專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)生靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物滋養(yǎng)層的方法
相關(guān)申請(qǐng)的參照此專(zhuān)利申請(qǐng)要求提交于2002年3月15日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/365,136的權(quán)利。
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背景技術(shù)：
現(xiàn)代細(xì)胞生物包括多種體外操作不同活生物體細(xì)胞的技術(shù)。特別感興趣的是一類(lèi)稱(chēng)為干細(xì)胞的細(xì)胞。干細(xì)胞是未分化或僅部分分化的細(xì)胞，能分化成一些祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞系和類(lèi)型。術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”可用于指一種細(xì)胞類(lèi)型，它是較大生物體中分化細(xì)胞系的祖細(xì)胞如造血干細(xì)胞，或可指完全未分化干細(xì)胞，它們至少在理論上能分化成任何身體組織。干細(xì)胞最少是多能性的，意味著它們有分化成許多不同組織細(xì)胞的潛能，且可以是全能性的，意味著有分化成任何成熟生物種類(lèi)的細(xì)胞類(lèi)型的潛能。干細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)展自多種組織類(lèi)型和一些不同動(dòng)物。
近來(lái)，能產(chǎn)生、培養(yǎng)和維持靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物，包括人和恒河猴胚胎干細(xì)胞。參見(jiàn)例如Thomson的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,843,780、6,200,806。靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞是產(chǎn)生自胚胎的干培養(yǎng)物，在培養(yǎng)中存活不確定且證明能分化成靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物身體的主要組織類(lèi)型。靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞可在培養(yǎng)中以未分化狀態(tài)不確定維持，或可開(kāi)始分化過(guò)程，通過(guò)此過(guò)程不同細(xì)胞定向成為一種或多種發(fā)育譜系(developmental lineage)。通常，干細(xì)胞分化成不同組織類(lèi)型是以胚狀體產(chǎn)生為開(kāi)始，這使胚胎體中的干細(xì)胞開(kāi)始分化成不同細(xì)胞類(lèi)型。
具有科學(xué)和研究興趣的更加分化的人細(xì)胞類(lèi)型是人滋養(yǎng)層。滋養(yǎng)層是一種細(xì)胞，它是參與人胎盤(pán)形成的細(xì)胞前體。當(dāng)胚胎開(kāi)始分化時(shí)，在胚泡階段，內(nèi)細(xì)胞群中的細(xì)胞定向形成變?yōu)榕咛サ募?xì)胞，而胚泡的外部細(xì)胞定向參與胎盤(pán)發(fā)育。以前分離過(guò)滋養(yǎng)層細(xì)胞，但它們難以分離且不能大量用于研究。小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞系產(chǎn)生自胚泡和移植后滋養(yǎng)層。人滋養(yǎng)層細(xì)胞系產(chǎn)生自轉(zhuǎn)化的胎盤(pán)細(xì)胞，但還未報(bào)導(dǎo)從胚細(xì)胞或干細(xì)胞系生成靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物滋養(yǎng)層培養(yǎng)物的技術(shù)。人胚胎干細(xì)胞會(huì)同時(shí)分化成一些分化細(xì)胞類(lèi)型，包括一些滋養(yǎng)層細(xì)胞，此現(xiàn)象不導(dǎo)致有用的滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生。事實(shí)上，小鼠胚胎干細(xì)胞似乎缺乏分化成滋養(yǎng)層的能力，因此，滋養(yǎng)層供應(yīng)總是很有限。恒定滋養(yǎng)層細(xì)胞的可補(bǔ)充供應(yīng)對(duì)許多藥物研究很有用。針對(duì)胚胎移植的避孕藥物研究和防止胎盤(pán)相關(guān)出生缺陷的治療仍是科學(xué)研究的主題，如果有靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物滋養(yǎng)層來(lái)源，能更容易研究。
發(fā)明概述本發(fā)明概括了誘導(dǎo)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞主要分化成人滋養(yǎng)層的方法，包括在蛋白滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子存在時(shí)培養(yǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明也涉及由本文所教授方法產(chǎn)生的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物滋養(yǎng)層細(xì)胞統(tǒng)一培養(yǎng)物。
本發(fā)明同樣涉及在胎盤(pán)細(xì)胞上測(cè)試試劑的方法，其中試劑暴露于本文所述滋養(yǎng)層培養(yǎng)物。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是以一致和可重復(fù)方式產(chǎn)生幾乎純的滋養(yǎng)層培養(yǎng)物。
本發(fā)明的一個(gè)特征是教授了第一種已知引起培養(yǎng)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞重復(fù)、直接、單獨(dú)和同步分化成定向細(xì)胞系的方法。
本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)從下列說(shuō)明中顯然。
