATCCTCCTTAG(SEQ ID NO5)進(jìn)行擴(kuò)增，其中加下劃線的序列分別對(duì)應(yīng)于大腸桿菌染色體中緊接panD基因座上游和下游的區(qū)域，而非加下劃線的區(qū)域是pKD3中允許擴(kuò)增包含基因的片段的同源區(qū)域。PCR反應(yīng)液包括在300μl終體積中的30μl 10×濃縮的PCR緩沖液(Roche Molecμlar Biochemicals)、質(zhì)粒pKD3、0.2mM的各種dNTP、0.2μM的每種引物和15個(gè)單位的Taq聚合酶(Roche Molecμlar Biochemicals)。PCR反應(yīng)在95℃溫育30秒，然后是95℃ 30秒，45℃ 30秒，72℃ 1分鐘的30個(gè)循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀，用DpnI消化，用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化，并轉(zhuǎn)化入表達(dá)重組功能的BW 25113/pKD46中。將轉(zhuǎn)化體接種到包含25μg/ml氯霉素和5μM β-丙氨酸的LB平板上。
通過補(bǔ)充有5μM β-丙氨酸的非選擇性LB培養(yǎng)基，于43℃單克隆純化氯霉素-抗性的轉(zhuǎn)化體，并且檢驗(yàn)單克隆氯霉素抗性的保持狀況、氨芐青霉素抗性的損失(表明pKD46的消除)以及在M9-葡萄糖基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所需要的β-丙氨酸。CAT基因正確插入panD基因座的證實(shí)是通過使用側(cè)接于插入位點(diǎn)的引物(TTACCGAGCAGCGTTCAGAG，SEQ ID NO6和CACCTGGCGGTGACAACCAT，SEQ ID NO7)產(chǎn)生的ΔpanD∷CAT菌株的克隆PCR來進(jìn)行的。當(dāng)預(yù)期野生型panD基因座產(chǎn)生713個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物，ΔpanD∷CAT構(gòu)建體產(chǎn)生1215個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。如上所述(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)976640-5，2000)構(gòu)建ΔpanD∷CAT菌株的衍生物，其中插入的CAT基因通過由質(zhì)粒pCP20編碼的FLP重組酶的活性而除去。這些菌株稱為ΔpanD。
β-丙氨酸的第二途徑存在于基于尿嘧啶代謝的還原途徑的大腸桿菌中(West，Can.J.Microbiol.441106-9，1998，圖2)。在該途徑中，尿嘧啶通過酶二氫嘧啶脫氫酶(E.C.1.3.1.2)還原成二氫尿嘧啶。然后二氫尿嘧啶通過二氫嘧啶酶(E.C.3.5.2.2)轉(zhuǎn)化為N-氨甲酰基-β-丙氨酸，它依次通過N-氨甲?；?β-丙氨酸氨基水解酶(E.C.3.5.1.6)水解為β-丙氨酸、CO2和NH3。為了防止通過該途徑形成β-丙氨酸，將編碼二氫嘧啶脫氫酶的基因，yeiA(GenBank登記號(hào)No.AAC75208)通過如上所述的Datsenko和Wanner的方法插入缺失。pKD3的CAT基因使用引物GCGGCGTGAAGTTTCCCAACCCGTTCTGCCTCTCTTCTTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO8)，和TTACAACGTTACCGGGTGTTCTTTCTCGCCTTTCTTAAACCATATGAATATCCTCCTTAG(SEQ ID NO9)擴(kuò)增，其中加下劃線的序列分別對(duì)應(yīng)于大腸桿菌染色體緊接yeiA基因座上游和下游的區(qū)域，而不加下劃線的序列是與pKD3中允許包含CAT基因的片段的擴(kuò)增的區(qū)域同源的。如上所述分離氯霉素-抗性的插入突變體，并且將抗性標(biāo)記轉(zhuǎn)導(dǎo)入ΔpanD菌株以產(chǎn)生雙重突變的ΔpanD/ΔyeiA∷CAT。
產(chǎn)生大腸桿菌BW 25115ΔpanD∷CAT、ΔpanD或ΔpanD/ΔveiA∷CAT的電感受態(tài)細(xì)胞并且用作轉(zhuǎn)化如實(shí)施例6中所述的突變賴氨酸2，3-氨基變位酶DNAs文庫(kù)的宿主。
實(shí)施例5牙齦卟啉單胞菌KAM基因的克隆和體外誘變通過從基因組DNA PCR擴(kuò)增來自牙齦卟啉單胞菌的賴氨酸2，3氨基變位酶基因并克隆到載體pET22B(Novagen)的NdeI和NotI位點(diǎn)。誘變PCR是通過Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl.228-33，1992)的方法，使用用于擴(kuò)增的T7啟動(dòng)子和T7終止子引物和每100μl反應(yīng)物中6.25μl或9.38μl的誘變緩沖液來進(jìn)行的。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化(Qiagen)并隨后用NdeI和NotI消化。消化的PCR產(chǎn)物被連接到pPRONde載體中并如實(shí)施例2中所述轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ElectromaxTMDH10BTM。進(jìn)行重復(fù)的轉(zhuǎn)化以獲得每個(gè)突變處理至少60,000個(gè)克隆。從平板上刮下克隆并制備和沉淀質(zhì)粒DNA以提高它的濃度。所得到的文庫(kù)具有0.3％和0.35％的突變率。
實(shí)施例6具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的克隆的鑒定將上述實(shí)施例2中產(chǎn)生的誘變處理的賴氨酸2，3-氨基變位酶質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)的大腸桿菌菌株DV1細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化體接種到包含25μg/ml卡那霉素的適當(dāng)稀釋的LB中以獲得總轉(zhuǎn)化體的估計(jì)值，并接種到補(bǔ)充有0.4％葡萄糖、0.2％維生素測(cè)定酪蛋白氨基酸(DIFCO/Becton Dickinson，Sparks，MD)和25μg/ml卡那霉素(Sigma，St.Louis，MO)的M9基本培養(yǎng)基中。為進(jìn)行一些篩選，加入IPTG至0.25mM。
將實(shí)施例4中所述的大腸桿菌的ΔpanD∷CAT菌株用實(shí)施例2，3和5中產(chǎn)生的文庫(kù)以類似的方式轉(zhuǎn)化，除了將轉(zhuǎn)化體接種到補(bǔ)充有0.4％葡萄糖和25μg/ml卡那霉素(Sigma，St.Louis，MO)的M9基本培養(yǎng)基中。為篩選枯草芽孢桿菌文庫(kù)，加入IPTG至0.25mM，加入Fe2(NH4)2SO4至50μM并加入氯霉素至25μg/ml。文進(jìn)行篩選牙齦卟啉單胞菌庫(kù)，IPTG加入至50μM，F(xiàn)e2(NH4)2SO4加入至50μM，氯霉素加入至25μg/ml，L-丙氨酸加入至1mg/ml并且L-賴氨酸加入至2mg/ml。
通過在添加25μg/ml卡那霉素的LB上生長(zhǎng)的克隆數(shù)目測(cè)定，在基本培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的相對(duì)于轉(zhuǎn)化子總數(shù)大約為1×10-4頻率的轉(zhuǎn)化子。使用Qiagen Miniprep試劑盒從生長(zhǎng)于基本培養(yǎng)基上的克隆制備質(zhì)粒DNA并將其再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的ΔpanD∷CAT菌株以證實(shí)能夠在缺乏β-丙氨酸的情況下生長(zhǎng)的能力是通過質(zhì)粒攜帶的功能而被賦予的。從再轉(zhuǎn)化的克隆制備質(zhì)粒DNA并對(duì)kam基因測(cè)序以決定相對(duì)于野生型枯草芽孢桿菌或牙齦卟啉單胞菌kam基因序列的任何變化。
編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的突變的枯草芽孢桿菌kam基因序列顯示在SEQ ID NO20中并且相應(yīng)的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO21中。攜帶這些序列的質(zhì)粒被稱為pLC4-7LC1。同野生型枯草芽孢桿菌kam基因序列(圖4)相比，在突變的序列中觀察到3種氨基酸變化。在丙氨酸2，3-氨基變位酶蛋白中有L103M取代、M136V取代和D339H取代(其中第一氨基酸是野生型序列，數(shù)字是氨基酸的位置，而第二氨基酸是在丙氨酸2，3-氨基變位酶序列中觀察到的序列)。FeS簇-結(jié)合基序(SEQ ID NO21的氨基酸134-146)和推定的PLP-結(jié)合基序(SEQ ID NO21的氨基酸288-293)也顯示在圖4中。這是丙氨酸2，3-氨基變位酶核酸和氨基酸序列的第一個(gè)示證。編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的突變的牙齦卟啉單胞菌kam基因序列顯示在SEQ ID NO29中并且相應(yīng)的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO 30中。同野生型牙齦卟啉單胞菌序列(圖5)相比，在突變的序列中觀察到5種氨基酸變化。在丙氨酸2，3-氨基變位酶蛋白中有N19Y取代、L53P取代、H85Q取代、D331G取代和M342T取代。然而，可能并非所有的這些突變是具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性所必需的。在枯草芽孢桿菌和牙齦卟啉單胞菌突變蛋白的序列比對(duì)中，牙齦卟啉單胞菌D331G取代位于與枯草芽孢桿菌D339H取代一致的蛋白內(nèi)部的位置(圖6)，此表明可能是特別重要的。FeS簇-結(jié)合基序(SEQ ID NO30的氨基酸126-138)和推定的PLP-結(jié)合基序(SEQ ID NO30的氨基酸280-285)也顯示在圖5中。這是丙氨酸2，3-氨基變位酶核酸和氨基酸序列的另一個(gè)示證。
突變的kam基因能夠?qū)ⅵ?丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸并因此允許產(chǎn)生泛酸的能力，是通過將ΔpanD轉(zhuǎn)化體在包含泛酸的基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)與在缺乏泛酸的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)相比較的液體生長(zhǎng)測(cè)試來確定的。起始接種物包括來自生長(zhǎng)培養(yǎng)物的洗滌細(xì)胞或從平板刮下的細(xì)胞。
作為使用洗滌的細(xì)胞作為接種物的實(shí)例，3-5mL培養(yǎng)物由單克隆開始并在添加40μg/ml卡那霉素的LB肉湯中于30℃生長(zhǎng)過夜。讀取培養(yǎng)物的OD600并通過離心收獲每種培養(yǎng)物的等量數(shù)目的細(xì)胞(大約600總的OD×μl，例如OD4.0×150μl)。細(xì)胞用0.85％的NACl洗滌兩次，重懸于200μl 0.85％的NaCl中，并使用30μl在直徑為13mm的玻璃試管中以大約0.05的起始OD600接種于3ml的基于M9的基本培養(yǎng)基中(6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、2mM MgSO4、4g/L葡萄糖、1mM CaCl2、250μM IPTG、40μg/ml卡那霉素、50μM Fe(NH4)2(SO4)2)。對(duì)照培養(yǎng)物包含補(bǔ)充有20μM泛酸的基本培養(yǎng)基或有40μg/ml卡那霉素的LB肉湯。培養(yǎng)物于37℃不搖動(dòng)生長(zhǎng)大約18小時(shí)并測(cè)量OD600。
如表1中所示，盡管攜帶載體對(duì)照的細(xì)胞在不加有泛酸或β-丙氨酸的基本培養(yǎng)基中使用殘余保存的泛酸或β-丙氨酸生長(zhǎng)至0.21的平均OD600(存在泛酸時(shí)所獲得OD600的大約30％)，攜帶2，3-氨基變位酶克隆的細(xì)胞生長(zhǎng)至0.50的平均OD600，是存在泛酸時(shí)所獲得的大約90％。添加Fe2+沒有增加載體對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是允許丙氨酸2，3-氨基變位酶-耐受細(xì)胞獲得與存在泛酸或在富含LB肉湯培養(yǎng)基中所獲得的相等的生長(zhǎng)密度。這表明丙氨酸2，3-氨基變位酶基因提供了補(bǔ)充panD突變的β-丙氨酸的來源。
表1生長(zhǎng)測(cè)試


作為使用平板培養(yǎng)物作為接種物的實(shí)例，從平板刮下克隆并重懸于50μl缺乏泛酸的基本培養(yǎng)基中。使用重懸浮液(20μl)接種在1.5mL微試管中的1mL基本培養(yǎng)基而使用20μl接種入補(bǔ)充有泛酸的1mL基本培養(yǎng)基中。后者的培養(yǎng)物作為接種物加入的變化數(shù)量的對(duì)照。無泛酸生長(zhǎng)的培養(yǎng)物的反應(yīng)可以表示為在缺乏泛酸的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)與在包含泛酸的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)的比率。培養(yǎng)物于25-37℃無搖動(dòng)生長(zhǎng)1-3天并測(cè)量OD600。通過填充試管至更大的程度來獲得更多厭氧生長(zhǎng)的測(cè)試。這在牙齦卟啉單胞菌突變體的測(cè)試中是有用的。
表2刮下的克隆/半?yún)捬醯臏y(cè)試。

Pg aam＝具有攜帶突變的牙齦卟啉單胞菌kam基因的質(zhì)粒和丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞Bs aam＝具有攜帶突變的枯草芽孢桿菌kam基因的質(zhì)粒和丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞
Pg kam＝具有攜帶野生型牙齦卟啉單胞菌kam基因的質(zhì)粒的細(xì)胞實(shí)施例7枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶中個(gè)體突變的產(chǎn)生在上述實(shí)施例5的野生型枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶基因中鑒定的突變是在野生型枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶基因(SEQ ID NO3)中使用Stratagene QuikChangeTMSite-Directed試劑盒單獨(dú)構(gòu)建的。用于產(chǎn)生L103M突變的寡聚核苷酸是CACAAAACAAAATACGATATGGAAGACCCGCTCCATGAGGATGAAGATTCA(SEQ ID NO10)，和TGAATCTTCATCCTCATGGAGCGGGTCTTCCATATCGTATTTTGTTTTGTG(SEQ ID NO11)。
用于產(chǎn)生M136V突變的寡核苷酸是GAATCAATGTTCCGTATACTGCCGCTAC(SEQ ID NO12)，和GTAGCGGCAGTATACGGAACATTGATTC(SEQ ID NO13)。
用于產(chǎn)生D339H突變的寡聚核苷酸是GTTCCTACCTTTGTTGTACACGCACCAGGCG(SEQ ID NO14)，和CGCCTGGTGCGTGTACAACAAAGGTAGGAAC(SEQ ID NO15)。
使用實(shí)施例6中描述的液體生長(zhǎng)測(cè)試，具有單獨(dú)攜帶L103M突變的質(zhì)粒的細(xì)胞能夠在沒有添加泛酸或β-丙氨酸的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然而與具有pLC4-7LC1質(zhì)粒的細(xì)胞程度不同，單獨(dú)攜帶M136V或D339H突變的細(xì)胞具有宿主的ΔpanD表型。在野生型枯草芽孢桿菌kam序列中L103M突變與M136V和D339H突變的組合產(chǎn)生與pLC4-7LC1相同的，賦予在缺乏β-丙氨酸或泛酸中生長(zhǎng)的能力的基因，證實(shí)這3個(gè)突變或其亞組合對(duì)于賦予丙氨酸2，3-氨基變位酶活性是充分的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解在這些位置可產(chǎn)生可選擇的取代。因此使用與SEQ ID NOS10和11相似的，且其中相應(yīng)于L103的密碼子是隨機(jī)的寡核苷酸，可獲得具有L103K、L103R、L103E和L103S取代的賦予ΔpanD菌株能在缺乏β-丙氨酸或泛酸時(shí)生長(zhǎng)的能力的突變體。進(jìn)一步地，使用與SEQ ID NO14和15相似的，其中相應(yīng)于D339的密碼子是隨機(jī)的寡核苷酸，獲得具有D339Q、D339T、D339N取代的賦予ΔpanD菌株能在缺乏β-丙氨酸或泛酸時(shí)生長(zhǎng)的能力的突變體。
實(shí)施例8不使用誘變處理的賴氨酸2，3-氨基變位酶對(duì)丙氨酸2，3-氨基變位酶活性進(jìn)行的篩選鑒定具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞的可選擇的方法是將如上所述的諸如DV1或ΔpanD∷CAT細(xì)胞接種到如上所述的培養(yǎng)基中，而不用誘變處理的賴氨酸2，3-氨基變位酶庫(kù)轉(zhuǎn)染它們。如上所述篩選這種細(xì)胞，并如實(shí)施例6和9中所描述的驗(yàn)證丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的存在。
細(xì)胞可在接種前誘變處理，例如通過將細(xì)胞暴露于紫外線照射或化學(xué)制品(例如MES)。這允許分離具有在一或多個(gè)導(dǎo)致細(xì)胞具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的其它基因中的突變。
可選擇地，細(xì)胞在接種前可以是未改變的(例如未轉(zhuǎn)化的，未誘變處理的)。該方法允許分離自然發(fā)生的具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的菌株。
實(shí)施例9丙氨酸2，3-氨基變位酶的證明檢驗(yàn)通過上述篩選法獲得的細(xì)胞的丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。對(duì)于用誘變處理的庫(kù)(實(shí)施例2，3和5)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而言，使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法從所選擇的宿主分離質(zhì)粒。將所得到的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化到所選擇的宿主中，再分離質(zhì)粒，并且如實(shí)施例中所述對(duì)所得到的克隆進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(實(shí)施例8)，使用例如鳥槍法克隆賦予丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的基因。
可使用一些測(cè)定方法檢測(cè)丙氨酸2，3-氨基變位酶活性，諸如由[3-13C]丙氨酸經(jīng)過[3-13C]β-丙氨酸測(cè)定[13C]輔酶A的生物合成，通過使用測(cè)量轉(zhuǎn)化α-丙氨酸到β-丙氨酸的的酶活測(cè)定，或測(cè)量攜帶丙氨酸2，3-氨基變位酶的細(xì)胞獲細(xì)胞提取物中β-丙氨酸的存在進(jìn)行的測(cè)定。
從[3-13C]α-丙氨酸經(jīng)過[3-13C]β-丙氨酸進(jìn)行[13C]輔酶A的生物合成其基因產(chǎn)物(天冬氨酸1-脫羧酶)催化從天冬氨酸生產(chǎn)β-丙氨酸的ΔpanD基因的插入缺失，導(dǎo)致泛酸的缺乏并由此不能生產(chǎn)輔酶A。然而，具有丙氨酸2，3-氨基變位酶而能夠由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸的ΔpanD細(xì)胞能夠繞過這種缺乏；尤其是，當(dāng)這些細(xì)胞在存在[3-13C]α-丙氨酸生長(zhǎng)時(shí)，可將[13C]標(biāo)記摻入輔酶A。此測(cè)試證實(shí)在實(shí)施例6中分離的枯草芽孢桿菌丙氨酸2，3-氨基變位酶序列(SEQ ID NOS20和21)可催化α-丙氨酸到β-丙氨酸的轉(zhuǎn)化。
用pPRONde、pPRO-KAM1或pLC4-7LC1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌ΔpanD/ΔyeiA∷CAT細(xì)胞在除25μg/ml卡那霉素和10μM Fe(NH4)2(SO4)2和1mM丙氨酸(未標(biāo)記的)和10μMβ-丙氨酸之外的基本培養(yǎng)基中(實(shí)施例6)于37℃生長(zhǎng)過夜。將該培養(yǎng)物在具有25μg/ml卡那霉素、10μM Fe(NH4)2(SO4)2和11mM[3-13C]α-丙氨酸(99％，劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室，Andover，MA)但是沒有未標(biāo)記的α-丙氨酸或β-丙氨酸的基本培養(yǎng)基稀釋100倍。30℃生長(zhǎng)大約20小時(shí)后，通過離心回收細(xì)胞并通過Jaskowski和Rock(細(xì)菌學(xué)雜志J.Bacteriol.148926-32，1981)的方法產(chǎn)生提取物，在存在10mM二硫蘇糖醇時(shí)將輔酶A的硫酯轉(zhuǎn)化為自由巰基的形式。
