專利名稱：應用重組病毒分析試驗評價病毒受體/共受體用途以及病毒侵入抑制劑的組合物和方法
在整個本專利申請中，是通過在正文中列出作者和時間來引入各種已發(fā)表的參考文獻，可發(fā)現(xiàn)，對這些已發(fā)表文獻的完全引證，按字母順序列舉在本申請的后面，緊靠權(quán)利要求的前面。在此引用的所有專利，專利申請和已發(fā)表的文獻，不論前后，均被整體引入作為參考。為了更充分地描述根據(jù)本發(fā)明所述的和權(quán)利要求中的資料，技術(shù)人員已知的技術(shù)狀況，這些已發(fā)表文獻的公開內(nèi)容在此被整體引入本申請作為參考。
背景技術(shù)：
對于抗病毒治療，病毒的侵入是一個誘人的新穎目標，設(shè)計了大約10個阻礙病毒附著或膜融合的藥物，目前正在對它們進行臨床前或臨床研究評價(Richman，1998；phRMA，1999；Stephenson，1999)。通過病毒粒子膜中的病毒蛋白(被膜蛋白)與細胞表面蛋白(病毒受體)的相互作用，具被膜的動物病毒附著于并侵入宿主細胞。由表面被膜蛋白介導受體的識別和結(jié)合。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目標是提供一種快速靈敏的表型分析法，來測定病毒對病毒侵入抑制劑的敏感性。
本發(fā)明進一步的目標是提供一個反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，此系統(tǒng)可產(chǎn)生包含由多種來源獲得的病毒被膜蛋白的病毒顆粒，而且提供對細胞系的鑒別法，用于鑒別可表達病毒受體，并允許病毒復制的細胞系。
本發(fā)明的另一目標是為病毒被膜提供表達載體，此載體能夠接受病人來源的編碼被膜基因的片段。
本發(fā)明的另一目標是提供一種生物安全的載體。此載體具有大部分HIV-1病毒基因組，但是攜帶有代替被膜區(qū)的螢光素酶報導基因。
本發(fā)明進一步的目標是，通過提供在HIV-1基因組的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(U3的3′拷貝)帶有缺失的病毒表達載體，而提供可減少形成重組感染性HIV-1可能性的表型分析法。
本發(fā)明的另一個目標是提供一種能夠鑒別和確定受體/共受體向性的分析法，此分析法可快速、準確地鑒別被向性病毒株感染的病人。
通過本發(fā)明，借助于測定是否病毒對某一化合物具有敏感性改變的方法可實現(xiàn)這些目標和另一些目標，此方法包括(a)使宿主細胞與此化合物接觸，其中該宿主細胞包含病毒來源的核酸和一個指示基因，病毒來源核酸的活性可影響指示基因的活性，以致病毒來源核酸活性的改變將導致指示基因的活性改變，并且該化合物將直接或間接地針對此病毒來源的核酸或者它編碼的蛋白質(zhì)，以及(b)測定指示基因的活性，其中與化合物接觸的宿主細胞中指示基因的活性相對于不存化合物時的活性差異，指示該病毒對此化合物具有敏感性改變。
一方面，本發(fā)明的第一種細胞包含編碼病毒蛋白質(zhì)的病毒來源的核酸以及病毒表達載體，此載體缺少編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸而包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含由病毒來源核酸所編碼的病毒蛋白質(zhì)的病毒顆粒?？梢栽谟谢衔锎嬖跁r使第一種細胞與第二種細胞例如宿主細胞接觸，其中第二種細胞可表達病毒顆粒與之結(jié)合的細胞表面受體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于鑒別化合物是否抑制病毒侵入細胞的方法，此方法包括(a)從被該病毒感染的病人獲得編碼病毒被膜蛋白的核酸；(b)將如下二種成分共轉(zhuǎn)染進入第一種細胞；(i)步驟(a)中的核酸，以及(ii)缺少編碼被膜蛋白的核酸，而包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含被膜蛋白的病毒顆粒，此被膜蛋白是由從病人獲得的核酸編碼的；(c)在有化合物存在時，使步驟(b)中產(chǎn)生的病毒顆粒與第二種細胞接觸，其中此第二種細胞表達該病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；(d)測定由第二種細胞所產(chǎn)生的信號數(shù)量，以便確定此病毒顆粒的侵染性，以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在此化合物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在化合物時測定的信號數(shù)量減少，指示該化合物可抑制病毒侵入第二種細胞。
另一方面，第一種細胞包含編碼病毒蛋白質(zhì)的病毒來源的核酸和病毒表達載體，此載體缺少編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含由病毒來源的核酸所編碼的病毒蛋白質(zhì)的病毒顆粒?？梢栽谟谢衔锎嬖跁r使第一種細胞與第二種細胞例如宿主細胞接觸，其中第二種細胞可表達病毒顆粒與之結(jié)合的細胞表面受體。此外，第二種細胞還包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸。在一個實施方案中，指示核酸被整合進入第二種細胞的核酸中。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，用于對病毒感染的病人檢測能夠阻止感染的抗體應答反應的形成，此方法包括(a)使宿主細胞與來自病人的抗體制備物接觸，其中該宿主細胞包含來自病人的編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸，以及產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸；(b)測定由宿主細胞產(chǎn)生的可檢測信號的數(shù)量；以及(c)將步驟(b)中測定的信號數(shù)量與不存在抗體制備物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在抗體制備物時測定的信號數(shù)量減少，指示該病人已經(jīng)形成了能夠阻止感染的對病毒蛋白質(zhì)的抗體應答反應。