專利名稱：包裝流感病毒載體的信號的制作方法
政府權(quán)益聲明本發(fā)明至少有一部分是在美利堅合眾國政府的資助下完成的(國立衛(wèi)生院資助號為AI47446)。政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
流感病毒A和B的基因組由八段負(fù)極性單鏈RNA片段組成，其中兩段編碼包膜糖蛋白、血凝素(HA)及唾液酸苷酶(NA)。流感病毒復(fù)制以病毒顆粒表面上的病毒HA蛋白與含唾液酸的細(xì)胞受體結(jié)合為起始。與受體結(jié)合后，宿主細(xì)胞通過胞飲作用將病毒攝入。晚期核內(nèi)體中的酸性環(huán)境激發(fā)HA的構(gòu)象發(fā)生變化，啟動病毒包膜與核內(nèi)體膜之間的融合，并使M2離子通道活化，導(dǎo)致質(zhì)子流入病毒顆粒內(nèi)。據(jù)認(rèn)為將病毒顆粒內(nèi)部暴露于低pH中，可以破壞M1蛋白和核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物之間酸依賴性的相互作用，最終使RNP釋放入細(xì)胞質(zhì)中。然后RNP會轉(zhuǎn)運到核，在這里合成病毒mRNA及病毒基因組。mRNA進入細(xì)胞質(zhì)中，從而病毒蛋白得以合成。核蛋白(NP)進入核內(nèi)并用殼體包裝新合成的vRNA，并與三種聚合酶亞基蛋白(PA、PB1、PB2)一起形成RNP。當(dāng)有M1及NS2蛋白存在時，RNP輸出核外。三種漿膜相關(guān)蛋白(HA、NA及M2)與RNP相互作用并以芽殖的方式形成新的病毒顆粒。NA負(fù)責(zé)從細(xì)胞的復(fù)合糖及病毒糖蛋白中去除唾液酸，從而將病毒從感染細(xì)胞中釋放出來(Lamb等，2000)。
根據(jù)HA(H1～H5)及NA(N1～N9)的抗原性A型病毒分成數(shù)種亞型。兩種不同的A型病毒所感染的細(xì)胞中，可以生成具有各種基因片段組合的類型內(nèi)重排體(Wright等，2000)。但是，盡管兩種病毒均在人類群體共傳播，仍未發(fā)現(xiàn)A型病毒與B型病毒之間的天然類型間重排體。
研究者已嘗試在實驗室內(nèi)生成A型和B型病毒之間的重排體，但沒有成功(Kaverin等，1983；Mikheera等，1982；Tobita等，1983)。Muster等(1991)生成了一種突變A型病毒，其中一個片段的NA片段非編碼區(qū)由B型病毒非結(jié)構(gòu)性(NS)基因的非編碼區(qū)片段所取代。盡管此突變病毒的復(fù)制比野生型病毒慢得多，所達(dá)到的滴度也比野生型低，此類病毒的生成表明B型NS片段的非編碼區(qū)與A型流感病毒組分在RNA轉(zhuǎn)錄及復(fù)制水平上是兼容的。相反，當(dāng)RNA片段所含外源編碼片段的旁側(cè)為A型流感病毒RNA片段3′和5’端非編碼區(qū)時，經(jīng)過反復(fù)傳代后不能在病毒顆粒內(nèi)穩(wěn)定維持(Luytjes等，1989)。Muster等(1991)也發(fā)現(xiàn)突變病毒在小鼠中減毒了，用突變病毒感染的動物可以耐受野生型病毒的攻擊。
因此需要有一種方法鑒別流感病毒復(fù)制期間負(fù)責(zé)所鏈接序列導(dǎo)入及/或維持的流感病毒序列。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離重組核酸分子(多核苷酸)，如載體，其中該分子含有流感病毒的導(dǎo)入序列(“包裝信號”或vRNA衣殼化信號)及任選異源核酸片段。通常導(dǎo)入序列存在于各流感vRNA片段一端或兩端約150至250個核苷酸處。在一個實施方案中，流感病毒導(dǎo)入序列包含與NA 3’末端對應(yīng)的序列，包括與NA編碼區(qū)N端對應(yīng)的序列，例如包括3’非編碼區(qū)19個核苷酸及至少與NA起始19個編碼核苷酸對應(yīng)的序列的A型NA vRNA 3’末端37個核苷酸；與任選NA vRNA 5’末端對應(yīng)的導(dǎo)入序列，包括與NA編碼區(qū)C-末端對應(yīng)的序列，例如包括5’非編碼區(qū)28個核苷酸的A型NA vRNA 5′末端67個核苷酸；以及至少39個與此NA 3′編碼區(qū)39個核苷酸對應(yīng)的核苷酸。在另一實施方案中，流感病毒導(dǎo)入序列包含與NS vRNA 3’末端對應(yīng)的序列，包括與NS編碼區(qū)N-末端對應(yīng)的序列。在另一實施方案中，流感病毒導(dǎo)入序列包含與HA vRNA 5’末端對應(yīng)的序列，包括與HA編碼區(qū)C-末端對應(yīng)的序列，例如包括5’非編碼序列45個核苷酸及至少80個與HA 80個3’編碼核苷酸對應(yīng)的核苷酸的A型HA vRNA 5’末端135個核苷酸；和任選與HA vRNA 3’末端對應(yīng)的導(dǎo)入序列，包括與HA編碼區(qū)N-末端對應(yīng)的序列，例如包括33個3’非編碼序列核苷酸及至少3個與HA編碼核苷酸起始3個對應(yīng)的核苷酸的A型HA vRNA 5′末端36個核苷酸。在一個進一步的實施方案中，流感病毒導(dǎo)入序列包含與PB2 vRNA 5’末端對應(yīng)的序列，包括與PB2編碼區(qū)C-末端對應(yīng)的序列。在另一實施方案中，流感病毒導(dǎo)入序列包含與M vRNA 3’末端對應(yīng)的序列，包括與M編碼區(qū)N端對應(yīng)的序列，例如包括3’非編碼序列26個核苷酸及221個與M編碼核苷酸對應(yīng)的核苷酸的A型M vRNA 3’末端247個核苷酸；與M vRNA 5’末端對應(yīng)的序列，包括與M編碼區(qū)C-末端對應(yīng)的導(dǎo)入序列，例如包括23個3’非編碼序列核苷酸及219個與M編碼區(qū)C-末端核苷酸最后219個對應(yīng)的核苷酸的A型M vRNA 5′末端242個核苷酸。在另一實施方案中，流感病毒導(dǎo)入序列包含與NS vRNA 5’末端對應(yīng)的序列，包括與NS編碼區(qū)N-末端對應(yīng)的序列，例如包括3’非編碼序列和與NS編碼區(qū)N-末端對應(yīng)的至少30個核苷酸的序列；與NSvRNA 5’末端對應(yīng)的序列，包括與NS編碼區(qū)C端對應(yīng)的導(dǎo)入序列，例如包括5’非編碼序列及與NS編碼區(qū)C-末端對應(yīng)的序列的至少30個核苷酸的序列。在一個實施方案中，流感病毒導(dǎo)入序列包含與PB1 vRNA 5’末端對應(yīng)的序列，包括與PB1編碼區(qū)N-末端對應(yīng)的序列和與PB1 vRNA5’末端對應(yīng)的序列，包括與PB1編碼區(qū)C-末端對應(yīng)的導(dǎo)入序列。在另一實施方案中，流感病毒導(dǎo)入序列包含與PA vRNA 5’末端對應(yīng)的序列，包括與PA編碼區(qū)N-末端對應(yīng)的序列和與PA vRNA 5’末端對應(yīng)的序列，包括與PA編碼區(qū)C-末端對應(yīng)的序列。本文所述流感病毒“導(dǎo)入序列”，是指當(dāng)存在于具有相應(yīng)(同源)3’及5’非編碼區(qū)的vRNA中時可使含該序列的核酸分子導(dǎo)入病毒顆粒中并在反復(fù)傳代過程中使該分子在病毒顆粒中得以維持的序列。
正如下文所述，利用基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)已在含截短NA片段的突變病毒中鑒定到了NA導(dǎo)入序列。該NA導(dǎo)入序列位于一個包括NAvRNA 3’末端的區(qū)域中，其中該3’末端延伸入部分NA編碼區(qū)中。因此，該區(qū)域可用于包裝和維持野生型NA RNA以及突變NA RNA，例如內(nèi)部發(fā)生缺失及/或插入的RNA，包括表達(dá)目的開放閱讀框如含目的開放閱讀框的異源核酸片段的重組RNA。
也如此處所述，為了深入了解A型與B型流感病毒之間的類型間不兼容性，采用反向遺傳學(xué)在A型病毒背景下生成含完整B型HA片段的重排體。盡管B型HA片段確實由A型聚合酶復(fù)合物進行了轉(zhuǎn)錄，但是并未產(chǎn)生病毒。雖然含由B型HA全部編碼序列及其旁側(cè)A型HA非編碼序列組成的嵌合HA片段的A型病毒可以存活，但僅能微弱復(fù)制。生成一系列基于A型、包含嵌合HA的病毒，其中嵌合HA具有A型非編碼區(qū)、編碼A型病毒信號肽或跨膜/胞漿區(qū)或二者均有，以及B型HA來源區(qū)域的其它部分。這些病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中均長到超過106組織培養(yǎng)感染劑量50/ml，但是A型HA序列越多則復(fù)制情況越好，說明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或更多HA片段導(dǎo)入病毒顆粒中對于病毒高效生長起一定作用。與野生型A型或B型病毒相比，這些A/B嵌合病毒在小鼠中均減毒了。而且，對這些用嵌合病毒在鼻內(nèi)免疫的動物給予致死量的野生型B型病毒攻擊時，所有動物均存活下來，示范了一種設(shè)計全新活疫苗病毒很有希望的方法。
這樣，當(dāng)含特定流感病毒片段導(dǎo)入序列、同源3’及5’非編碼序列(區(qū))和異源核酸片段的本發(fā)明分離核酸分子，以vRNA生產(chǎn)載體形式且在PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、諸如M1及/或M2之類的M及/或NS中一個或多個的病毒蛋白或編碼病毒蛋白的載體存在下，以及在PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、諸如M1及M2之類的M及/或NS中一個或多個的用于vRNA生產(chǎn)的vRNA或載體存在時導(dǎo)入到細(xì)胞中，就產(chǎn)生了重組病毒。該重組病毒可用于感染細(xì)胞。與本發(fā)明核酸分子對應(yīng)的vRNA優(yōu)選以是相應(yīng)野生型vRNA的至少10％、更優(yōu)選至少30％、甚至更優(yōu)選至少50％的效率導(dǎo)入病毒顆粒中。在一個實施方案中，該核酸分子包括與野生型vRNA對應(yīng)的序列和異源核酸片段，其中該異源核酸片段導(dǎo)入vRNA中與該vRNA編碼區(qū)對應(yīng)的序列中，優(yōu)選此插入基本上不破壞該導(dǎo)入序列。例如，該異源核酸片段導(dǎo)入到與NA編碼區(qū)起始300個核苷酸對應(yīng)的序列之后。
在另一實施方案中，3’NA導(dǎo)入序列與NA編碼區(qū)N-末端1～183、1～90、1～45、1～21、1～19或19至183之間任意整數(shù)個核苷酸對應(yīng)，在NA起始密碼子處還可包括突變。在另一實施方案中，5’NA導(dǎo)入序列與NA編碼區(qū)C-末端中的序列、相當(dāng)于NA編碼區(qū)C-末端3’最多39、78或157或1至157之間任意整數(shù)個核苷酸的序列對應(yīng)。在另一實施方案中，5’HA導(dǎo)入序列與HA編碼區(qū)C-末端中的序列、對應(yīng)于HA編碼區(qū)C-末端3’最多75、80、268、291或518或1至518之間任意整數(shù)個核苷酸的序列對應(yīng)。3’HA導(dǎo)入序列與HA編碼區(qū)N-末端的1～3、1～6、1～9、1～15、1～216、1～468或1～468間任意整數(shù)個核苷酸對應(yīng)。在一實施方案中，3’PB1導(dǎo)入序列與PB1編碼區(qū)C-末端的1～250、1～200、1～150或1～250間任意整數(shù)個核苷酸對應(yīng)。在一實施方案中，3’PA導(dǎo)入序列與PA編碼區(qū)N-末端的1～250、1～200、1～150或1～250間任意整數(shù)個核苷酸對應(yīng)。在一實施方案中，5’PA導(dǎo)入序列與PA編碼區(qū)C-末端3’絕大部分核苷酸對應(yīng)，如與PA編碼區(qū)C-末端3′1～250、1～200、1～150或1～250間任意整數(shù)個核苷酸對應(yīng)。在另一實施方案中，3’M導(dǎo)入序列與M編碼區(qū)N-末端的1～250、1～242、1～240或1～250間任意整數(shù)個核苷酸對應(yīng)，在M起始密碼子處還可包括突變。在另一實施方案中，5’M導(dǎo)入序列與M編碼區(qū)C-末端中的序列、對應(yīng)于M編碼區(qū)C-末端3’最多50、100或220或1至250之間任意整數(shù)個核苷酸的序列對應(yīng)。在另一實施方案中，3’NS導(dǎo)入序列與NS編碼區(qū)N-末端的1～250、1～200、1～150、1～30、1～20或1～250間任意整數(shù)個核苷酸對應(yīng)，在NS起始密碼子處還可包括突變。在另一實施方案中，5’NS導(dǎo)入序列與NS編碼區(qū)C-末端中的序列、對應(yīng)于NS編碼區(qū)C-末端3’最多10、30、150、200或250或1至250之間任意整數(shù)個核苷酸的序列對應(yīng)。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了包含與特定vRNA 3’及5’非編碼區(qū)對應(yīng)的序列、相應(yīng)vRNA的導(dǎo)入序列以及異源核酸片段的流感病毒載體。這樣，在一實施方案中，該載體包含NA vRNA 3’非編碼區(qū)、3’或5’NA vRNA導(dǎo)入序列、和任選3’或5’NA導(dǎo)入序列、異源核酸片段及NA vRNA 5’非編碼區(qū)。在另一實施方案中，該載體包含HA vRNA 3’非編碼區(qū)、5’或3’HA vRNA導(dǎo)入序列、或5’和3’HA導(dǎo)入序列、異源核酸片段及HAvRNA 5’非編碼區(qū)。在另一實施方案中，該載體包含NS vRNA 3’非編碼區(qū)、NS導(dǎo)入序列、異源核酸片段及NS vRNA 5’非編碼區(qū)。在另一實施方案中，該載體包含M vRNA 3’非編碼區(qū)、5’或3’M導(dǎo)入序列、或5’和3’M導(dǎo)入序列、異源核酸片段及M vRNA 5’非編碼區(qū)。在另一實施方案中，該載體包含PB2 vRNA 3’非編碼區(qū)、異源核酸片段、PB2導(dǎo)入序列、及PB2 vRNA 5’非編碼區(qū)。當(dāng)在載體中使用兩段導(dǎo)入序列時，優(yōu)選用異源核酸片段將它們隔開?？墒褂酶鬏d體制備用于導(dǎo)入細(xì)胞的vRNA或在細(xì)胞中表達(dá)vRNA，細(xì)胞中也存在病毒生產(chǎn)所需的其它流感病毒vRNA及蛋白。
在一實施方案中，該異源核酸片段包含與標(biāo)記基因開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。在另一實施方案中，該異源核酸片段包含與治療基因開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。在另一實施方案中，該異源核酸片段包含與病原體或腫瘤細(xì)胞免疫原性肽或蛋白的開放閱讀框?qū)?yīng)的序列，如用于誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)的肽或蛋白。舉例來說，該異源核酸片段可編碼在癌癥治療或疫苗中使用的免疫原表位。因而可以制備包含該異源核酸片段的載體，以便載體vRNA的轉(zhuǎn)錄可生成編碼與諸如NA之類流感病毒蛋白融合的蛋白的mRNA。由此可考慮將該異源核酸片段與病毒導(dǎo)入序列融合以編碼融合蛋白，如與NA N-末端21個殘基的融合體。該融合蛋白可包含來自兩種不同流感病毒蛋白的序列，包括來自兩種不同NA或HA蛋白的序列。在另一實施方案中，異源核酸片段可包含與連接于開放閱讀框5’端的IRES對應(yīng)的序列。
為通過基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)用大量流感病毒載體制備重組病毒，載體中的流感病毒DNA相對于啟動子來說可以在正義的也可以在反義的方向。這樣，載體可編碼A型、B型或C型流感病毒、病毒株或隔離體或重組流感病毒的流感病毒蛋白(正義)或vRNA(反義)[參見《病毒學(xué)》第45及46章相關(guān)部分(Fields等編，Lippincott-Rawen出版社，費城，PA(1996))，在此特別引入作為參考]?？捎萌我鈫幼觼肀磉_(dá)病毒蛋白，所得載體包括與特定流感病毒蛋白的DNA操縱性連接的啟動子。用于編碼vRNA的載體的啟動子優(yōu)選包括但不限于RNA聚合酶I啟動子、RNA聚合酶II啟動子、RNA聚合酶III啟動子、T7啟動子及T3啟動子。在一實施方案中，RNA聚合酶I啟動子為人RNA聚合酶I啟動子。編碼vRNA的載體其轉(zhuǎn)錄終止序列優(yōu)選包括但不限于RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄終止序列、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄終止序列、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄終止序列或核酶。因此，vRNA載體包括與流感病毒蛋白cDNA以相對于啟動子反義的方向操縱性連接的啟動子，所述cDNA與轉(zhuǎn)錄終止序列操縱性連接。為生成帶有本發(fā)明載體的重組病毒，可省略一些野生型vRNA載體和對一些編碼野生型病毒蛋白的載體加以代替。例如，對于含HA 3’和5’非編碼序列、5’HA導(dǎo)入序列以及與流感病毒蛋白編碼序列如VSV G蛋白編碼序列對應(yīng)的異源核酸片段的vRNA載體來說，可以忽略HA的野生型vRNA載體。本發(fā)明的載體可以依次或同時導(dǎo)入一個細(xì)胞中。也提供了含多個上述所提到載體的組合物、與這些載體一個或多個相接觸的宿主細(xì)胞及病毒感染的細(xì)胞。