該提取物使用包括具有串聯(lián)于色譜儀和三重四極質(zhì)譜儀系列之間的Waters996光電二級(jí)管陣列(PDA)吸光率監(jiān)測(cè)器的Waters2690液相色譜儀Micromass Ultima LC/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。使用4.6×150mm的YMC ODS-AQ(3μM粒子，120_孔)反相分配色譜法柱在室溫下產(chǎn)生LC分離。使用包含0.5％(v/v)乙酸的含水的25mM乙酸銨(BufferA)和包含0.5％(v/v)乙酸的乙腈(BufferB)進(jìn)行分析物的梯度洗脫。該洗提在等濃度10％B中0-10分鐘，然后在線性10％B到100％B中10-12分鐘。流速是0.250mL/min，并且調(diào)控光電二極管陣列的UV吸光率從200nm到400nm。該電噴射MS系統(tǒng)的所有參數(shù)是最優(yōu)化的，并且基于產(chǎn)生目的分析物的質(zhì)子化分子離子([M+H]+)和生產(chǎn)特征性片段離子來進(jìn)行選擇。使用下列儀器參數(shù)進(jìn)行輔酶A的陽(yáng)離子方式的ESI-MS檢測(cè)毛細(xì)管4.0V；錐體80V；六邊形1∶25V；孔0V；六邊形2∶0V；輻射源溫度100℃；脫溶溫度350℃；脫溶氣體500L/h；錐體氣體40L/h；低質(zhì)分辨率15.0；高質(zhì)分辨率15.0；離子能量0；倍增650。報(bào)道質(zhì)量/電荷比率(m/z)和分子質(zhì)量的測(cè)不準(zhǔn)性是0.01％。m/z 769([13C]輔酶A)的峰面積與m/z 768(未標(biāo)記的輔酶A)的比率顯示在表3中。
表3[13C]輔酶A的生物合成

表3中顯示的結(jié)果證實(shí)具有攜帶丙氨酸2，3-氨基變位酶活性(SEQID NOS20和21)突變的質(zhì)粒的細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)于[13C]α-丙氨酸中時(shí)，與正常豐度的[13C]輔酶A或具有載體或野生型枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶基因的細(xì)胞相比產(chǎn)生更高的[13C]輔酶A比[12C]輔酶A的比率。這證明丙氨酸2，3-氨基變位酶序列可產(chǎn)生在輔酶A生物合成中必需的中間產(chǎn)物，β-丙氨酸。
酶測(cè)定測(cè)定α-丙氨酸到β-丙氨酸的轉(zhuǎn)化或測(cè)定β-丙氨酸存在來確定細(xì)胞是否具有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。例如，可應(yīng)用Chen等人(生物化學(xué)雜志Biochem.J.348539-49，2000)描述的確定賴氨酸2，3-氨基變位酶活性的方法通過與還原性預(yù)溫育的酶或細(xì)胞抽提物溫育，取代L-[U-13C]丙氨酸為L(zhǎng)-[U-13C]賴氨酸，以及通過紙電泳分離放射性的α-丙氨酸和β-丙氨酸，隨后分別閃爍計(jì)數(shù)相當(dāng)于α-丙氨酸和β-丙氨酸的斑點(diǎn)，從而確定丙氨酸2，3-氨基變位酶活性?？蛇x擇地，純化的和還原性預(yù)溫育的丙氨酸2，3-氨基變位酶可以與α-丙氨酸溫育，并且該反應(yīng)混合物通過高效液相色譜法分離來從α-丙氨酸分離產(chǎn)物β-丙氨酸，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析(Abe等人，J.Chromatography B，71243-9，1998)。
也可在大腸桿菌ΔpanDCAT菌株的完全細(xì)胞中監(jiān)測(cè)由α-丙氨酸形成β-丙氨酸，通過將細(xì)胞在包含0.4％(w/v)葡萄糖、25μg/ml卡那霉素(賦予卡那霉素抗性的質(zhì)粒)、0.25mM IPTG和1mg/ml[13C]-標(biāo)記的α-丙氨酸的M9基本培養(yǎng)基中(Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)Molecμlar CloningAlaboratory Manual，冷泉港，紐約，1989)培養(yǎng)，并用表達(dá)丙氨酸2，3-氨基變位酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，提取該細(xì)胞并通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的高效液相色譜/質(zhì)譜方法檢測(cè)[13C]-β丙氨酸。
實(shí)施例10來自β-丙氨酸用于3-HP生產(chǎn)的合成操縱子產(chǎn)生允許經(jīng)過β-丙氨酸產(chǎn)生3-HP的生物合成途徑(圖.1)。從β-丙氨酸到3-HP的一種途徑包括利用具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，即來自將CoA基團(tuán)從一種代謝物傳遞到另一種的酶類的酶。如圖1所示，β-丙氨酸可使用具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽和例如乙酰-CoA或丙酰-CoA的CoA供體而被轉(zhuǎn)化為β-丙氨?；?CoA?？蛇x擇地，β-丙氨酰基-CoA可以在具有CoA合成酶活性的多肽的作用下產(chǎn)生。β-丙氨?；?CoA可通過具有β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性的多肽被去氨基以形成丙烯酰-CoA?？赏ㄟ^具有3-HP-CoA脫水酶活性的多肽進(jìn)行丙烯酰基-CoA在β位置的水合作用來產(chǎn)生3-HP-CoA。3-HP-CoA可以作為用于β-丙氨酸的CoA供體，該反應(yīng)可用具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽催化來產(chǎn)生3-HP產(chǎn)物。可選擇地，3-HP-CoA可通過具有特異的CoA水解酶活性的多肽水解產(chǎn)生3-HP。
這些途徑使用如WO02/42418(在此引入作為參考)中或下列所述克隆和表達(dá)的一些酶。使用埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)細(xì)胞(ATCC 17753)、橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurantiacus)細(xì)胞(ATCC 29365)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)(ATCC 25522)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(ATCC 824)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 17933)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(ATCC 23857)、糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC 25094)，和大鼠cDNA(Clontech，Palo Alto，CA)作為DNA的來源。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可使用類似的方法從任何生物體獲得這些酶的序列。
在操縱子的構(gòu)建前，克隆、表達(dá)和分析單獨(dú)的基因。將用于在大腸桿菌中生產(chǎn)3-HP的合成操縱子克隆到位于T7啟動(dòng)子(Novagen)控制下的pET-11a(5.7kb)表達(dá)載體中，具有l(wèi)ac/ara-1啟動(dòng)子(Clontech，Palo Alto，CA)的pPROLar.A(2.6kb)載體中，以及具有trc啟動(dòng)子(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)的pTrc99A(4.2kb)載體中。一些具有不同組合的相關(guān)基因的操縱子產(chǎn)生如下。對(duì)于丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶和丙烯酰-CoA水合酶(或3-HP脫水酶)的分析描述在WO02/42418(在此引入作為參考)中。
來自糞產(chǎn)堿菌M3A的3-HP脫氫酶基因的分離糞產(chǎn)堿菌(ATCC #700596)是經(jīng)3-HP代謝丙烯酸酯的鹽堿細(xì)菌。由丙烯酸酯產(chǎn)生的3-HP可通過3-HP脫氫酶轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛。為了分離編碼這些脫氫酶的基因，如下分離糞產(chǎn)堿菌基因組DNA。5mL的糞產(chǎn)堿菌培養(yǎng)物在胰胨豆胨培養(yǎng)液中于37℃生長(zhǎng)，然后將收獲的細(xì)胞重懸于400mL TE緩沖液中。隨后將20mL的10％SDS、100μl 10mg/ml的蛋白酶K和10mL 100mg/ml溶菌酶加入細(xì)胞懸液并將混合物在42℃與臨時(shí)混合物溫育2小時(shí)。向該混合物加入150mL酚并且將該混合物于37℃搖動(dòng)至少2小時(shí)，然后加入大約800mL氯仿。該混合物通過渦旋混合并15000rpm離心30分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)入干凈的微離心試管中，用60mL 3M的NaOAc和大約1mL的乙醇沉淀DNA并且通過轉(zhuǎn)子回收。該DNA用400mL TE緩沖液重懸浮并加入20mL 200mg/ml的RNase，然后該混合物于37℃溫育1小時(shí)。該DNA用NaOAC和乙醇再沉淀，用70％的乙醇漂洗幾次并重懸于TE緩沖液中。
根據(jù)公開的3-脫氫酶基因已知氨基酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)下列變性的引物，該基因預(yù)期與所需的3-HP脫氫酶同源。APHPDHF15′TTYATYGGBYTSGGBAAYATGGG3(SEQ ID NO16)；AFHPDHF25′GAYGCNCCNGTBWSSGGBGG3′(SEQ ID NO17)；和AFHPDHR25′CATRTTRTTRCARATYTTNGC3′(SEQ ID NO18)。使用糞產(chǎn)堿菌基因組DNA作為模板按照制造商的說明使用Taq DNA聚合酶(Roche)，使用SEQ ID NOS16和18(反應(yīng)A)或SEQ ID NOS17和18(反應(yīng)B)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR程序包括94℃ 2分鐘的起始溫育，4個(gè)循環(huán)的94℃，30秒；56℃，45秒，72℃3分鐘；4個(gè)循環(huán)的94℃，30秒；54℃，45秒，72℃ 3分鐘；4個(gè)循環(huán)的94℃，30秒；52℃，45秒，72℃3分鐘；4個(gè)循環(huán)的94℃，30秒；50℃，45秒，72℃3分鐘；和16個(gè)循環(huán)的94℃，30秒；47℃，45秒，72℃ 3分鐘，然后是72℃ 7分鐘的最后溫育。兩個(gè)反應(yīng)都產(chǎn)生大約500bp的產(chǎn)物。反應(yīng)A的PCR產(chǎn)物用凝膠分離，克隆到pCR11中并轉(zhuǎn)化入TOP10化學(xué)感受態(tài)的細(xì)胞中，在包含50mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選。選擇具有正確大小插入的克隆，分離其質(zhì)粒并測(cè)序。根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)下列基因的特異性巢式引物GWHPDF15′GGTTTACGAGGGCGAGAACGGCTTGCT3′(SEQ ID NO19)；GWHPDF25′CAAGCTGGGTCTGTTCATGCTGGATG3′(SEQ ID NO26)；GWHPDR15′AAGCGGTTCTCGCCCTCGTAAACCTGA3′(SEQ ID NO27)；和GWHPDR25′CGCATTCAAGTCAAAGACGTTCAGGCTA3′(SEQID NO32)，并且使用基因組步測(cè)技術(shù)分離編碼3-HP脫氫酶的基因的完整ORF。該ORF的序列顯示在SEQ ID NO33中，而相應(yīng)的蛋白序列顯示在SEQ ID NO34中。3-HP脫氫酶的起始密碼子在SEQ IDNO33的408位并通過位于SEQ ID NO33的397-403位的核糖體-結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行下去。終止密碼子位于SEQ ID NO33的1304位。
丙氨酸-COA氨裂解酶(ACL)的克隆、表達(dá)和分析從丙酸梭菌克隆兩個(gè)acl基因，acl-1(SEQ ID NO22)編碼145個(gè)氨基酸的蛋白(SEQ ID NO23)且acl-2(SEQ ID NO53)編碼144個(gè)氨基酸的蛋白(SEQ ID NO54)。這兩種蛋白是高度同源的并且只有C-末端的8個(gè)氨基酸不同。acl-1和acl-2基因使用下列引物來克隆用于克隆acl-1的OsaclNdeF5′-GGGAATTCCATATGGTAGGTAAAAAGGTTGTACATC-3′(SEQ ID NO35)，和OsaclBamR5′-GACGGATCCATTCGTCCGCTTGAATAACTAAAG-3′(SEQ IDNO.36)，和用于克隆acl-2的SEQ ID NO35和OSacl2BamR5′-CGACGGATCCCGAAAATGTCACCAAAAATTATTGAG-3′(SEQ ID NO37)。所得到的序列被克隆到用Ndel和BamHI消化的pET11a載體中。將所得到的質(zhì)粒pACL-1和pACL-2轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)細(xì)胞中。攜帶pET 11a(對(duì)照)、pACL-1和pACL-2的BL21(DE3)生長(zhǎng)在補(bǔ)充有50μg/ml羧芐青霉素的10ml LB培養(yǎng)基中至OD600-0.5并且用100μM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。通過在Avanti J20離心機(jī)(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)中以3500rpm離心收集誘導(dǎo)的細(xì)胞，并且按照制造商的說明用Bug Buster(Novagen，Madison，WI)處理。在丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸-CoA(逆反應(yīng)相應(yīng)于圖1中的途徑)后，將所得到的細(xì)胞提取物用于酶活測(cè)定。
分析混合物包含10μl 1M的TAE、20μl 1M的NH4Cl、2μl 100μM的丙烯酰-COA、10μl細(xì)胞抽提物和158μl的H2O。酶促反應(yīng)物在37℃溫育5分鐘并通過加入200μl 10％的TFA終止。將混合物加載到C18 Sep-Pak Vac Icc柱(Waters，Milford，MA)上，用200μl 40％的乙腈、0.1％的TFA洗提并且通過在Speed Vac(Savant InstrμMents，Holbrook，NY)中離心，使體積減小到100μl。β-丙氨酰基-CoA的形成通過LC-MS使用標(biāo)準(zhǔn)的方法來檢測(cè)。ACL-1和ACL-2酶都有活性并且被用于β-丙氨酸操縱子的構(gòu)建。
來自大腸桿菌的CoA轉(zhuǎn)移酶的克隆、表達(dá)和分析通過PCR擴(kuò)增開放閱讀框yfdE(在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中確定為假設(shè)的蛋白)。
因?yàn)樵撻_放閱讀框具有兩個(gè)潛在的起始位點(diǎn)，使用下列引物克隆和表達(dá)兩個(gè)基因用于yfdE-1的yfdE gtg nde sen(5′-AGAGAGCATATGTCTTTTCACCTTCGGC-3′；SEQ ID NO38)，和yfdE atg nde sen(5′-AGAGAGGGATCCGCGGCTCCCACAATGTTGAAATG-3′SEQID NO39)，和yfdE-2的yfdE gtg nde sen(SEQ ID NO38)，和yfdE bam反義(5′-AGAGAGCATATGACAAATAATGAAAGCAAAGG-3′，SEQID NO40)。
使用來自大腸桿菌MG1655的染色體DNA被用作利用Pfu Turbo(Stratagene)進(jìn)行的PCR的模板，使用下列PCR條件進(jìn)行94℃5分鐘；25個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，55℃ 30秒，和72℃ 2分鐘20秒，然后在72℃溫育7分鐘。PCR反應(yīng)物使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化，用NdeI和BamHI消化而克隆到用相同限制酶消化的pET28b(Novagen)中，并轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)的TOP10細(xì)胞(Invitrogen)中。分離來自陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)表達(dá)細(xì)胞(Novagen)中。細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中于37℃生長(zhǎng)到OD600.6，用100μM的IPTG誘導(dǎo)并且在誘導(dǎo)后溫育另外的3小時(shí)。通過離心收獲該細(xì)胞并用0.85％NaCl洗滌一次。細(xì)胞顆粒沉淀貯存于-80℃直到進(jìn)一步使用。
細(xì)胞顆粒沉淀在冰上解凍，并重懸于4ml結(jié)合緩沖液(NovagenHisBind純化試劑盒)中。該細(xì)胞用三步法通過French Pressure Cell(SLM Aminco)(10000psi)來裂解。細(xì)胞碎片通過離心(30,000×g 30分鐘)除去。該提取物在按照制造商的說明加載到Quick900柱體(Novagen)前用0.45μm的針筒過濾器過濾。純化的蛋白使用PD-10柱(Pharmacia)按照制造商的說明脫鹽。所使用的緩沖液是5mM的硼酸、5mM的Tris、5mM的檸檬酸、5mM的NaH2PO4pH7.0。
使用包含100mM磷酸鉀，pH7.0，100mM的β-丙氨酸，1mM乙酰-CoA和20μl純化的CoA轉(zhuǎn)移酶，總分析體積為200μl的反應(yīng)混合物分析純化的蛋白。反應(yīng)物在室溫下溫育20分鐘，隨后用100μl 10％的三氟乙酸(TFA)終止。反應(yīng)物使用1 cc SepPak Vac柱體(WatersMilford，MA)用1ml甲醇純化，并用1ml 0.1％的TFA洗滌兩次。施加樣品并且用1ml 0.1％的TFA洗滌柱體兩次。樣品用包含0.1％TFA的200μl 40％的乙腈洗提，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥到1/2的體積，并且通過液體色譜/質(zhì)譜法分析。用yfdE-1或yfdE-2蛋白分析對(duì)應(yīng)于β-丙氨?；?CoA的預(yù)期質(zhì)量的峰，且該峰在缺失該純化蛋白的對(duì)照物中不存在，此表明CoA轉(zhuǎn)移酶決定了β-丙氨?；?CoA的合成。
操縱子1和2ACL-丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶-丙烯酰-CoA水合酶構(gòu)建用于下列轉(zhuǎn)化β-丙氨酸到β-丙氨?；?CoA到丙烯酰-CoA到3-HP的操縱子。通過PCR從埃氏巨球型菌的基因組DNA中擴(kuò)增編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因，使用引物OSNBpctF(5′-GGGAATTCCATATGAGAAAAGTAGAAATCATTACAGCTG-3′；SEQ ID NO41)和OSHTR(OSHTR5′-ACGTTGATCTCCTTCTACATTATTTTTTCAGTCCCATG-3′；SEQ ID NO42)。
通過PCR從橙色綠屈撓菌的基因組DNA中擴(kuò)增CoA水合酶基因，使用引物OSTHF(5′-CATGGGACTGAAAAAATAATGTAGAAGGAGATCAACGT-3′；SEQ ID NO43)和OSHBR(5′-CGACGGATCCTCAACGACCACTGAAGTTGG-3′；SEQ ID NO44)。
從丙酮梭菌基因組DNA克隆ACL-1和ACL-2(β-丙氨酸-CoA氨裂解酶)基因，擴(kuò)增acl-1的引物對(duì)OsaclXbaF(5′-CTAGTCTAGAGCTTTCTAAGAAACGATTTCCG-3′；SEQ ID NO45)和OSaclNdeR(5′-GGGAATTCCATATGCGTAACTTCCTCCTGCTATCATTCACCGGGGTGCTTTCT-3′；SEQ ID NO46)；擴(kuò)增acl-2的引物對(duì)OSacl2XbaF(5′-CTAGTCTAGAGGAAACCGCTTAACGAACTC-3′；SEQ ID NO47)和OSacl2-2NdeR(5′-GGGAATTCCATATGCGTAACTTCCTCCTGCTATTATTGAGGGTGCTTTGCATCC-3′；SEQ ID NO48)。
在Perkin Elmer 2400熱循環(huán)儀中按照制造商的指導(dǎo)使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)進(jìn)行PCR。PCR在下列條件下進(jìn)行94℃ 2分鐘的起始變性步驟；25個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分鐘；最后72℃延伸7分鐘。所得到的PCR產(chǎn)物使用Qiagen Gel Extraction試劑盒(Qiagen，Inc.)進(jìn)行凝膠純化。
CoA-轉(zhuǎn)移酶和CoA水合酶的PCR產(chǎn)物是在組裝PCR中共同組裝的。OSTHF和OSHTR引物(SEQ ID NOS42和43)是彼此互補(bǔ)的，這就允許互補(bǔ)的DNA末端在PCR中相互退火和雙向延伸DNA。為了保證組裝及其后擴(kuò)增的效率，將兩個(gè)末端引物OSNBpctF和OSHBR(SEQ ID NOS41和44)加入包含100ng純化的CoA-轉(zhuǎn)移酶和CoA-水合酶的PCR產(chǎn)物以及比率為8∶1的rTth聚合酶(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City、CA)和Pfu Turbo聚合酶(stratagene)混合物的組裝PCR混合物中。聚合酶混合物確保PCR反應(yīng)的高保真度。組裝PCR在下列條件下進(jìn)行94℃ 1分鐘的起始變性步驟；20個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，54℃ 30秒，68℃ 2.5分鐘；68℃ 7分鐘的最終延伸。如上所述用凝膠純化組裝PCR產(chǎn)物并用NdeI和BamHI消化。這些限制性酶的位點(diǎn)用OSNBpctF(NdeI)和OSHBR(BamHI)引物(SEQ ID NOS41和44)引入組裝PCR產(chǎn)物。消化的PCR產(chǎn)物在80℃溫育30分鐘(使限制性酶失活)并直接連接到pET 11a載體中。