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，用于對病毒感染的病人檢測能夠阻止感染的抗體應答反應的形成，此方法包括(a)將如下二種成分轉(zhuǎn)染進入第一種細胞；(i)來自病人的編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸，以及(ii)缺少編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸，而包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含病毒蛋白質(zhì)的病毒顆粒，此病毒蛋白質(zhì)是由從病人獲得的核酸編碼的；(b)使在步驟(a)中產(chǎn)生的病毒顆粒與來自病人的抗體制備物接觸；(c)使步驟b的病毒顆粒和抗體制備物與第二種細胞接觸，其中第二種細胞可表達此病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；(d)測定由第二種細胞產(chǎn)生的可檢測信號數(shù)量，以便確定此病毒顆粒的侵染性；以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在抗體制備物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在抗體制備物時測定的信號數(shù)量減少，指示該病人已經(jīng)形成了能夠阻止感染的對病毒蛋白質(zhì)的抗體應答反應。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，用于對病毒感染的病人體內(nèi)檢測能夠阻止感染的抗體應答反應的形成，此方法包括(a)將如下二種成分轉(zhuǎn)染進入第一種細胞；(i)來自病人的編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸，以及(ii)缺少編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含病毒蛋白質(zhì)的病毒顆粒，此病毒蛋白質(zhì)是由從病人獲得的核酸編碼的；(b)使在步驟(a)中產(chǎn)生的病毒顆粒與來自病人的抗體制備物接觸；(c)使步驟(b)的病毒顆粒和抗體制備物與第二種細胞接觸，其中第二種細胞可表達此病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；并且第二種細胞還包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸(d)測定由第二種細胞產(chǎn)生的可檢測信號數(shù)量，以便確定此病毒顆粒的侵染性；以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在抗體制備物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在抗體制備物時測定的信號數(shù)量減少，指示該病人已經(jīng)形成了能夠阻止感染的對病毒蛋白質(zhì)的抗體應答反應。
在一個實施方案中，病毒蛋白質(zhì)是被膜蛋白。在另一實施方案中，病毒蛋白質(zhì)是衣殼蛋白。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，用于對病毒感染的病人檢測能夠阻止感染的抗體應答反應的形成，此方法包括(a)培育包含如下二種成分的第一種細胞(i)編碼來自病人的病毒蛋白質(zhì)的核酸，以及(ii)缺少編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸，而包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含病毒蛋白質(zhì)的病毒顆粒，此病毒蛋白質(zhì)是由從病人獲得的核酸編碼的；(b)使在步驟(a)中產(chǎn)生的病毒顆粒與來自病人的抗體制備物接觸；(c)使步驟(b)的病毒顆粒和抗體制備物與第二種細胞接觸，其中第二種細胞可表達此病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；(d)測定由第二種細胞產(chǎn)生的可檢測信號數(shù)量，以便確定此病毒顆粒的侵染性；以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在抗體制備物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在抗體制備物時測定的信號數(shù)量減少，指示該病人已經(jīng)形成了能夠組止感染的對病毒蛋白質(zhì)的抗體應答反應。在一個實施方案中，(i)中的核酸是(ii)中病毒表達載體的一部分。在另一實施方案中，(i)中的核酸被整合進入第一種細胞的基因組中。在另一實施方案中，(ii)中的病毒載體被整合進入第一種細胞的基因組中。在另一實施方案中，(i)中的核酸和(ii)中的病毒載體都被整合進入第一種細胞的基因組中。在一個實施方案中，病毒蛋白質(zhì)是衣殼蛋白。在另一實施方案中，病毒蛋白質(zhì)是被膜蛋白。
附圖簡述

圖1A被膜表達載體和病毒表達載體的結(jié)構(gòu)此HIV被膜表達載體(pHIVenv)被修飾以便接受來自病人血漿樣品的已被擴增的被膜序列。標識符號a/b和c/d指示定位了HIV-1被膜多蛋白(gp160)5′和3′末端的限制性內(nèi)切酶酶切位點。HIV表達載體(pHIVlucΔU3)編碼除了被膜多蛋白以外的所有HIV蛋白。已使一部分被膜基因具有缺失，以便容納指示基因盒，在本發(fā)明的情況下，“螢火蟲熒光素酶”被用于監(jiān)測在存在或不存在抗病毒藥物時病毒的復制能力。已使3′U3區(qū)具有部分缺失，以便防止在被感染的細胞中從5′LTR轉(zhuǎn)錄。在此系統(tǒng)中產(chǎn)生的病毒被限制于單一復制循環(huán)。
圖1B以細胞為基礎(chǔ)的侵入分析通過以PHIVenv和pHIVlucΔU3共轉(zhuǎn)染宿主細胞，實施藥敏感性、共受體細胞和病毒中和作用測定。此宿主細胞產(chǎn)生被擬型的HIV顆粒，這種HIV顆粒帶有來源于待測病毒或病人樣品的HIV被膜序列。轉(zhuǎn)染片(～48h)收集病毒顆粒、并用于感染表達HIV受體(例如CD4)和共受體(例如CXCR4，CCR5)的靶細胞。感染后(～72小時)把靶細胞裂解并測定熒光素酶活性。為了成功地感染靶宿主細胞，并產(chǎn)生熒光素酶活性，HIV必須完成一次復制循環(huán)。如果病毒不能夠進入靶細胞，則熒光素酶活性被減弱。此系統(tǒng)可以被用于測定對侵入抑制劑的敏感性，測定受體和共受體向性以及病毒中和作用。
圖2HIV被膜表達載體將來自病人樣品的HIV被膜序列擴增，并應用限制性內(nèi)切酶酶切位點(5′a/b和3′c/d)被插入進表達載體中。借助于人細胞肥大病毒(CMV)的立即早期基因啟動子驅(qū)動被膜轉(zhuǎn)錄過程。使用猴病毒40(SV40)聚腺苷酸化信號序列(A+)使被膜RNA聚腺苷酸化。位于CMV啟動子和HIV被膜序列之間的內(nèi)含子被設(shè)計成能在被轉(zhuǎn)染的細胞中增加被膜mRNA的含量。FL表達全長度被膜蛋白(gp120，gp41)；ΔCT表達缺少gp41的C-末端細胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域的被膜蛋白(gp120，gp21)；+CT表達含有預先確定的恒定性gp41細胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域的被膜蛋白(gp120，gp41)；gp120表達同預先確定的恒定性gp41一起來源于病人的gp120蛋白；gp41表達同來源于病人的gp41蛋白一起的預先確定的恒定性gp120。