多個本發(fā)明的載體可物理連接，或各載體位于單個質(zhì)?；蚱渌缇€性核酸輸送載體上。
用上述重組DNA分子增大的宿主細(xì)胞可用于制備具有感染性復(fù)制缺陷的流感病毒。例如，用編碼HA、NA、M1、M2及NS2的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，可與多個載體接觸，即表達(dá)包含PA的vRNA、包含NP的vRNA、包含PB1的vRNA、包含PB2的vRNA和任選包含目標(biāo)基因的vRNA的載體；以及編碼PA、PB1、PB2及NP的載體。
本文所述的病毒生產(chǎn)方法不需要輔助病毒的感染，在病毒突變性研究、疫苗(如用于AIDS、流感、B型肝炎、丙型肝炎、鼻病毒感染、絲狀病毒感染、瘧疾、皰疹、以及口蹄疫的疫苗)和基因治療載體(如用于癌癥、AIDS、腺苷脫氨酶、肌營養(yǎng)不良、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤)的生產(chǎn)中很有用。
這樣就提供了藥物治療(如疫苗治療或基因治療)中使用的重組病毒。例如，本發(fā)明提供了使個體對病原體如細(xì)菌、病毒、寄生蟲或惡性腫瘤產(chǎn)生免疫的方法。該方法包括將有效免疫個體的一定量本發(fā)明至少一種分離病毒施用于個體，任選與佐劑聯(lián)用。所述病毒包括含病原體所編碼多肽或腫瘤特異性多肽的vRNA。
本發(fā)明也提供了增大或促進內(nèi)源性蛋白在哺乳動物中表達(dá)的方法，其中所述哺乳動物具有以該內(nèi)源性蛋白含量下降或缺乏為特征的適應(yīng)癥或疾病。該方法包括向哺乳動物施用可有效增大或促進內(nèi)源性蛋白在哺乳動物中表達(dá)的一定量本發(fā)明重組病毒。哺乳動物優(yōu)選人類。
本發(fā)明進一步提供了抑制流感病毒感染及/或復(fù)制的方法。該方法包括讓細(xì)胞與可有效抑制流感病毒感染及/或復(fù)制的一定量組合物接觸，其中包含于組合物中的分離核酸分子含有NA、M、HA、NS、NP、PB1、PB2、PA或其任意組合的流感病毒導(dǎo)入序列。細(xì)胞可以是未感染的細(xì)胞，也可以是流感病毒感染的細(xì)胞。導(dǎo)入序列可以對一種或多種類型NA或HA特異。在一實施方案中，細(xì)胞還進一步與M2通道抑制劑或唾液酸苷酶抑制劑接觸。
本發(fā)明也提供了鑒定可選擇性抑制或防止流感病毒導(dǎo)入病毒顆粒的試劑的方法。該方法包括讓流感病毒感染的細(xì)胞與試劑接觸，檢測或測定該試劑是否抑制諸如NA vRNA或重組NA vRNA之類的流感病毒RNA導(dǎo)入病毒顆粒中。也提供了通過此方法鑒定的試劑及其用途，如抑制或防止流感病毒復(fù)制。
附圖簡述

圖1.凝集素抗性細(xì)胞系的結(jié)合。對于每一細(xì)胞系，細(xì)胞與洋地黃毒甙標(biāo)記的朝鮮槐(maakia amurensis)(MAA)或西洋接骨木(Sambucus)(SNA)凝集素一起孵育，再與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗洋地黃毒甙抗體一起孵育，然后用FACS分析。粗線為MAA凝集素的結(jié)合，細(xì)線為SNA凝集素的結(jié)合，陰影部分為陰性對照(不加凝集素)。
圖2.AL3(MaKS)-13及K4(MaKS)-13突變體的NA基因結(jié)構(gòu)。(A)AL3(MaKS)-13包含一個936-核苷酸的缺失(第220個堿基至1253個堿基)，該缺失去除了NA基因的一大部分編碼區(qū)。該突變也將一個TAG終止密碼子帶入到缺失外兩個堿基的框架中，使該基因僅編碼66個氨基酸的肽，該肽與NA的胞漿尾端、跨膜區(qū)、莖及頭部的一部分對應(yīng)。(B)K4(MaKS)-13包含一個1066-核苷酸的缺失(第130個堿基至1193個堿基)，該缺失去除了NA基因的一大部分編碼區(qū)。該突變也將一個TAG終止密碼子帶入到缺失外四個堿基的框架中，使該基因僅編碼38個氨基酸的肽，該肽與NA基因的胞漿尾端及跨膜區(qū)對應(yīng)。
圖3.AM2AL3和K4親代病毒及AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13突變體的唾液酸酶活性。對于每一樣品來說，將一式兩份病毒(5×102PFU)在可產(chǎn)生熒光的唾液酸酶底物(4-甲基傘形酮基-α-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸)存在的條件下于37℃孵育1小時。用熒光儀(LabsystemsFluoroskan II)測定4-甲基傘形花內(nèi)酯的熒光強度，激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為460nm。
圖4A.野生型及NAFLAG載體的示意圖。
圖4B.NAFLAG病毒的生產(chǎn)方法示意圖。
圖4C.NAFLAGWT病毒或NA(-)病毒感染的MDCK細(xì)胞的免疫染色。細(xì)胞用抗-FLAG單克隆抗體(MAb)M2或抗-WSN多克隆抗體染色。
圖5.重組7片段流感病毒和NAFLAG病毒的競爭分析示意圖。
圖6A.NAFLAG及NAFLAGM(-)(“-ATG”)載體的示意圖。
圖6B.用NAFLAGM(-)病毒感染的MDCK細(xì)胞的免疫染色。細(xì)胞用抗-FLAG單克隆抗體M2或抗-WSN多克隆抗體染色。
圖7A.NAFLAG及NAFLAGM(-)感染細(xì)胞的FLAG序列原位雜交分析。
圖7B.NAFLAGWT病毒或NAFLAGM(-)病毒的復(fù)制效率。
圖8A.NA缺失病毒的示意圖。
圖8B.NA缺失病毒的包裝率。
圖9.含6、7或8個片段的流感病毒隨時間變化的病毒滴度。
圖10.顯示流感病毒片段(stipled)導(dǎo)入信號的示意圖。
圖11A.流感病毒的電子顯微鏡斷層攝影圖。
圖11B～F.用電子顯微鏡斷層攝影所發(fā)現(xiàn)的流感病毒顆粒彩色圖譜。
圖12.A)A型流感病毒及HA編碼序列用B型HA取代的A型流感病毒的病毒片段。B)A型流感病毒及HA編碼序列用B型HA取代的A型流感病毒的病毒顆粒。
圖13.A/B嵌合HA構(gòu)建體圖。嵌合HA構(gòu)建體如Neumann等(1999)所述在基于pPolI的質(zhì)粒(pHH21)中于野生型A型/WSN病毒HA(pPolI-WSN-HA)和野生型B型/LEE病毒HA(pPolI-B-HA)之間生成。
圖14.A/B HA嵌合病毒的B型HA表達(dá)。用各病毒感染的MDCK細(xì)胞在感染后24小時固定，然后用抗-A/HA、抗-B/HA或抗-A/NP抗體免疫染色。
圖15.A/B HA嵌合病毒的生長性。用MOI為0.01 TCID50的各病毒感染MDCK細(xì)胞，然后監(jiān)測病毒的生長。圖中所示為兩次獨立試驗相似結(jié)果中的一次結(jié)果。
圖16.接種A/B HA嵌合病毒的小鼠對B型病毒的抗體反應(yīng)。A)鼻內(nèi)接種各病毒(103TCID50)的小鼠(3只小鼠/組)。接種3天后，從各鼠取鼻/氣管洗液和血清樣品用ELISA方法檢測抗B型病毒特異性IgA(鼻/氣管洗液)或IgG(血清)抗體。B)測定血清樣品中的HI滴度。每條柱代表用該嵌合病毒感染的小鼠個體。
圖17.突變HA vRNA及其病毒顆粒導(dǎo)入效率的示意圖。所有突變HA RNA均以與正義相反的方向表示。每個突變體包含旁側(cè)有終止密碼子、HA vRNA(黑色柱條)3’非編碼區(qū)33個核苷酸及5’非編碼區(qū)45個核苷酸的GFP開放閱讀框(插入到帶HA開放閱讀框的框架中)。這些突變體根據(jù)來源于HA編碼區(qū)的核苷酸數(shù)來命名。HA編碼區(qū)用灰色柱條表示。水平虛線表示缺失。區(qū)域的長度不按比例描繪。感染后16小時固定，將表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)除以VLP-感染細(xì)胞中表達(dá)NP的細(xì)胞數(shù)，以此測定突變HA vRNA導(dǎo)入VLPs的導(dǎo)入效率。
圖18.用表達(dá)突變HA vRNA的質(zhì)粒所感染的293T細(xì)胞中的vRNA水平。293T細(xì)胞用pPol IHA(0)GFP(0)或pPol IHA(9)GFP(80)及表達(dá)PA、PB1、PB2和NP的質(zhì)粒感染。
圖19.VSVG(HA)GFP(NA)病毒感染的細(xì)胞表達(dá)VSV G和GFP。MDCK細(xì)胞用VSVG(HA)GFP(NA)病毒或WSN病毒感染，并用1.0％的瓊脂糖覆蓋。感染的細(xì)胞于37℃孵育48小時，將噬斑在正常光線下(A、B)及帶有限正常光的熒光下(C、D)拍照以鑒定噬斑。用溶于3％甲醛中的0.1％Triton-X100固定細(xì)胞并穿透。用抗-VSVG單克隆抗體(E、F)、抗-HA單克隆抗體(G、H)或抗-NP單克隆抗體(I、J)作為第一抗體和生物素化的第二抗體，使用Vectastain ABC試劑盒(Vector，Burlingame，CA)，進行免疫染色來檢測病毒蛋白。
圖20.VSG蛋白向VSVG(HA)GFP(NA)病毒的導(dǎo)入。濃縮的WNS、VSVG(HA)GFP(NA)和VSV病毒在樣本緩沖液中裂解。病毒蛋白用2-巰基乙醇處理，10％SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，與抗-VSV G單克隆抗體或抗-WSN-HA-單克隆抗體一起孵育。左邊所示為標(biāo)記蛋白的分子量。
圖21.VSVG(HA)GFP(NA)病毒在BHK、CHO及MDCK細(xì)胞中的生長曲線。BHK(A)、CHO(B)及MDCK(C)細(xì)胞用MOI為0.001的病毒感染。在感染后指定時間用MDCK細(xì)胞測定上清液中的病毒滴度。所示值為兩次試驗值的均值。
圖22.突變NS vRNA及其導(dǎo)入效率的示意圖。
圖23.突變M vRNA及其導(dǎo)入效率的示意圖。
圖24.病毒片段(A)及表達(dá)兩種異源蛋白的病毒顆粒(B)的示意圖。
圖25.病毒片段含有HIV gp160和gag兩種異源蛋白的流感病毒示意圖。
圖26.使用Cre/lox生產(chǎn)不可復(fù)制型病毒的示意圖。
發(fā)明詳述本文所用術(shù)語“分離的及/或純化的”指本發(fā)明的宿主細(xì)胞或病毒在體外制備、分離及/或純化，從而與體內(nèi)物質(zhì)無關(guān)聯(lián)，或從體外物質(zhì)基本純化出來。本文所用“基本純化”意為目標(biāo)物質(zhì)占主要部分(即按摩爾數(shù)算，它的豐度比組合物中的其它任意物質(zhì)均高)，優(yōu)選的基本純化組分為目標(biāo)物質(zhì)至少構(gòu)成所有存在大分子物質(zhì)的50％(按摩爾數(shù)算)的組合物。一般地，基本純化的組合物將包含組合物存中所有存在大分子物質(zhì)的約50％、更優(yōu)選約80％、甚至更優(yōu)選約85％、90％、95％及99％。最優(yōu)選的是，目標(biāo)物質(zhì)純化到基本同質(zhì)(用常規(guī)檢測方法不能檢測到組合物中的污染物質(zhì))。
本文所用術(shù)語“重組核酸”或“重組DNA序列或片段”指核酸如DNA等，已從原始材料進行衍生或分離，隨后可在體外進行化學(xué)改變，使其序列不是天然存在的，或與天然存在的序列一致但其位置與天然基因組中的位置不同。鑒定為有用片段DNA序列或從RNA逆轉(zhuǎn)錄而來然后以基本純化形式合成的DNA序列是“衍生”于原始材料的DNA實例。此類從原始材料“分離”的DNA實例之一是，將有用DNA序列用化學(xué)方法如使用限制性內(nèi)切酶，從所述原始材料切下來、移走，以便利用基因工程方法進一步操作如擴增以便在本發(fā)明中使用。重組病毒從重組核酸制備。
本文使用的“異源”核酸片段、序列或分子意為片段、序列或分子所來源的原始材料與參照核酸片段、序列或分子的來源不同。例如，A型流感病毒片段或其中一部分對相應(yīng)的B型流感病毒片段或其中一部分來說是異源的，一種流感病毒株或血清型的NA病毒片段對于不同株或血清型的NA病毒片段來說是異源的，非流感病毒核酸分子如HIVgap160對于流感病毒核酸分子來說是異源的。相反，同源核酸片段來源于與參照核酸片段來源相同的原始材料。因此，本發(fā)明的核酸分子是嵌合分子，它包括3’非編碼區(qū)、互為同源的至少一段導(dǎo)入序列及5′非編碼區(qū)。
短語“高效復(fù)制”在本發(fā)明的上下文中定義為在體外組織培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生很高的感染滴度，如104～1010PFU/ml、優(yōu)選106～109PFU/ml。復(fù)制或疫苗生產(chǎn)中使用的流感病毒篩選，可使用本領(lǐng)域內(nèi)任意已知及/或合適的測定方法進行測定。適合于篩選的測定方法(單用或任意聯(lián)用)包括但不限于，使用諸如反向遺傳學(xué)、重排、互補及/或感染的方法的病毒復(fù)制、滅活(如使用抗血清滅活)的定量及/或定性測定、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯、病毒顆粒導(dǎo)入、毒性、HA或NA活性、病毒產(chǎn)率及/或形態(tài)學(xué)。例如，病毒復(fù)制測定可用于篩選病毒的減毒或滅活。參見Krug，R.M.等，《流感病毒》，Plenum出版社，紐約，1989。
“唾液酸”指一族含9個或更多碳原子的氨基糖，如神經(jīng)氨酸的N-及O-取代衍生物。
本文使用的“位點特異性重組”應(yīng)包括下列三種事件1)旁側(cè)有位點特異性重組位點或序列如lox位點的目標(biāo)DNA片段刪除；2)旁側(cè)有位點特異性重組位點或序列如lox位點的目標(biāo)DNA片段的核酸序列反轉(zhuǎn)；和3)不同DNA分子上位點特異性重組位點或序列如lox位點旁邊的目標(biāo)DNA片段發(fā)生相互交換。位點特異性重組酶系統(tǒng)包括但不限于，噬茵體P1的Cre/lox系統(tǒng)(No.5,658,772號美國專利)、酵母的FLP/FRT系統(tǒng)(Golic和lindquist，1989)、Mu的Gin重組酶(Maeser等，1991)、E.coli的Pin重組酶(Enomoto等，1983)及質(zhì)粒pSR1的R/RS系統(tǒng)(Araki等，1992)。
可在本發(fā)明中使用的細(xì)胞系和流感病毒根據(jù)本發(fā)明，任何支持流感病毒高效復(fù)制的細(xì)胞均可在本發(fā)明中使用，包括作為流感病毒受體的一種或多種唾液酸表達(dá)水平減少或下降的突變細(xì)胞。此方法所得病毒可制備成重排體病毒。
優(yōu)選的細(xì)胞是WHO鑒定的或可鑒定的可連續(xù)傳代細(xì)胞系。認(rèn)證此類細(xì)胞系的需求包括系譜學(xué)、生長特性、免疫學(xué)標(biāo)記、病毒易感性、致瘤性及儲存條件中至少一種特征，以及動物、卵及細(xì)胞培養(yǎng)。這些特征用于確認(rèn)細(xì)胞不含可檢測的外來物。在一些國家中，還需要細(xì)胞核學(xué)。另外，優(yōu)選在與疫苗生產(chǎn)所用細(xì)胞同代水平的細(xì)胞中檢驗致瘤性。在疫苗生成的滅活或減毒前，病毒優(yōu)選用已表明可給出一致結(jié)果的方法進行純化(參見世界衛(wèi)生組織，1982)。
優(yōu)選完成所用細(xì)胞系的全部鑒定，以包括合適的終產(chǎn)品純度檢驗?？捎糜诒景l(fā)明中所用細(xì)胞鑒定的數(shù)據(jù)包括(a)其起源、衍生及傳代歷史的信息；(b)其生長及形態(tài)學(xué)特征的信息；(c)外源性物質(zhì)檢驗結(jié)果；(d)可在其它細(xì)胞系中清楚識別該細(xì)胞的明顯特性，如生化、免疫學(xué)及細(xì)胞遺傳模式；及(e)致瘤性檢驗結(jié)果。優(yōu)選的是，所用宿主細(xì)胞的傳代水平或數(shù)量擴增盡可能低。
優(yōu)選在疫苗或基因治療制劑制備前將細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒高度純化。一般地，純化過程可以除去大量細(xì)胞DNA、其它細(xì)胞組分及外源性物質(zhì)。使DNA廣泛降解或變性的方法也可使用。參見Mizrahi，1990。
疫苗本發(fā)明的疫苗可包含包括任意病原體糖蛋白在內(nèi)免疫原性蛋白，如來自一種或多種細(xì)菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白。因此，在一實施方案中，本發(fā)明的流感病毒可以是流感病毒或其它病毒性病原體的疫苗載體，這些病原體包括但不限于諸如HIV、B型肝炎病毒、丙型肝炎病毒的慢病毒，諸如CMV或HSV或口蹄疫病毒之類的皰疹病毒。
完全病毒顆粒疫苗用超濾法濃縮，然后用區(qū)帶離心或?qū)游龇椒兓?。病毒在純化前或純化后進行滅活，如用甲醛或β-丙內(nèi)酯滅活。
亞單位疫苗包含純化的糖蛋白。此類疫苗可按如下所述制備用去污劑處理片段化的病毒懸液，純化表面抗原，如利用超速離心。因而亞單位疫苗主要包含HA蛋白，也包含NA。所用去污劑可以是陽離子去污劑，如十六烷基三甲基溴化銨(Bachmeyer，1975)；陰離子去污劑，如去氧膽酸胺(Laver & Webster，1976；Webster等，1977)；或非離子去污劑，如名為TRITON X100的商用去污劑。病毒顆粒用諸如菠蘿蛋白酶的蛋白酶處理后，可將血凝素分離出來，然后加以純化，如用Grand及Skehel(1972)所述的方法純化。