載體pET 11A用NdeI和BamHI消化，使用Qiagen Gel Extraction試劑盒凝膠純化，如制造商(Roche Molecular Biochemicals)所建議的用蝦堿性磷酸酶處理，并與組裝PCR的產(chǎn)物連接。在16℃使用T4連接酶(Roche Molecular Biochemicals)進(jìn)行連接過夜。將連接混合物轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)的NovaBlue細(xì)胞(Novagen)中，并接種到補(bǔ)充有50μg/ml羧芐青霉素的LB平板上。選擇單獨(dú)的克隆用于提純質(zhì)粒DNA；使用QiagenSpinMiniprep試劑盒獲得質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒用NdeI和BamHI消化并通過凝膠電泳進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒命名為pTH，用XbaI和NdeI消化，如上所述使用凝膠電泳和Qiagen Gel Extraction試劑盒純化，并作為后面克隆用相同的酶消化的ACL-1和ACL-2 PCR產(chǎn)物的載體。連接如上所述進(jìn)行，并如上所述將連接混合物轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)的NovaBlue細(xì)胞。選擇單獨(dú)的克隆用于提純質(zhì)粒DNA；質(zhì)粒DNA使用QiagenSpinMiniprep試劑盒獲得。質(zhì)粒用XbaI和NdeI消化并通過凝膠電泳分析。將所得的攜帶構(gòu)建的操縱子的pATH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中以測(cè)定克隆基因的表達(dá)。
為了測(cè)定基因表達(dá)和3-HP的產(chǎn)生，攜帶pATH-1和pATH-2質(zhì)粒的BL21(DE3)細(xì)胞在補(bǔ)充有10g/l葡萄糖、5g/lβ-丙氨酸和50μg/ml羧芐青霉素的M9CA培養(yǎng)基(Difco Laboratories，Sparks，MA)中生長(zhǎng)到OD600～0.5，并用100μM的IPTG在有氧條件下誘導(dǎo)。用攜帶pET11a載體的BL21(DE3)細(xì)胞作為對(duì)照。在IPTG誘導(dǎo)2和4小時(shí)后取細(xì)胞樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。所有3種酶被顯示為凝膠上顯示的合適大小的條帶。用操縱子構(gòu)建體pATH-1和pATH-2通過LC-MS分析檢測(cè)由β-丙氨酸生成的3-HP，但不在對(duì)照細(xì)胞中進(jìn)行分析。
操縱子34-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶-3-羥異丁酸脫氫酶在可選擇的或另外的途徑中，β-丙氨酸可通過具有β-丙氨酸-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽脫氨基來生產(chǎn)丙二酸半醛，其可進(jìn)一步通過具有3-HP脫氫酶活性的多肽或具有3-羥基異丁酸脫氫酶活性的多肽還原成3-HP。
用于分離、測(cè)序、表達(dá)和測(cè)試這種多肽的活性的方法描述在WO02/42418(在此引入作為參考)中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可使用相似的方法從任何生物體中獲得任何這種多肽的序列。
通過PCR用OsabatF(5′-CCGGAATTCTTTAATATGCGATTTGGAGGAG-3′；SEQ ID NO49)和OSDATR(5′-GTCCGTCTCCCTTTCAGCTTAAATCGCTATTCTTATAGC-3′；SEQ ID NO50)引物自丙酮丁醇梭菌擴(kuò)增編碼4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因。
通過PCR用OSATDF(5′-GCTATAAGAATAGCGATTTAAGCTGAAAGGGAGACGGAC-3′；SEQ ID NO51)和OSibdR(5′-CGACGGATCCGCAGTGAGTGAGCCTTGGAG-3′；SEQ ID NO52)引物自銅綠假單胞菌擴(kuò)增編碼3-羥基異丁酸脫氫酶的基因。PCR在PerkinElmer2400熱循環(huán)儀中根據(jù)制造商的說明使用Pfu Turbo聚合酶在下列條件下進(jìn)行94℃ 2分鐘的起始變性步驟；25個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 1.5分鐘；72℃ 10分鐘的最終延伸。所得的PCR產(chǎn)物使用QiagenGel Extraction試劑盒進(jìn)行凝膠純化。
4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶和3-羥基異丁酸脫氫酶的PCR產(chǎn)物在組裝PCR中共同組裝。SEQ ID NOS50和51中顯示的引物是彼此互補(bǔ)的，因此互補(bǔ)的DNA末端可在PCR反應(yīng)中相互退火，并且雙向延伸DNA。為了保證組裝及其后擴(kuò)增的效率，將兩個(gè)末端引物OSabatF和OSibdR(SEQ ID NOS49和52)加入包含100ng純化的4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶和3-羥基異丁酸脫氫酶的PCR產(chǎn)物以及以8∶1比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶的組裝PCR混合物中。組裝PCR在下列條件下進(jìn)行94℃ 1分鐘的起始變性步驟；25個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 3分鐘；最終68℃延伸7分鐘。組裝PCR產(chǎn)物如上所述用凝膠純化并用EcoRI和BamHI消化。這些限制性酶的位點(diǎn)用OSabatF(EcoRI)(SEQ ID NO49)和OSibdR(BamHI)(SEQ ID NO52)引物引入組裝PCR產(chǎn)物。消化的PCR產(chǎn)物在80℃加熱30分鐘，使用Qiagen Gel Extraction試劑盒進(jìn)行凝膠純化，并連接到pPROLar.A載體中。
載體pPROLar.A用EcoRI和BamHI消化，使用Qiagen Gel Extraction試劑盒凝膠純化，如制造商所建議的用蝦堿性磷酸酶處理，并與組裝PCR的產(chǎn)物連接。如上所述進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)的TOP10細(xì)胞(Novagen)并接種到補(bǔ)充有25μg/ml卡那霉素的LB平板上。選擇單獨(dú)的克隆用于提純質(zhì)粒DNA；使用QiagenSpinMiniprep試劑盒來獲得質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒用EcoRI和BamHI消化并通過凝膠電泳分析。所獲得的攜帶4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶和3-羥基異丁酸脫氫酶基因的質(zhì)粒被稱為pATD。
為了觀察基因表達(dá)和生產(chǎn)3-HP，攜帶pATD質(zhì)粒或無質(zhì)粒(對(duì)照)的TOP 10細(xì)胞在補(bǔ)充有5g/l葡萄糖、5g/lβ丙氨酸和25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到OD600～0.5并且在有氧條件下用100μM的IPTG和0.5％阿拉伯糖誘導(dǎo)。通過用攜帶pATD的細(xì)胞進(jìn)行LC-MS分析來檢測(cè)由β-丙氨酸產(chǎn)生3-HP，但不在對(duì)照細(xì)胞中進(jìn)行。在IPTG誘導(dǎo)6和24小時(shí)后的細(xì)胞上清液中觀察到3-HP。
實(shí)施例11用于從α-丙氨酸產(chǎn)生3-HP的合成操縱子在實(shí)施例10中產(chǎn)生了允許通過幾個(gè)可選擇的途徑經(jīng)β-丙氨酸生產(chǎn)3-HP的幾個(gè)操縱子。在該實(shí)施例中公開的方法詳述了通過包括在此操縱子中公開的丙氨酸2，3-氨基變位酶序列的方法。這允許經(jīng)α-丙氨酸生產(chǎn)3-HP。
操縱子4α-丙氨酸氨基變位酶-ACL-丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶-烯丙酰-CoA水合酶用于轉(zhuǎn)化α-丙氨酸到β-丙氨酸到β-丙氨?；?CoA到-CoA到3-HP的操縱子構(gòu)建如下。使用攜帶丙氨酸2，3-氨基變位酶(實(shí)施例6；SEQ ID NOS20和21)的質(zhì)粒pLC4-7LC1質(zhì)粒構(gòu)建pLCATH2-1。ATH-2操縱子被通過用下列引物OSacl2NotF25′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGATTAAAGGAGGAATTCTCAATGG-3′(SEQ ID NO55)和OShydXbaR5′CTAGTCTAGATCAACGACCACTGAAGTTGG-3′(SEQ IDNO56)擴(kuò)增自pATH-2(實(shí)施例10)。如上所述使用以8∶1的比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶，在下列條件下進(jìn)行PCR94℃ 2分鐘的起始變性步驟；25個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，56℃ 30秒，68℃ 2分鐘；68℃ 7分鐘的最終延伸。
所得的PCR產(chǎn)物使用Qiagen PCR Purification試劑盒純化并用NotI和XbaI消化。消化的DNA在65℃加熱30分鐘以使酶失活，使用Qiagen Gel Extraction試劑盒凝膠純化，并克隆到用相同酶消化的pLC4-7LC-1質(zhì)粒中。在16℃使用T4連接酶進(jìn)行連接過夜。將連接混合物轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)的Tuner細(xì)胞(Novagen)并接種到補(bǔ)充有25μg/ml卡那霉素的LB平板上。選擇單獨(dú)的克隆用于提純質(zhì)粒DNA；使用QiagenSpinMiniprep試劑盒來獲得質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒用NotI和XbaI消化并通過凝膠電泳分析。所得的Tuner(pLCATH2-1)細(xì)胞被用于觀察克隆基因的表達(dá)和從α-丙氨酸和β-丙氨酸產(chǎn)生3-HP。
操縱子5α-丙氨酸氨基變位酶-4氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶-3-羥基異丁酸脫氫酶用于α-丙氨酸到β丙氨酸到丙二酸半醛3-HP的轉(zhuǎn)化的操縱子構(gòu)建如下。使用攜帶丙氨酸2，3-氨基變位酶(實(shí)施例6；SEQ ID NOS20和21)的質(zhì)粒pLC4-7LC1構(gòu)建pLCATD1。ATD操縱子用OSabatNotF5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTTAATATGCGATTTGGAGGAG-3′(SEQ ID NO57)和OsibdXbaR5′-CTAGTCTAGAGCAGTGAGTGAGCCTTGGAG-3′(SEQ ID NO58)擴(kuò)增自pATD質(zhì)粒(實(shí)施例10)。如上所述對(duì)操縱子4進(jìn)行PCR，并且純化所得的PCR產(chǎn)物，用NotI和XbaI消化，克隆到pLC4-7LC-1質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)的Tuner細(xì)胞，并如對(duì)操縱子4所描述的，選擇單獨(dú)的克隆。
操縱子的誘導(dǎo)和3-HP的生產(chǎn)為了觀察基因表達(dá)和3-HP的生產(chǎn)，攜帶pLCATH2-1、pLCATD1質(zhì)?；騪PROLar載體(對(duì)照)的Tuner細(xì)胞在補(bǔ)充有5g/l葡萄糖、5g/lα-丙氨酸或5g/lβ-丙氨酸和25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到OD600-0.5，并且在有氧條件下用100μM的IPTG和0.5％的阿拉伯糖誘導(dǎo)。使用攜帶pLCATH2-1和pLCATD1的細(xì)胞通過LC-MS分析來檢測(cè)由β-丙氨酸產(chǎn)生3-HP，但不在對(duì)照細(xì)胞中進(jìn)行。在誘導(dǎo)22小時(shí)后的細(xì)胞上清液中觀察到3-HP。
操縱子6丙氨酸氨基變位酶-β丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶-3-hp脫氫酶-α-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶用于轉(zhuǎn)化丙酮酸到α-丙氨酸到β-丙氨酸到丙二酸半醛到3-HP的操縱子構(gòu)建如下。編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的基因通過PCR用引物KAM10F(5′-CACACAGAATTCATTAAAGAGGAG-3′；SEQ ID NO59)和KAMRBATR 5′-CATAATCAAACTCAAAGTCAACCATATAAGATCTCCTCCTTACTTCATGAAGAATCCCCTCC-′；SEQ ID NO60)擴(kuò)增自pLC4-7LC1。
β-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因通過PCR用引物KAMRBATF(5′-GGAGGGGATTCTTCATGAAGTAAGGAGGAGATCTTATATGGTTGACTTTGAGTTTGATTG-3′；SEQ ID NO61)和RBATAFDR(5′-CGTGTTACTCATTTTGTCTCCTCGTCATTTACTTGAAGTCTGCTAAGATAC-3′；(SEQ ID NO62)擴(kuò)增自大鼠cDNA。
3-HP脫氫酶通過PCR用引物RBATAFDF(5′-GTATCTTAGCAGACTTCAAGTAAATGACGAGGAGACAAAATGAGTAACACG-3′；SEQID NO63)和(5′-TCATTCACCCGTGAGGCCATGAATATATCTCCTTCTTAAGCTTAGTGCTTCTGACGGTAC-3′；SEQ ID NO64)擴(kuò)增自糞產(chǎn)堿菌DNA。
α-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因用引物AFDRAATF(5′-GTACCGTCAGAAGCACTAAGCTTAAGAAGGAGATATATTCATGGCCTCACGGGTGAATGA-3′；SEQ ID NO65)和RATGPTOR(5’-GACTAGATATCTCAGGAGTACTCATGGGTGAA-3′(SEQ ID NO66)擴(kuò)增自大鼠cDNA。
在下列條件下進(jìn)行上述PCR94℃ 2分鐘的起始變性步驟；10個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，48℃ 30秒，72℃ 2分鐘；5個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 2分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 2分鐘；72℃ 7分鐘的最終延伸。所得的PCR產(chǎn)物使用Qiagen Gel Extraction試劑盒進(jìn)行凝膠純化。
丙氨酸2，3-氨基變位酶和β丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的PCR產(chǎn)物，以及3-HP脫氫酶和α-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的PCR產(chǎn)物是在兩個(gè)組裝PCR中成對(duì)組裝的。SEQ ID NOS60和61以及SEQ ID NOS64和65中的引物對(duì)是彼此互補(bǔ)的，因此互補(bǔ)DNA的末端可以在PCR反應(yīng)中相互退火并雙向延伸DNA。為了保證組裝及其后擴(kuò)增的效率，將兩個(gè)末端引物(SEQ ID NOS59和62)加入包含100ng兩個(gè)純化的丙氨酸氨基變位酶和β-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的PCR產(chǎn)物以及以8∶1比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶的組裝PCR混合物中。將另外兩個(gè)末端引物，SEQ ID NOS63和66加入包含100ng純化的3-HP脫氫酶和α-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶以及以8∶1的比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶的組裝PCR混合物中。組裝PCR在下列條件下進(jìn)行94℃ 2分鐘的起始變性步驟；5個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，48℃ 30秒，68℃ 4分鐘；5個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，52℃ 30秒，68℃ 4分鐘；5個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 4分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，50℃ 30秒，68℃ 4分鐘；68℃ 7分鐘的最終延伸。
進(jìn)行第二個(gè)組裝PCR以聯(lián)合組裝的對(duì)來產(chǎn)生包含所有4個(gè)基因的操縱子6。將兩個(gè)末端引物(SEQ ID NOS59和66)加入到包含100ng純化的丙氨酸氨基變位酶/β-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶對(duì)；100ng純化的3-HP脫氫酶/α-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶對(duì)以及以8∶1的比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶的PCR混合物中。組裝PCR在下列條件下進(jìn)行94℃ 2分鐘的起始變性步驟；15個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，50℃ 30秒，70℃ 5分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃ 30秒，55℃ 30秒，70℃ 5分鐘；70℃ 7分鐘的最終延伸。
如上所述凝膠純化組裝的PCR產(chǎn)物并用EcoRI和EcoRV消化。用SEQ ID NO59(EcoRI)和SEQ ID NO66(EcoRV)引物將這些限制性酶的位點(diǎn)引入組裝的PCR產(chǎn)物中。消化的PCR產(chǎn)物在65℃加熱30分鐘，使用Qiagen Gel Extraction試劑盒進(jìn)行凝膠純化，并連接到用EcoRI和SmaI消化的pTrc99A載體中。連接在16℃使用T4連接酶進(jìn)行過夜，將混合物轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)的Tuner細(xì)胞中，并接種到補(bǔ)充有50μg/ml羧芐青霉素的LB平板上。選擇單獨(dú)的克隆用于質(zhì)粒DNA提純；使用QiagenSpinMiniprep試劑盒來獲得質(zhì)粒DNA。通過PCR用SEQ ID NOS59和66引物及凝膠電泳分析進(jìn)行篩選質(zhì)粒。所獲得的質(zhì)粒被命名為pTrcβ-ala。
使用Tuner(pTrcβ-ala)細(xì)胞確定克隆基因的表達(dá)和從葡萄糖、α-丙氨酸和β-丙氨酸進(jìn)行的3-HP的生產(chǎn)。Tuner(pTrc99A)被用作對(duì)照。細(xì)胞在補(bǔ)充有5g/l葡萄糖和50μg/ml羧芐青霉素；或5g/l葡萄糖、5g/lα-丙氨酸和50μg/ml羧芐青霉素；或5g/l葡萄糖、5g/lβ-丙氨酸和50羧芐青霉素的M9CA培養(yǎng)基(Difco Laboratories)中生長(zhǎng)到OD600～0.5；并且在有氧條件下用100μM的IPTG和0.5％的阿拉伯糖誘導(dǎo)。來自β-丙氨酸的3-HP的生產(chǎn)用攜帶pTrcβ-ala的細(xì)胞通過LC-MS分析進(jìn)行檢測(cè)，但不在對(duì)照細(xì)胞中進(jìn)行。在誘導(dǎo)22小時(shí)后的細(xì)胞上清液中觀察到3-HP。
實(shí)施例12由β-丙氨酸產(chǎn)生泛酸泛酸可由β-丙氨酸通過具有α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸還原酶(E.C.1.1.1.169)和泛酸合酶(E.C.6.3.2.1)活性的多肽來產(chǎn)生(圖3)。
使用實(shí)施例10和11中描述的克隆方法，α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸還原酶(E.C.1.169)和泛酸合酶(E.C.6.3.)的多肽可被分離、測(cè)序、表達(dá)和測(cè)試。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可使用相似的方法從任何生物體中獲得任何這種多肽的序列。
實(shí)施例13重組表達(dá)使用公眾可利用的酶的cDNA和氨基酸順序以及在此公開的酶和序列，諸如丙氨酸2，3-氨基變位酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、β-丙氨?；?CoA氨裂解酶、3-HP CoA脫水酶、4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶、β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、3-羥丙酸脫氫酶、3-羥基異丁酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、3-HP-COA水解酶、3-羥異丁酰基-CoA水解酶多醇酸合酶、脂肪酶、酯酶、CoA水解酶、α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、α-酮泛酸還原酶、泛酸合酶、泛酸激酶、4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶、脫磷酸-CoA激酶乙酰化醛NAD(+)氧化還原酶、醇NAD(+)氧化還原酶、醛脫氫酶(NAD(P)+)和乙醇脫氫酶、及其變體、多態(tài)型、突變體、片段和融合體，任何蛋白諸如酶的表達(dá)和提純，是能夠通過標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)來得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解其酶和片段可在任何目的細(xì)胞或生物體中重組生產(chǎn)以及在使用前，例如在3-HP、泛酸及其衍生物的生產(chǎn)前進(jìn)行純化。