圖3A共受體向性篩選分析試驗在此圖中，使用了二種細胞系進行該分析試驗。一種細胞系表達CD4和CCR5(上面6個方格)。另一細胞系表達CD4和CXCR4(底下6個方格)，通過用大量重組病毒原種感染細胞來實施該分析試驗，這些重組病毒原種來源于用pHIVenv和pHIVlucΔU3載體轉(zhuǎn)染的細胞。所顯示的實施例代表不存藥物(沒有任何藥物)時，或者存在可優(yōu)先抑制R5向性病毒的藥物(CCR抑制劑)，或優(yōu)先抑制X4向性病毒的藥物(CXCR4抑制劑)時，對被安排在96孔培養(yǎng)板中的96個病毒感染進行分析。通過比較在存在和不存在藥物時每種細胞類型中產(chǎn)生的熒光素酶活性數(shù)量來確定共受體向性(對分析試驗結(jié)果的說明見圖3B)。
圖3B確定共受體向性在此圖中，是通過比較每種樣品病毒感染(產(chǎn)生熒光素酶活性)表達CD4/CCR5的細胞(R5細胞)，或表達CD4/CXCR4的細胞(X4細胞)的能力來說明分析試驗的結(jié)果，還評定了CCR5或CXCR4抑制劑特異性阻止感染(抑制熒光素酶活性)的能力。X4向性病毒(綠色方格)感染X4細胞但不感染R5細胞。對X4細胞的感染可被CXCR4抑制劑阻斷，R5向性病毒(蘭色方格)感染R5細胞但不感染X4細胞。對R5細胞的感染可被CCR5抑制劑阻斷，雙向性或X4/R5混合向性病毒(黃色方格)感染X4細胞和R5細胞。對R5細胞的感染可被CCR5抑制劑阻斷，對X4細胞的感染可被CXCR4抑制劑阻斷。無活力的病毒(紅色方格)在X4細胞或R5細胞內(nèi)部不能復制。
圖4A測定對融合抑制劑的侵入抑制劑敏感性在此圖中，證明了對融合抑制劑T-20的敏感性，在不存在T-20時，以及在存在T-20寬濃度范圍時(X-軸，log10分度)，感染表達CD4，CCR5和CXCR4的細胞。通過將存在T-20時感染細胞中產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量與不存在T-20時產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量相比較，確定對病毒復制的百分數(shù)抑制作用(Y軸)。對R5向性，X4向性和雙向性的病毒進行了測試。通過確定抑制病毒復制作用50％所需要的T-20濃度(IC50，以縱虛線所顯示的)，對藥物敏感性作定量測定。與具有較高IC50值的病毒相比。具有較低IC50值的病毒對T-20比較敏感。NL4-3明確鑒定的X4向性株；JRCSF明確鑒定的R5向性株；91USOO5.11R5向性分離物，從NIH AIDS研究和參照試劑單目(ARRRP)中獲得；92HT593.1雙向性(X4R5)分離物，從NIH ARRRP獲得；92HT599.24X4向性分離物，以NIH ARRRP獲得。
圖4B測定帶有藥物性抗突變的侵入抑制劑敏感性在此圖中，證明了由gp41被膜蛋白中特異性藥物抗性突變引起的對融合抑制劑T-20敏感性降低。在不存在T-20時，以及存在T-20寬濃度范圍時(X-軸，log10分度)，感染表達CD4，CCR5和CXCR4的細胞。通過將存在T-20時感染細胞中產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量與不存在T-20時產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量相比較，確定對病毒復制的百分數(shù)抑制作用(Y-軸)。對在gp41跨膜被膜蛋白中含有一個或二個特異性突變的等基因病毒進行了測試(圖例中顯紅色標記的)。通過確定抑制病毒復制作用50％所需要的T-20濃度(IC50，以縱虛線所顯示的)，對藥物敏感性作定量測定。與具有較高IC50值的病毒相比，具有較低1C50值的病毒對T-20比較敏感。
無突變株(野生型序列)GIV單突變株GIV，DIM，SIV雙突變株DIM，SIM，DTV圖5A測定對CCR5抑制劑的侵入抑制劑敏感性在此圖中，證明了對CCR5抑制劑(merck化合物)的敏感性。在不存在CCR5抑制劑時，以及存在CCR5抑制劑寬濃度范圍時(X-軸，log10分度)，感染表達CD4和CCR5的細胞(R5細胞)。通過將存在CCR5抑制劑時感染細胞中產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量與不存在CCR5抑制劑時產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量相比較，確定對病毒復制的百分數(shù)抑制作用(Y-軸)。對R5向性，X4向性和雙向性病毒進行了測試。通過確定抑制病毒復制作用50％所需要的CCR5抑制劑濃度(IC50，以縱虛線顯示的)，對藥物敏感性作定量測定。與具有有較高IC5有有值的病毒相比，具有較低IC50值的病毒對CCR5抑制劑比較敏感。X4向性病毒不感染R5細胞。
NL4-3明確鑒定的X4向性株；JRCSF明確鑒定的R5向性株92HT593.1雙向性(X4，R5)分離物，從NIH ARRRP獲得。
圖5B測定對CXCR4抑制劑的侵入抑制劑敏感性在此圖中，證明了對CXCR4抑制劑(AMD3100)的敏感性，在不存在CXCR4抑制劑時，以及存在CXCR4抑制劑寬濃度范圍時(X-軸，log10分度)，感染表達CD4和CXCR4的細胞(X4細胞)。通過將存在CXCR4抑制劑時感染細胞中產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量與不存在CXCR4抑制劑時產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量相比較，確定對病毒復制的百分數(shù)抑制作用(Y-軸)。對R5向性，X4向性和雙向性病毒進行了測試，通過確定抑制病毒復制作用50％所需要的CXCR抑制劑濃度(IC50，以縱虛線顯示的)，對藥物敏感性作定量測定。與具有較高IC50值的病毒相比，具有較低IC50值的病毒對CXCR4抑制劑比較敏感。R5向性病毒不感染X4細胞。
NL4-3明確鑒定的X4向性株；JRCSF明確鑒定的R5向性株92HT593.1雙向性(X4，R5)分離物，從NIH ARRRP獲得。
圖6被膜序列擴增此圖證明產(chǎn)生了相當于全長度被膜序列或細胞及尾部缺失的被膜序列的擴增子(amplicons)序列。電泳道數(shù)字對應于在凝膠右邊緊隨每個數(shù)字之后所顯示的共受體向性。
圖7靶細胞受體和共受體的表達顯示表明借助于FACS(熒光活性細胞選擇)分析法所獲得結(jié)果的散步圖，是使用抗CCR5或者抗CXCR4抗體(Y軸顯示的)進行FACS分析試驗。此細胞系表達列舉在圖下面的共受體，X-軸表示CD4熒光?？笴XCR4抗體與表達相應共受體CXCR4的細胞結(jié)合最強。