片段疫苗包含已用可溶解脂質(zhì)的試劑處理過的病毒顆粒。片段疫苗可按如下所述制備如上述所獲得的純化病毒水性懸液，不管其滅活與否，在振搖下用諸如乙醚或氯仿等與去污劑相關(guān)的脂溶解劑處理。水相恢復(fù)成包含片段疫苗，主要由起始脂質(zhì)外界已除去的血凝素及唾液酸酶、核心或其降解產(chǎn)物。如果殘留的感染性顆粒還未滅活，則將其滅活。
滅活的疫苗。
本發(fā)明的滅活流感病毒疫苗可用已知方法使復(fù)制后的病毒滅活而得以制備，這些方法包括但不限于用甲醛或β-丙內(nèi)酯處理?？稍诒景l(fā)明中使用的滅活疫苗類型可包括全病毒(WV)疫苗或亞病毒顆粒(SV)(片段)疫苗。WV疫苗包含完整、滅活的病毒；而SV疫苗包含純化病毒，該病毒用可溶解含脂病毒包膜的去污劑破壞，然后將殘留病毒用化學(xué)方法滅活。
另外，可用的疫苗包括含分離HA及NA表面蛋白的疫苗，表面蛋白指表面抗原或亞單位疫苗。通常，對SV及表面抗原(即純化的HA或NA)疫苗的反應(yīng)是類似的。含有流行病毒相關(guān)NA抗原及不相關(guān)HA的試驗性滅活WV疫苗似乎比常規(guī)疫苗的效率低(Ogra等，1977)。優(yōu)選包含兩種表面抗原的滅活疫苗。
活的減毒病毒疫苗。
按照已知方法的步驟操作，活的減毒病毒疫苗也可用于預(yù)防或治療流感病毒感染。優(yōu)選按照已知方法(參見Murphy，1993)，在一個步驟中將減毒的基因從減毒的供體病毒轉(zhuǎn)移到復(fù)制的分離體或重排病毒，從而實現(xiàn)減毒。由于對流感病毒A的抗性由對HA及NA糖蛋白的免疫反應(yīng)發(fā)展所介導(dǎo)，編碼這些表面抗原的基因必須來源于這些重排病毒或高速生長的臨床分離體。減毒的基因來源于減毒的親代。在此方法中，負(fù)責(zé)減毒的基因優(yōu)選不編碼HA及NA糖蛋白。否則，這些基因不能轉(zhuǎn)移到含重排體的臨床病毒分離體表面抗原。
已評價了許多供體病毒再現(xiàn)性地減毒流感病毒的能力。作為非限制性的實施例之一，A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)耐寒(ca)的供體病毒可用于減毒疫苗的生產(chǎn)(參見Edwards，1994；Murphy，1993)。另外，可以將ca供體病毒與本發(fā)明的有毒復(fù)制病毒配對，從而生成活的減毒重排病毒疫苗。然后在H2N2抗血清存在的條件下于25℃(限制有毒病毒的復(fù)制)對重排體的子代進行選擇，所述抗血清抑制含減毒A/AA/6/60(H2N2)ca供體病毒表面抗原的病毒復(fù)制。
已在人類評價了大部分的H1N1及H3N2重排體系列，并發(fā)現(xiàn)它們滿足(a)具感染性；(b)對血清反應(yīng)陰性兒童及免疫學(xué)刺激的成人發(fā)生減毒；(c)具免疫原性；及(d)遺傳穩(wěn)定。Ca重排體的免疫原性與其復(fù)制水平平行。因此，通過新的野生型病毒獲得ca供體病毒的6個可轉(zhuǎn)移基因可以再現(xiàn)地使這些病毒減毒以用于易感成人及兒童的疫苗接種。
可利用定點突變將其它減毒突變導(dǎo)入流感病毒基因中以維持含這些突變基因的病毒。減毒突變可導(dǎo)入基因組的非編碼區(qū)和編碼區(qū)。此類減毒突變也可導(dǎo)入HA或NA之外的基因中，如PB2聚合酶基因(Subbarao等，1993)。這樣，新供體病毒生成時也可含有定點突變所導(dǎo)入的減毒突變，并且這些新的病毒可用于以與上述A/AA/6/60 ca供體病毒類同的方式還原活的減毒重排體H1N1和H3N2疫苗侯選者。類似地，其它已知及合適的減毒病毒可與本發(fā)明的流感病毒一起進行重排以獲得適合在哺乳動物疫苗接種中使用的減毒病毒(Ewami等，1990；Muster等，1991；Subbarao等，1993)。
優(yōu)選的是這些減毒病毒維持來自于病毒的基因，所述基因編碼與原始臨床分離體基本類似的抗原決定簇。這是因為減毒疫苗的目標(biāo)是提供與病毒原始分離體基本相同的抗原性，同時感染性減少到疫苗可導(dǎo)致在接種哺乳動物中誘導(dǎo)嚴(yán)重疾病狀態(tài)發(fā)生微小改變的程度。
這樣病毒可根據(jù)已知方法減毒或滅活，制成制劑作為疫苗施用以在動物如哺乳動物中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。此類減毒或滅活疫苗是否保持了與臨床分離體或其衍生高速生長株類似的抗原性，其測定方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。這樣的方法包括使用抗血清或抗體清除表達(dá)供體病毒抗原決定簇的病毒；化學(xué)選擇(如金剛烷胺或rimantidine)；HA及NA的活性和抑制；以及DNA篩選(諸如探針雜交或PCR)來確認(rèn)減毒病毒中不存在編碼抗原決定簇(如HA或NA基因)的供體基因。參見Robertson等，1988；Kilbourne等，1969；Aymard-Henry等，1985；Robertson等，1992。
藥用組合物本發(fā)明適合于接種、非腸道使用或口服的藥用組合物包含減毒或滅活的流感病毒，任選還包括無菌水性或非水性溶液、懸液及乳液。組合物還可進一步包含領(lǐng)域內(nèi)已知的輔助劑或賦形劑，參見Berkow等，1987；Goodman等，1990；Avery的藥物治療，1987；Osol，1980；Katzung，1992。本發(fā)明的組合物通常以單劑(單位劑量)的形式提供。
常規(guī)疫苗通常包含約0.1～200μg、優(yōu)選約10～15μg來自各株而進入其組合物的血凝素。構(gòu)成本發(fā)明疫苗組合物的主要成分的疫苗可包含A型、B型或C型或是其任意組合，如三種類型中的至少兩種、不同亞型的至少兩種、相同類型的至少兩種、相同亞型的至少兩種，或不同的分離體或重排體。A型人類流感病毒包括H1N1、H2N2及H3N2亞型。
非腸道施用制品包括無菌水性或非水性溶液、懸液及/或乳液，它們可包含領(lǐng)域內(nèi)已知的輔助試劑或賦形劑。非水性溶媒實例包括丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之類的植物油及諸如油酸乙酯之類的可注射有機酯類?？捎幂d體或密閉的敷料增強皮膚的滲透性和抗原吸收?？诜囊后w制劑通?？砂ê撘后w制劑的脂質(zhì)體溶液。用于懸浮脂質(zhì)體的合適形式包括乳液、懸液、溶液、糖漿及含純化水等本領(lǐng)域內(nèi)常用惰性稀釋劑的酏劑。除了惰性稀釋劑外，此類組合物也可包括佐劑、潤濕劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑或加香劑。參見Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery’s等，1987；Osol等，1980；以及Katzung，1992。
當(dāng)本發(fā)明的組合物用于個體施用時，它還可包括鹽、緩沖液、佐劑或其它增強組合物效能所需的物質(zhì)。例如，可使用佐劑這種能擴大特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)。正常情況下，在施用給免疫系統(tǒng)前將佐劑和組合物混合，或分開施用但進入接種器官的同一部位。適合在疫苗組合物中使用的材料實例見Oso1(1980)。
疫苗中的異源性可以通過使諸如2～50株或其任意范圍內(nèi)、任意數(shù)目的至少兩種流感病毒株的復(fù)制流感病毒混合而實現(xiàn)。優(yōu)選含現(xiàn)代抗原組合物的A型或B型流感病毒株。根據(jù)本發(fā)明，可提供使用本領(lǐng)域內(nèi)已知技術(shù)使流感病毒單株發(fā)生變異的疫苗。
根照本發(fā)明，藥用組合物還可進一步或另外包含一種化學(xué)治療化合物如用于基因治療的化合物、免疫抑制劑、抗炎劑或免疫增強劑；對于疫苗來說，化學(xué)治療劑包括但不限于γ-球蛋白、金剛烷胺、胍類、羥基苯并咪唑、α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α、縮氨基硫脲類、美替沙腙、利福平、利巴韋林、嘧啶類似物、嘌呤類似物、膦甲酸、膦?；宜帷⑽袈屙f、雙脫氧核苷、蛋白酶抑制劑或更昔洛韋。參見Katzung(1992)，及其在第798-800和680-681頁分別引用的文獻(xiàn)。
組合物也可包含可調(diào)但小量的無內(nèi)毒素甲醛及防腐劑，它們均已知是安全的，并不會在組合物所施用的生物體內(nèi)產(chǎn)生不需要的效應(yīng)。
藥學(xué)目的施用組合物(或其所激發(fā)的抗血清)的目的可以是“預(yù)防性”的，也可以是“治療性的”。當(dāng)預(yù)防性使用時，本發(fā)明組合物為疫苗，在病原體感染的任何癥狀顯現(xiàn)前使用。本發(fā)明組合物的預(yù)防性施用可作預(yù)防或減弱隨后的感染用。當(dāng)治療性使用時，減毒或來活的病毒疫苗在檢測到真正感染的癥狀后施用。本發(fā)明組合物的治療性施用可用于減弱任何真正的感染。參見Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；以及Katzung，1992。
因此，本發(fā)明的減毒或滅活疫苗組合物可以在感染發(fā)生前使用(以便預(yù)防或減弱預(yù)期的感染)，也可在真正的感染啟動后使用。
類似的，對于基因治療來說，組合物可以在病癥或疾病的任意癥狀顯現(xiàn)出來之前使用，也可在檢測到一個或多個癥狀后使用。
如果組合物可以為接受患者所耐受，則該組合為稱為“藥理學(xué)可接受”。如果所用量具有生理學(xué)上的意義，則稱“以治療有效量”施用。如果本發(fā)明組合物的存在可以使接受患者發(fā)生可檢測到的生理學(xué)變化，例如增強針對感染性流感病毒至少一株的初級或次級體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，則可稱具有生理學(xué)意義。
所提供的“保護”不一定是絕對的，也就是說如果與對照人群或一組患者相比，獲得了令人滿意的改善，則流感感染不一定是完全預(yù)防或根除了。保護可能僅限于緩解流感病毒感染癥狀的嚴(yán)重程度或發(fā)生速度。
藥學(xué)施用本發(fā)明的組合物通過被動免疫或主動免疫提供了對一種或多種病原體的抗性，如對一株或多株流感病毒株的抗性。主動免疫時，滅活或減毒活疫苗組合物預(yù)防性的施用于宿主(如哺乳動物)，而宿主對所施用疫苗的免疫反應(yīng)保護宿主免受感染及/或發(fā)病。對于被動免疫來說，所激發(fā)的抗血清可以復(fù)原并施用于可能帶有由至少一種流感病毒株導(dǎo)致的感染的接受者。
在第二個實施方案中，疫苗施用于哺乳動物的雌性(妊娠或分娩之時或之前施用)，施用時間和劑量足以產(chǎn)生可同時保護雌性及其胎兒或嬰兒(通過抗體被動穿過胎盤或進入母親的奶中起作用)的免疫反應(yīng)。
因此，本發(fā)明包括預(yù)防或改善病癥或疾病，例如由至少一株病原體所致的感染的方法。正如本文所述，如果疫苗的施用可獲得疾病病情或癥狀的完全或部分改善(即抑制)，或個體對該病的完全或部分免疫力，則說該疫苗可預(yù)防或緩解該疾病。
本發(fā)明的滅活或減毒流感病毒或其組合物至少有一種可利用前述藥用組合物通過可達(dá)到所需目的任意方法施用。
例如，可以通過各種非腸道途徑來施用這樣的組合物，如皮下、靜脈內(nèi)、腹腹腔、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、口腔或透皮途徑。非腸道施用可以是以一起注射或隨時間逐步推注。使用本發(fā)明藥用組合物的優(yōu)選模式之一是在肌內(nèi)或皮下應(yīng)用。參見Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；以及Katzung，1992。
預(yù)防、抑制或治療流感病毒相關(guān)病狀的典型方案包括施用有效量的本文前述疫苗組合物，可單次施用治療，或在包括1周到約24個月或其中任意范圍或數(shù)值的一段時期內(nèi)以增強或追加劑量重復(fù)施用。
按據(jù)本發(fā)明，“有效量”疫苗組合物是能獲得所需生物學(xué)效應(yīng)的量?？梢岳斫獾氖怯行┝恳蕾囉谀挲g、性別、接受者的健康狀況和體重，如果有合并治療則也依賴于合并治療的種類及治療的頻率，還依賴于所需效應(yīng)的本性。下面提供的有效劑量范圍不是想限制本發(fā)明，而是代表了優(yōu)選的劑量范圍。但是，最優(yōu)選的劑量依個體受試者而定，并為本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員所清楚和可由其決定。參見Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；以及Katzung，1992。
哺乳類(如人)或禽類成年生物體的減毒病毒疫苗用量可以是約103～107噬斑形成單位(PFU)/kg，或是其中任意范圍或數(shù)值的量。滅活疫苗的劑量可以是約0.1～200μg血凝素蛋白，如50μg。但是用已有疫苗作為起點，常規(guī)方法測定所用量應(yīng)當(dāng)是安全和有效的量。
具免疫反應(yīng)性的HA在復(fù)制病毒疫苗各劑量中的用量可以標(biāo)準(zhǔn)化為含有適當(dāng)?shù)暮?，?～50μg或其中任意范圍或數(shù)值，或是美國公共衛(wèi)生部所推薦的用量，通常是不小于3歲的兒童每組分15μg，小于3歲的兒童每組分7.5μg。NA的量也可標(biāo)準(zhǔn)化，但是該糖蛋白在純化過程及儲存時不穩(wěn)定(Kendal等，1980；kerr等，1975)。優(yōu)選每0.5-ml量的疫苗包含約1-50億個病毒顆粒，更優(yōu)選10億個顆粒。
本發(fā)明將在下面的非限限制性實施例作進一步的說明。
實施例1材料與方法病毒和細(xì)胞。從單個患者分離、位于含胚雞蛋(A/Tottori/AT1/AM2AL3/94；AM1AL3)或madin-darby犬腎內(nèi)的人H3N2病毒，從T.ito(Tottori大學(xué)，Tottori，日本)獲得。病毒原種在10天齡含胚雞蛋(AMZAL3病毒)中培養(yǎng)，或在補充有0.3％牛血清白蛋白及0.5mg胰蛋白酶/ml的最小基本培養(yǎng)基(MEM)中的MDCK細(xì)胞(K4病毒)上培養(yǎng)。MDCK細(xì)胞在補充有5％新生牛血清(Sigma，St.Louis，MO)的MEM中培養(yǎng)。
凝集素抗性細(xì)胞系的產(chǎn)生。長至75％融合的MDCK細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次，與朝鮮槐(MMA)凝集素(100mg/ml，BoehringerMannheim)或西洋接骨木(SNA)凝集素(100mg/ml，BoehringerMannheim)一起在含0.3％牛血清白蛋白的MEM中孵育。孵育48小時后，培養(yǎng)基用生長培養(yǎng)基(MEM-5％胎牛血清)取代。凝集素選擇如上所述另外重復(fù)兩次。存活下來的細(xì)胞集落加以克隆，SNA及MAA選擇的細(xì)胞系分別指定為MDCK-Sn10和MDCK-Ma。
用熒光計HPLC方法測定唾液酸含量。按Suzuki等(1997)所述，用高效液相色譜以熒光計測定兩種細(xì)胞系和純化病毒中的唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸[NeuAc]和N-糖基神經(jīng)氨酸[NeuGc])含量。各樣品置于5-ml頂部磨砂玻璃瓶中，與100μl(25mM)硫酸混合。然后將瓶于60℃加熱12小時水解唾液-糖鏈。冷卻后，50μl水解物中加入50μl 1，2-二氨-4，5-亞甲二氧基苯，混合物避光于60℃加熱2.5小時以使唾液酸的熒光顯影。所得溶液取10μl等分液注入裝有樣品注射閥(模型7125，Reodyne)和熒光分光光度計(650-105，Hirachi，東京，日本)的880-PU高效液相色譜(JASCO，東京，日本)，該熒光分光光度計帶有20-μl流動池和記錄儀(Chromatopac C-RSA，Shionadzu，東京，日本)。熒光分光光度計設(shè)置成激發(fā)波長為373nm、發(fā)射波長為448nm。NeuAc(Sigma)和NeuGc(Sigma)的標(biāo)準(zhǔn)混合物(200pmol/μl)用于建立校正曲線。
使用熒光計的唾液酸酶活性測定。病毒唾液酸酶活性(5×105PFU)按Hara等(1987)所述，以2’-(4-甲基傘形酮基)-α-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸(Sigma)為底物進行測定。簡單地說，熒光底物用0.5M醋酸鈉(pH4.6)以1∶2稀釋后，加到等量樣品中，于37℃孵育30分鐘。用200ml 0.5M的Na2CO2(pH10.7)終止反應(yīng)，于激發(fā)波長360nm和發(fā)射波長460nm孵化熒光。所有反應(yīng)一式兩份實施。