用于生產(chǎn)重組蛋白的方法是本領(lǐng)域公知的。因此本發(fā)明的范圍包括任何蛋白或其片段諸如酶的重組表達(dá)。例如，參見Johnson等人的美國(guó)專利No5,342,764；Pausch等人的美國(guó)專利No5,846,819；Fleer等人的美國(guó)專利No5,876,969以及Sambrook等人(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港，紐約，1989，第17章)。
簡(jiǎn)而言之，編碼蛋白質(zhì)或肽的部分的、全長(zhǎng)的或變化的cDNA序列可被連接到表達(dá)載體諸如細(xì)菌表達(dá)載體中。蛋白質(zhì)和/或肽可通過將啟動(dòng)子置于cDNA序列的上游而生產(chǎn)。啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于，lac，trp，tac，trc，噬菌體λ的主要操作子和啟動(dòng)子區(qū)域，fd外殼蛋白的調(diào)控區(qū)域，SV40的早期和晚期啟動(dòng)子，源自多形瘤、腺病毒、反向病毒、桿狀病毒和猿猴病毒的啟動(dòng)子，3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子，酵母酸性磷酸酶的啟動(dòng)子，酵母α-接合因子的啟動(dòng)子及其組合。
適合完整天然蛋白質(zhì)生產(chǎn)的載體包括pKC30(Shimatake和Rosenberg，1981，Nature 292128)、pKK177-3(Amann和Brosius，1985Gene40183)和pET-3(Studier和Moffatt，1986，J.Mol.Biol.189113)。DNA序列可被轉(zhuǎn)入其它克隆載體，例如其它的質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、柯斯質(zhì)粒、動(dòng)物病毒和酵母人工染色體(YACs)(Burke等人，1987，Science 236806-12)。這些載體可導(dǎo)入多種宿主，包括體細(xì)胞和簡(jiǎn)單或復(fù)雜生物體中，諸如細(xì)菌、真菌(Timberlake和Marshall，1989，Science 2441313-7)，無脊椎動(dòng)物、植物(Gasser和Fraley，1989，Science 2441293)和哺乳動(dòng)物(Pursel等人，1989，Science 2441281-8)，它們是通過導(dǎo)入異源的cDNA而提供轉(zhuǎn)基因的。
為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，cDNA序列可連接到異源的啟動(dòng)子上，例如猿猴病毒SV40、pSV2載體中的啟動(dòng)子(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)782072-6)并導(dǎo)入例如猴子COS-1細(xì)胞的細(xì)胞中(Gluzman，1981，細(xì)胞Cell 23175-82)以實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)或長(zhǎng)期的表達(dá)。嵌合基因構(gòu)建體的穩(wěn)定整合可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過諸如新霉素(Southern和Berg，1982，J.Mol.Aool.Genet.1327-41)和霉酚酸(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)782072-6)的生物化學(xué)篩選而保持。
將DNA轉(zhuǎn)入諸如人類或其它哺乳動(dòng)物的真核細(xì)胞中是一種常規(guī)技術(shù)。載體以純的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)染)通過，例如，磷酸鈣沉淀(Graham和vander Eb，1973，Virology 52466)，磷酸鍶沉淀(Brash等人，1987，Mol.Cell Biol.72013)、電穿孔(Neumann等人，1982，EMBO.J.1841)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Felgner等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)847413)、DEAE葡聚糖(McCuthan等人，1968，J.Natl.CancerInst.41351)、微注射(Mueller等人，1978，Cell 15579)、原生質(zhì)體融合(Schafner，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)772163-7)或顆粒槍(Klein等人，1987，Nature 32770)?？蛇x擇地，cDNA可通過用病毒載體感染來導(dǎo)入，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒(Bernstein等人，1985，Gen.Engrg.7235)，諸如腺病毒(Ahmad等人，1986，J.Virol.57267)或皰疹(Spaete等人，1982，Cell 30295)。
實(shí)施例14肽的合成和純化在此公開的酶，諸如丙氨酸2，3-氨基變位酶、CoA、β丙氨?；鵆oA氨裂解酶、3-HP-CoA脫水酶、4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶、β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、3-羥丙酸脫氫酶、3-羥基異丁酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、3-HP-CoA水解酶、3-羥異丁?；鵆oA水解酶、多醇酸合酶、脂肪酶、酯酶、CoA水解酶、α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、α-酮泛酸還原酶、泛酸合酶、泛酸激酶、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶、4-磷酸泛醇酰半胱氨酸脫羧酶、ATP4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶、脫磷酸-CoA激酶乙?；㎞AD(+)氧化還原酶、醇NAD(+)氧化還原酶、醛脫氫酶(NAD(P)+)和乙醇脫氫酶(及其變體、融合體、多態(tài)型、片段和突變體)可通過本領(lǐng)域已知的許多人工或自動(dòng)化合成的任何方法進(jìn)行化學(xué)合成。例如，使用Applied Biosystems Model 431A肽合成儀以及使用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基-末端保護(hù)，與二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑或2-(1氫-苯并-三唑-1基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/羥基苯并三唑(HBTU/HOBT)偶聯(lián)，以及使用羧基-末端酸的p-羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)或Sasrin樹脂或者羧基-末端酰胺的Rink氨化樹脂以0.25毫摩爾(mmole)的刻度進(jìn)行固相肽合成(SPPS)。
通過在三氟乙酸中三苯甲基化和三苯甲醇化，隨后通過如Atherton等人(固相肽合成Solid Phase Peptide Synthesis，IRL PressOxford，1989)所描述的Fmoc衍生化，從合適的前體氨基酸來制備Fmoc-衍生的氨基酸。
使用1％的TFA二氯甲烷溶液切割Sasrin樹脂-結(jié)合的肽以產(chǎn)生受保護(hù)的肽。當(dāng)合適時(shí)，受保護(hù)肽的前體在氨基和羧基末端之間被通過使用二苯磷酸疊氮化物在新生成肽的氨基末端的自由胺和羧基末端自由酸進(jìn)行反應(yīng)中而環(huán)化，其中氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)鞘鼙Ｗo(hù)的。
HMP或Rink氨化物樹脂-結(jié)合產(chǎn)物通常被切割且包含環(huán)化肽的受保護(hù)側(cè)鏈被利用含有三氟乙酸(TFA)的溶液，任意也包含水、苯硫基甲烷和乙二硫醇，以100∶5∶5∶2.5的比率于室溫0.5-3小時(shí)而去保護(hù)。
粗制的肽通過預(yù)高壓液相色譜法(HPLC)來純化，例如使用WaterDelta-PAKC18柱和用乙腈緩和的含0.1％TFA的水梯度洗脫。柱洗提后，從洗脫級(jí)分中蒸發(fā)乙腈，然后凍干該洗脫級(jí)分。如此生產(chǎn)和純化的各種產(chǎn)物的同一性可通過快速原子轟擊質(zhì)譜法(FABMS)或電噴射質(zhì)譜法(ESMS)進(jìn)行驗(yàn)證。
鑒于我們公開的原理可應(yīng)用于許多可能的實(shí)施方案，應(yīng)該理解舉例說明的實(shí)施方案只是公開的特定實(shí)施例而不應(yīng)該作為本發(fā)明范圍的限制。相應(yīng)的，所公開內(nèi)容的范圍與下列權(quán)利要求是一致的。因此我們要求保護(hù)所有在這些權(quán)利要求的范圍和精神內(nèi)的發(fā)明。
序列表<110>卡吉爾公司(CARGIL，INCORPORATED)<120>丙氨酸2，3-氨基變位酶(ALANINE 2，3-AMINOMUTASE)<130>SCT042701-47<150>US 60/350,727<151>2002-01-18<150>US 60/375,785<151>2002-04-25<160>66<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>1gcgcgaggag gagttcatat gaaaaacaaa tggtataaac 40<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>2cgggcaccgc ttcgaggcgg ccgcaccatt cgcatg 36<210>3<211>1416<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>3ttgaaaaaca aatggtataa accgaaacgg cattggaagg agatcgagtt atggaaggac 60gttccggaag agaaatggaa cgattggctt tggcagctga cacacactgt aagaacgtta120
gatgatttaa agaaagtcat taatctgacc gaggatgaag aggaaggcgt cagaatttct 180accaaaacga tccccttaaa tattacacct tactatgctt ctttaatgga ccccgacaat 240ccgagatgcc cggtacgcat gcagtctgtg ccgctttctg aagaaatgca caaaacaaaa 300tacgatctgg aagacccgct tcatgaggat gaagattcac cggtacccgg tctgacacac 360cgctatcccg accgtgtgct gtttcttgtc acgaatcaat gttccatgta ctgccgctac 420tgcacaagaa ggcgcttttc cggacaaatc ggaatgggcg tccccaaaaa acagcttgat 480gctgcaattg cttatatccg ggaaacaccc gaaatccgcg attgtttaat ttcaggcggt 540gatgggctgc tcatcaacga ccaaatttta gaatatattt taaaagagct gcgcagcatt 600ccgcatctgg aagtcatcag aatcggaaca agagctcccg tcgtctttcc gcagcgcatt 660accgatcatc tgtgcgagat attgaaaaaa tatcatccgg tctggctgaa cacccatttt 720aacacaagca tcgaaatgac agaagaatcc gttgaggcat gtgaaaagct ggtgaacgcg 780ggagtgccgg tcggaaatca ggctgtcgta ttagcaggta ttaatgattc ggttccaatt 840atgaaaaagc tcatgcatga cttggtaaaa atcagagtcc gtccttatta tatttaccaa 900tgtgatctgt cagaaggaat agggcatttc agagctcctg tttccaaagg tttggagatc 960attgaagggc tgagaggtca tacctcaggc tatgcggttc ctacctttgt cgttgacgca1020ccaggcggag gaggtaaaat cgccctgcag ccaaactatg tcctgtcaca aagtcctgac1080aaagtgatct taagaaattt tgaaggtgtg attacgtcat atccggaacc agagaattat1140atccccaatc aggcagacgc ctattttgag tccgttttcc ctgaaaccgc tgacaaaaag1200gagccgatcg ggctgagtgc catttttgct gacaaagaag tttcgtttac acctgaaaat1260gtagacagaa tcaaaaggag agaggcatac atcgcaaatc cggagcatga aacattaaaa1320gatcggcgtg agaaaagaga tcagctcaaa gaaaagaaat ttttggcgca gcagaaaaaa1380cagaaagaga ctgaatgcgg aggggattct tcatga 1416<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>4tatcaattcg ttacaggcga tacatggcac gcttcggcgc gtgtaggctg gagctgcttc 60<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5gatgtcgcgg ctggtgagta accagccgca gggataacaa catatgaata tcctccttag 60<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6ttaccgagca gcgttcagag 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>7cacctggcgg tgacaaccat 20<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物
<400>8gcggcgtgaa gtttcccaac ccgttctgcc tctcttcttc gtgtaggctg gagctgcttc 60<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>9ttacaacgtt accgggtgtt ctttctcgcc tttcttaaac catatgaata tcctccttag 60<210>10<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>10cacaaaacaa aatacgatat ggaagacccg ctccatgagg atgaagattc a 51<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>11tgaatcttca tcctcatgga gcgggtcttc catatcgtat tttgttttgt g 51<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>12gaatcaatgt tccgtatact gccgctac28
<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>13gtagcggcag tatacggaac attgattc28<210>14<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>14gttcctacct ttgttgtaca cgcaccaggc g31<210>15<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>15cgcctggtgc gtgtacaaca aaggtaggaa c31<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(23)<223>y為t/u或c；s為g或c；b為g，c或t/u.
<400>16
ttyatyggby tsggbaayat ggg 23<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(20)<223>y為t/u或c；s為g或c；b為g，c或t/u；w為a或t/u；n為a，c，g或t/u.
<400>17gaygcnccng tbwssggbgg 20<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(21)<223>y為t/u或c；r為g或a；n為a，c，g或t/u.
<400>18catrttrttr caratyttng c 21<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>19ggtttacgag ggcgagaacg gcttgct 27
<210>20<211>1416<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1416)<223>
<400>20atg aaa aac aaa tgg tat aaa ccg aaa cgg cat tgg aag gag atc gag 48Met Lys Asn Lys Trp Tyr Lys Pro Lys Arg His Trp Lys Glu Ile Glu1 5 10 15tta tgg aag gac gtt ccg gaa gag aaa tgg aac gat tgg ctt tgg cag 96Leu Trp Lys Asp Val Pro Glu Glu Lys Trp Asn Asp Trp Leu Trp Gln20 25 30ctg aca cac act gta aga acg tta gat gat tta aag aaa gtc att aat 144Leu Thr His Thr Val Arg Thr Leu Asp Asp Leu Lys Lys Val Ile Asn35 40 45ctg acc gag gat gaa gag gaa ggc gtc aga att tct acc aaa acg atc 192Leu Thr Glu Asp Glu Glu Glu Gly Val Arg Ile Ser Thr Lys Thr Ile50 55 60ccc tta aat att aca cct tac tat gct tct tta atg gac ccc gac aat 240Pro Leu Asn Ile Thr Pro Tyr Tyr Ala Ser Leu Met Asp Pro Asp Asn65 70 75 80ccg aga tgc ccg gta cgc atg cag tct gtg ccg ctt tct gaa gaa atg 288Pro Arg Cys Pro Val Arg Met Gln Ser Val Pro Leu Ser Glu Glu Met85 90 95cac aaa aca aaa tac gat atg gaa gac ccg ctt cat gag gat gaa gat 336His Lys Thr Lys Tyr Asp Met Glu Asp Pro Leu His Glu Asp Glu Asp100 105 110tca ccg gta ccc ggt ctg aca cac cgc tat ccc gac cgt gtg ctg ttt 384Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe115 120 125ctt gtc acg aat caa tgt tcc gtg tac tgc cgc tac tgc aca aga agg 432Leu Val Thr Asn Gln Cys Ser Val Tyr Cys Arg Tyr Cys Thr Arg Arg130 135 140cgc ttt tcc gga caa atc gga atg ggc gtc ccc aaa aaa cag ctt gat 480Arg Phe Ser Gly Gln Ile Gly Met Gly Val Pro Lys Lys Gln Leu Asp