附圖簡(jiǎn)述

圖1闡述了按照本發(fā)明培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞的激素分泌。
發(fā)明詳述本發(fā)明以觀察為前提。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)一些蛋白因子會(huì)引起靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞分化成滋養(yǎng)層細(xì)胞。滋養(yǎng)層細(xì)胞穩(wěn)定并表現(xiàn)出胎盤(pán)前體細(xì)胞的所有細(xì)胞特征。由于產(chǎn)生和培養(yǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和人胚胎干細(xì)胞被標(biāo)準(zhǔn)化且易重復(fù)，此觀察可第一次直接從人或其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞來(lái)源生成單細(xì)胞類(lèi)型的主要種類(lèi)(滋養(yǎng)層細(xì)胞)，而不干擾胚狀體產(chǎn)生。這里發(fā)現(xiàn)引起靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞直接分化成滋養(yǎng)層細(xì)胞的蛋白因子包括骨形成蛋白4(BMP4)以及相關(guān)蛋白因子如BMP2、BMP7及生長(zhǎng)-分化因子5(GDF5)。這種因子在本文稱(chēng)為滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子。
存在可再生量的人和其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物滋養(yǎng)層細(xì)胞能對(duì)胎盤(pán)細(xì)胞性質(zhì)進(jìn)行許多調(diào)查研究?，F(xiàn)在能具有可再生和無(wú)窮盡的胎盤(pán)前體細(xì)胞供應(yīng)。特定認(rèn)為滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)物可用于化學(xué)反應(yīng)研究以模擬藥物測(cè)試中使用的胎盤(pán)細(xì)胞性質(zhì)，用于一般毒物學(xué)以及對(duì)胎盤(pán)細(xì)胞的特定作用。例如，研究抑制子宮中受精胚胎移植的試劑即節(jié)育劑可通過(guò)觀察推定試劑對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)物的作用。
此描述包括證明人和其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞能通過(guò)單蛋白因子處理直接轉(zhuǎn)入滋養(yǎng)層細(xì)胞的數(shù)據(jù)。如本文所用，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞指人或其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物未分化的細(xì)胞，它們至少是多能的。下面例子中所用干細(xì)胞來(lái)源自人和恒河猴胚胎，從而稱(chēng)為靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞來(lái)自處于一定發(fā)育階段人的干細(xì)胞。然而，本文所述方法同樣可應(yīng)用于獲自其它來(lái)源的人干細(xì)胞，包括胚生殖系細(xì)胞和分離自成熟靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體的干細(xì)胞。注意到在小鼠干細(xì)胞經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上不預(yù)期人干細(xì)胞會(huì)分化成滋養(yǎng)層細(xì)胞。通過(guò)控制外部培養(yǎng)環(huán)境從小鼠干細(xì)胞獲得滋養(yǎng)外胚層組織的努力迄今還未成功，當(dāng)與完整預(yù)移植胚形成嵌合體時(shí)，小鼠干細(xì)胞很少對(duì)滋養(yǎng)層有貢獻(xiàn)。小鼠胚胎干細(xì)胞不能形成滋養(yǎng)層細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞發(fā)育類(lèi)似原始外胚層的理論一致，小鼠胚胎干細(xì)胞在原始外胚層與內(nèi)細(xì)胞群分離后形成且不再對(duì)滋養(yǎng)層譜系有貢獻(xiàn)。人胚胎干細(xì)胞形成滋養(yǎng)層細(xì)胞的能力暗示小鼠和人胚胎干細(xì)胞間發(fā)育潛能的基本差異。
注意到本文的方法包括直接應(yīng)用滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子于培養(yǎng)的干細(xì)胞，而沒(méi)有通常與干細(xì)胞分化相關(guān)的任何干擾過(guò)程。特別注意到?jīng)]有轉(zhuǎn)變成胚狀體的階段與此方法相關(guān)。由其它方法培養(yǎng)的干細(xì)胞分化過(guò)程一般不均一，這通常是許多不同細(xì)胞譜系或細(xì)胞類(lèi)型導(dǎo)致的。相反，本文所述方法使干細(xì)胞大量分化成定向分化的細(xì)胞類(lèi)型即滋養(yǎng)層。
為證明干細(xì)胞定向分化成滋養(yǎng)層細(xì)胞是由于滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子的影響，可能抑制滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子的作用并觀察結(jié)果。如果BMP4是滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子，此蛋白能被可溶性BMP4受體或拮抗蛋白頭蛋白抑制。如果僅用BMP4培養(yǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞，干細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)大規(guī)模定向分化成滋養(yǎng)層細(xì)胞類(lèi)型。然而，如果用BMP4和抑制劑如可溶性BMP4受體或頭蛋白培養(yǎng)類(lèi)似的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞培養(yǎng)物，不發(fā)生成為滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化。