NA及HA基因的序列分析。使用Qiappin vRNA純化試劑盒，按廠商(Qiagen，Inc.，Valencia，Calif.)說明從病毒樣品獲得總病毒RNA(vRNA)。生產(chǎn)cDNA時，使用與A型病毒基因片段3’端12個保守vRNA核苷酸互補的寡核苷酸Uni-12作為莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，Madison，WI)反應(yīng)的引物。NA基因cDNA用NA基因特異性引物 JN2-43 (5′cRNA 正義序列5’-TGGCTCGTTTCTCTCACTATTGCC-3’；SEQ ID NO1)、JN2-1410r(3′cRNA反義序列5’-TTATATAGGCATGAGATTGATGTTCCG-3’；SEQ ID NO2)和10U Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)進行30輪循環(huán)擴增。所得PCR產(chǎn)物亞克隆入載體pCR21(Inbitrogen，Carlsbad，Calif.)，在自動化熒光測序中使用。HA基因用HA基因特異性引物JH3-Up(5′cRNA正義引物序列AGCAAAAGCAGGGGATAATTCTATTAACCATGAAGAC-3’；SEQ ID NO3)和JH3-Down(3′cRNA反義引物序列5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAATTAATGCACTC-3’；SEQ ID NO4)以與NA基因類似的方式進行克隆。對于每一個分離體，檢驗三個克隆以獲得NA和HA的共有序列。
結(jié)果凝集素抗性細(xì)胞系的產(chǎn)生。為了產(chǎn)生細(xì)胞表面唾液酸表達(dá)水平下降的細(xì)胞系，使用了唾液酸結(jié)合特異性不同的凝集素SNA和MAA。與MAA結(jié)合的唾液酸通過α(2，3)鍵與半乳糖(Wang等，1988)，而與SNA結(jié)合的唾液酸通過α(2-6)鍵與半乳糖或N-乙酰半乳糖胺連接(Shibuya等，1987)。使用支持流感病毒生長的MDCK細(xì)胞作為凝集素選擇的親代細(xì)胞。當(dāng)在其中任意一種凝集素存在的條件下導(dǎo)入時，大部分細(xì)胞在一周內(nèi)死亡。然后讓抗性細(xì)胞克隆長出來作為原種培養(yǎng)物。MAA及SNA凝集素選擇所得到的細(xì)胞系分別指定為MDCK-Ma和MDCK-Sn10。
用洋地黃毒甙標(biāo)記的MAA和SNA凝集素進行的熒光激活細(xì)胞分選(圖1A)證明正如以前所報道的那樣(Ito等，1997)，MDCK細(xì)胞與兩種凝集素的結(jié)合水平都很高。用α(2，6)鍵特異性凝集素選擇的MDCK-Sn10細(xì)胞，仍保持與α(2，3)特異性MAA凝集素的強烈結(jié)合，但對SNA凝集素的結(jié)合與親代MDCK親代相比變?nèi)趿?。相比之下，用?2，3)鍵特異性凝集素選擇的MDCK-Ma細(xì)胞，對兩種凝集素的結(jié)合均比MDCK細(xì)胞弱得多。
病毒在MDCK-Sn10和MDCK-Ma細(xì)胞系中的生長。為了獲悉流感病毒如何適應(yīng)受體表達(dá)減少的細(xì)胞，使用兩種唾液酸受體鍵特異性已知的流感病毒變體(AM2AL3及K4)(Ito等，1997)。K4病毒特異性地識別通過α(2，6)鍵與半乳糖連接的NeuAc[NeuAcα(2，6)Gal]，而AM2AL3病毒特異性識別NeuAcα(2，3)Gal。兩種病毒在MDCK-Sn10細(xì)胞中的復(fù)制與在MDCK細(xì)胞中的復(fù)制一樣好(表1)。但是，兩種細(xì)胞在MDCK-Ma細(xì)胞中的滴度均比MDCK細(xì)胞中的滴度低1個log。同樣，其中任意一種病毒感染后，即使感染復(fù)數(shù)達(dá)到10也僅有一小部分MDCK-Ma細(xì)胞繼續(xù)長至融合且不發(fā)生細(xì)胞病變效應(yīng)。當(dāng)培養(yǎng)基用含可促進病毒生長的胰蛋白酶的培養(yǎng)基替換時，血細(xì)胞凝集測定不能檢測到這些存活細(xì)胞中的病毒生成。這些細(xì)胞的HA和NP蛋白免疫化學(xué)染色也呈陰性(數(shù)據(jù)未列出)，因而證明細(xì)胞未持續(xù)感染。存活的細(xì)胞指定為MaKS。
表1.流感病毒在凝集素抗性細(xì)胞系中的復(fù)制*
*用AM2AL3或K4和病毒一起感染細(xì)胞，并測定感染50％組織培養(yǎng)細(xì)胞所需要的劑量(TCID50)，以此測定各細(xì)胞系的敏感性。
SNA和MAA凝集素的FACS分析證明，MaKS細(xì)胞象其衍生來源的MDCK-Ma細(xì)胞一樣，與α(2，6)特異性SNA的結(jié)合比MDCK細(xì)胞弱得多(圖1B)。另外，MaKS細(xì)胞的MAA凝集素結(jié)合峰比MDCK-Ma細(xì)胞系的結(jié)合峰窄得多，并且缺失了代表更高MAA結(jié)合群的小肩峰(圖1)。
為了測定唾液酸含量減少是MaKS細(xì)胞凝集素結(jié)合減少的原因，用液相色譜分析對MaKS細(xì)胞中存在的唾液酸進行定量。盡管NeuGc的水平低得多，MaKS細(xì)胞的NeuAC和NeuGc水平(分別為8.2和0.4pmol/μg蛋白)比MDCK細(xì)胞中的水平(分別為216.0和2.5pmol/μg蛋白)低得多。這些數(shù)據(jù)說明MaKS細(xì)胞中唾液酸受體決定簇大量減少。
病毒在MaKS細(xì)胞中的適應(yīng)。為測定AM2AL3及K4病毒如何在病毒表達(dá)水平非常低的細(xì)胞中繁殖并適應(yīng)生長，兩種病毒先后在液體培養(yǎng)中的MaKS細(xì)胞內(nèi)傳代。由于兩種病毒在MaKs細(xì)胞中的復(fù)制均比在MDCK細(xì)胞中的復(fù)制弱得多(表2)，第1至3代不稀釋，第4至13代按1∶1,000稀釋。第8代后，任意一種變體所產(chǎn)生的噬斑直徑由大(超過3mm)變小(約1mm)。到了10代或更高的代數(shù)，用MDCK細(xì)胞測定的病毒只呈現(xiàn)更小的噬斑(數(shù)據(jù)未列出)。經(jīng)過連續(xù)的13代后，兩種病毒均能在MaKS細(xì)胞中生長得與在MDCK細(xì)胞中一樣或長得更好(表2)。13代后由任一變種產(chǎn)生的病毒原種進行擴增，并分別指定為AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13。
表2.適應(yīng)于在凝集素選擇細(xì)胞中生長的病毒的復(fù)制*
*用AM2AL3(在卵中生長)、K4(在MDCK細(xì)胞中生長)、AL3(MaKS)-13或K4(MaKS)-13原種病毒感染的細(xì)胞，測定感染50％組織培養(yǎng)細(xì)胞所需要的劑量(TCID50)，以此測定各細(xì)胞系的敏感性。注意適應(yīng)于MaKS細(xì)胞中生長的兩種病毒在這些細(xì)胞中生長情況與MDCK細(xì)胞中一樣良好(AL3(MaKS)-13)或更好(K4(MaKS)-13)，而起始病毒在MDCK中生長得更好一些。
AL3(MaKS)-13如K4(MaKS)-13病毒HA及NA基因的突變分析。為測定病毒適應(yīng)以受體濃度降低為特征的細(xì)胞環(huán)境，將AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13病毒的HA基因逆轉(zhuǎn)錄，用PCR擴增cDNA，對所得產(chǎn)物測序。與兩親代病毒的相應(yīng)HA基因相比，兩種病毒的基因均不含突變。
由于NA唾液酸酶活性很可能影響HA受體結(jié)合活性，因而測定了AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13病毒的NA序列。兩種變體的NA基因序列分析均表明內(nèi)部有一大片缺失(圖2)。AL3(MaKS)-13內(nèi)，缺失從第220個核苷酸延伸到第1253個核苷酸，使一個閱讀框發(fā)生移支，從而在緊接該缺失后產(chǎn)生了一個終止密碼子。此NA的編碼容量為66個氨基酸，與NA的胞漿尾端、跨膜區(qū)、莖及頭部的一部分對應(yīng)。類似地，K4(MaKS)-13分離體在NA基因中從第130個堿基到1193個堿基發(fā)生，在第39個密碼子處引入了一個終止密碼子。和AL3(MaKS)-13一樣，該基因不再編碼完整的催化頭部區(qū)。因而，在受體表達(dá)水平下降的細(xì)胞中傳代的病毒已喪失其NA催化活性。
為了確認(rèn)此結(jié)果，用熒光唾液酸酶底物[2’-(4-甲基傘形酮基)-α-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸]分析了AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13變體的唾液酸酶活性。與親代病毒不同，兩個NA缺失突變體均未檢測到唾液酸酶活性(圖3)。
病毒糖蛋白的唾液酸化程度。正常感染時，唾液酸酶活性下降的病毒不能在細(xì)胞表達(dá)有效生長和聚集(Palese等，1974；Shibata等，1993)。那么，為什么缺乏唾液酸酶活性的AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13病毒可以在MaKS細(xì)胞中生長呢？一種可能的解釋是由于這些細(xì)胞的唾液酸含量低，HA及NA寡糖的唾液酸化程度也低，阻止了病毒在感染細(xì)胞表面上的聚集，即使無病毒唾液酸酶活性時也如此。為了檢驗此假設(shè)，對在MDCK細(xì)胞中生長的AM2AL3及K4病毒和MaKS細(xì)胞中生長的AL3(MaKS)-13病毒作了純化病毒制品的唾液酸含量比較。雖然AM2AL3病毒的唾液酸含量(0.9pmol NeuAc/g蛋白)比其它兩種的含量(A/Tottori/872/K4/94，3.8pmol NeuAc/g蛋白；AL3(MaKS)-13，2.6pmol NeuAc/g蛋白)要低，三種病毒樣品中的NeuAc含量類似。
因此，缺乏唾液酸酶活性的病毒可在唾液酸水平下降的細(xì)胞中高效生長，因為與正常細(xì)胞系相比，病毒蛋白并沒有廣泛地唾液酸化及與HA結(jié)合，而這些會阻止病毒的聚集。
討論以前的研究里，A型流感病毒在有外源細(xì)茵唾液酸酶活性及病毒NA抗體存在的條件下傳代導(dǎo)致病毒NA基因缺失(Liu等，1993；Liu等，1995；Yang等，1997)。而且，作為該分子對唾液酸殘基親和力下降的HA蛋白的補償性突變結(jié)果，如此傳代所得NA突變體可在缺乏外源唾液酸酶活性的細(xì)胞培養(yǎng)物、及卵和小鼠中生長(Hughes等，2000)。正如本文所述，A型流感病毒可適應(yīng)于在因NA基因大量缺失受體表達(dá)極度下降的細(xì)胞中生長，其中NA基因大量缺失使其唾液酸酶活性喪失。盡管病毒受體的減少理論上會影響結(jié)合受體的HA蛋白，只有NA基因發(fā)生了改變。
該結(jié)果的分子基礎(chǔ)是什么呢？在正常的細(xì)胞環(huán)境中，唾液酸受體豐度很高，NA活性的缺失可以通過減少唾液酸對病毒HA的親和力來補償，可以使子代有效地從宿主細(xì)胞釋放出來，防止病毒顆粒聚集(Hughes等，2000)。當(dāng)病毒受體不夠高時，如我們的MaKS細(xì)胞，HA親和力下降并不為病毒子代釋放及NA缺失突變體生長所必需。實際上，對于在病毒受表達(dá)水平下降細(xì)胞中的病毒復(fù)制來說，必須維持HA蛋白的高親和力結(jié)合。但是唾液酸酶活性對于在此類環(huán)境中病毒顆粒的釋放和防止病毒顆粒聚集來說不是必需的，因為細(xì)胞表面分子的唾液酸含量非常低，NA缺失的病毒顆粒其唾液酸含量與野生型病毒顆粒類似。實際上，對于病毒生長來說唾液酸酶活性很可能是有害的，因為它進一步從細(xì)胞表面去除了受體決定簇唾液酸。最近，發(fā)現(xiàn)缺失NA莖從而不能在卵中生長的A型流感病毒通過非同源RNA-RNA重組獲得了多至22個氨基酸的莖插入(Mitnau等，2000)。概括起來，這些結(jié)果表明流感病毒可通過進行包括大量插入及缺失在內(nèi)的根本遺傳學(xué)改變來適應(yīng)于新的宿主環(huán)境。
本研究及以前的研究(Hughes等，2000；Liu等，1993)均發(fā)現(xiàn)病毒通過NA基因片段中的缺失而喪失其唾液酸酶活性，其中剩下的片段編碼胞漿尾和跨膜區(qū)。因此，這些突變體中的NA基因保守區(qū)域可能對于諸如病毒形態(tài)形成和穩(wěn)定來說是必須的。
MaKS細(xì)胞的唾液酸含量比其親代(MDCK)細(xì)胞低。盡管也從CHO細(xì)胞生成了類似的細(xì)胞系(Ray等，1991)，但不能證明可在流感病毒研究中使用，因為它們不能有效的支持流感病毒。相反，MaKS細(xì)胞來源于流感病毒研究中的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系MDCK細(xì)胞，應(yīng)該可以在基于病毒受體的分析中使用。例如，由于外源性添加的神經(jīng)節(jié)苷酯可以合到宿主細(xì)胞膜中(Cafroll等，1985)，因而可以將一種已知的神經(jīng)節(jié)苷酯與MaKS一起孵育，并檢驗其作為病毒受體的能力。
在上個世紀(jì)，當(dāng)新興病毒的HA或HA及NA基因兩者引入人類時，三種A型流感病毒流行開來。不同宿主動物來源的病毒對照研究表明，這些流行的病毒株中NA基因引入了突變(Bean等，1992)。病毒突破宿主種屬障礙是否需要NA中發(fā)生類似的突變尚不清楚，但是來源于一種禽類病毒的人類病毒N2 NA其底物特異性在人類的復(fù)制過程中逐漸發(fā)生改變(Baum等，1991)。上述結(jié)果說明NA突變確實能有助于A型流感病毒適應(yīng)于新的環(huán)境。例如，人類病毒NA和鴨病毒其余基因的重排體病毒不能在鴨子中復(fù)制(Hinshaw等，1983)，即使人類病毒的NA來源于禽類病毒也是如此(Scholtissek等，1978)。說明NA基因在適應(yīng)人類的過程中很可能發(fā)生了突變。不同動物來源的病毒NA對照研究，和最近發(fā)展出來的基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)(Fodor等，1999；Neumann等，1999)一起，可能且助于深入理解這些表面糖蛋白有助于流感病毒適應(yīng)自然中的變化。
實施例2材料與方法細(xì)胞。293T人胚腎細(xì)胞于補充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)，Madindarby犬腎(MDCK)細(xì)胞于補充有5％新生牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)。按Neumann等(1999)所述，用含受RNA聚合酶I啟動子和終止子控制的A/WSN/33(H1N1)病毒基因cNDA的質(zhì)粒(稱為Pol1質(zhì)粒)和表達(dá)流感病毒蛋白的pCAGGS/MCS質(zhì)粒生成A型流感病毒(圖4)。簡單地說，Pol1質(zhì)粒及蛋白表達(dá)質(zhì)粒和感染試劑Trans ITLT-1(Panvera，Madison，WI)混合后，于室溫孵育10分鐘，加到Opti-MEM(GIBCO/BRL)培養(yǎng)的1×106個293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，培養(yǎng)基中加入0.5μg/ml胰蛋白酶的以激活HA蛋白，于37℃孵育1小時。收集上清。
質(zhì)粒。NAFLAG基因含NA cRNA的5’非編碼區(qū)；與胞漿尾(6個氨基酸)、跨膜區(qū)(29個氨基酸)和莖區(qū)(16個氨基酸)對應(yīng)的51個NA密碼子(圖4A)；FLAG表位(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；SEQ ID5)；兩個相連的終止密碼子(TAA TAG；SEQ ID NO6)；以及NA cRNA 3’端序列的185個堿基。該長度的3’端序列是截短NA片段中發(fā)現(xiàn)的最短片段(Yang等，1997)。用PCR將pT7Blue-NA中WSN基因的第173至1070(正義鏈中)個核苷酸缺失、并插入FLAG序列、兩個終止密碼子和一個StuI位點，生成可產(chǎn)生反義NAFLAG RNA的pPol1-NAFLAGWT。用StuI消化此片段，使之自我連接。用BsmBI將NAFLAG切下來，插到pHH21的BsmBI位點內(nèi)。
用于NAFLAGM(-)生產(chǎn)的pPOl1-NAFLAGM(-)缺乏NA蛋白的起始密碼子。用體外定點突變系統(tǒng)(GeneEditor，Promega)將截短NAFLAG蛋白的ATG起始密碼子變成GCG，來實現(xiàn)此目標(biāo)。
通過反向PCR將pT7Blue-NA中WSN基因的第203至1109(正義鏈中)個核苷酸用BglII位點取代，生成pPOl1-(183)GFP(157)，它生成的RNA含NA vRNA 3’末端非編碼區(qū)及編碼帶61個NA N-端密碼子的融合蛋白的互補序列，以及NA vRNA 5’末端的185個堿基，其中融合蛋白為增強熒光蛋白(eGFP，Clontech)。eGFP基因克隆入此BglII位點和位于NA蛋白框中1226位處(野生型NA基因中)的StuI位點。然后將NA-(183)GFP(157)基因插入pHH21的BsmBI位點。
用含BbsI位點的寡核苷酸引物通過PCR生成NA(0)GFP(0)基因，它含NA vRNA 3’末端非編碼區(qū)、eGFP的互補編碼序列及NA vRNA 5’非編碼區(qū)。此PCR片段用BbsI消化并插入這HH21的BsmBI位點中以便將質(zhì)粒引入細(xì)胞時，可以合成負(fù)鏈方向中含旁側(cè)有5’及3’NA vRNA區(qū)非編碼區(qū)的eGFP編碼序列的RNA。