圖8共受體拮抗劑的抑制作用以共受體拮抗劑給藥之后顯示出X4和R5抑制作用圖9融合抑制劑肽顯示一種肽的CXCR4抑制圖和氨基酸序列，此肽是病毒膜和細胞之間融合作用的抑制劑。
圖10對病毒侵染性的中和作用使病毒與5倍系列稀釋的抗體(血漿)共溫育，并用于感染U-87/CD4/CCR5/CXCR4靶細胞。應用矩陣格式以系列的病毒樣品(縱行)對系列的抗體樣品(橫排)進行測試。中和作用值代表抑制病毒侵染性50％所需要的血漿(抗體)稀釋度(IC50)。數(shù)字越大，稀釋度越高，反映抗體中和作用的滴度越高。樣品收集的日期以月/日/年表示。還對二個參照病毒NL4-3(X4實驗室株)，JRCSF(R5初始分離物)測試了每個血漿樣品的中和活性。
通過下面的詳細論述并參照附圖和實施例，本發(fā)明的特點將更加一目了然。如下的詳述將論述實施本發(fā)明的方式和方法，這些方式和方法屬于與鑒別和測定病毒侵入抑制劑有關(guān)的表型分析法，包括對例如HIV-1和HIV-1病毒侵入抑制劑(不作為對本發(fā)明的限制)的鑒別和測定。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種方法，用于確定是否病毒對某一化合物具有敏感性改變，該方法包括(a)使宿主細胞與此化合物接觸，其中宿主細胞包含病毒來源的核酸和一個指示基因，病毒來源核酸的活性可影響指示基因的活性，此致病毒來源核酸活性的改變將導致指示基因的活性改變，并且該化合物將直接或間接地針對此病毒來源的核酸或者它編碼的蛋白質(zhì)；以及(b)測定指示基因的活性，其中與化合物接觸的宿主細胞中指示基因的活性相對于不存在化合物時的活性差異，指示該病毒對此化合物具有敏感性改變。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于鑒別化合物是否抑制病毒侵入細胞的方法，此方法包括(a)從病毒感染的病人獲得編碼病毒被膜蛋白的核酸；(b)將如下二種成分共轉(zhuǎn)染進入第一種細胞(i)步驟(a)中的核酸，和(ii)缺少編碼被膜蛋白的核酸。而包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含被膜蛋白的病毒顆粒，此被膜蛋白是由從病人獲得的核酸編碼的；(c)在有化合物存在時，使步驟(b)中產(chǎn)生的病毒顆粒與第二種細胞接觸，其中此第二種細胞可表達病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；(d)測定由第二種細胞產(chǎn)生的信號數(shù)量，必須確定此病毒顆粒的侵染性；以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在化合物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在化合物時測定的信號數(shù)量減少，指示該化合物可抑制病毒侵入第二種細胞。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于鑒別化合物是否抑制病毒侵入細胞的方法，此方法包括(a)從病毒感染的病人獲得編碼病毒被膜蛋白的核酸；(b)將如下二種成分共轉(zhuǎn)染進入第一種細胞(i)步驟(a)中的核酸，和(ii)缺少編碼被膜蛋白的核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含被膜蛋白的病毒顆粒，此被膜蛋白是由從病人獲得的核酸編碼的；(c)在有化合物存在時，使步驟(b)中產(chǎn)生的病毒顆粒與第二種細胞接觸，其中此第二種細胞可表達病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；并且第二種細胞包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸；(d)測定由第二種細胞產(chǎn)生的信號數(shù)量，以便確定此病毒顆粒的侵染性，以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在化合物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在化合物時測定的信號數(shù)量減少，指示該化合物可抑制病毒侵入第二種細胞。
在本發(fā)明的另一實施方案中，指示核酸包含一個指示基因，在本發(fā)明的又一實施方案中，指示基因是熒光素酶基因。
在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞表面受體是CD4。在本發(fā)明的又一實施方案中，細胞表面受體是化學因子(Chemokine)受體，在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞表面受體是CXCR4或CCR5。
在本發(fā)明的一個實施方案中，病人是感染了HIV-1病毒，肝炎病毒(如HCV或HBV病毒)或者任何其它的病毒。在本發(fā)明的一個實施方案中，步驟(a)中的核酸包含編碼gp120和gp41的DNA。在本發(fā)明的一個實施方案中，其病毒表達載體包含HIV核酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，其病毒表達載體包含HIV gag-pol基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，其病毒表達載體包含編碼vif、vpr、tat、rev、vpu和nef的DNA、在本發(fā)明的一個實施方案中，其第一種細胞是哺乳動物細胞，在本發(fā)明的一個實施方案中，該哺乳動物細胞是人細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，該人細胞是人胚胎腎細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，該人胚胎腎細胞是293細胞。
在本發(fā)明的一個實施方案中，第二種細胞是人T細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，第二種細胞是人T細胞白血病細胞系。在本發(fā)明的一個實施方案中，第二種細胞是外周血單核細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，第二種細胞是星形神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，該星形神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞是U87細胞，在本發(fā)明的一個實施方案中，第二種細胞是人骨肌瘤細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，該人骨肌瘤細胞是HT4細胞。