培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞有很獨(dú)特的形態(tài)。細(xì)胞小、緊密且均一，有獨(dú)特的細(xì)胞膜和成組的簇。干細(xì)胞分化成其它細(xì)胞類(lèi)型是明顯的過(guò)程，因?yàn)楦杉?xì)胞變得更大和更擴(kuò)散。有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員能通過(guò)分化細(xì)胞的細(xì)胞外形識(shí)別許多細(xì)胞類(lèi)型。在滋養(yǎng)層細(xì)胞的情況中，細(xì)胞確實(shí)變得更大和扁平，細(xì)胞膜從擴(kuò)散變?yōu)椴豢梢?jiàn)。然而，為補(bǔ)充滋養(yǎng)層細(xì)胞狀況，采用不同細(xì)胞特征研究。進(jìn)行使用DNA微陣列的基因表達(dá)研究以檢測(cè)細(xì)胞的基因表達(dá)模式。也檢測(cè)細(xì)胞的胎盤(pán)激素分泌。結(jié)果與這些分化細(xì)胞被鑒定為滋養(yǎng)層細(xì)胞一致。這確認(rèn)了形態(tài)鑒定這些細(xì)胞是正確的。
實(shí)施例人胚胎干細(xì)胞系H1在MatrigelTM-包被塑料平板的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)為條件且添加4mg/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。人骨形成蛋白4(BMP4)(R&D Systems，Minneapolis，MN，也是本文所列其它重組蛋白來(lái)源)以1、10和100ng/ml培養(yǎng)基濃度應(yīng)用于干細(xì)胞。干細(xì)胞是單層細(xì)胞且不在胚狀體中聚集。隨后H1細(xì)胞經(jīng)歷了劑量和時(shí)間依賴(lài)的形態(tài)變化，變得展開(kāi)、扁平、薄和擴(kuò)大或延長(zhǎng)，它們的核變得更小。這些變化與滋養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)一致。形態(tài)變化開(kāi)始于各菌落邊緣并由此向內(nèi)展開(kāi)。形態(tài)變化在用100ng/ml BMP4處理培養(yǎng)的第2天、10ng/ml BMP4處理培養(yǎng)的第3或4天和1ng/ml BMP4處理培養(yǎng)的第4到5天明顯。
用BMP4蛋白信號(hào)家族其它成員進(jìn)行類(lèi)似實(shí)驗(yàn)。證明引起相似作用、導(dǎo)致干細(xì)胞變?yōu)樽甜B(yǎng)層細(xì)胞的蛋白包括BMP2、BMP7及生長(zhǎng)-分化因子5(GDF5)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它蛋白在干細(xì)胞中引起這種相同的形態(tài)變化，包括TGF超家族成員如TGFβ1和活化素。類(lèi)似形態(tài)變化在用BMP4、BMP2、BMP7和GDF5處理的恒河猴胚胎干細(xì)胞系中觀察到。
用滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子處理干細(xì)胞的形態(tài)變化與胚胎發(fā)育中發(fā)生的形態(tài)變化一致，其中一些細(xì)胞定向變?yōu)楫a(chǎn)生胎盤(pán)的譜系。除了形態(tài)變化，細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GATA2和GATA3和慢性促性腺激素α和β基因，它們都在由其它方法生成的滋養(yǎng)層中表達(dá)。細(xì)胞產(chǎn)生大量胎盤(pán)激素，包括慢性促性腺激素、雌二醇和孕酮。細(xì)胞繼續(xù)不確定分泌這些激素。細(xì)胞的流式細(xì)胞儀證明細(xì)胞至少主要是CGβ陽(yáng)性。
也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中BMP家族因子的拮抗物與蛋白因子同時(shí)加入培養(yǎng)物。發(fā)現(xiàn)如果可溶性BMP受體(100ng/ml)或BMP拮抗蛋白頭蛋白(300ng/ml)與BMP4同時(shí)加入培養(yǎng)物，完全防止了干細(xì)胞中的形態(tài)變化。這證明活化蛋白因子的作用特異性。
對(duì)名為H9的另外細(xì)胞系進(jìn)行類(lèi)似實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生滋養(yǎng)層細(xì)胞生成的相似結(jié)果。此外，對(duì)缺乏bFGF時(shí)培養(yǎng)的H1細(xì)胞進(jìn)行類(lèi)似實(shí)驗(yàn)，暗示此作用對(duì)來(lái)自不同供體的人干細(xì)胞是普遍的且不取決于bFGF的存在。
為進(jìn)一步研究滋養(yǎng)層特征，cDNA微陣列用于分析BMP4處理細(xì)胞和未處理未分化H1細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。在陣列上檢測(cè)的43,000個(gè)cDNA基因中，僅代表14個(gè)基因的19個(gè)克隆簇在所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)烈上調(diào)。14個(gè)基因中的11在前面確定特征為與滋養(yǎng)層或胎盤(pán)發(fā)育相關(guān)。許多這些基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，如轉(zhuǎn)錄因子AP-2(TFAP-2)、mah同源盒同系物2(MSX2)、細(xì)胞因子信號(hào)3的抑制物(SSI3)、GATA結(jié)合蛋白2和3(GATA2和GATA3)及與YPRW基序1相關(guān)的多毛/spli增強(qiáng)子(HEY1)。用BMP4處理的第7天也觀察到許多已知在滋養(yǎng)層或胎盤(pán)表達(dá)的基因mRNA表達(dá)顯著增加，如編碼CG-α和CG-β亞基、促黃體素-α和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子的基因。