通過PCR突變生成一系列缺失突變體。NA-eGFP融合蛋白的缺失突變體從pT7Blue載體中的NA-(183)GFP(157)基因制備。通過PCR突變生成NA-(183)GFP(0)基因，它缺失了NA-(183)GFP(157)的NA編碼區(qū)的整個3’端(正義)。該突變體含5’非編碼區(qū)(正義)、NA序列的61個氨基酸、eGFP基因、兩個終止密碼子及3’非編碼區(qū)。NA-(90)GFP(0)、NA-(45)GFP(0)、NA-(21)GFP(0)和NA-(18)GFP(0)等PCR突變體分別包含NA-(180)GFP(0)NA編碼區(qū)的30、15、7或6個N-末端氨基酸缺失。
用與NA(61)GFP基因相同的方式制備NA0G185基因，它含NA基因(正義)的5’非編碼區(qū)、eGFP基因、兩個終止密碼子及3’非編碼區(qū)的185個核苷酸。此突變體具有NA vRNA的5’非編碼區(qū)(28個苷酸)和NA vRNA 5’編碼區(qū)的157個核苷酸。NA-(183)GFP(78)和NA-(183)GFP(39)突變體是NA0G185的缺失突變體，分別象NA0G185那樣具有NA 5’編碼區(qū)的一半或四分之一。
免疫染色。為了檢測粘附到截短NA蛋白上的FLAG表位，用含該表位的病毒感染MDCK細(xì)胞，并用含0.5μg胰蛋白酶/ml及100μU/ml霍亂弧茵唾液酸酶(GIBCO/BRL)的0.6％瓊脂糖覆蓋。感染的細(xì)胞用3％甲醛溶液固定。然后以抗-FLAG單克隆抗體M2(Sigma)為第一抗體并以生物素化的抗小鼠IgG為第二抗體，用Vectastain ABC試劑盒(Vector，Burlingame，CA)檢測FLAG表位。為了鑒定WSN病毒感染的細(xì)胞，用兔抗WSN血清作為第一抗體。
原位雜交。用洋地黃毒甙(DIG)標(biāo)記的探針與感染細(xì)胞雜交，并根據(jù)制造商的說明用DIG核酸檢測試劑盒(Roche)染色。與編碼FLAG表位核苷酸序列互補的寡核苷酸(100pmol)(GAC TAC AAG GAC GAC GATGAC AAG；SEQ ID NO7)用DIG寡核苷酸加尾試劑盒(Roche)于37℃標(biāo)記6小時。病毒感染的細(xì)胞用3％甲醛溶液固定，用溶于3％甲醛中的0.1％Triton-X100穿透，在預(yù)雜交緩沖液(5X SSC，檢測試劑盒中的1％封閉試劑，1％N-十二烷基肌氨酸，含0.1mg/ml檢測試劑盒的多聚(A)-DNA的0.02％十二烷基硫酸鈉[SDS])中于65℃預(yù)雜交30分鐘。預(yù)雜交緩沖液中加入寡核苷酸探針(10pmol)，于55℃雜交1小時。雜交的細(xì)胞用洗滌液(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，0.3％吐溫20，pH7.5)洗滌5分鐘，用1％封閉試劑于室溫封閉30分鐘，與偶聯(lián)有堿性磷酸酶的抗-DIG抗體(1∶5000)于室溫孵育30分鐘。然后用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞，與檢測緩沖液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5)的氯化氮藍(lán)四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)中于室溫避光孵育3小時。
競爭傳代。NAFLAGWT或NAFLAGM(-)病毒(300噬斑形成單位[PFU])與3×104PFU NA(-)病毒混合，用于感染亞融合的MDCK細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)為0.01)，并在含0.5μg胰蛋白酶/ml及100μU/ml霍亂弧茵唾液酸酶的培養(yǎng)基中孵育72小時。用收獲的病毒感染MDCK細(xì)胞。此過程重復(fù)5次。
結(jié)果。
缺乏NA基因片段的A型流感病毒可以存活。反復(fù)傳代后截短NA基因得以保留下來說明其對于病毒復(fù)制的重要性。為了生成沒有NA RNA片段的突變A型流感病毒，用生產(chǎn)除NA vRNA外vRNA和表達(dá)九種結(jié)構(gòu)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。當(dāng)293T細(xì)胞培養(yǎng)上清與MDCK細(xì)胞在霍亂病毒唾液酸酶存在的條件下一起孵育時，觀測到了噬斑(直徑為189±15.6μm)。在液體培養(yǎng)物中，該病毒(指定為NA(-))長到了105PFU/ml。因而，只有7個vRNA片段的A型流感病毒可以存活。
截短NA片段對于病毒高效生長是必需的。為了理解反復(fù)傳代后NA基因穩(wěn)定維持的分子基礎(chǔ)，將含截短NA基因的病毒生長情況與缺乏NA基因起始密碼子、編碼NA(-病毒)的病毒生長情況作對比。用反向遺傳學(xué)生成NAFLAGWT突變病毒。NAFLAGWT所含的NA基因內(nèi)部有缺失及與截短NA融合的FLAG表位序列。NAFLAGWT生長至105PFU/ml，并在細(xì)菌唾液酸酶存在的條件下生成了噬斑。噬斑用抗-FLAG單克隆抗體或抗-WSN多克隆抗體進行免疫染色(圖4C)。NA(-)或NAFLAGWT病毒生成的噬斑用抗-WSN抗體染色，僅對后者產(chǎn)生的噬斑用抗-FLAG抗體染色。
為了測定復(fù)制能力的差別，NA(-)和NAFLAGWT病毒以100∶1的比例混合，將此混合物與MDCK細(xì)胞一起孵育(圖5)。感染48小時后，取上清用于生成噬斑，噬斑用抗-FLAG單克隆抗體免疫染色。計算總噬斑中FLAG-陽性噬斑的百分比，以此測定含截短NA片段的病毒的發(fā)生率。該過程重復(fù)4次以上。如圖7B所示，群體中FLAG陽性噬斑在傳代的過程中逐漸增加，到第5代時幾乎達(dá)到90％。此結(jié)果說明，含8個片段的病毒(即使該截短的NA基因不編碼功能性唾液酸酶)比含7個片段的病毒生長得更好。
病毒RNA對于病毒高效生長來說是重要的。為了測定截短的NA蛋白或病毒RNA對于病毒高效復(fù)制是否重要，構(gòu)建了缺乏NA起始密碼子及框中另一ATG密碼(第15個密碼子)的NAFLAGM(-)基因(圖6A)。用抗-FLAG抗體未能檢測到NAFLAGM(-)病毒生成的噬斑(圖6B)，表明蛋白未翻譯出來。為了確保NAFLAGM(-)病毒具有NAFLAGM(-)基因，對該病毒生成的噬斑用FLAG特異性探針進行原位雜交。這些噬斑與探針發(fā)生反應(yīng)，確認(rèn)此病毒中NAFLAGM(-)基因的存在。然后將此病毒的復(fù)制能力與上述7片段病毒相比。用FLAG序列特異性探針標(biāo)記的噬斑百分率逐步上升(圖7B)，到第5代時接近80％的噬斑變成FLAG序列陽性(圖7A)。如缺乏抗-FLAG抗體免疫染色的噬斑所證明，傳代過程中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)截短NA蛋白的回復(fù)突變體。因此，盡管由于混合感染物中NAFLAGM(-)變得占統(tǒng)治地位時病毒復(fù)制速率低于NAFLGWT的復(fù)制速率，因而NA蛋白可能在高效病毒有效復(fù)制中起一定作用，但是病毒RNA本身可能在高效病毒復(fù)制中起重要作用。
病毒NA vRNA包裝信號延伸入編碼區(qū)。CK2-29及E17E病毒即使在廣泛的傳代后，截短NA基因仍得以保留下來，表明NA RNA片段的編碼區(qū)中有vRNA導(dǎo)入到病毒中的信號(即包裝信號)存在。為了檢驗此假設(shè)，將編碼eGFP的序列插入截短NA基因閱讀框內(nèi)NA序列缺失的位置。將此重組基因指定為NA-(183)GFP(157)，它具有NA vRNA的3’非編碼區(qū)和NA編碼區(qū)的N-末端61個密碼子、eGFP編碼區(qū)及NA vRNA5’末端的185個核苷酸。制備用NA-(183)GFP(157)基因取代相應(yīng)野生型NA基因的病毒，進行噬斑測定(圖8A)。超過90％的噬斑表達(dá)eGFP，表明NA-(183)GFP(157)基因?qū)肓瞬《绢w粒并在病毒的復(fù)制過程中得以保留下來(圖8B)?？紤]到旁側(cè)有NS非編碼區(qū)序列CAT基因未能保持留到超過5代以上(Luytjes等，1989)，該結(jié)果是引人注目的。
既然NA-(183)GFP(157)和CAT構(gòu)建體之間的差異表現(xiàn)在病毒編碼序列，構(gòu)建了與CAT構(gòu)建體類似的基因NA(0)GFP(0)，它包含旁側(cè)有3’及5’NA非編碼區(qū)的eGFP編碼序列。此構(gòu)建體缺失NA編碼區(qū)。盡管用此基因生成的病毒可以生成噬斑，只有一小部分(0.1％)噬斑有一兩個表達(dá)eGFP的細(xì)胞，表明NA(0)GFP(0)基因未能在病毒復(fù)制過程中得以保留下來。用質(zhì)粒感染的293T細(xì)胞，包括一個表達(dá)生產(chǎn)病毒所用NA(0)GFP(0)基因的質(zhì)粒所感染的293T細(xì)胞，其eGFP的表達(dá)程度低于表達(dá)NA(61)GFP的質(zhì)粒所感染病毒的表達(dá)水平。用于NA(0)GFP(0)的PolI質(zhì)粒量增加了10倍，結(jié)果使表達(dá)eGFP的293T細(xì)胞數(shù)與用NA(0)GFP(0)的polI質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)類似。即使用于NA(61)GFP的PolI質(zhì)粒用量高出10倍，NA(0)GFP(0)病毒生成的噬斑僅有1％包含eGFP陽性細(xì)胞，而且這些噬斑中的細(xì)胞只有少量表達(dá)eGFP。這些結(jié)果表明，病毒NA RNA的包裝信號延伸到了NA編碼區(qū)內(nèi)。
RNA片段在高效病毒生產(chǎn)中的作用。為了理解為什么8片段RNA病毒比7片段RNA病毒長得好，對具有6、7或8個病毒RNA片段的病毒作了感染性病毒顆粒生產(chǎn)的比較(圖9)。為了生成8片段病毒，用正常病毒生產(chǎn)的所有9個片段結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白表達(dá)質(zhì)粒和8種PolI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。同時也使用具有兩突變使NS2不能生成的NS PolI質(zhì)粒，這樣從293T細(xì)胞生成的病毒不會進行多次復(fù)制循環(huán)。另外，分別使用具有使HA及NA蛋白不能生成的突變的HA和NA PolI質(zhì)粒，以便基因片段的消除僅限于RNA片段，而不是基因產(chǎn)物。對于7片段病毒的生產(chǎn)，不包括NA基因的PolI基因，但包括一個表達(dá)NA蛋白的質(zhì)粒。為制備6片段病毒，不用HA及NA RNA的質(zhì)粒，但包括HA及NA蛋白表達(dá)質(zhì)粒。
為了比較三種病毒的病毒顆粒產(chǎn)量，用這些病毒感染MDCK細(xì)胞，在感染后48小時用抗WSN抗體對感染的細(xì)胞進行免疫染色，從而滴定從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞生成的感染性病毒顆粒數(shù)量。如圖9所示，感染性病毒顆粒生產(chǎn)的效率與病毒RNA片段的數(shù)量成正相關(guān)病毒RNA片段越多，病毒顆粒的生產(chǎn)越好。這些結(jié)果表明病毒RNA片段在高效病毒顆粒生產(chǎn)中起一定作用。
Na vRNA的3’末端對于其包裝入病毒顆粒內(nèi)很重要。縮小NA vRNA中包裝信號的范圍，制備了截短NA基因的3’或5’(vRNA正義)編碼區(qū)中有進一步缺失的病毒(圖8A)。由缺乏NA編碼區(qū)5’末端的NA-(183)GFP(0)病毒生成的噬斑約有40％表達(dá)eGFP，而由缺乏NA編碼區(qū)3’末端的NA0G185病毒生成的噬斑僅有1.8％表達(dá)eGFP。這些數(shù)據(jù)表明NA vRNA的3’末端對于其包裝入病毒顆粒內(nèi)很重要(圖8)。
討論通過制備缺失構(gòu)建體，測定了使NA片段導(dǎo)入病毒顆粒的NA編碼區(qū)。發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)的兩端均很重要，但與NA編碼區(qū)5’末端相對應(yīng)的vRNA3’末端比另一端更為重要。對于NS片段來說，與NS編碼區(qū)5’末端相對應(yīng)的vRNA 3’末端看起來比另一端更為重要(圖22)。相比之下，對于HA、M及NP片段來說，兩端均很重要，而對于PB2來說，與PB2編碼區(qū)3’末端相對應(yīng)的vRNA 5’末端更重要。這些結(jié)果說明，對于vRNA片段導(dǎo)入來說重要的序列位于編碼區(qū)內(nèi)，并且對于每一片段來說是唯一的。那些區(qū)域有可能通過堿基配對與其它病毒RNA相互作用，導(dǎo)致一組8個vRNA片段重新進入病毒顆粒。由于vRNA和病毒組分之間的相互作用是病毒特異性的，這樣的相互作用可以成為抗病毒化合物研發(fā)的靶點。
實施例3為了獲得病毒內(nèi)含物的真實形象，進行了電子顯微鏡斷層攝影(圖11A)。采集了厚度為50nm的病毒顆粒的圖象。然后，對這些病毒顆粒中的一個進行分析，重構(gòu)病毒顆粒內(nèi)含物的3D圖象。顆粒內(nèi)的結(jié)構(gòu)(桿)進行著色，以區(qū)分各結(jié)構(gòu)(圖11B～F，顯示頂視圖、側(cè)視圖及仰視圖)。桿的大部分視圖為橫截面，但是在桿從中間橫截的視圖中，顯示了整個分子。不過，所有視圖均顯示了桿之間的相互作用。
基于上述概要結(jié)果，以及支持每一病毒片段包含一段對于導(dǎo)入病毒顆粒內(nèi)來說很重要的唯一序列的數(shù)據(jù)，該序列可能有助于病毒內(nèi)含物獨特形態(tài)學(xué)特性的形成，vRNA片段很可能選擇性地導(dǎo)入流感病毒顆粒中。此信息不僅對鑒定研發(fā)抗病毒化合物有用，而且對制備減毒活疫苗也很有用，因為破壞病毒特異性相互作用可以抑制病毒復(fù)制并使之減毒。
實施例4材料與方法細(xì)胞。293T人胚腎細(xì)胞和COS-7細(xì)胞于補充有10％胎牛血清(FCS)和抗生素的Dulbecco’s改良Eagle’s最基本培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。Madindarby犬腎(MDCK)細(xì)胞于補充有5％新生牛血清和抗生素的MEM中培養(yǎng)。細(xì)胞在5％CO2中于37℃培養(yǎng)。
質(zhì)粒的構(gòu)建。Neumann等(1999)描述了如何生成含野生型A/WSN/33(H1N1)HA基因(命名為pPolI-WSN-HA)和野生型B/Lee/40HA基因(pPolI-B-HA)、用于病毒RNA生產(chǎn)的質(zhì)粒構(gòu)建體，其中兩者的HA基因旁側(cè)有人RNA聚合酶I啟動子及小鼠RNA聚合酶I終止子。使用引物及ProofStart聚合酶(QiaGEN)經(jīng)過PCR擴增生成一系列的A/B嵌合HA pPolI構(gòu)建體，然后用野生型HA構(gòu)建體進行連接(圖13)。所有構(gòu)建體均進行測序，確保未包含不需要的突變。
細(xì)胞培養(yǎng)中所表達(dá)HA的生物測定。用Trans IT試劑(Mirus)將各A/B嵌合HA pPolI構(gòu)建體(1μg)和其它四種基于pCAGGS的質(zhì)粒(各1μg)一起轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞，其中基于pCAGGS的質(zhì)粒表達(dá)三種聚合酶亞基(PA、PB1和PB2)和A/WSN病毒的核蛋白(NP)(Neumann等，1991)。轉(zhuǎn)染后48小時，細(xì)胞用霍亂弧茵唾液酸酶(10U/ml)和TPCK-胰蛋白酶(2.5μg/ml)于37℃處理30分鐘。然后細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，并用抗-B/HA抗體和商用ABC檢測試劑盒(Vector實驗室)進行免疫染色。同樣，進行血細(xì)胞吸附測定來評估各HA的受體結(jié)合性質(zhì)。簡單地說，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在磷酸鹽緩液中的1％雞紅細(xì)胞懸液內(nèi)于室溫孵育30分鐘，觀察前洗滌5次。另外，進行融合測定。簡單地說，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在HEPES緩沖液(pH5.0)中于37℃孵育5分鐘，然后在培養(yǎng)基中孵育7小時。用冰甲醇固定后，融合細(xì)胞如上所述進行免疫染色。
反向遺傳學(xué)。按Neumann等(1999)所述用基于質(zhì)粒的A/WSN或Blee反向遺傳系統(tǒng)生成病毒。帶來自于質(zhì)粒的野生型基因型的病毒分別指定為A/WSN-R或B/Lee-R，用作對比的對照。為了生成A/B嵌合病毒，用嵌合HA PolI構(gòu)建體取代了pPolI-WSN-HA。從293T細(xì)胞生成的病毒進行一次有限稀釋，實施生物克隆，在MDCK細(xì)胞中生成原種病毒。
實驗性感染。為了測定病毒的病原性，四周齡的雌性BALB/c小鼠經(jīng)七氟烷麻醉后，用A/B嵌合病毒或野生型病毒(105TCID50/50μl)進行鼻內(nèi)感染。監(jiān)測感染后14天的死亡率及體重。感染三天后，一些感染的小鼠處以無痛處死，測定器官中的病毒滴度。