在本發(fā)明的一個實施方案中，其化合物可結(jié)合于細胞表面受體。在本發(fā)明的一個實施方案中，該化合物是細胞表面受體的配體。在本發(fā)明的一個實施方案中，該化合物包括抗體。在本發(fā)明的一個實施方案中，該化合物可抑制膜融合。在本發(fā)明的一個實施方案中，該化合物是肽，模擬肽，有機分子，或合成的化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，該化合物可結(jié)合病毒被膜蛋白。
本發(fā)明提供了制備一種組合物的方法，包括將通過在此所述的篩選方法(用于鑒別化合物的方法)鑒別的化合物與一種運載體混合。在本發(fā)明的一個實施方案中，此運載體是鹽水聚乙二醇，緩沖液，淀粉或有機溶劑。
本發(fā)明提供了一種方法，用于鑒別當病毒感染細胞時被病毒結(jié)合的細胞表面受體，此方法包括(a)獲得包含如下二種成分的病毒顆粒(i)病毒核酸和(ii)產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸；(b)使表達細胞表面受體的細胞與來自步驟(a)的病毒顆粒接觸；以及(c)測定細胞內(nèi)產(chǎn)生的可檢測信號的數(shù)量，其中，信號的產(chǎn)生指示此細胞所表達的細胞表面受體可被病毒結(jié)合，從而可鑒別當細胞受感染時，此細胞表面受體將被病毒結(jié)合。
本發(fā)明還提供了一種方法，用于鑒別抗體是無抑制病毒侵入細胞，此方法包括(a)從病毒感染的病人獲得編碼病毒被膜蛋白的核酸；(b)將如下二種成分共轉(zhuǎn)染進入第一種細胞(i)步驟(a)中的核酸，和(ii)缺少編碼被膜蛋白的核酸，而包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含被膜蛋白的病毒顆粒，此被膜蛋白是由從病人獲得的核酸所編碼的；(c)在有抗體存在時，使步驟(b)中產(chǎn)生的病毒顆粒與第二種細胞接觸，其中第二種細胞可表達病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；(d)測定由第二種細胞產(chǎn)生的信號數(shù)量，以便確定病毒顆粒的侵染性，以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在抗體時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在抗體時測定的信號數(shù)量減少，指示該抗體可抑制病毒侵入第二種細胞。
本發(fā)明提供了一種方法，用于測定病毒對于可抑制病毒侵入細胞的化合物的敏感性，此方法包括(a)從病毒感染的病人獲得編碼病毒被膜蛋白的核酸；(b)將如下二種成分共轉(zhuǎn)染進入第一種細胞(i)步驟(a)中的核酸，和(ii)缺少編碼被膜蛋白的核酸，而包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含被膜蛋白的病毒顆粒，此被膜蛋白是由從病人獲得的核酸編碼的；(c)在有化合物存在時，使步驟(b)中產(chǎn)生的病毒顆粒與第二種細胞接觸，其中第二種細胞可表達病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；(d)測定第二種細胞產(chǎn)生的信號數(shù)量，以便確定此病毒顆粒的侵染性，以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在化合物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在化合物時測定的信號數(shù)量減少，指示該病毒對此化合物是敏感的。
本發(fā)明還提供了一種方法，用于確定某一病毒與參照病毒相比較，是否對抑制病毒侵入細胞的化合物具有抗性增加，該方法包括(a)首先第一次確定病毒對化合物的敏感性，例如按照上述的方法；(b)后來第二次再測定病毒對此化合物的敏感性；以及(c)比較步驟(a)和(b)中測定的敏感性，其中，在后來第二次測定的敏感性降低指示病毒對此化合物增加了抗性。
本發(fā)明提供了一種方法，用于鑒別使病毒對于抑制病毒侵入細胞的化合物具有抗性的病毒突變，該方法包括(a)在用該化合物對病毒作任何處理之前測定病毒的核酸序列或氨基酸序列；(b)獲得對此化合物具有抗性的病毒；(c)對來自步驟(b)的抗性病毒測定其核酸序列或氨基酸序列；以及(d)對步驟(a)和(c)的核酸序列或氨基酸序列分別進行比較，以便鑒別使病毒對此化合物具有抗性的病毒突變。
在本發(fā)明的一個實施方案中，步驟(b)中獲得的病毒，是在有化合物存在時培養(yǎng)步驟(a)的病毒直致使其產(chǎn)生抗性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，步驟(b)中獲得的病毒，是從已經(jīng)經(jīng)受用此化合物治療的病人中分離出的。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于準確并可重復地測定HIV-1對病毒侵入抑制劑的敏感性。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還提供了一種方式和方法，用于準確并可重復地測定HIV-1的共受體向性。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于準確并可重復地測定對HIV-1的抗體介導的中和作用。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于發(fā)現(xiàn)和最優(yōu)化針對病毒附著和侵入過程中已明確和尚未明確的不同步驟的，新穎或新型藥物，并鑒定其特征。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于發(fā)現(xiàn)和最優(yōu)化針對病毒附著和侵入過程中已明確和尚未明確的不同步驟的HIV-1疫苗(用于預防或者治療的)，并鑒定其特征。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于鑒別HIV-1被膜蛋白中(gp41TM和gp120SU)改變對病毒侵入抑制劑敏感性的氨基酸取代/突變。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于定量測定HIV-1被膜中存在的特異性突變對病毒侵入抑制劑敏感性的影響。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于確定以單獨或者組合形式常見于病毒中的HIV-1被膜氨基酸取代/突變，這種病毒表現(xiàn)為對病毒侵入抑制劑的敏感性改變。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于鑒別將改變受體或共受體向性的HIV-1被膜蛋白中(gp41TM和gp120SU)氨基酸取代/突變。