145 150 155 160gct gca att gct tat atc cgg gaa aca ccc gaa atc cgc gat tgt tta 528Ala Ala Ile Ala Tyr Ile Arg Glu Thr Pro Glu Ile Arg Asp Cys Leu165 170 175att tca ggc ggt gat ggg ctg ctc atc aac gac caa att tta gaa tat 576Ile Ser Gly Gly Asp Gly Leu Leu Ile Asn Asp Gln Ile Leu Glu Tyr180 185 190att tta aaa gag ctg cgc agc att ccg cat ctg gaa gtc atc aga atc 624Ile Leu Lys Glu Leu Arg Ser Ile Pro His Leu Glu Val Ile Arg Ile195 200 205gga aca aga gct ccc gtc gtc ttt ccg cag cgc att acc gat cat ctg 672Gly Thr Arg Ala Pro Val Val Phe Pro Gln Arg Ile Thr Asp His Leu210 215 220tgc gag ata ttg aaa aaa tat cat ccg gtc tgg ctg aac acc cat ttt 720Cys Glu Ile Leu Lys Lys Tyr His Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe225 230 235 240aac aca agc atc gaa atg aca gaa gaa tcc gtt gag gca tgt gaa aag 768Asn Thr Ser Ile Glu Met Thr Glu Glu Ser Val Glu Ala Cys Glu Lys245 250 255ctg gtg aac gcg gga gtg ccg gtc gga aat cag gct gtc gta tta gca 816Leu Val Asn Ala Gly Val Pro Val Gly Asn Gln Ala Val Val Leu Ala260 265 270ggt att aat gat tcg gtt cca att atg aaa aag ctc atg cat gac ttg 864Gly Ile Asn Asp Ser Val Pro Ile Met Lys Lys Leu Met His Asp Leu275 280 285gta aaa atc aga gtc cgt cct tat tat att tac caa tgt gat ctg tca 912Val Lys Ile Arg Val Arg Pro Tyr Tyr Ile Tyr Gln Cys Asp Leu Ser290 295 300gaa gga ata ggg cat ttc aga gct cct gtt tcc aaa ggt ttg gag atc 960Glu Gly Ile Gly His Phe Arg Ala Pro Val Ser Lys Gly Leu Glu Ile305 310 315 320att gaa ggg ctg aga ggt cat acc tca ggc tat gcg gtt cct acc ttt 1008Ile Glu Gly Leu Arg Gly His Thr Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe325 330 335gtc gtt cac gca cca ggc gga gga ggt aaa atc gcc ctg cag ccg aac 1056Val Val His Ala Pro Gly Gly Gly Gly Lys Ile Ala Leu Gln Pro Asn340 345 350tat gtc ctg tca caa agt cct gac aaa gtg atc tta aga aat ttt gaa 1104
Tyr Val Leu Ser Gln Ser Pro Asp Lys Val Ile Leu Arg Asn Phe Glu355 360 365ggt gtg att acg tca tat ccg gaa cca gag aat tat atc ccc aat cag 1152Gly Val Ile Thr Ser Tyr Pro Glu Pro Glu Asn Tyr Ile Pro Asn Gln370 375 380gca gac gcc tat ttt gag tcc gtt ttc cct gaa acc gct gac aaa aag 1200Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Ser Val Phe Pro Glu Thr Ala Asp Lys Lys385 390 395 400gag ccg atc ggg ctg agt gcc att ttt gct gac aaa gaa gtt tcg ttt 1248Glu Pro Ile Gly Leu Ser Ala Ile Phe Ala Asp Lys Glu Val Ser Phe405 410 415aca cct gaa aat gta gac aga atc aaa agg aga gag gca tac atc gca 1296Thr Pro Glu Asn Val Asp Arg Ile Lys Arg Arg Glu Ala Tyr Ile Ala420 425 430aat ccg gag cat gaa aca tta aaa gat cgg cgt gag aaa aga gat cag 1344Asn Pro Glu His Glu Thr Leu Lys Asp Arg Arg Glu Lys Arg Asp Gln435 440 445ctc aaa gaa aag aaa ttt ttg gcg cag cag aaa aaa cag aaa gag act 1392Leu Lys Glu Lys Lys Phe Leu Ala Gln Gln Lys Lys Gln Lys Glu Thr450 455 460gaa tgc gga ggg gat tct tca tga 1416Glu Cys Gly Gly Asp Ser Ser465 470<210>21<211>471<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>21Met Lys Asn Lys Trp Tyr Lys Pro Lys Arg His Trp Lys Glu Ile Glu1 5 10 15Leu Trp Lys Asp Val Pro Glu Glu Lys Trp Asn Asp Trp Leu Trp Gln20 25 30Leu Thr His Thr Val Arg Thr Leu Asp Asp Leu Lys Lys Val Ile Asn35 40 45
Leu Thr Glu Asp Glu Glu Glu Gly Val Arg Ile Ser Thr Lys Thr Ile50 55 60Pro Leu Asn Ile Thr Pro Tyr Tyr Ala Ser Leu Met Asp Pro Asp Asn65 70 75 80Pro Arg Cys Pro Val Arg Met Gln Ser Val Pro Leu Ser Glu Glu Met85 90 95His Lys Thr Lys Tyr Asp Met Glu Asp Pro Leu His Glu Asp Glu Asp100 105 110Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe115 120 125Leu Val Thr Ash Gln Cys Ser Val Tyr Cys Arg Tyr Cys Thr Arg Arg130 135 140Arg Phe Ser Gly Gln Ile Gly Met Gly Val Pro Lys Lys Gln Leu Asp145 150 155 160Ala Ala Ile Ala Tyr Ile Arg Glu Thr Pro Glu Ile Arg Asp Cys Leu165 170 175Ile Ser Gly Gly Asp Gly Leu Leu Ile Asn Asp Gln Ile Leu Glu Tyr180 185 190Ile Leu Lys Glu Leu Arg Ser Ile Pro His Leu Glu Val Ile Arg Ile195 200 205Gly Thr Arg Ala Pro Val Val Phe Pro Gln Arg Ile Thr Asp His Leu210 215 220Cys Glu Ile Leu Lys Lys Tyr His Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe225 230 235 240Asn Thr Ser Ile Glu Met Thr Glu Glu Ser Val Glu Ala Cys Glu Lys245 250 255
Leu Val Asn Ala Gly Val Pro Val Gly Asn Gln Ala Val Val Leu Ala260 265 270Gly Ile Asn Asp Ser Val Pro Ile Met Lys Lys Leu Met His Asp Leu275 280 285Val Lys Ile Arg Val Arg Pro Tyr Tyr Ile Tyr Gln Cys Asp Leu Ser290 295 300Glu Gly Ile Gly His Phe Arg Ala Pro Val Ser Lys Gly Leu Glu Ile305 310 315 320Ile Glu Gly Leu Arg Gly His Thr Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe325 330 335Val Val His Ala Pro Gly Gly Gly Gly Lys Ile Ala Leu Gln Pro Ash340 345 350Tyr Val Leu Ser Gln Ser Pro Asp Lys Val Ile Leu Arg Asn Phe Glu355 360 365Gly Val Ile Thr Ser Tyr Pro Glu Pro Glu Asn Tyr Ile Pro Asn Gln370 375 380Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Ser Val Phe Pro Glu Thr Ala Asp Lys Lys385 390 395 400Glu Pro Ile Gly Leu Ser Ala Ile Phe Ala Asp Lys Glu Val Ser Phe405 410 415Thr Pro Glu Asn Val Asp Arg Ile Lys Arg Arg Glu Ala Tyr Ile Ala420 425 430Asn Pro Glu His Glu Thr Leu Lys Asp Arg Arg Glu Lys Arg Asp Gln435 440 445Leu Lys Glu Lys Lys Phe Leu Ala Gln Gln Lys Lys Gln Lys Glu Thr450 455 460
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Gln Arg Gly Pro Gln Glu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Lys His Pro Gly130 135 140gaa tga 438Glu145<210>23<211>145<212>PRT<213>丙酸梭菌(Clostridium propionicum)<400>23Met Val Gly Lys Lys Val Val His His Leu Met Met Ser Ala Lys Asp1 5 10 15Ala His Tyr Thr Gly Asn Leu Val Asn Gly Ala Arg Ile Val Asn Gln20 25 30Trp Gly Asp Val Gly Thr Glu Leu Met Val Tyr Val Asp GIy Asp Ile35 40 45Ser Leu Phe Leu Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr Ala Pro Val Tyr50 55 60Val Gly Asp Phe Met Glu Tyr His Gly Trp Ile Glu Lys Val Gly Asn65 70 75 80Gln Ser Tyr Thr Cys Lys Phe Glu Ala Trp Lys Val Ala Thr Met Val85 90 95Asp Ile Thr Asn Pro Gln Asp Thr Arg Ala Thr Ala Cys Glu Pro Pro100 105 110Val Leu Cys Gly Arg Ala Thr Gly Ser Leu Phe Ile Ala Lys Lys Asp115 120 125Gln Arg Gly Pro Gln Glu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Lys His Pro Gly130 135 140
Glu145<210>24<211>1554<212>DNA<213>埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)<220>
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aat gac gta acc aaa gaa gac ctc gtc aaa ctg atc gaa gtc gat ggt 480Asn Asp Val Thr Lys Glu Asp Leu Val Lys Leu Ile Glu Val Asp Gly145 150 155 160cat gaa cag ctt ttc tac ccg acc ttc ccg gtc aac gta gct ttc ctc 528His Glu Gln Leu Phe Tyr Pro Thr Phe Pro Val Asn Val Ala Phe Leu165 170 175cgc ggt acg tat gct gat gaa tcc ggc aat atc acc atg gac gaa gaa 576Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Met Asp Glu Glu180 185 190atc ggg cct ttc gaa agc act tcc gta gcc cag gcc gtt cac aac tgt 624Ile Gly Pro Phe Glu Ser Thr Ser Val Ala Gln Ala Val His Asn Cys195 200 205ggc ggt aaa gtc gtc gtc cag gtc aaa gac gtc gtc gct cac ggc agc 672Gly Gly Lys Val Val Val Gln Val Lys Asp Val Val Ala His Gly Ser210 215 220ctc gac ccg cgc atg gtc aag atc cct ggc atc tat gtc gac tac gtc 720Leu Asp Pro Arg Met Val Lys Ile Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val225 230 235 240gtc gta gca gct ccg gaa gac cat cag cag acg tat gac tgc gaa tac 768Val Val Ala Ala Pro Glu Asp His Gln Gln Thr Tyr Asp Cys Glu Tyr245 250 255gat ccg tcc ctc agc ggt gaa cat cgt gct cct gaa ggc gct acc gat 816Asp Pro Ser Leu Ser Gly Glu His Arg Ala Pro Glu Gly Ala Thr Asp260 265 270gca gct ctc ccc atg agc gct aag aaa atc atc ggc cgc cgc ggc gct 864Ala Ala Leu Pro Met Ser Ala Lys Lys Ile Ile Gly Arg Arg Gly Ala275 280 285ttg gaa ttg act gaa aac gct gtc gtc aac ctc ggc gtc ggt gct ccg 912Leu Glu Leu Thr Glu Asn Ala Val Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro290 295 300gaa tac gtt gct tct gtt gcc ggt gaa gaa ggt atc gcc gat acc att 960Glu Tyr Val Ala Ser Val Ala Gly Glu Glu Gly Ile Ala Asp Thr Ile305 310 315 320acc ctg acc gtc gaa ggt ggc gcc atc ggt ggc gta ccg cag ggc ggt 1008Thr Leu Thr Val Glu Gly Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Gln Gly Gly325 330 335gcc cgc ttc ggt tcg tcc cgc aat gcc gat gcc atc atc gac cac acc 1056Ala Arg Phe Gly Ser Ser Arg Asn Ala Asp Ala Ile Ile Asp His Thr
340 345 350tat cag ttc gac ttc tac gat ggc ggc ggt ctg gac atc gct tac ctc 1104Tyr Gln Phe Asp Phe Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Ile Ala Tyr Leu355 360 365ggc ctg gcc cag tgc gat ggc tcg ggc aac atc aac gtc agc aag ttc 1152Gly Leu Ala Gln Cys Asp Gly Ser Gly Asn Ile Asn Val Ser Lys Phe370 375 380ggt act aac gtt gcc ggc tgc ggc ggt ttc ccc aac att tcc cag cag 1200Gly Thr Asn Val Ala Gly Cys Gly Gly Phe Pro Asn Ile Ser Gln Gln385 390 395 400aca ccg aat gtt tac ttc tgc ggc acc ttc acg gct ggc ggc ttg aaa 1248Thr Pro Asn Val Tyr Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys405 410 415atc gct gtc gaa gac ggc aaa gtc aag atc ctc cag gaa ggc aaa gcc 1296Ile Ala Val Glu Asp Gly Lys Val Lys Ile Leu Gln Glu Gly Lys Ala420 425 430aag aag ttc atc aaa gct gtc gac cag atc act ttc aac ggt tcc tat 1344Lys Lys Phe Ile Lys Ala Val Asp Gln Ile Thr Phe Asn Gly Ser Tyr435 440 445gca gcc cgc aac ggc aaa cac gtt ctc tac atc aca gaa cgc tgc gta 1392Ala Ala Arg Asn Gly Lys His Val Leu Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val450 455 460ttt gaa ctg acc aaa gaa ggc ttg aaa ctc atc gaa gtc gca ccg ggc 1440Phe Glu Leu Thr Lys Glu Gly Leu Lys Leu Ile Glu Val Ala Pro Gly465 470 475 480atc gat att gaa aaa gat atc ctc gct cac atg gac ttc aag ccg atc 1488Ile Asp Ile Glu Lys Asp Ile Leu Ala His Met Asp Phe Lys Pro lle485 490 495att gat aat ccg aaa ctc atg gat gcc cgc ctc ttc cag gac ggt ccc 1536Ile Asp Asn Pro Lys Leu Met Asp Ala Arg Leu Phe Gln Asp Gly Pro500 505 510atg gga ctg aaa aaa taa 1554Met Gly Leu Lys Lys515<210>25<211>517<212>PRT<213>埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)
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<223>PCR引物<400>27aagcggttct cgccctcgta aacctga 27<210>28<211>416<212>PRT<213>牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)<400>28Met Ala Glu Ser Arg Arg Lys Tyr Tyr Phe Pro Asp Val Thr Asp Glu1 5 10 15Gln Trp Asn Asp Trp His Trp Gln Val Leu Asn Arg Ile Glu Thr Leu20 25 30Asp Gln Leu Lys Lys Tyr Val Thr Leu Thr Ala Glu Glu Glu Glu Gly35 40 45Val Lys Glu Ser Leu Lys Val Leu Arg Met Ala Ile Thr Pro Tyr Tyr50 55 60Leu Ser Leu Ile Asp Pro Glu Asn Pro Asn Cys Pro Ile Arg Lys Gln65 70 75 80Ala Ile Pro Thr His Gln Glu Leu Val Arg Ala Pro Glu Asp Gln Val85 90 95Asp Pro Leu Ser Glu Asp Glu Asp Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His100 105 110Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe Leu Ile Thr Asp Lys Cys Ser Met115 120 125Tyr Cys Arg His Cys Thr Arg Arg Arg Phe Ala Gly Gln Lys Asp Ala130 135 140Ser Ser Pro Ser Glu Arg Ile Asp Arg Cys Ile Asp Tyr Ile Ala Asn145 150 155 160
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355 360 365Pro Glu Asn Tyr His Glu Glu Cys Asp Cys Glu Asp Cys Arg Ala Gly370 375 380Lys His Lys Glu Gly Val Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gln Gln Leu Ala385 390 395 400Ile Glu Pro Ser Asp Leu Ala Arg Lys Lys Arg Lys Phe Asp Lys Asn405 410 415<210>29<211>1251<212>DNA<213>牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1251)<223>