為了評價各嵌合病毒對野生型病毒攻擊的疫苗效力，小鼠用嵌合病毒或野生型病毒(103TCID50/50μl)進行鼻內(nèi)感染。三周后，一組小鼠處以無痛處死，獲取血清及氣管-鼻洗液，檢測病毒特異性的IgA或IgG抗體。感染4周后，乘余的小鼠在麻醉狀態(tài)下用50倍LD50的野生型病毒(B/Lee-R)攻擊，監(jiān)測14天內(nèi)的死亡率及體重。
病毒特異性抗體的檢測。用Kida等(1982)所述酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢驗血清及氣管-鼻洗液中的IgA或IgG抗體。血清樣品用受體破壞酶(REDIIDenka Seken)處理后也檢驗了HI抗體。
結(jié)果A/B嵌合HA基因的構(gòu)建。為了測定B型HA與A型病毒組分的兼容性，在A/WSN和B/Lee HA基因之間構(gòu)建了一系列嵌合基因(圖14)。由于RNA片段兩個末端的非編碼區(qū)很可能可以在A型病毒和B型病毒之間互相交換，以進行RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制(Crescenzo-Chaigne等，1999；Desselberger等，1980；Mster等，1981)，制備了含A型病毒非編碼區(qū)及B型病毒完整編碼區(qū)的嵌合HA基因(圖14A，ANBH)。此構(gòu)建體將產(chǎn)生完整的B型HA蛋白。然后制備B型病毒HA編碼區(qū)及非編碼區(qū)換成A型病毒相應(yīng)部分的嵌合基因(ANSBH)。此構(gòu)建體經(jīng)細(xì)胞信號肽酶除去A型信號肽后也會產(chǎn)生完整的B型HA。類似的，制備編碼B型HA跨膜區(qū)及胞漿區(qū)的序列換成A型的嵌合基因(ANTBH)，從而編碼A/B嵌合HA蛋白。制備編碼B型HA信號、跨膜區(qū)及胞漿區(qū)的序列均換成A型的嵌合基因(ANSTBH)。此構(gòu)建體在切去信號肽后也會產(chǎn)生與ANTBH相同的嵌合HA蛋白。另外，制備HA編碼區(qū)切割位點上游所有相應(yīng)序列來自于B型病毒、下游序列來自A型病毒的嵌合體(ANBW)。此構(gòu)建體將會產(chǎn)生包含B型病毒HA1區(qū)和A型病毒HA2區(qū)的嵌合HA蛋白。最后制備ANBW構(gòu)建體中信號序列從B型換成A型的嵌合基因，也可以產(chǎn)生與ANBW一樣的嵌合HA蛋白。
細(xì)胞培養(yǎng)中所表達(dá)A/B嵌合Ha的生物學(xué)性質(zhì)。為了評價嵌合HA的功能性，將每一pPolI構(gòu)建體與表達(dá)野生型PA、PB1、PB2及NP的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞中。這些嵌合HA構(gòu)建體均可在細(xì)胞表面表達(dá)。為了檢驗這些HA的受體結(jié)合活性，進行血細(xì)胞吸附測定。測定前，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用細(xì)菌唾液酸酶處理以除去HA寡糖側(cè)鏈中的末端唾液酸，因為這些唾液酸會干擾受體結(jié)合活性(Luo等，1999)。表達(dá)ANBH、ANSBH、ANTBH及ANSTBH的細(xì)胞發(fā)生了血細(xì)胞吸附，而表達(dá)另外兩種(ANBW和ANSBW)的細(xì)胞未發(fā)生血細(xì)胞吸附(表3)。類似的，前面的HA誘導(dǎo)細(xì)胞融合，而后者不會。這些結(jié)果表明，前面的HA嵌合體具有生物學(xué)功能，而后面兩相沒有，可能是結(jié)構(gòu)改變所致。與以前報道所預(yù)期的一樣，A型聚合酶復(fù)合物和NP從完整的野生型B型HA片段生成了功能性B型HA(表3)，確證了B型啟動子結(jié)構(gòu)與A型聚合酶復(fù)合物之間的兼容性。
表3.A/B嵌合HA在所表達(dá)細(xì)胞及包含它們的病毒中的性質(zhì)
a)每一HA構(gòu)建體與表達(dá)A型聚合酶及表達(dá)NA的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時后測定各HA的生物學(xué)性質(zhì)。
b)含有野生型或嵌合HA基因和其它A型流感病毒基因的病毒用基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)生成。轉(zhuǎn)染48小時后收集294T細(xì)胞上清，進行感染性滴定。
c)用MDCK細(xì)胞制備病毒原種。發(fā)生細(xì)胞病變效應(yīng)時收獲病毒。
d)NA不能測得。
含嵌合HA的病毒生成。為了測定A型流感病毒感染時嵌合HA基因是否起作用，制備了HA基因為A/B HA嵌合基因所取代的突變WSN病毒?；谫|(zhì)粒的反向遺傳學(xué)可以產(chǎn)生滴度約為107TCID50/ml的野生型病毒(表3)。當(dāng)用pPolI-B-HA替換掉pPolI-WSN-HA時，未產(chǎn)生感染性病毒。雖然由質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清病毒滴度判定的效率不同，這四種具有生物學(xué)功能的嵌合HA構(gòu)建體(表3)均成功地在感染性A型病毒中保留下來了。含ANBH HA的病毒僅有微弱的復(fù)制，而含ANSTBHHA的病毒效率最高，長到了超過106TCID50/ml。另外兩種不表達(dá)具有生物功能的蛋白的HA基因不能支持病毒生長。這些A/B嵌合病毒指定為ANBH病毒、ANSBH病毒、ANTBH病毒和ANSTBH病毒。
為了確認(rèn)哪一種產(chǎn)生的病毒確實包含B型HA外功能域，用這些病毒感染MDCK細(xì)胞，并檢驗它們與A型病毒或B型病毒HA抗體的反應(yīng)性(圖14)。用含嵌合HA構(gòu)建體的病毒感染的細(xì)胞與抗-B/HA抗體及抗-A/NP抗體反應(yīng)，但不與抗-A/HA抗體反應(yīng)，確證了這些病毒包含B型HA外功能域。
A/B嵌合病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的生長特征。為了測定A/B HA嵌合病毒的復(fù)制性質(zhì)，用這此病毒以0.01的MOI感染細(xì)胞，對所得病毒檢驗其生長動學(xué)(圖15)。盡管這些帶嵌合HA的病毒沒有一種長得比野生型A型病毒更好，ANSTBH和ANTBH嵌合病毒幾乎長到了106TCID50/ml。與A型及B型病毒均不一樣，這些病毒均形成極小的噬斑，只有用免疫染色才能檢測到(數(shù)據(jù)未列出)。
A/B嵌合病毒在小鼠中的復(fù)制。A/B嵌合病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的限制性復(fù)制提示這些病毒可在體外減毒。因此，小鼠用A/B HA嵌合病毒(105TCID50/50μl)進行鼻內(nèi)接種。ANBH病毒未做檢驗，因為其原種滴度太低(約103TCID50/ml)。其它三種檢驗的嵌合病毒沒有一種可致小鼠死亡，而同樣劑量的A型病毒殺死了所有感染的小鼠，同樣劑量的B型病毒則殺死了8只受感染小鼠中的7只(表4)。接種后第3天從肺和鼻甲復(fù)原出了嵌合病毒，表明這些病毒在小鼠中得以復(fù)制。有趣的是，嵌合病毒的復(fù)制在肺部更受限，而在鼻甲的復(fù)制受到的限制要少一些。說明肺中的病毒復(fù)制與致死性之間可能存在聯(lián)系。與野生型A型病毒感染的小鼠相比，ANTBH及ANSTBH嵌合病毒感染的小鼠其體重下降的程度要小一些。總而言之，這些數(shù)據(jù)表明A/B HA嵌合病毒在小鼠中減毒了。
表4.小鼠中A/B嵌合病毒的病原性
a)小鼠用病毒(106TCID50)在鼻內(nèi)接種，監(jiān)測14天。體重變化用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD，n＝3)表示。
b)接種后第3天測定器官中的病毒滴度，以Log10TCID50/g的均值±SD(n＝3)表示。
c)NA不能測得d)對照小鼠用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行模擬接種。
當(dāng)野生型病毒感染時，A/B HA嵌合病毒免疫對小鼠的保護作用。由于A/BHA嵌合病毒表達(dá)來源于B型病毒的HA外功能域，可以預(yù)測的是這些病毒能提供對野生型B型病毒感染的保護性免疫反應(yīng)。在攻擊實驗之前測定小鼠經(jīng)嵌合病毒感染后是否誘導(dǎo)出了抗-B型抗體。接種三周后，用ELISA檢驗在來自于嵌合病毒所感染小鼠的鼻/氣管洗液內(nèi)檢測到了B型病毒特異性IgA，在血清中則檢測到了IgG抗體(圖16A)。來自于A/B HA嵌合病毒所感染小鼠的血清樣品中也檢測到了HI抗體(圖16B)。因此，盡管ANSBH誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)效率低一些，在所有用嵌合病毒感染的小鼠中均證明產(chǎn)生了特異性的抗體反應(yīng)。
這些嵌合病毒免疫的小鼠于免疫后4周用50倍LD50的B型病毒攻擊(表5)。攻擊后，這些小鼠均存活下來，而所有對照模擬免疫的小鼠均死了，用亞致死量(103TCID50)WSN病毒免疫的8只小鼠在野生型B型病毒攻擊后僅有2只存活下采，表明嵌合病毒的免疫反應(yīng)對野生型B型病毒感染具有特異性保護作用。另外，除一只攻擊3天后接受ANSBH病毒的小鼠外，從嵌合病毒預(yù)免疫的小鼠鼻甲或肺未復(fù)原出B型病毒(數(shù)據(jù)未列出)。
表5.A/B嵌合病毒免疫小鼠對野生型B型病毒攻擊的保護作用
a)小鼠用所列病毒進行鼻內(nèi)感染b)免疫4周后，小鼠用野生型B/Lee-R病毒(50倍LD50)在鼻內(nèi)進行攻擊，攻擊后監(jiān)測14天。體重的變化用均值±SD(n＝3)。
c)NA不能測得d)對照小鼠用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行模擬接種和攻擊。
討論正如本文所述，首次在A型病毒背景下生成了具有B型而不是A型HA的流感病毒，從而同時包含A型和B型病毒蛋白。生成A/B HA嵌合病毒所必需的是什么呢？嵌合基因必須轉(zhuǎn)錄和復(fù)制以便在病毒顆粒中維持下來。盡管在相同病毒類型中是保守的，A型和B型RNA片段之間的非編碼區(qū)(含RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所需啟動子序列(Luyt jes等，1989)兩端的末端序列不同(Crescenzo-Chaigne等，1999；Desselberger等，1980)。但是，以前的研究顯示A型聚合酶使旁側(cè)有B型病毒NS片段非編碼區(qū)的報道基因得以轉(zhuǎn)錄(Muster等，1991)。而且，生成了包含嵌合基因的嵌合A/B流感病毒(NA/B-NS)，其中嵌合基因包含A型病毒NA的編碼序列和B型病毒NS的非編碼區(qū)(Muster等，1991)。這些數(shù)據(jù)表明雖然程度低于A型病毒基因的同源啟動子，A型聚合酶復(fù)合物還是識別出了B型NS基因的啟動子序列。
各RNA片段的非編碼區(qū)包括兩個結(jié)構(gòu)性區(qū)域所有8個RNA片段中保守的終止序列和內(nèi)部片段特異性的序列。由于啟動子活性主要由前面區(qū)域決定(Portela等，1999)，所有B型基因片段均有可能被A型聚合酶復(fù)合物轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。實際上，用含B型非編碼區(qū)的pPolI-B-HA質(zhì)粒和表達(dá)A型聚合酶及NP的質(zhì)粒感染細(xì)胞后，細(xì)胞中有B型HA表達(dá)(表3)，這一數(shù)據(jù)支持上述觀念。因此，未生成含完整B型HA片段的病毒即HA類型間重排體，不能解釋為缺乏RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。
嵌合病毒生成的限制性可能起始于RNA片段導(dǎo)入病毒顆粒的水平；對于病毒生成來說，嵌合片段必須包裝入病毒顆粒。盡管有報道認(rèn)為A型NS片段的非編區(qū)包含RNA包裝信號(Luyt jes等，1989)，流感病毒RNA片段的包裝機制尚未完全闡明。病毒顆粒導(dǎo)入所需RNA片段的序列或結(jié)構(gòu)特性大半仍是未知的，但是，最近發(fā)現(xiàn)A型NA RNA片段在編碼區(qū)的兩端均有其自身的病毒顆粒導(dǎo)入信號(Fujii等，2002，實施例2)。在此研究中，ANSBH病毒的復(fù)制效率比ANBH病毒的復(fù)制效率更高(圖14和表3)。因為這兩種病毒中表達(dá)的HA蛋白應(yīng)該是一樣的，那么復(fù)制效率的差異可能是RNA包裝效率不同的結(jié)果。也就是說，編碼HA信號序列的區(qū)域內(nèi)可能存在高效RNA包裝所需的結(jié)構(gòu)性特性。類似地，這也可解釋ANTBH和ANSTBH病毒之間復(fù)制效率的差異，它們也表達(dá)相同的HA蛋白。事實上，A型HA片段的包裝信號位于編碼區(qū)的兩端(數(shù)據(jù)未公開)。有趣的是，含A型病毒NA非編碼序列及B型病毒NA編碼區(qū)序列的嵌合NA基因不能進入A型病毒中(Ghate等，1999)。這可以解釋為缺乏含RNA包裝信號的A型病毒NA編碼區(qū)所致，與前面提及的最近發(fā)現(xiàn)(Fujii等，2002)一致。
就A/B HA嵌合病毒的生成來說可能也存在蛋白質(zhì)水平上的關(guān)鍵相互作用嵌合蛋白必須包裝入病毒顆粒中，而且必須對病毒復(fù)制發(fā)揮作用。反式方式供應(yīng)的B型NA蛋折可以替代A型NA的功能并導(dǎo)入A型病毒顆粒中，支持NA缺失的A型病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中完成多個復(fù)制循環(huán)(Ghate等，1999)。但是，正如前面所討論的，并沒有產(chǎn)生含B型NA的A型病毒。盡管產(chǎn)生了嵌合A/B HA病毒，與野生型病毒相比它們還是弱化了。這種弱化可能起始于B型HA受體結(jié)合活性和A型NA唾液酸酶活性之間的次最佳平衡。另外，HA中信號肽及/或跨膜區(qū)/胞漿域的替換可能已經(jīng)使結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。例如，HA中的跨膜區(qū)/胞漿域可以與其它病毒組分如引導(dǎo)高效病毒裝配的M1相互作用(Ali等，2000；Cenami等，1996；Jin等，1997；Zhang等，2000)。因此，不能產(chǎn)生含完整B型RNA片段的A型病毒或含完整A型RNA片段的B型病毒，其原因可能為RNA片段導(dǎo)入水平或蛋白功能性相互作用水平上受到限制，或者二者兼而有之。
A/B HA嵌合病毒在小鼠中因肺部受限制的復(fù)制得以減毒，并為小鼠提供了對野生型B型病毒感染的保護性免疫，提出了一種研發(fā)流感疫苗的新方法。目前，皮下施用三價滅活流感疫苗是全世界的標(biāo)準(zhǔn)，但是它們的效率不是最優(yōu)的。這主要是因為在流感病毒起始入侵的上呼吸道外未能誘導(dǎo)出令人滿意的體液免疫(Wavening等，2001)。因而，雖然這些疫苗可以減輕疾病的嚴(yán)重程度，但不能預(yù)防病毒感染。與滅活疫苗不同，活疫苗同時誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。此處所述的研究表明HA基因的嵌合操縱可以控制病毒減毒到不同的程度。這樣，此方法可允許生產(chǎn)在減毒和免疫原性間達(dá)成適當(dāng)平衡的活疫苗株。此外，A/B嵌合HA可以導(dǎo)入減毒突變已得到良好鑒定的耐寒A型流感病毒中(Maassab等，1999)。目前耐寒疫苗是A型病毒和B型病毒的混合物。兩種病毒之間的相互作用可能影響疫苗的效力，雖然此問題已通過調(diào)整病毒的劑量比而得以解決。含A/B嵌合HA的A型病毒將允許生產(chǎn)基于單個而不是兩個減毒病毒的活疫苗，從而消除A型病毒和B型病毒之間潛在的干擾。
因此，與對B型疫苗株減毒突變所知甚少、含A型病毒及B型病毒混合物的活減毒疫苗不同，可以生成含A型病毒背景下B型HA及NA的病毒。此方法允許生產(chǎn)基于主疫苗株的活疫苗，其中主疫苗株用于表達(dá)A型及B型HA和NA的減毒突變已得到良好界定。而且，病毒片段包裝信號的知識也促進了改良活減毒流感疫苗的研發(fā)。
實施例5材料與方法細(xì)胞和病毒。293T人胚腎細(xì)胞(293細(xì)胞系中插入了猿病毒40T抗原基因的衍生系)在補充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Baby倉鼠腎細(xì)胞(BHK)、中國倉鼠卵細(xì)胞(CHO)和Madindarby犬腎細(xì)胞(MDCK)分別用含5％FCS的DMEM、含10％新生牛血清的MEM和含5％新生牛血清的MEM培養(yǎng)。所有細(xì)胞在5％CO2中于37℃培養(yǎng)。A/WSN/33(H1N1)(WSN)病毒經(jīng)Neumann等(1999)所述反向遺傳學(xué)生成，并在MDCK細(xì)胞中繁殖。VSV印第安那株由反向遺傳學(xué)生成并在BHK細(xì)胞中繁殖。