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于定量測定HIV-1被膜中存在的特異性突變對受體或共受體向性的影響。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于鑒別以單獨或者組合形式常見于病毒中的HIV-1被膜氨基酸取代/突變，這種病毒表現(xiàn)為CXCR4或CCR5共受體向性。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于鑒別將改變抗體介導的中和作用的HIV-1被膜蛋白中(gp41TM和gp120SU)氨基酸取代/突變。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于定量測定HIV-1被膜中存在的特異性突變對抗體介導的中和作用的影響。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于鑒別以單獨或者組合形式常見于病毒中的HVI-1被膜氨基酸取代/突變，這種病毒表現(xiàn)為抗體介導的病毒中和作用。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于鑒別病人樣品病毒中常見的抗體，這種抗體能夠中和HIV-1。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于鑒別其感染需要一個CD4結(jié)合的病毒。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進步提供了一種方式和方法，用于鑒別其感染不需要與CD4結(jié)合的病毒。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還提供了一種方式和方法，用于鑒別表現(xiàn)出與CD4無關(guān)感染的病人樣品病毒的致病率。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于鑒別其感染需要與CD8結(jié)合的病毒。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還提供了一種方式和方法，用于鑒別表現(xiàn)出與CD8相關(guān)感染的病人病毒的致病率。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于鑒別其感染需要與CXCD4化學激活受體結(jié)合，或者與CCR5化學激活受體結(jié)合，或者與CXCR4或CCR5結(jié)合(雙重向性)的病毒。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于鑒別其感染需要與CXCR4化學激活受體結(jié)合，或者與CCR5化學激活受體結(jié)合，或者與CXCR4或CCR5結(jié)合(雙重向性)的病毒的致病率。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于鑒別以單獨或者組合形式常見于病毒中的HIV-1被膜氨基酸取代/突變，這種病毒表現(xiàn)為(a)對病毒侵入抑制劑敏感性的改變，(b)CXCR4或CCR5共受體向性，以及(c)抗體介導的病毒中和作用。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于利用對病毒侵入抑制劑的敏感性來指導對HIV-1的治療。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于利用對病毒侵入抑制劑的敏感性，來指導反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療失敗的病人進行治療。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于利用對病毒侵入抑制劑的敏感性，來指導新近感染HIV-1的病人進行治療。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方式和方法，用于利用HIV-1的共受體向性來指導對HIV-1的治療，或者指導反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療失敗的病人進行治療。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于利用HIV-1的共受體向性來指導新近感染HIV-1的病人進行治療。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于測定對HIV-1的抗體介導的中和作用，以便監(jiān)測疫苗接種后初始的預防性抗體應答反應。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于測定對HIV-1的抗體介導的中和作用，以便監(jiān)測疫苗接種后初始的治療性抗體應答反應。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于測定整個時間對HIV-1的抗體介導的中和作用，以便監(jiān)測疫苗接種后預防性抗體應答反應的持續(xù)時間。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種方式和方法，用于測定對HIV-1的抗體介導的中和作用，以便確立和最優(yōu)化疫苗接種的基礎(chǔ)-加強免疫方案，使疫苗接種的效力最強，持續(xù)時間最長。
例如，在HIV-的情況下，SU蛋白(gp120-SU)與跨越膜的被膜蛋白(gp41-TM)密切相關(guān)，此被膜蛋白將該復合物固定于病毒膜。通過斷開被膜基因的未斷裂前體產(chǎn)物gp160，可得到被膜蛋白gp120和gp41。HIV-1對其細胞受體(CD4)和共受體(CCR5或CXCR4)的結(jié)合，將促進TM蛋白發(fā)生構(gòu)象改變，而導致病毒與細胞膜融合，并使病毒核心進入細胞質(zhì)中(反轉(zhuǎn)錄病毒，1997)。雖然新型HIV-侵入抑制劑都是針對病毒被膜蛋白(gp120/gp41)或者宿主細胞蛋白(CD4，CCR5，CXCR4)，但是正如所預料的，HIV-1中大多數(shù)與抗性相關(guān)的突變都被定位于病毒被膜基因，例如，很可能病毒發(fā)展的一種途徑是轉(zhuǎn)換對共受體的利用。侵入阻斷劑構(gòu)成了一類新穎的抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物，并且具有較高的對抗目前多藥物抗性HIV-1變異體的廣泛活性潛力。這類潛在的病毒侵入阻斷劑中，包括融合抑制劑，受體/共受體拮抗劑和疫苗。