<400>29atg gca gaa agt cgt aga aag tat tat ttc cct gat gtc acc gat gag 48Met Ala Glu Ser Arg Arg Lys Tyr Tyr Phe Pro Asp Val Thr Asp Glu1 5 10 15caa tgg tac gac tgg cat tgg cag gtc ctc aat cga att gag acg ctc 96Gln Trp Tyr Asp Trp His Trp Gln Val Leu Asn Arg Ile Glu Thr Leu20 25 30gac cag ctg aaa aag tac gtt aca ctc acc gct gaa gaa gaa gag gga 144Asp Gln Leu Lys Lys Tyr Val Thr Leu Thr Ala Glu Glu Glu Glu Gly35 40 45gta aaa gaa tcg ccc aaa gta ctc cga atg gct atc aca cct tat tat 192Val Lys Glu Ser Pro Lys Val Leu Arg Met Ala Ile Thr Pro Tyr Tyr50 55 60ttg agt ttg ata gac ccc gag aat cct aat tgt ccg att cgt aaa caa 240Leu Ser Leu lle Asp Pro Glu Asn Pro Asn Cys Pro Ile Arg Lys Gln65 70 75 80gcc att cct act caa cag gaa ctg gta cgt gct cct gaa gat cag gta 288Ala Ile Pro Thr Gln Gln Glu Leu Val Arg Ala Pro Glu Asp Gln Val85 90 95
gac cca ctt agt gaa gat gaa gat tcg ccc gta ccc gga ctg act cat 336Asp Pro Leu Ser Glu Asp Glu Asp Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His100 105 110cgt tat ccg gat cgt gta ttg ttc ctt atc acg gac aaa tgt tcg atg 384Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe Leu Ile Thr Asp Lys Cys Ser Met115 120 125tac tgt cgt cat tgt act cgc cgt cgc ttc gca gga cag aaa gat gct 432Tyr Cys Arg His Cys Thr Arg Arg Arg Phe Ala Gly Gln Lys Asp Ala130 135 140tct tct cct tct gag cgc atc gat cga tgc att gac tat ata gcc aat 480Ser Ser Pro Ser Glu Arg Ile Asp Arg Cys Ile Asp Tyr Ile Ala Asn145 150 155 160aca ccg aca gtc cgc gat gtt ttg cta tcg gga ggc gat gcc ctc ctt 528Thr Pro Thr Val Arg Asp Val Leu Leu Ser Gly Gly Asp Ala Leu Leu165 170 175gtc agc gac gaa cgc ttg gaa tac ata ttg aag cgt ctg cgc gaa ata 576Val Ser Asp Glu Arg Leu Glu Tyr Ile Leu Lys Arg Leu Arg Glu Ile180 185 190cct cat gtg gag att gtt cgt ata gga agc cgt acg ccg gta gtc ctc 624Pro His Val Glu Ile Val Arg Ile Gly Ser Arg Thr Pro Val Val Leu195 200 205cct cag cgt ata acg cct caa ttg gtg gat atg ctc aaa aaa tat cat 672Pro Gln Arg Ile Thr Pro Gln Leu Val Asp Met Leu Lys Lys Tyr His210 215 220ccg gtg tgg ctg aac act cac ttc aac cac ccg aat gaa gtt acc gaa 720Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe Asn His Pro Asn Glu Val Thr Glu225 230 235 240gaa gca gta gag gct tgt gaa aga atg gcc aat gcc ggt att ccg ttg 768Glu Ala Val Glu Ala Cys Glu Arg Met Ala Asn Ala Gly Ile Pro Leu245 250 255ggt aac caa acg gtt tta ttg cgt gga atc aat gat tgt aca cat gtg 816Gly Asn Gln Thr Val Leu Leu Arg Gly Ile Asn Asp Cys Thr His Val260 265 270atg aag aga ttg gta cat ttg ctg gta aag atg cgt gtg cgt cct tac 864Met Lys Arg Leu Val His Leu Leu Val Lys Met Arg Val Arg Pro Tyr275 280 285tat ata tat gta tgc gat ctt tcg ctt gga ata ggt cat ttc cgc acg 912Tyr Ile Tyr Val Cys Asp Leu Ser Leu Gly Ile Gly His Phe Arg Thr290 295 300
ccg gta tct aaa gga atc gaa att atc gaa aat ttg cgc gga cac acc 960Pro Val Ser Lys Gly Ile Glu Ile Ile Glu Asn Leu Arg Gly His Thr305 310 315 320tcg ggc tat gca gtt cct acc ttt gtg gta ggt gct ccg ggg ggt ggt 1008Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe Val Val Gly Ala Pro Gly Gly Gly325 330 335ggt aag ata cct gta acg ccg aac tat gtt gta tct cag tcc cca cga 1056Gly Lys Ile Pro Val Thr Pro Asn Tyr Val Val Ser Gln Ser Pro Arg340 345 350cat gtg gtt ctt cgc aat tat gaa ggt gtt atc aca acc tat acg gag 1104His Val Val Leu Arg Asn Tyr Glu Gly Val Ile Thr Thr Tyr Thr Glu355 360 365ccg gag aat tat cat gag gag tgc gat tgt gag gac tgt cga gcc ggt 1152Pro Glu Asn Tyr His Glu Glu Cys Asp Cys Glu Asp Cys Arg Ala Gly370 375 380aag cat aaa gag ggt gta gct gca ctt tcc gga ggt cag cag ttg gct 1200Lys His Lys Glu Gly Val Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gln Gln Leu Ala385 390 395 400atc gag cct tcc gac tta gct cgc aaa aaa cgc aag ttt gat aag aac 1248Ile Glu Pro Ser Asp Leu Ala Arg Lys Lys Arg Lys Phe Asp Lys Ash405 410 415tga 1251<210>30<211>416<212>PRT<213>牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)<400>30Met Ala Glu Ser Arg Arg Lys Tyr Tyr Phe Pro Asp Val Thr Asp Glu1 5 10 15Gln Trp Tyr Asp Trp His Trp Gln Val Leu Asn Arg Ile Glu Thr Leu20 25 30Asp Gln Leu Lys Lys Tyr Val Thr Leu Thr Ala Glu Glu Glu Glu Gly35 40 45
Val Lys Glu Ser Pro Lys Val Leu Arg Met Ala Ile Thr Pro Tyr Tyr50 55 60Leu Ser Leu Ile Asp Pro Glu Asn Pro Asn Cys Pro Ile Arg Lys Gln65 70 75 80Ala Ile Pro Thr Gln Gln Glu Leu Val Arg Ala Pro Glu Asp Gln Val85 90 95Asp Pro Leu Ser Glu Asp Glu Asp Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His100 105 110Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe Leu Ile Thr Asp Lys Cys Ser Met115 120 125Tyr Cys Arg His Cys Thr Arg Arg Arg Phe Ala Gly Gln Lys Asp Ala130 135 140Ser Ser Pro Ser Glu Arg Ile Asp Arg Cys Ile Asp Tyr Ile Ala Asn145 150 155 160Thr Pro Thr Val Arg Asp Val Leu Leu Ser Gly Gly Asp Ala Leu Leu165 170 175Val Ser Asp Glu Arg Leu Glu Tyr Ile Leu Lys Arg Leu Arg Glu Ile180 185 190Pro His Val Glu Ile Val Arg Ile Gly Ser Arg Thr Pro Val Val Leu195 200 205Pro Gln Arg Ile Thr Pro Gln Leu Val Asp Met Leu Lys Lys Tyr His210 215 220Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe Asn His Pro Asn Glu Val Thr Glu225 230 235 240Glu Ala Val Glu Ala Cys Glu Arg Met Ala Asn Ala Gly Ile Pro Leu245 250 255
Gly Asn Gln Thr Val Leu Leu Arg Gly Ile Asn Asp Cys Thr His Val260 265 270Met Lys Arg Leu Val His Leu Leu Val Lys Met Arg Val Arg Pro Tyr275 280 285Tyr Ile Tyr Val Cys Asp Leu Ser Leu Gly Ile Gly His Phe Arg Thr290 295 300Pro Val Ser Lys Gly Ile Glu Ile Ile Glu Asn Leu Arg Gly His Thr305 310 315 320Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe Val Val Gly Ala Pro Gly Gly Gly325 330 335Gly Lys Ile Pro Val Thr Pro Asn Tyr Val Val Ser Gln Ser Pro Arg340 345 350His Val Val Leu Arg Asn Tyr Glu Gly Val Ile Thr Thr Tyr Thr Glu355 360 365Pro Glu Asn Tyr His Glu Glu Cys Asp Cys Glu Asp Cys Arg Ala Gly370 375 380Lys His Lys Glu Gly Val Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gln Gln Leu Ala385 390 395 400Ile Glu Pro Ser Asp Leu Ala Arg Lys Lys Arg Lys Phe Asp Lys Asn405 410 415<210>31<211>471<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>31Met Lys Asn Lys Trp Tyr Lys Pro Lys Arg His Trp Lys Glu Ile Glu1 5 10 15
Leu Trp Lys Asp Val Pro Glu Glu Lys Trp Asn Asp Trp Leu Trp Gln20 25 30Leu Thr His Thr Val Arg Thr Leu Asp Asp Leu Lys Lys Val Ile Asn35 40 45Leu Thr Glu Asp Glu Glu Glu Gly Val Arg Ile Ser Thr Lys Thr Ile50 55 60Pro Leu Asn Ile Thr Pro Tyr Tyr Ala Ser Leu Met Asp Pro Asp Asn65 70 75 80Pro Arg Cys Pro Val Arg Met Gln Ser Val Pro Leu Ser Glu Glu Met85 90 95His Lys Thr Lys Tyr Asp Leu Glu Asp Pro Leu His Glu Asp Glu Asp100 105 110Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe115 120 125Leu Val Thr Asn Gln Cys Ser Met Tyr Cys Arg Tyr Cys Thr Arg Arg130 135 140Arg Phe Ser Gly Gln Ile Gly Met Gly Val Pro Lys Lys Gln Leu Asp145 150 155 160Ala Ala Ile Ala Tyr Ile Arg Glu Thr Pro Glu Ile Arg Asp Cys Leu165 170 175Ile Ser Gly Gly Asp Gly Leu Leu Ile Asn Asp Gln Ile Leu Glu Tyr180 185 190Ile Leu Lys Glu Leu Arg Ser Ile Pro His Leu Glu Val Ile Arg Ile195 200 205Gly Thr Arg Ala Pro Val Val Phe Pro Gln Arg Ile Thr Asp His Leu210 215 220
Cys Glu Ile Leu Lys Lys Tyr His Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe225 230 235 240Asn Thr Ser Ile Glu Met Thr Glu Glu Ser Val Glu Ala Cys Glu Lys245 250 255Leu Val Asn Ala Gly Val Pro Val Gly Asn Gln Ala Val Val Leu Ala260 265 270Gly Ile Asn Asp Ser Val Pro Ile Met Lys Lys Leu Met His Asp Leu275 280 285Val Lys Ile Arg Val Arg Pro Tyr Tyr Ile Tyr Gln Cys Asp Leu Ser290 295 300Glu Gly Ile Gly His Phe Arg Ala Pro Val Ser Lys Gly Leu Glu Ile305 310 315 320Ile Glu Gly Leu Arg Gly His Thr Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe325 330 335Val Val Asp Ala Pro Gly Gly Gly Gly Lys Ile Ala Leu Gln Pro Asn340 345 350Tyr Val Leu Ser Gln Ser Pro Asp Lys Val Ile Leu Arg Asn Phe Glu355 360 365Gly Val Ile Thr Ser Tyr Pro Glu Pro Glu Asn Tyr Ile Pro Asn Gln370 375 380Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Ser Val Phe Pro Glu Thr Ala Asp Lys Lys385 390 395 400Glu Pro Ile Gly Leu Ser Ala Ile Phe Ala Asp Lys Glu Val Ser Phe405 410 415Thr Pro Glu Asn Val Asp Arg Ile Lys Arg Arg Glu Ala Tyr Ile Ala
420 425 430Asn Pro Glu His Glu Thr Leu Lys Asp Arg Arg Glu Lys Arg Asp Gln435 440 445Leu Lys Glu Lys Lys Phe Leu Ala Gln Gln Lys Lys Gln Lys Glu Thr450 455 460Glu Cys Gly Gly Asp Ser Ser465 470<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>32cgcattcaag tcaaagacgt tcaggcta28<210>33<211>1387<212>DNA<213>糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)<220>
<221>CDS<222>(408)..(1304)<223>
<400>33cattacacag gctctgcagc agtggcaggg cagtgccgac ccctggttgt cccgtgccgc 60gcaaaccttc gccaaaggtg cgcctggttc ggctcgtttg tcctttgagc tgctggagag120ggtgcatcac ctgtctttgg ccgatgtttt ccgtctggaa tacattgtgt cgctgcaatg180tggcgtacag ggcgacttcc aggaaggcat acgggcactg ctgattgata aagacaaaca240gccgcgctgg aatcctgcct cgctggaaca ggcggatgca cgctgggtgg aacgtttttt300tgttcctgcc tggccggcag aaacgactca tcccttggct gacctgtaac ccaggcagac360
cgctgcggcg ccagacggcg ccgctttcat aatgacgagg agacaaa atg agt aac 416Met Ser Asn1acg att gca ttt atc ggg ctg ggc cat atg ggt aaa ccc atg gcg ctg 464Thr Ile Ala Phe Ile Gly Leu Gly His Met Gly Lys Pro Met Ala Leu5 l0 15aat ctg ctc aaa gcc ggt cat agc ctg aac gtc ttt gac ttg aat gcg 512Asn Leu Leu Lys Ala Gly His Ser Leu Asn Val Phe Asp Leu Asn Ala20 25 30 35caa gcc atg cag gaa ctg cag gca gca ggg gca cag gtg ggg gaa tcg 560Gln Ala Met Gln Glu Leu Gln Ala Ala Gly Ala Gln Val Gly Glu Ser40 45 50gcg gtg caa atc gcc caa gac gcg cag atg gtc ttt acc atg ctg cct 608Ala Val Gln Ile Ala Gln Asp Ala Gln Met Val Phe Thr Met Leu Pro55 60 65gct ggc cgc cat gtt cgt cag gtt tac gag ggc gag aac ggc ttg ctg 656Ala Gly Arg His Val Arg Gln Val Tyr Glu Gly Glu Asn Gly Leu Leu70 75 80cag act gtg gcc ccc ggt acg gtg ctg gtc gat tgc agc acc att gat 704Gln Thr Val Ala Pro Gly Thr Val Leu Val Asp Cys Ser Thr Ile Asp85 90 95gcg caa acc agc cag gat ctg gcg gcc aaa gcc agc aag ctg ggt ctg 752Ala Gln Thr Ser Gln Asp Leu Ala Ala Lys Ala Ser Lys Leu Gly Leu100 105 110 115ttc atg ctg gat gcg ccg gtc tcc ggt ggg acc ggt ggc gcc att gct 800Phe Met Leu Asp Ala Pro Val Ser Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ile Ala120 125 130ggc acc ttg acc ttt atg gtc ggg ggc gag gat cag gcc ctg gaa aag 848Gly Thr Leu Thr Phe Met Val Gly Gly Glu Asp Gln Ala Leu Glu Lys135 140 145gcg cgc cct tac ttg gat gcc atg ggc aag aac att ttc cac gcg ggt 896Ala Arg Pro Tyr Leu Asp Ala Met Gly Lys Asn Ile Phe His Ala Gly150 155 160aaa gcc ggt gcg ggt cag gtt gcc aag att tgc aac aat atg ctc ttg 944Lys Ala Gly Ala Gly Gln Val Ala Lys Ile Cys Asn Asn Met Leu Leu165 170 175ggg att ttg atg gcg ggt act gct gaa gcc ttg gct ttg ggc gtt gcc 992Gly Ile Leu Met Ala Gly Thr Ala Glu Ala Leu Ala Leu Gly Val Ala180 185 190 195