反向遺傳學(xué)。為生成流感病毒樣的顆粒(VLP)及突變A型流病毒，使用了含WSN病毒基因cDNA的質(zhì)粒(稱為PolI質(zhì)粒)和真核蛋白表達(dá)載體pCAGGS/MCS(受雞β-肌動蛋白啟動子控制)，其中WSN病毒基因受人RNA聚合酶I啟動子和小鼠RNA聚合酶I終止子控制。簡單地說，PolI質(zhì)粒和蛋白表達(dá)載體與轉(zhuǎn)染試劑Trans IT LT-1(Panver，MadisCon，WI)混合，于室溫孵育15分鐘，加到Opti-MEM(GIBCO/BRL)培養(yǎng)的1×106個293T細(xì)胞中。6小時后，DNA轉(zhuǎn)染試劑換成含0.3％BSA和0.01％FCS的Opti-MEMI(GIBCO/BRL)。48小時后，收獲上清中的VLP或突變A型流感病毒。此研究中生成的轉(zhuǎn)染體均包含突變的HA vRNA片段和WSN病毒的其它vRNA片段，并按突變HA vRNA片段命名(例如，含HA(0)GFP(0)RNA片段的VLP指定為HA(0)GFP(0)VLP)。
質(zhì)粒的構(gòu)建。pPolI HA(0)GFP(0)用于生成含HA vRNA3’非編碼區(qū)、增強熒光蛋白互補編碼序列及HA vRNA 5’非編碼區(qū)的反義RNA。簡單地說，GFP基因用含BsmBI位點和HA 5’或3’非編碼序列的引物經(jīng)PCR擴增，用BsmBI消化，并克隆入PolI質(zhì)粒的BsmBI位點。此質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞可以生成反義方向上含編碼GFP的序列的RNA，其中所該序列旁側(cè)有HA vRNA的5’及3’非編碼區(qū)。
pPol IHA(468)GFP(513)這樣制備先用緊接引物Bam500R(5′-GCGGAT CCT CCC CTA TGG GAG CAT GAT AC-3’；SEQ ID NO6)和Xba1218F(5′-GCT CTA GAA ACT CTG TTA TCG AGA AAA TG-3’；SEQ ID NO7)經(jīng)反向PCR擴增用于生成WSN vRNA的pPolIHA。PCR產(chǎn)物用BamHI和XbaI消化，然后將GFP基因克隆入BamHI位點和XbaI位點。所得質(zhì)粒pPol IHA(468)GFP(513)用于生產(chǎn)含HA vRNA 3’非編碼區(qū)和3’編碼區(qū)468個堿基、GFP編碼序列、HA vRNA 5’編碼區(qū)513個堿基和5’非編碼區(qū)的反義RNA。以同樣的方式經(jīng)反向PCR生成一系列HA缺失突變體。這些突變體根據(jù)來源于HA編碼區(qū)的核苷酸數(shù)命名，例如HA(9)GFP(80)RNA片段包含HA 3’非編碼區(qū)，與N-末端區(qū)對應(yīng)、來自于HA編碼區(qū)的9個核苷酸，GFP閱讀框，與C-末端區(qū)對應(yīng)、來自于HA編碼區(qū)的80個核苷酸，以及HA 5’非編碼序列。這些質(zhì)粒構(gòu)建體均進行測序，確保PCR未引入不需要的突變。
用PCR生成pPol IHA(0)VSVG(0)，它用于生成含HA vRNA 3’非編碼區(qū)、V SVG互補編碼序列及HA vRNA 5’非編碼區(qū)的反義RNA。簡單地說，用含BsmBI位點和HA 5’或3’非編碼序列的引物，以pCAGGS-VSVG為模板經(jīng)PCR擴增VSV G基因。PCR產(chǎn)物用BsmBI消化，并克隆入pHH21載體的BsmBI位點。將VSV G的編碼序列克隆入HA(9)GFP(80)的BamHI位點和XbaI位點，從而制備pPol IHA(9)VSVG(80)。pPol INA(183)GFP(157)包含NA vRNA 3’非編碼區(qū)和編碼融合蛋白的互補序列，其中編碼融合蛋白的序列含61個NA的N-末端密碼子、兩個連續(xù)的終止密碼子(TAA-TAG)及NA vRNA 5’末端的185個堿基。它的制備方法如下pT7Blue-NA內(nèi)WSN NA基因中與第203個至1099個核苷酸(正義)對應(yīng)的區(qū)域先經(jīng)PCR用BglII位點取代，然后將GFP基因克隆入此BglII位點和1226位的StuI位點。然后將NA(183)GFP(157)基因插入PolI質(zhì)粒pHH21的BsmBI位點。
用于生產(chǎn)反義INA(183)GFP(157)Met(-)RNA的pPol INA(183)GFP(157)Met(-)缺少NA蛋白的起始密碼。它的制備方法如下通過體外定點突變(GeneEditor，Promega)將pPol INA(183)GFP(157)中pPol INA(183)GFP(157)基因的ATG起始密碼子和位于第15個密碼子的另一個ATG換成GCG。所得構(gòu)建體pPol INA(183)GFP(157)Met(-)包含NA 3’非編碼區(qū)(19個核苷酸)、與NA編碼區(qū)N端對應(yīng)的183個核苷酸、GFP開放閱讀框、兩個連續(xù)的終止密碼子(TAA-TAG)、與NA編碼區(qū)C端對應(yīng)的157個核苷酸及NA 5’非編碼區(qū)(28個核苷酸)，它受人RNA聚合酶I啟動子和小鼠RNA聚合酶I終止子控制。
免疫染色測定。在流感VLP感染16小時后，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次，用3.7％甲醛(在PBS中)于室溫固定20分鐘，然后用0.1％TritonX-100處理。為了檢驗VLP的生成效率，取106個細(xì)胞與0.1ml質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清一起孵育，記錄感染16小時后免疫染色測定NP為陽性的細(xì)胞數(shù)。
Western印跡。VLP或突變病毒于4℃以50,000×g的離心力離心下來。濃縮后的VLP或病毒重懸于裂解緩沖液(0.6M KCl，50mM TrisHCl，pH7.5，0.5％TritonX-100)中。裂解液置于15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，電轉(zhuǎn)移到聚偏乙烯二氟(PVDF)膜上，用PBS中的5％脫脂奶于4℃封閉過夜，然后與抗-WSN病毒多克隆抗體、抗-HA單克隆抗體或抗-VSVG單克隆抗體于室溫孵育1小時。膜用含0.05％吐溫-20的PBS洗滌三次。結(jié)合的抗體用VECTASTAIN ABC試劑盒(Vector)及Konica免疫染色試劑盒(Konica)檢測。
Northern雜交。存在于PolI質(zhì)粒所感染293T細(xì)胞中的vRNA用Isogen RNA提取試劑盒(Nippon Gene，東京，日本)于轉(zhuǎn)染24小后提取出來。RNA在乙二醛/DMSO/磷酸緩沖液中于50℃乙二醛化Glyoxalate化，在10mM磷酸緩沖液(pH7.0)中的1.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳分離。RNA點樣到尼龍膜上，并與寡核苷酸探針雜交，該探針與GFP序列(ATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGG；SEQ ID NO8)(10pmol)互補，并用DI G寡核苷酸加尾試劑盒(Roche)于37℃標(biāo)記30分鐘。利用該GFP探針于Easy Hyb(Roche)中于42℃過夜完成雜交。RNA條帶用DIG核酸檢測試劑盒(Roche)檢測。簡單地說，雜交膜用洗液(0.1M馬來酸、0.15M NaCl、0.3％吐溫-20，pH7.5)洗滌，用1％封閉試劑于室溫封閉30分鐘，與偶聯(lián)有堿性磷酸酶的抗-DIG抗體(1∶5000)一起于室溫孵育30分鐘。然后膜用洗滌緩沖液洗滌，與檢測緩沖液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5)的氯化氮藍(lán)四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)中于室溫避光孵育。RNA條帶用DIG核酸檢測試劑盒(Roche)檢測。對照RNA從模擬轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中提取。
轉(zhuǎn)染體病毒的復(fù)制性質(zhì)。24孔板中的雙孔RHK、CHO或MDCK細(xì)胞用病毒感染，用含0.01％FCS的MEM培養(yǎng)基覆蓋，于37℃孵育。于不同時間取上清測定MDCK細(xì)胞噬斑測定中的感染性病毒。
結(jié)果。
HA vRNA的編碼區(qū)是HA片段導(dǎo)入病毒顆粒中所必需的。為了測定HA vRNA的編碼區(qū)是否象NA vRNA那樣為導(dǎo)入病毒顆粒所必需，構(gòu)建了兩個質(zhì)粒僅含HA vRNA 5’及3’非編碼區(qū)和GFP編碼序列的pPol IHA(0)GFP(0)，和HA序列于500～1218位(正義方向)核苷酸缺失后GFP編碼序列插入HA基因框內(nèi)的pPol IHA(468)GFP(513)(圖17)。后面一個構(gòu)建體含HA 3’非編碼區(qū)(33個核苷酸)、與編碼區(qū)N-端對應(yīng)的468個核苷酸、帶一個終止密碼子的GFP開放閱讀框以及HA 5’非編碼區(qū)(45個核苷酸)。所得融合蛋白包含HA N-端的156個氨基酸和完整的GFP序列。
為了產(chǎn)生含這些突變HA vRNA的VLP，用pPol IHA(0)GFP(0)或pPol IHA(468)GFP(513)、7 RNA PolI質(zhì)粒和蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，其中7 RNA PolI質(zhì)粒用于生成剩余的病毒RNA片段，蛋白表達(dá)載體用于表達(dá)9種病毒蛋白(即PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、M1、M2和NS2)。轉(zhuǎn)染48小時后，收獲293T細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VLP，用它們感染MDCK細(xì)胞。由于所得VLP含突變HA，它們表達(dá)GFP及除HA之外的所有病毒蛋白。因此未產(chǎn)生無感染性的子代病毒(數(shù)據(jù)未列出)。感染16小時后，將表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)(即含編碼GFP基因的片段的VLP數(shù))除以表達(dá)NP的細(xì)胞數(shù)(即所有感染性VLP的數(shù)目)，以此測定突變HA vRNA的病毒顆粒導(dǎo)入效率。所有感染性VLP在pPol IHA(468)GFP(513)所感染293T細(xì)胞(即所有NP陽性的細(xì)胞數(shù))培養(yǎng)上清中的滴度是7.4×105感染性VLP/ml，而含pPol IHA(468)GFP(513)RNA的VLP(即GFP陽性的細(xì)胞數(shù))滴度是3.2×105VLP/ml。這些結(jié)果表明，所有感染性VLP中有42.8％產(chǎn)生了隱匿的突變HA vRNA(圖18)。相板只有3.9％的VLP含pPol IHA(0)GFP(0)RNA片段(圖18)。這些結(jié)果提示，HA vRNA的編碼區(qū)對于HA片段導(dǎo)入流感病毒顆粒內(nèi)是必需的。
HA vRNA編碼區(qū)的3’和5’端對于HA片段導(dǎo)入病毒顆粒內(nèi)均很重要。以前人們發(fā)現(xiàn)NA vRNA編碼區(qū)的3’端在病毒顆粒導(dǎo)入時發(fā)揮著比5’端更為關(guān)鍵的作用。因此，測定了3’端、5’端或是兩端對于HA vRNA片段的病毒顆粒導(dǎo)入是否重要。為了解決這一問題，制備了缺乏HA vRNA編碼區(qū)3’端的HA(0)GFP(1011)基因和缺乏HA vRNA編碼區(qū)5’端的HA(966)GFP(0)基因(圖17)，并如上所述檢驗了HA vRNA的病毒顆粒導(dǎo)入。盡管質(zhì)粒感染細(xì)胞中兩種vRNA的量均與HA(468)GFP(513)vRNA量相當(dāng)(數(shù)據(jù)未列出)，HA(0)GFP(1011)和HA(966)GFP(0)的片段導(dǎo)入效率分別只有6.8％和8.4％(圖17)，表明HA vRNA編碼區(qū)的3’和5’端對于HA片段導(dǎo)入病毒顆粒內(nèi)均很重要。
為了進一步確定HA vRNA中對于其自身導(dǎo)入病毒顆粒的關(guān)鍵區(qū)域，生成了一系列所含截短HA vRNA還進一步在3’及/或5’編碼區(qū)中發(fā)生缺失的VLPs(圖17)。然后測定突變HA vRNA導(dǎo)入VLPs的導(dǎo)入效率。由于使3’端只剩下15個核苷酸和5’端剩下268個核苷酸的進一步缺失不影響HA vRNA導(dǎo)入效率(HA(468)GFP(513)與HA(15)GFP(268)比較)，用含HA編碼區(qū)3’端15個核苷酸和5’端268個核苷酸的HA(15)GFP(268)另外構(gòu)建了缺失構(gòu)建體。雖然隨著缺失的程度增加vRNA導(dǎo)入程度逐漸下降，HA編碼區(qū)5’端的80個核苷酸是HA vRNA高效導(dǎo)入病毒顆粒所至少必需的(HA(15)GFP(80)與HA(15)GFP(75)比較)。進一步的缺失分析證明，雖然轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的HA(9)GFP(80)水平與HA(0)GFP(0)RNA水平?jīng)]有一點差別，HA編碼區(qū)3’端剩下9個核苷酸殘基的HA(9)GFP(80)可以使HA vRNA高效導(dǎo)入病毒顆粒(超過65％)(圖17和18)。這些結(jié)果表明HA編碼區(qū)中3’端的9個核苷酸和5’端的80個核苷酸對于HA vRNA有效地導(dǎo)入病毒顆粒中是必需的。
HA及NA基因含外源基因編碼序列的新的A型流感病毒的生成。由于HA片段導(dǎo)入病毒顆粒所需序 已測定，又檢驗了旁側(cè)有這些序列的外源基因是否可以導(dǎo)入A型流感病毒并在反復(fù)傳代時可以保留下來。作為外源基因模型的VSV G編碼區(qū)序列插入pPol IHA(9)GFP(80)的BamHI和XbaI位點取代GFP序列。所得構(gòu)建體指定為pPolIHA(9)VSVG(80)，它包含HA 3’非編碼區(qū)(33個核苷酸)、與HA編碼式N端對應(yīng)的9個核苷酸、帶一個終止密碼子VSVG開放閱讀框(1552個核苷酸)、與HA編碼區(qū)C端對應(yīng)的80個核苷酸以及HA 5’非編碼區(qū)(45個核苷酸)。構(gòu)建只含3’及5’非編碼區(qū)但不含HA vRNA編碼區(qū)的載體pPol IHA(0)VSVG(0)作為對照。由于VSV G蛋白應(yīng)該替換HA和NA蛋白，NA編碼區(qū)可以用外源基因替換。因此，構(gòu)建pPol INA(183)GFP(157)Met(-)用于生產(chǎn)含GFP編碼序列和NA片段高效導(dǎo)入病毒顆粒所需NA編碼序列的重組NA RNA片段。此構(gòu)建體中，將ATG替換成GCG使NA開放閱讀框的起始密碼子破壞掉。這樣，GFP開放閱讀框?qū)钠渥陨淼钠鹗济艽a子開始翻譯。
用生產(chǎn)HA(9)VSVG(80)、NA(183)GFP(157)Met(-)和剩余6種病毒RNA片段的質(zhì)粒以及表達(dá)流感病毒聚合酶蛋白NP、M1、M2、NS2和VSVG的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72小時后，收集293T細(xì)胞上清用MDCK細(xì)胞進行噬斑測定。含 HA(9)VSVG(80)RNA片段和NA(183)GFP(157)Met(-)RNA片段的轉(zhuǎn)染體病毒(指定為VSVG(HA)GFP(NA)病毒)可以存活并在無胰蛋白酶的條件下生成了表達(dá)GFP的噬茵體(圖19)。免疫染色確認(rèn)了含VSV G但不是HA的噬斑的表達(dá)(圖19)。VSVG(HA)GFP(NA)病毒但不是對照WSN病毒感染的細(xì)胞也表達(dá)GFP。相反，當(dāng)用pPol IHA(0)VSVG(0)質(zhì)粒取代pPol IHA(9)VSVG(80)時，雖然可在MDCK細(xì)胞中檢測表達(dá)GFP及/或NP蛋白的單個細(xì)胞，但未能觀測到噬斑(數(shù)據(jù)未列出)。而且，在5次連續(xù)傳代后還觀測到VSVG及GFP均在VSVG(HA)GFP(NA)感染的MDCK細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)(數(shù)據(jù)未列出)。5次傳代后在VSVG(HA)GFP(NA)病毒中HA(9)VSVG(80)RNA片段的剩余HA區(qū)域未檢測到突變。但是，VSVG氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了三個突變57位的Ile變成Leu、95位的Gln變成His以及499位的Gln變成終止子。雖然野生型VSV G蛋白含有胞漿域的29個殘基，但499位的Gln變成終止子突變使該結(jié)構(gòu)域的最后13個殘基缺失了。
VSVG(HA)GFP(NA)病毒的生物學(xué)性質(zhì)。為了測定VSV G蛋白是否確實導(dǎo)入了含其它流感病毒蛋白的病毒顆粒中，對濃縮VSVG(HA)GFP(NA)病毒和WSN(對照)病毒進行western印跡分析。如圖20所示，VSVG(HA)GFP(NA)病毒顆粒中檢測到了VSV G蛋白而未檢測到HA，確認(rèn)了VSV G蛋白導(dǎo)入了病毒顆粒。