盡管如此，病毒侵入抑制劑也很可能產(chǎn)生藥物抗性病毒(通過被膜基因突變)，這樣，使對病人的治療變得復雜化了，類似于用蛋白酶抑制劑(PR1)和反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(RT1)治療HIV所見到的情況。實際上FDA在審批任何阻斷病毒侵入的新藥時將要求有抗性評價資料。在融合抑制劑T-20的情況下已經(jīng)證明有必要進行測定對侵入阻斷劑敏感性的診斷分析。已有報導表明，在有藥物存在時使病毒通過體內(nèi)之后，表現(xiàn)出對T-20敏感性降低。在此時還不能方便地進行能夠測定對病毒侵入阻斷藥物敏感性的表型分析。因而，醫(yī)生將很快面臨挑戰(zhàn)要在沒有為尋求藥物敏感性所必需的工具存在的情況下，設(shè)計合適的治療方案。因此，對于被感染的病人，可準確地測定對抑制病毒侵入的藥物敏感性的可靠分析法將是極端有價值的。
例如，最近世界衛(wèi)生組織的評估指出，全世界有三千三百萬以上的人感染了HIV-1這種流行性AIDS(艾滋病)的致病因素。在美國有將近一百萬人感染，目前有三十萬人在接受抗病毒治療(CDC，1999，WHO，1999)。抗擊AIDS已成為政府機構(gòu)，院校研究室和制藥/生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)共同的空前努力目標。FDA已經(jīng)批準了14個抗病毒藥物用于治療HIV-1感染(Carpenter等，2000)，并且另有20個以上藥物目前正在進行臨床試驗評價(PHRMA，1999)。這些被批準的藥物可通過干擾蛋白酶(PR)或者反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的酶促活性而抑制HIV-1的復制。PR抑制劑(PRIs)阻斷病毒適當?shù)匦纬刹《靖腥竞蛷椭扑匦璧牟《镜鞍踪|(zhì)，而RT抑制劑(RTIs)阻斷病毒拷貝其遺傳物質(zhì)。由于尚未達到最佳效果，為了阻止病毒復制，目前最通常的方式是組合使用PRIs和RTIs(Carpenter等2000)。
因此，所希望的是提供一種能夠進行如下評估測定的快速、準確和安全的病毒分析法測定病毒附著和侵入抑制劑(包括配合抑制劑，受體和共受體抑制劑)的活性；測定受體/共受體病毒向性，以便促進病毒侵入抑制劑的藥物設(shè)計和治療；測定病人的病毒對附著和侵入抑制劑的藥物敏感性改變；以及測定在應答使用被膜蛋白抗原作免疫接種所產(chǎn)生的中和病毒的活性。
本發(fā)明的方法可以被用于其病毒對病毒侵入抑制劑敏感的任何一種病毒疾病，并且其中對病毒侵入抑制劑的抗病毒藥物敏感性和抗性與如下病毒有關(guān)，例如包括但不限于lentiviruses(例如HIV-2)，其它反轉(zhuǎn)錄病毒(例如HLV-1和HTLV-2)，hepednavimses(例如人乙型肝炎病毒)，flaviviruses(黃病毒)(例如人丙型肝炎病毒)以及皰疹病毒(例如人細胞肥大病毒)。
侵入阻斷劑構(gòu)成了一類新穎的抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物，并且具有較高的對抗目前多藥物抗性HIV-1變異體的廣泛活性潛力。這類潛在的病毒侵入阻斷劑中，包括融合抑制劑，受體/共受體拮抗劑和疫苗。
融合抑制劑被設(shè)計成競爭性抑制TM構(gòu)象改變的化合物稱為融合抑制劑，是HIV-1復制的有效抑制劑，雖然在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和HIV-1感染的病人中都已證明了它們的活性(Wild等1992；Judice等1997；Kilby等1998)，但是在美國迄今尚沒有任何融合抑制劑被批準用于HIV-1感染的治療。這類藥物中例如T-20和T-1249(Trimeris公司，美國)是進一步深入臨床研究的對象。
受體/共受體拮抗劑除了在HIV-1與其受體相互作用之后發(fā)揮作用的融合抑制劑之外，還在努力開發(fā)另一類藥物，這類藥物是阻止HIV-1與CD4或者其二個主要共受體中的任何一個相互作用。已經(jīng)在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和動物模型中證明了這類藥劑抑制HIV-1感染的能力。幾個針對被巨噬細胞向性病毒(R5)利用的gp120，CD4和CCR5共受體的，或者針對被T-細胞向性病毒(X4)利用的CXCR4共受體的導向性化合物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)(Allaway等1993，Reimann等1995；Baba等1999；Bridger等1999)。
目前在美國還沒有批準將任何共受體拮抗劑用于治療HIV-1感染，這類藥物中，例如PRO 542(美國Progenic公司)，5a8(美國Tanox)，TAK-779(Takeda公司，日本)，以及AMD-3100(加拿大Anormed公司)是進行臨床前研究或者早期臨床研究的對象。因此，提供一種能夠鑒別和確定受體/共受體向性的分析法，用此分析法可快速準確地鑒別被向性病毒株(如HIV-1)感染的病人，這樣將促進對病毒侵入抑制藥物的設(shè)計和對病人的治療。
疫苗還已證明，在人類抗擊致病性病毒感染的戰(zhàn)斗中，疫苗也是一種有效的對策，并且有幾個防止HIV-1感染的候選幼苗正在臨床開發(fā)研究中，被膜蛋白gp120和gp41是最顯而易見的候選者，正在為用作HIV-1疫苗而加緊研究，并且正在臨床評價中的多達11個候選疫苗都是以被膜蛋白為基礎(chǔ)的(PhRMA，1999)。一般認為，有效的被膜疫苗可誘導產(chǎn)生阻止病毒感染的中和抗體(Mascola等2000)。因此，迫切需要一種靈敏的高效率分析法，能可靠地測定這種中和抗體的效力，并且不需要進行長時間的病毒培養(yǎng)。這種分析法將可顯著地促進研究有效的AIDS疫苗，特別是考慮到末期臨床試驗將包括數(shù)以千計的大規(guī)模病人群體時更是如此。因為中和抗體將阻止對靶細胞的有效感染，所以被膜受體分析法將有益于用作病毒中和作用分析法。
不幸地是，大多數(shù)這些藥物組合物僅在有限的時間內(nèi)有效，主要是由于藥物抗性病毒的出現(xiàn)，由于天生地缺乏對以高水平偶聯(lián)的RT和RNA聚合酶II的校正功能，而易進行錯誤的復制，致使病毒如HIV-1容易發(fā)生突變(Coffin 1995)，這種高頻率的突變促使HIV-1能夠成功地逃避長時間的藥物治療，導致病毒數(shù)量反彈。對于全部14個通過審批的藥物以及許多研究中的化合物的抗性相關(guān)的突變已被描述(Schinazi等1999)。因而，多藥物抗性HIV-1變異體導致對感染病人的護理更加困難。為了獲得長期臨床治療的效果，理想的是選擇可最大限度阻止病毒復制的那些藥物，并避免使用病人的病毒對其有抗性的藥物(DHHs，2000)，長遠的解決問題的方法可以依賴于藥物抗性試驗，這種試驗可以指導醫(yī)生選擇針對病人病毒的最有效藥物。對抗性試驗的必要性已在來自DHHs的最新指南中被確認，它推薦在治療HIV-1感染的病人時常規(guī)地使用抗性試驗。敏感性試驗也可以有助于開發(fā)針對抗性病毒的新藥。最近FDA咨詢委員會(1999年11月)曾建議，在開發(fā)用于HIV-1的抗病毒新藥時使用抗性試驗。