cac ggt ctg gac cct gcc gtg ctg tcg acc atc atg gcg cgc agt tcc 1040His Gly Leu Asp Pro Ala Val Leu Ser Thr Ile Met Ala Arg Ser Ser200 205 210ggt cga aac tgg gca acc gag ctg tac aac ccc tgg cct ggg gtg atg 1088Gly Arg Asn Trp Ala Thr Glu Leu Tyr Asn Pro Trp Pro Gly Val Met215 220 225ccg gat gta ccg gct tcg cgt gat tat cag ggc ggt ttt gcg acg ggc 1136Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Asp Tyr Gln Gly Gly Phe Ala Thr Gly230 235 240ctg atg ctc aaa gac ctg ggt ctg gca gcc gat gcg gct gtc agc cag 1184Leu Met Leu Lys Asp Leu Gly Leu Ala Ala Asp Ala Ala Val Ser Gln245 250 255aac agc gcg acg cct ttg ggc gaa ctg gca cgt aac ctg ttc gcc ttg 1232Asn Ser Ala Thr Pro Leu Gly Glu Leu Ala Arg Asn Leu Phe Ala Leu260 265 270 275cac gcc gca caa ggt cag aat gca ggg ctg gat ttc tcc agc att ctt 1280His Ala Ala Gln Gly Gln Asn Ala Gly Leu Asp Phe Ser Ser Ile Leu280 285 290aat ttg tac cgt cag aag cac taa gttctggcag tgcgtagggc aggggctgca1334Asn Leu Tyr Arg Gln Lys His295gttccagcgc ctgtccttgc tccaattgaa actggccttg ttccaggtcc gcc 1387<210>34<211>298<212>PRT<213>糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)<400>34Met Ser Asn Thr Ile Ala Phe Ile Gly Leu Gly His Met Gly Lys Pro1 5 10 15Met Ala Leu Asn Leu Leu Lys Ala Gly His Ser Leu Asn Val Phe Asp20 25 30Leu Asn Ala Gln Ala Met Gln Glu Leu Gln Ala Ala Gly Ala Gln Val35 40 45
Gly Glu Ser Ala Val Gln Ile Ala Gln Asp Ala Gln Met Val Phe Thr50 55 60Met Leu Pro Ala Gly Arg His Val Arg Gln Val Tyr Glu Gly Glu Asn65 70 75 80Gly Leu Leu Gln Thr Val Ala Pro Gly Thr Val Leu Val Asp Cys Ser85 90 95Thr Ile Asp Ala Gln Thr Ser Gln Asp Leu Ala Ala Lys Ala Ser Lys100 105 110Leu Gly Leu Phe Met Leu Asp Ala Pro Val Ser Gly Gly Thr Gly Gly115 120 125Ala Ile Ala Gly Thr Leu Thr Phe Met Val Gly Gly Glu Asp Gln Ala130 135 140Leu Glu Lys Ala Arg Pro Tyr Leu Asp Ala Met Gly Lys Asn Ile Phe145 150 155 160His Ala Gly Lys Ala Gly Ala Gly Gln Val Ala Lys Ile Cys Asn Asn165 170 175Met Leu Leu Gly Ile Leu Met Ala Gly Thr Ala Glu Ala Leu Ala Leu180 185 190Gly Val Ala His Gly Leu Asp Pro Ala Val Leu Ser Thr Ile Met Ala195 200 205Arg Ser Ser Gly Arg Asn Trp Ala Thr Glu Leu Tyr Asn Pro Trp Pro210 215 220Gly Val Met Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Asp Tyr Gln Gly Gly Phe225 230 235 240Ala Thr Gly Leu Met Leu Lys Asp Leu Gly Leu Ala Ala Asp Ala Ala245 250 255
Val Ser Gln Asn Ser Ala Thr Pro Leu Gly Glu Leu Ala Arg Asn Leu260 265 270Phe Ala Leu His Ala Ala Gln Gly Gln Asn Ala Gly Leu Asp Phe Ser275 280 285Ser Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Gln Lys His290 295<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>35gggaattcca tatggtaggt aaaaaggttg tacatc 36<210>36<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>36cgacggatcc attcgtccgc ttgaataact aaag34<210>37<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>37cgacggatcc cgaaaatgtc accaaaaatt attgag 36<210>38<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>38agagagcata tgtcttttca ccttcggc 28<210>39<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>39agagagggat ccgcggctcc cacaatgttg aaatg 35<210>40<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>40agagagcata tgacaaataa tgaaagcaaa gg 32<210>41<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>41gggaattcca tatgagaaaa gtagaaatca ttacagctg 39<210>42<211>38<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>42acgttgatct ccttctacat tattttttca gtcccatg38<210>43<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>43catgggactg aaaaaataat gtagaaggag atcaacgt38<210>44<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>44cgacggatcc tcaacgacca ctgaagttgg 30<210>45<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>45ctagtctaga gctttctaag aaacgatttc cg 32<210>46<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物
<400>46gggaattcca tatgcgtaac ttcctcctgc tatcattcac cggggtgctt tct53<210>47<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>47ctagtctaga ggaaaccgct taacgaactc 30<210>48<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>48gggaattcca tatgcgtaac ttcctcctgc tattattgag ggtgctttgc atcc 54<210>49<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>49ccggaattct ttaatatgcg atttggagga g31<210>50<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>50gtccgtctcc ctttcagctt aaatcgctat tcttatagc39
<210>51<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>51gctataagaa tagcgattta agctgaaagg gagacggac39<210>52<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>52cgacggatcc gcagtgagtg agccttggag 30<210>53<211>435<212>DNA<213>丙酸梭菌(Clostridium propionicum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(435)<223>
<400>53atg gta ggt aaa aag gtt gta cat cat tta atg atg agc gca aaa gac 48Met Val Gly Lys Lys Val Val His His Leu Met Met Ser Ala Lys Asp1 5 10 15gct cac tat act gga aac tta gta aac ggc gct aga atc gtg aat cag 96Ala His Tyr Thr Gly Asn Leu Val Asn Gly Ala Arg Ile Val Asn Gln20 25 30tgg ggc gac gta ggt aca gaa tta atg gtt tat gtt gat ggt gac atc 144Trp Gly Asp Val Gly Thr Glu Leu Met Val Tyr Val Asp Gly Asp Ile35 40 45agc tta ttc ttg ggc tac aaa gat atc gaa ttc aca gct cct gta tat 192Ser Leu Phe Leu Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr Ala Pro Val Tyr
50 55 60gtt ggt gat ttt atg gaa tac cac ggc tgg att gaa aaa gtt ggc aac 240Val Gly Asp Phe Met Glu Tyr His Gly Trp Ile Glu Lys Val Gly Asn65 70 75 80cag tcc tat aca tgt aaa ttt gaa gca tgg aaa gta gca aag atg gtt 288Gln Ser Tyr Thr Cys Lys Phe Glu Ala Trp Lys Val Ala Lys Met Val85 90 95gat atc aca aat cca cag gat aca cgt gca aca gct tgt gaa cct ccg 336Asp Ile Thr Asn Pro Gln Asp Thr Arg Ala Thr Ala Cys Glu Pro Pro100 105 110gta ctt tgt ggt act gca aca ggc agc ctt ttc atc gca aag gat aat 384Val Leu Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ser Leu Phe Ile Ala Lys Asp Asn115 120 125cag aga ggt cct cag gaa tct tcc ttc aag gat gca aag cac cct caa 432Gln Arg Gly Pro Gln Glu Ser Ser Phe Lys Asp Ala Lys His Pro Gln130 135 140taa 435<210>54<211>144<212>PRT<213>丙酸梭菌(Clostridium propionicum)<400>54Met Val Gly Lys Lys Val Val His His Leu Met Met Ser Ala Lys Asp1 5 10 15Ala His Tyr Thr Gly Asn Leu Val Asn Gly Ala Arg Ile Val Asn Gln20 25 30Trp Gly Asp Val Gly Thr Glu Leu Met Val Tyr Val Asp Gly Asp Ile35 40 45Ser Leu Phe Leu Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr Ala Pro Val Tyr50 55 60Val Gly Asp Phe Met Glu Tyr His Gly Trp Ile Glu Lys Val Gly Asn65 70 75 80
Gln Ser Tyr Thr Cys Lys Phe Glu Ala Trp Lys Val Ala Lys Met Val85 90 95Asp Ile Thr Asn Pro Gln Asp Thr Arg Ala Thr Ala Cys Glu Pro Pro100 105 110Val Leu Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ser Leu Phe Ile Ala Lys Asp Asn115 120 125Gln Arg Gly Pro Gln Glu Ser Ser Phe Lys Asp Ala Lys His Pro Gln130 135 140<210>55<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>55aaggaaaaaa gcggccgcag attaaaggag gaattctcaa tgg 43<210>56<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>56ctagtctaga tcaacgacca ctgaagttgg 30<210>57<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>57aaggaaaaaa gcggccgctt taatatgcga tttggaggag 40
<210>58<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>58ctagtctaga gcagtgagtg agccttggag 30<210>59<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>59cacacagaat tcattaaaga ggag 24<210>60<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>60cataatcaaa ctcaaagtca accatataag atctcctcct tacttcatga agaatcccct60cc 62<210>61<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PRC引物<400>61ggaggggatt cttcatgaag taaggaggag atcttatatg gttgactttg agtttgatta60
tg 62<210>62<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>62cgtgttactc attttgtctc ctcgtcattt acttgaagtc tgctaagata c 51<210>63<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>63gtatcttagc agacttcaag taaatgacga ggagacaaaa tgagtaacac g 51<210>64<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>64tcattcaccc gtgaggccat gaatatatct ccttcttaag cttagtgctt ctgacggtac60<210>65<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>65gtaccgtcag aagcactaag cttaagaagg agatatattc atggcctcac gggtgaatga60
<210>66<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>66gactagatat ctcaggagta ctcatgggtg aa 3權(quán)利要求
1.一種含有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一種外源核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的核酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中的外源核酸分子是突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中的外源核酸分子是突變的亮氨酸2，3-氨基變位酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中的外源核酸分子是突變的賴氨酸5，6-氨基變位酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的核酸序列包含SEQ ID NO20中所示的核苷酸307-1017或SEQ ID NO29中所示的核苷酸55-1026。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中包含SEQ ID NO20的核苷酸307-1017或SEQ ID NO29的核苷酸55-1026的核酸包括產(chǎn)生一或多個(gè)保守氨基酸取代的一或多個(gè)取代。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中包含SEQ ID NO20的核苷酸307-1017或SEQ ID NO29的核苷酸55-1026的核酸包括產(chǎn)生不多于10個(gè)保守氨基酸取代的一或多個(gè)取代。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的核酸序列包含與SEQ ID NO20或SEQ ID NO29具有至少90％同一性的序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的核酸序列包含與SEQ ID NO20或SEQ ID NO29具有至少95％同一性的序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的核酸序列包含SEQ ID NO20或SEQ ID NO29。
13.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞，其中突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶是突變的原核生物的賴氨酸2，3-氨基變位酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中突變的原核生物的賴氨酸2，3-氨基變位酶是突變的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)或大腸桿菌(Escherichiacoli)賴氨酸2，3-氨基變位酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶是突變的枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中突變的枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶包含L103M、L103K、L103R、L103E或L103S取代。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中突變的枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶包含L103M、M136V取代、D339H取代或其任意的組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中突變的枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶包含D339H、D339Q、D339T或D339N取代。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶是突變的牙齦卟啉單胞菌賴氨酸2，3-氨基變位酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的細(xì)胞，其中突變的牙齦卟啉單胞菌賴氨酸2，3-氨基變位酶包含N19Y取代、L53P取代、H85Q取代、D331G取代、M342T取代或其任意的組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中突變的賴氨酸5，6-氨基變位酶是突變的斯氏梭菌(C.sticklandii)賴氨酸5，6-氨基變位酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中細(xì)胞是原核的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的細(xì)胞，其中原核細(xì)胞是乳酸桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽孢桿菌(Bacillus)或埃希氏菌(Escherichia)細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的細(xì)胞，其中原核細(xì)胞是大腸桿菌或地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生3-羥丙酸(3-HP)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中細(xì)胞進(jìn)一步含有CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶活性；β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性；和3HP-CoA脫水酶活性。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的細(xì)胞，其中細(xì)胞進(jìn)一步包含3-羥丙?；?CoA水解酶，和/或3-羥異丁?；?CoA水解酶活性。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中細(xì)胞進(jìn)一步包含4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性；和3-HP脫氫酶活性或3-羥異丁酸脫氫酶活性。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中細(xì)胞進(jìn)一步包含CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶活性；β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性；3-羥丙?；?CoA脫水酶活性；3-羥丙酰基-CoA水解酶，和/或3-羥異丁?；?CoA水解酶活性；和脂肪酶和/或酯酶活性。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的細(xì)胞，其中細(xì)胞產(chǎn)生3-HP的酯。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中3-HP的酯是3-羥丙酸甲酯、3-羥丙酸乙酯、3-羥丙酸丙酯、3-羥丙酸丁酯或3-羥丙酸2-乙基己酯。