接下來，檢驗了VSVG(HA)GFP(NA)病毒在BHK、CHO或MDCK細(xì)胞中的生長性質(zhì)。以0.001的MOI感染細(xì)胞，在感染后的不同時間于37℃用MDCK細(xì)胞上的噬斑測定來測定培養(yǎng)上清中的病毒產(chǎn)率。盡管低于WSN病毒的滴度，VSVG(HA)GFP(NA)病毒在BHK和MDCK細(xì)胞中的最大滴度至少達(dá)到了106PFU/ml(圖21)。與WSN病毒在CHO細(xì)胞中生長不良相比，VSVG(HA)GFP(NA)病毒在這些細(xì)胞中與在另外兩種受試細(xì)胞系中長得一樣好(圖21)。另外，在各細(xì)胞系中復(fù)制時，VSVG(HA)GFP(NA)病毒感染的細(xì)胞表達(dá)GFP。
這些結(jié)果表明，HA(9)VSVG(80)和NA(183)GFP(157)Met(-)片段均高效導(dǎo)入了流感病毒顆粒中，而且反復(fù)傳代時這兩種外源基因在A型流感病毒中得以穩(wěn)定地保留下來。
討論測定基因組包裝機制對理解流感病毒生活周期及研發(fā)基于流感病毒的載體用于表達(dá)外源蛋白很關(guān)鍵。本研究證明了HA vRNA編碼區(qū)3，及5’末端的序列均是此片段高效導(dǎo)入病毒顆粒所必需的。另外，利用此知識生成了一種基于流感病毒的新病毒，證明了兩種外源基因的穩(wěn)定表達(dá)；該新病毒包含兩種含VSV G和GFP編碼序列的重組RNA片段，它們旁側(cè)分別有HA vRNA和NA vRNA導(dǎo)入病毒顆粒所需的序列。
已報道有數(shù)種方法用于研發(fā)基于A型流感病毒的疫苗載體，這些載體用于表達(dá)來源于不相關(guān)感染性試劑的基因或其一部分。短多肽插入了HA的抗原位點，造成了對所插入肽段的陽性免疫反應(yīng)。對于更長的多肽及蛋白質(zhì)來說，外源基因插入流感病毒基因的一個基因中，在這里外源蛋白利用內(nèi)部核糖體入口位點(IRES)或口蹄疫病毒2A蛋白酶表達(dá)。這里，建立了一種利用NA及HA vRNA中順式作用病毒顆粒導(dǎo)入信號的新系統(tǒng)用于表達(dá)外源蛋白。此系統(tǒng)可以使基于流感的病毒導(dǎo)入超過1.5kb的外源基因(如VSV G)，證明了此載體系統(tǒng)的潛能。由于不可復(fù)制型流感VLP在中小鼠中的疫苗效率已知，所帶重組RNA片段含來源于不相關(guān)病原體的基因、基于不可復(fù)制型流感(病毒)的VLP可用作很有希望的疫苗。此潛能對于針對HIV、口蹄疫、及其它感染的疫苗尤基有吸引力，這些情況下活疫苗病毒向野生型病毒的任意回復(fù)均不可接受，或是由于體液免疫及細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)而造成滅活疫苗的效率很有限。因此，使用此方法可以將流感病毒用作疫苗載體。例如，可以制備一種HIV gp160編碼區(qū)取代HA、gag編碼區(qū)取代NA的病毒(圖24和25)。另外，如果VSV G取代了HA，M2就不再需要了，因而就有三種基因可以用異源基因替代。例如，HA可以用HIV gp160取代，NA可以用gag取代，而M2可用nef取代。所得重組流感病毒可用作疫苗或作為另一種HIV疫苗如HIV DNA疫苗的增強劑。此外，疫苗也可以是基于重組流感病毒的多價體疫苗，其中該重組病毒中的NA編碼片段用另一種病原體如皰疹病毒D糖蛋白的編碼片段，這樣該疫苗可以對流感病毒和皰疹病毒感染產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)。
來源于腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和痘病毒的病毒載體可有效地將外源基因?qū)氚屑?xì)胞中。由于這些病毒包含可以整合入宿主染色體的DNA或DNA復(fù)制中間體，無法消除發(fā)生不良后果的危險。相反，由于在受感染細(xì)胞中缺乏DNA期，這樣的整合在流感病毒中是不會發(fā)生的。另外，由于VSVG(HA)GFP(NA)病毒不象其它典型流感病毒那樣需要HA切割所需的胰蛋白酶，它可以有更廣泛的用途。另外，可以通過改變病毒顆粒表面上的糖蛋白而生成具有所需細(xì)胞向性的重組病毒。這樣，利用vRNA片段中病毒顆粒導(dǎo)入順式作用信號的系統(tǒng)可以設(shè)計基于流感的重組病毒載體，這些載體可以將多個外源基因輸送入靶細(xì)胞。
來源于上皮細(xì)胞的病毒其裝配和釋放在一些病毒中是極化的，選擇性地發(fā)生在頂點或基側(cè)的表面。據(jù)認(rèn)為極化病毒芽殖在測定病毒感染病原性時起一定作用。A型流感病毒從受感染上皮細(xì)胞的頂部芽殖，個別表達(dá)的HA、NA及M2蛋白也靶向到細(xì)胞的頂部表面。另一方面，VSV從受感染細(xì)胞基側(cè)表面釋放，VSV G蛋白也轉(zhuǎn)運到基側(cè)表面。本研究中，成功地生成了用VSV G取代HA及NA蛋白的重組病毒VSVG(HA)GFP(NA)病毒。但是，由于點突變此重組病毒的VSV G蛋白缺乏胞漿結(jié)構(gòu)域的最后13個殘基。已知胞漿結(jié)構(gòu)域中這13個殘基缺失而生成的蛋白轉(zhuǎn)運到頂部表面的效率比轉(zhuǎn)運到基側(cè)表面的效率高。因此，VSVG(HA)GFP(NA)病毒中VSV G蛋白內(nèi)引入的突變很可能促進它高效轉(zhuǎn)運到頂部表面，造成了VSVG(HA)GFP(NA)病毒的高效芽殖。
流感的流行常常在流感病毒RNA片段發(fā)生重排使病毒的HA及/或NA與以前傳播的病毒株有著免疫學(xué)不同時發(fā)生。HA、NA、M及NS vRNA內(nèi)編碼區(qū)3’和5’的序列對于它們高效導(dǎo)入病毒顆粒是必需的。vRNA片段的包裝(很可能是病毒核蛋白復(fù)合物的形式)由病毒RNA片段間反式發(fā)生的RNA-RNA相互作用介導(dǎo)。如果是這樣，各片段內(nèi)的特異性導(dǎo)入信號可能限制RNA片段的重排。從經(jīng)驗上來說，已知流感病毒RNA片段不會發(fā)生隨機重排。據(jù)認(rèn)為蛋白間的功能性相互作用(如聚合酶復(fù)合物的形成、HA-NA及或切割HA-M2功能性連接)限制了隨機重排。除了蛋白質(zhì)水平上的這些重排限制外，RNA水平上可能也存在類似的限制。在此背景下，1957及1968年流行時，除HA及/或NA基因外PB1基因也導(dǎo)入了來源于禽病毒的人病毒，提示HA和PB1 RNA片段間可能存在關(guān)聯(lián)。進一步鑒定對于其它RNA片段導(dǎo)入病毒顆粒的關(guān)鍵區(qū)域可提供理解RNA片段重排的線索，從而預(yù)測新型A型流感病毒流行株的出現(xiàn)。
總之，有了vRNA包裝信號的信息，就可以研發(fā)新的流感疫苗和基于流感的疫苗載體。
實施例6如圖26所示，可以制備組成性表達(dá)編碼蛋白如NS2的流感病毒樣RNA的細(xì)胞系，即使此RNA缺乏導(dǎo)入信號。也可制備缺乏NS2編碼序列(NS2 KO)的病毒(Neumann等，2000；Watanabe等，2002)。因為病毒缺乏NS2，當(dāng)NS2 KO病毒感染正常細(xì)胞時將不會產(chǎn)生子代病毒。相反，當(dāng)NS2 KO病毒感染表達(dá)編碼NS但缺乏導(dǎo)入信號的流感病毒樣RNA的細(xì)胞時，病毒感染后NS2得以表達(dá)從而產(chǎn)生了子代NS2 KO病毒。但是，編碼NS2的流感病毒樣RNA不會導(dǎo)入NS2 KO病毒中，因為它缺乏病毒顆粒導(dǎo)入信號。因此，NS2 KO在正常細(xì)胞中仍然是不可復(fù)制型。此系統(tǒng)可用于生產(chǎn)不可復(fù)制型病毒的生產(chǎn)細(xì)胞。利用此系統(tǒng)，可以制備表達(dá)病毒蛋白的生產(chǎn)細(xì)胞，其對細(xì)胞的毒性通常會阻止組成性表達(dá)它們的細(xì)胞系產(chǎn)生。因此，在本申請中，病毒顆粒導(dǎo)入信號的知識可以用于設(shè)計不允許特定片段導(dǎo)入病毒顆粒的系統(tǒng)。
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所有出版物、專利及專利申請在此引入作為參考。盡管在前述說明書中本發(fā)明已說明了相關(guān)的其中一些優(yōu)選實施方案，出于闡述目的也列出的許多細(xì)節(jié)；對于本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員來說，本發(fā)明容許另外的實施方案及本文所述某些細(xì)節(jié)可以作出很大改變而不背離本發(fā)明的基本原則是非常直觀的。
權(quán)利要求
1.包含流感病毒導(dǎo)入序列的流感病毒載體，該載體包含a)與流感病毒NA vRNA3’非編碼區(qū)對應(yīng)的序列，3’NA導(dǎo)入序列，異源核酸片段和NA vRNA5’非編碼區(qū)；b)與流感病毒HA vRNA3’非編碼區(qū)對應(yīng)的序列，異源核酸片段，5’HA導(dǎo)入序列和HA vRNA5’非編碼區(qū)；c)與流感病毒M vRNA3’非編碼區(qū)對應(yīng)的序列，3’M導(dǎo)入序列，異源核酸片段，5’M導(dǎo)入序列和M vRNA5’非編碼區(qū)；d)與流感病毒NS vRNA3’非編碼區(qū)對應(yīng)的序列，3’NS導(dǎo)入序列，異源核酸片段和NS vRNA5’非編碼區(qū)；e)與流感病毒PB2 vRNA3’非編碼區(qū)對應(yīng)的序列，異源核酸片段，5’PB2導(dǎo)入序列和PB2 vRNA5’非編碼區(qū)；f)與流感病毒PB1 vRNA3’非編碼區(qū)對應(yīng)的序列，異源核酸片段，5’PB1導(dǎo)入序列和PB1 vRNA5’非編碼區(qū)；或g)與流感病毒PA vRNA3’非編碼區(qū)對應(yīng)的序列，異源核酸片段，5’PA導(dǎo)入序列和PA vRNA5’非編碼區(qū)；其中當(dāng)與該載體對應(yīng)的vRNA存在于表達(dá)流感病毒蛋白并包含除與該載體對應(yīng)的vRNA之外的vRNA的細(xì)胞中時，與該載體對應(yīng)的vRNA包裝入病毒顆粒中。
2.權(quán)利要求1a)的載體，其中3’NA導(dǎo)入序列包括至少19個與NA起始19個編碼核苷酸對應(yīng)的核苷酸。
3.權(quán)利要求2的載體，其中所述載體還包含5’NA導(dǎo)入序列。
4.權(quán)利要求3的載體，其中所述5’NA導(dǎo)入序列包括至少39個與NA3’39個編碼核苷酸對應(yīng)的核苷酸。
5.權(quán)利要求1a)的載體，其中3’NA導(dǎo)入序列包括至少90個與NA起始90個編碼核苷酸對應(yīng)的核苷酸。
6.權(quán)利要求1b)的載體，其中5’HA導(dǎo)入序列包括至少80個與HA3’80個編碼核苷酸對應(yīng)的核苷酸。
7.權(quán)利要求1b)的載體，其中5’HA導(dǎo)入序列包括至少291個與HA3’291個編碼核苷酸對應(yīng)的核苷酸。
8.權(quán)利要求1b)的載體，其中所述載體還包含3’HA導(dǎo)入序列。
9.權(quán)利要求8的載體，其中3’HA導(dǎo)入序列包括至少3個與HA起始3個編碼核苷酸對應(yīng)的核苷酸。
10.權(quán)利要求8的載體，其中3’HA導(dǎo)入序列包括至少9個與HA起始9個編碼核苷酸對應(yīng)的核苷酸。
11.權(quán)利要求1的載體，其中所述異源核酸片段包含與內(nèi)部核糖體入口序列對應(yīng)的序列。
12.權(quán)利要求1的載體，其中所述異源核酸片段包含與標(biāo)記基因開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。
13.權(quán)利要求1的載體，其中所述異源核酸片段包含與病原體免疫原性蛋白或肽或治療性蛋白的開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。
14.權(quán)利要求1的載體，其中所述導(dǎo)入序列來自于A型流感病毒。
15.權(quán)利要求1的載體，其中所述導(dǎo)入序列來自于B型流感病毒。
16.權(quán)利要求1的載體，其中所述異源核酸片段與另一核酸片段融合以編碼融合蛋白。
17.包含與權(quán)利要求1的載體對應(yīng)的vRNA的重組流感病毒。
18.權(quán)利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與標(biāo)記基因開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。
19.權(quán)利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與病原體免疫原性蛋白或肽的開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。
20.權(quán)利要求19的重組病毒，其中所述開放閱讀框編碼HA蛋白。
21.權(quán)利要求19的重組病毒，其中所述開放閱讀框編碼NA蛋白。
22.權(quán)利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與跨膜蛋白開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。
23.權(quán)利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與蛋白開放閱讀框?qū)?yīng)的序列，該蛋白具有膜融合活性。
24.權(quán)利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與病毒衣殼蛋白開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。
25.權(quán)利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與水泡性口炎病毒G蛋白開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。
26.權(quán)利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與治療性蛋白開放閱讀框?qū)?yīng)的序列。
27.權(quán)利要求20的重組病毒，其中所述HA蛋白為B型HA蛋白。
28.在細(xì)胞中表達(dá)異源核酸片段的方法，該方法包括讓細(xì)胞與權(quán)利要求17的重組病毒接觸，檢測或測定細(xì)胞中是否有所述異源核酸片段編碼的產(chǎn)物表達(dá)。
29.包含與NA5’編碼區(qū)對應(yīng)的流感病毒NA導(dǎo)入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
30.包含與NS5’編碼區(qū)對應(yīng)的流感病毒NS導(dǎo)入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
31.包含與HA3’編碼區(qū)對應(yīng)的流感病毒HA導(dǎo)入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
32.包含與PB23’編碼區(qū)對應(yīng)的流感病毒PB2導(dǎo)入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
33.包含與M3’編碼區(qū)及M5’編碼區(qū)對應(yīng)的流感病毒M導(dǎo)入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
34.權(quán)利要求1的載體，其中與所述載體對應(yīng)的vRNA當(dāng)在細(xì)胞中存在時以是相應(yīng)野生型vRNA的至少10％的效率包裝入病毒顆粒中。
35.權(quán)利要求1的載體，其中與所述載體對應(yīng)的vRNA當(dāng)在細(xì)胞中存在時以是相應(yīng)野生型vRNA的至少30％的效率包裝入病毒顆粒中。
36.權(quán)利要求1的載體，其中與所述載體對應(yīng)的vRNA當(dāng)在細(xì)胞中存在時以是相應(yīng)野生型vRNA的至少60％的效率包裝入病毒顆粒中。
37.制備不可復(fù)制型流感樣病毒的方法，該方法包括a)讓重組宿主細(xì)胞與缺乏含野生型NS編碼序列的vRNA及包含重組酶序列的重組流感病毒接觸，其中重組宿主細(xì)胞包含重組核酸分子，該重組核酸分子包含與兩位點特異性重組序列操縱性連接的NS2開放閱讀框而不是導(dǎo)入序列，所述重組序列與NS2開放閱讀框的5’端連接，并且所述重組序列由重組酶識別；而且在無重組酶存在時NS2不表達(dá)；和b)將不可復(fù)制型流感樣病毒與重組宿主細(xì)胞分離開來。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酶為Cre，位點特異性重組序列為loxP序列。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酶為FLP，位點特異性重組序列為frt序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了流感病毒載體的一種包裝(導(dǎo)入)信號，以及使用該信號在病毒及細(xì)胞中傳遞和維持流感病毒及外源核酸的方法。
文檔編號C12N15/09GK1997734SQ03808356
公開日2007年7月11日 申請日期2003年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月13日
發(fā)明者河岡義裕 申請人:威斯康星舊生研究基金會