我們也使用RT-PCR以觀察滋養(yǎng)層標(biāo)記表達(dá)增高，所述標(biāo)記包括CG-β、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺失-1(GCM1)、非典型HLA I類(lèi)分子HLA-G1和CD9。微陣列分析中，代表8個(gè)基因的所有10個(gè)上調(diào)最高克隆除了一個(gè)以外，都編碼前面與滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)基因相關(guān)的蛋白或肽。相反，用BMP4處理7天后，多能細(xì)胞中一些高度表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄本降低，如編碼POU結(jié)構(gòu)域、5類(lèi)、轉(zhuǎn)錄因子1(POU5F1，也稱(chēng)為OCT4)以及端粒酶反轉(zhuǎn)錄因子(TERT)的基因。
為進(jìn)一步確定細(xì)胞特征，檢測(cè)細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基的胎盤(pán)激素CG、雌二醇和孕酮量。用BMP4處理的H1細(xì)胞相較未分化細(xì)胞或無(wú)條件培養(yǎng)基中分化的細(xì)胞，表現(xiàn)出顯著更高的各激素濃度。圖1闡述與無(wú)BMP4的細(xì)胞(CM)和可在無(wú)條件培養(yǎng)基中分化的細(xì)胞(UM)相比，暴露于BMP4的細(xì)胞(CM+BMP4)中這些激素增加的時(shí)程。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞分化成人滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括在蛋白滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子存在時(shí)培養(yǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子選自骨形成蛋白4(BMP4)、骨形成蛋白2(BMP2)、骨形成蛋白7(BMP7)及生長(zhǎng)-分化因子5(GDF5)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子以每毫升培養(yǎng)基1-100納克的濃度應(yīng)用于干細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述干細(xì)胞是非人的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。
6.一種體外培養(yǎng)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述滋養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)自暴露于滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)物，其特征在于，所述滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子選自骨形成蛋白4(BMP4)、骨形成蛋白2(BMP2)、骨形成蛋白7(BMP7)及生長(zhǎng)-分化因子5(GDF5)。
8.如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)物，其特征在于，所述滋養(yǎng)層細(xì)胞是人細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)物，其特征在于，所述滋養(yǎng)層細(xì)胞是非人的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞。
10.一種測(cè)試試劑對(duì)胎盤(pán)細(xì)胞的作用的方法，其特征在于，所述方法包括通過(guò)在滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子存在時(shí)培養(yǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生滋養(yǎng)層細(xì)胞；使滋養(yǎng)層細(xì)胞暴露于試劑；以及觀察試劑對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的作用。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子選白骨形成蛋白4(BMP4)、骨形成蛋白2(BMP2)、骨形成蛋白7(BMP7)及生長(zhǎng)-分化因子5(GDF5)。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子以每毫升培養(yǎng)基1-100納克的濃度應(yīng)用于干細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述干細(xì)胞是非人的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。
全文摘要
揭示了第一種引起人和其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞培養(yǎng)物直接和統(tǒng)一分化成定向細(xì)胞系的方法。用單蛋白滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子處理靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物干細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)換成人滋養(yǎng)層細(xì)胞即胎盤(pán)前體細(xì)胞。一些蛋白因子包括骨形成蛋白4(BMP4)、BMP2、BMP7及生長(zhǎng)－分化因子5，能作為滋養(yǎng)層誘導(dǎo)因子。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1643159SQ03805960
公開(kāi)日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
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