33.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含CoA轉(zhuǎn)移酶活性；β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性；3-羥丙?；?CoA脫水酶活性；和聚羥酸合酶活性。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生聚合的3-HP。
35.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含CoA轉(zhuǎn)移酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；和聚羥酸合酶活性。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生聚合的丙烯酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含CoA轉(zhuǎn)移酶活性；β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性；和脂肪酶和/或酯酶活性。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞生產(chǎn)丙烯酸的酯。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中丙烯酸的酯是丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯或丙烯酸丁酯。
40.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生1，3-丙二醇。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶活性；β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性；3-羥丙酰基-CoA脫水酶活性；乙?；㎞AD(+)氧化還原酶活性；和醇NAD(+)氧化還原酶活性。
42.根據(jù)權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含CoA轉(zhuǎn)移酶活性；β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性；3-羥丙酰基-CoA脫水酶活性；3-羥丙?；?CoA水解酶，和/或3-羥異丁?；?CoA水解酶活性；醛脫氫酶(NAD(P)+)活性；和醇脫氫酶活性。
43.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生泛酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的細(xì)胞，進(jìn)一步包含α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、α-酮泛酸還原酶和泛酸合酶活性。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生輔酶A(CoA)。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的細(xì)胞，進(jìn)一步包含泛酸激酶、4’-磷酸羥泛酰基-1-半胱氨酸合成酶、4’-磷酸泛酰半胱氨酸脫羧酶、ATP4’-磷酸泛酰巰基乙胺腺甘?；D(zhuǎn)移酶和去磷酸基-CoA激酶活性。
47.一種包含丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的多肽，其中所述多肽包含突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶氨基酸序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的多肽，其中突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶的氨基酸序列是突變的枯草芽孢桿菌、耐放射異常球菌、近端梭菌、牙齦卟啉單胞菌或大腸桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的多肽，其中突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶的氨基酸序列是突變的枯草芽孢桿菌或突變的牙齦卟啉單胞菌賴氨酸2，3-氨基變位酶。
51.根據(jù)權(quán)利要求47的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO21中所示的氨基酸50-390或SEQ ID NO30中所示的氨基酸15-390。
52.根據(jù)權(quán)利要求47的多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO21或30具有至少90％序列同一性的序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO21或30具有至少95％序列同一性的序列。
54.權(quán)利要求52的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO21或30。
55.權(quán)利要求52的多肽，其中所述多肽包含一或多個(gè)保守的氨基酸取代。
56.權(quán)利要求52的多肽，其中所述多肽包含不多于10個(gè)的保守氨基酸取代。
57.一種包含編碼權(quán)利要求47多肽的核酸序列的分離核酸。
58.權(quán)利要求57的分離核酸，可操作地連接于啟動(dòng)子序列。
59.根據(jù)權(quán)利要求57的分離核酸，其中所述核酸包含SEQ IDNO20的核苷酸307-1017或SEQ ID NO29的核苷酸55-1026。
60.根據(jù)權(quán)利要求57的分離核酸，其中所述核酸包含與SEQ IDNO20或SEQ ID NO29具有至少90％同一性的序列。
61.根據(jù)權(quán)利要求57的分離核酸，其中所述核酸包含與SEQ IDNO20或SEQ ID NO29具有至少95％同一性的序列。
62.根據(jù)權(quán)利要求60的分離核酸，其中所述核酸序列包括導(dǎo)致一或多個(gè)保守的氨基酸取代的一或多個(gè)取代。
63.根據(jù)權(quán)利要求60的分離核酸，其中所述核酸序列包括導(dǎo)致不多于10個(gè)保守氨基酸取代的一或多個(gè)取代。
64.根據(jù)權(quán)利要求61的分離核酸，其中所述核酸包含SEQ IDNO20或29。
65.一種包含權(quán)利要求57德分離核酸的載體。
66.一種包含權(quán)利要求57德分離核酸的重組核酸。
67.一種用權(quán)利要求66的重組核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
68.一種包含權(quán)利要求57德重組核酸的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。
69.包含至少一種外源核酸分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述至少一種外源核酸分子包含編碼權(quán)利要求47德多肽的核酸序列。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述細(xì)胞由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞生產(chǎn)3-HP。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生1，3-丙二醇。
73.根據(jù)權(quán)利要求70的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生泛酸。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生CoA。
75.一種特異性結(jié)合權(quán)利要求47德多肽的特異性結(jié)合劑。
76.一種生產(chǎn)含由丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽的方法，包括在使細(xì)胞產(chǎn)生含有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求67的細(xì)胞。
77.一種由α-丙氨酸制備β-丙氨酸的方法，包括在使細(xì)胞由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1的細(xì)胞。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的方法，其中所述細(xì)胞包含至少一種編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的外源核酸分子，其中所述丙氨酸2，3-氨基變位酶能夠由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
80.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述細(xì)胞是酵母、乳酸桿菌、乳球菌、芽孢桿菌或埃希氏菌細(xì)胞。
81.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述細(xì)胞包含panD的功能性缺失。
82.一種鑒定含有丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的細(xì)胞的方法，包括在不含β-丙氨酸和泛酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)功能性缺失panD的細(xì)胞；和鑒定能夠在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞，其中細(xì)胞的生長(zhǎng)表明細(xì)胞由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸，這表明細(xì)胞包含丙氨酸2，3-氨基變位酶活性，且其中缺少細(xì)胞的生長(zhǎng)則表明細(xì)胞未由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸，這表明細(xì)胞不包含丙氨酸2，3-氨基變位酶活性。
83.根據(jù)權(quán)利要求82的方法，進(jìn)一步包括在培養(yǎng)細(xì)胞的步驟前用一種或多種突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
84.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中一種或多種突變的原核生物的賴氨酸2，3-氨基變位酶是突變的枯草芽孢桿菌、耐放射異常球菌、近端梭菌、嗜熱產(chǎn)液菌(Aquifex aeolicus)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza)、大腸桿菌和/或牙齦卟啉單胞菌賴氨酸2，3-氨基變位酶。
85.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中一種或多種突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶是突變的枯草芽孢桿菌賴氨酸2，3-氨基變位酶。
86.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，進(jìn)一步包括在鑒定在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞之后，鑒定一種或多種賦予細(xì)胞丙氨酸2，3-氨基變位酶活性的突變賴氨酸2，3-氨基變位酶中的突變。
87.根據(jù)權(quán)利要求86的方法，對(duì)一種或多種突變賴氨酸2，3-氨基變位酶中的突變進(jìn)行鑒定包括對(duì)一種或多種突變的賴氨酸2，3-氨基變位酶進(jìn)行測(cè)序。
88.根據(jù)權(quán)利要求82的方法，其中細(xì)胞是原核細(xì)胞。
89.一種制備3-HP的方法，包括在細(xì)胞產(chǎn)生3-HP的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1的細(xì)胞。
90.根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中細(xì)胞包括至少一種編碼丙氨酸2，3-氨基變位酶的外源核酸以使3-HP產(chǎn)生自β-丙氨酸，其中丙氨酸2，3-氨基變位酶由α-丙氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸。
91.根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中細(xì)胞進(jìn)一步包含CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶活性；β-丙氨?；?CoA氨裂解酶活性；3-HP-CoA脫水酶活性；和，3-羥丙?；?CoA水解酶，和/或3-羥異丁酰基-CoA水解酶活性。
92.根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中細(xì)胞進(jìn)一步包含4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性；和3-HP脫氫酶活性和/或3-羥丁酸脫氫酶活性。
93.一種制備1，3-丙二醇的方法，包括在其中細(xì)胞產(chǎn)生1，3-丙二醇的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求40的細(xì)胞。
94.一種制備泛酸的方法，包括在其中細(xì)胞產(chǎn)生泛酸的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求43的細(xì)胞。
95.一種制備CoA的方法，包括在其中細(xì)胞產(chǎn)生CoA的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求45的細(xì)胞。
96.一種制備3-HP的方法，包括從權(quán)利要求1的細(xì)胞純化β-丙氨酸；將β-丙氨酸與包含CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽接觸以形成β-丙氨酰基-CoA；將β-丙氨酰基-CoA與包含β-丙氨酰-CoA氨裂解酶活性的多肽接觸以形成丙烯?；?CoA；將丙烯?；?CoA與包含3HP-CoA脫水酶活性的多肽接觸以形成3-HP-CoA；和將3-HP-CoA與包含CoA轉(zhuǎn)移酶活性、3-羥丙?；?CoA水解酶，和/或3-羥異丁?；?CoA水解酶活性的多肽接觸以產(chǎn)生3-HP。
97.一種制備3-HP的方法，包括從權(quán)利要求1的細(xì)胞純化β-丙氨酸；將β-丙氨酸與包含4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽接觸以形成丙二酸半醛；和將丙二酸半醛與包含3-HP脫氫酶和/或3-羥異丁酸脫氫酶活性的多肽接觸以產(chǎn)生3-HP。
98.一種制備3-HP的方法，包括用編碼包含CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的核酸，和編碼包含β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性的多肽的核酸，以及編碼包含CoA轉(zhuǎn)移酶活性、3-羥丙酰基-CoA水解酶，和/或3-羥異丁酰-CoA水解酶活性的多肽的核酸轉(zhuǎn)染權(quán)利要求1的細(xì)胞；和培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以使轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生3-HP。
99.一種制備3-HP的方法，包括用編碼包含4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的核酸和編碼包含3-HP脫氫酶和/或3-羥基異丁酸脫氫酶活性的多肽的核酸轉(zhuǎn)染權(quán)利要求1的細(xì)胞；和培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以使所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生3-HP。
100.一種由3-HP制備1，3-丙二醇的方法，包括用權(quán)利要求97的方法制備3-HP；將3-HP與包含乙?；㎞AD(+)氧化還原酶活性的多肽和包含醇NAD(+)氧化還原酶活性的多肽接觸。
101.一種制備1，3-丙二醇的方法，包括用編碼包含CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶活性的多肽的核酸；編碼包含β-丙氨酰-CoA氨裂解酶活性的多肽的核酸；編碼包含3-羥丙酰-CoA水解酶，和/或3-羥異丁酰-CoA水解酶活性的多肽的核酸；編碼包含乙?；㎞AD(+)氧化還原酶活性的多肽的核酸；和編碼包含醇NAD(+)氧化還原酶活性的多肽的核酸轉(zhuǎn)染權(quán)利要求1的細(xì)胞；以及培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以使所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生1，3-丙二醇。
102.一種制備1，3-丙二醇的方法，包括用編碼包含CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶活性的多肽的核酸；編碼包含β-丙氨酰-CoA氨裂解酶活性的多肽的核酸；編碼包含3-羥丙酰-CoA脫水酶活性的多肽的核酸；編碼包含3-羥丙酰-CoA水解酶，和/或3-羥異丁酰-CoA水解酶活性的多肽的核酸；編碼包含醛脫氫酶(NAD(P)+)活性的多肽的核酸；編碼包含醇脫氫酶活性的多肽的核酸轉(zhuǎn)染權(quán)利要求1的細(xì)胞；以及培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以使所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生1，3-丙二醇。
103.一種制備泛酸的方法，包括由權(quán)利要求1的細(xì)胞純化β-丙氨酸；和將β-丙氨酸與α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、α-酮泛酸還原酶和泛酸合酶接觸以制備泛酸。
104.制備泛酸的方法，包括用編碼包含α-酮泛酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的核酸，編碼包含α-酮泛酸還原酶活性的多肽的核酸，和編碼包含泛酸合酶活性的多肽的核酸轉(zhuǎn)染權(quán)利要求1的細(xì)胞；和培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以使轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生泛酸。
105.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
106.含有權(quán)利要求104的細(xì)胞的植物。
106.一種包含權(quán)利要求57的重組核酸的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了丙氨酸2，3－氨基變位酶的序列，以及含有丙氨酸2，3－氨基變位酶活性的細(xì)胞和篩選所述細(xì)胞的方法。本發(fā)明也公開了生產(chǎn)β－丙氨酸、泛酸、3－羥丙酸以及其它有機(jī)化合物的方法。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1714146SQ03804939
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2003年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月18日
發(fā)明者漢斯·H·廖, 拉維·R·戈卡恩, 史蒂文·J·戈特, 奧利·J·耶森, 奧爾加·謝利豐諾娃 申請(qǐng)人:卡吉爾公司