幾種方案已被運用于評價抗病毒藥的敏感性?；蛐驮囼灴煞治龌竞塑账嵝蛄兄械耐蛔兓蛘呋蛐?，并嘗試將這些突變與藥物抗性相關(guān)聯(lián)(Rodriguez-Rosado等1999；Schinazi等1999)。但是，基因型與表型之間的關(guān)系很復雜，而不容易解釋，并且這些試驗結(jié)果不能定量分析。使用基因型藥物敏感性資料需要由專家進行解釋(Baxtei等1999)，或者借助于計算機演繹法來解釋，并且經(jīng)常不能預測治療結(jié)果(Piketty等1999)。
表型藥物敏感性分析法可直接測定并定量分析病毒在存在藥物時的復制能力。最初的表型試驗需要長時間的病毒培養(yǎng)，因而是緩慢，費勞力的，并且不容易實現(xiàn)自動化而提高效率(Japour等1993)。從而認為這種早期的表型試驗對于病人治療運用是不合實際的。重組病毒分析法的建立(Shi和Mellors 1997；Hertogs等1998)簡化了表型試驗，并提高了效率。但是，這種分析法的主要缺點是4-8周的漫長試驗周期。較近期已經(jīng)建立了幾種重組病毒分析法以及能夠在單一復制循環(huán)過程中測定藥物敏感性的另一些分析法(Zemnou等1998，Petropoulos等2000)，致使試驗周期引人注目地減少至8-10天?？狗崔D(zhuǎn)錄病毒活性失敗的病人可以從表型分析法得到好處，這種分析法對于病人的治療是一種誘人的工具，因為它們可提供對藥物敏感性的直接和快速的測定。
本發(fā)明的分析法可以被用于由于此病毒家族內(nèi)的其它病毒引起的病毒感染，以及由其它病毒家族的病毒引起的病毒感染。此外，本發(fā)明的藥物敏感性試驗的抗性試驗還可用于篩選治療目的尚不能治療的病毒疾病的化合物。
病毒的結(jié)構(gòu)，生命周期和遺傳成分，這些在本發(fā)明的藥物敏感性試驗和抗性試驗中可被測定的信息是本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員熟知的。例如，理解反轉(zhuǎn)錄病毒的生命周期，以及反轉(zhuǎn)錄病毒解救(rescue)和侵染性所需要的病毒基因，對于實踐本發(fā)明是有用的。反轉(zhuǎn)錄病毒感染的細胞放出包含二陪體RNA基因組的具膜病毒。這種鑲嵌有被膜蛋白(此糖蛋白負責確定侵染性的宿主細胞范圍)的病毒附著于被感染細胞質(zhì)膜中的細胞受體。在與受體結(jié)合之后，病毒侵入細胞內(nèi)，并在通過宿主細胞的細胞質(zhì)時脫去外膜。在進入細胞核的途中或者在細胞核內(nèi)，處于病毒核心中的反轉(zhuǎn)錄酶分子驅(qū)動對雙鏈DNA前病毒的合成，通過被tRNA分子結(jié)合于病毒基因組RNA為此合成作好了準備。隨后雙鏈DNA前病毒被整合進入宿主細胞的基因組，在此它可以作為轉(zhuǎn)錄模板，既可用于編碼病毒蛋白質(zhì)的mRNA，又可用于將被包裝成病毒核心顆粒的病毒粒子基因組RNA。在從被感染細胞出來的途中，核心顆粒通過細胞質(zhì)移動，附著于新感染細胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)，并出芽，它們攜帶有包含病毒編碼的被膜糖蛋白基因產(chǎn)物的膜片。這種感染-反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄、翻譯，病毒粒子裝配和出芽的循環(huán)過程，在感染蔓延時一次又一次地重復進行。
病毒RNA以及作為其結(jié)果的前病毒DNA，可編碼幾種對于成功地完成病毒生命周期所必需的順位作用成分(cis-acting elements)。病毒粒子RNA在其3′末端攜帶有病毒啟動子。當基因組被反轉(zhuǎn)錄時，復制的特技將病毒啟動子安置在前病毒基因組的5′末端。3′至5′反轉(zhuǎn)錄病毒LTR正好位于病毒外層包被部位。反轉(zhuǎn)錄病毒的生命周期需要有病毒編碼的反式作用因子存在。病毒-RNA依賴的DNA聚合酶(pol)-反轉(zhuǎn)錄酶也被包含在病毒核心，并且對于病毒的生命周期是必不可少的，在其中它負責使基因組RNA轉(zhuǎn)變成整合的中間體前病毒DNA。病毒附著于未感染的細胞以及病毒傳播需要病毒被膜糖蛋白env。還存在通常被稱為反式激活子的轉(zhuǎn)錄反式激活因子，它負責調(diào)整被整合的親本前病毒的轉(zhuǎn)錄水平。一般情況下，復制勝任的(未缺陷的)病毒自身包含了這種因子，其中它們可編碼所有的這些反式作用因子。它們的有缺陷對應部分則不被自身包含。
在DNA病毒的情況下，例如hepadvirus，了解其生命周期以及感染所需要的病毒基因，對于實踐本發(fā)明是有用的。HBV侵入的過程還沒有被充分地確定。HBV的復制可使用RNA中間體模板，在被感染的細胞，復制過程的第一個步驟是將不對稱的松環(huán)DNA(rc-DNA)轉(zhuǎn)變成共價閉環(huán)DNA(cccDNA)。發(fā)生在被感染肝細胞核中的這一過程包括完成DNA正鏈合成和DNA末端連接。在第二個步驟，cccDNA被宿主細胞RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生3.5KB RNA模板(前基因組)。在病毒核心，此前基因組與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物。第三個步驟包括通過使用病毒編碼的P蛋白反轉(zhuǎn)錄酶拷貝前基因組RNA，來合成第一負向DNA鏈。此P蛋白也可用作負鏈DNA引物。最后，利用P蛋白DNA聚合酶活性，并用病毒RNA的寡聚體作引物，通過拷貝第一DNA鏈進行第二正向DNA鏈的合成。前基因組也轉(zhuǎn)錄mRNA，用于形成主要的結(jié)構(gòu)核心蛋白。
設(shè)計和方法(1)構(gòu)建用于病毒被膜蛋白的表達載體，此載體能夠接受病人來源的編碼此被膜蛋白的片段。
在一個實施方案中，構(gòu)建了能夠在被轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)表達HIV-1被膜蛋白的被膜表達載體。類似的表達載體已被描述，包括如在美國專利No 5,837,464和(petropoulos等2000)中描述的，為了表達兼性向性鼠白血病病毒(A-MLV)被膜蛋白構(gòu)建的質(zhì)粒(pAmphoEnv)。在被轉(zhuǎn)染的細胞中，pAmphoEnv載體可利用人細胞肥大病毒(CMV)的立即早期基因啟動子以及SV40聚腺苷酸化信號序列，產(chǎn)生A-MLV被膜mRNA。通過缺失A-MLV被膜基因和導入限制酶切割位點使其可以插入來自各種分離物如HIV-1的病毒被膜片段，對pAmphoEnv質(zhì)粒進行修飾。在HIV-1的情況下，被膜開放讀框跨度為大約2600個核苷酸，編碼被膜多蛋白gp160。gp160多蛋白被細胞furin一樣蛋白酶切割產(chǎn)生二個亞單位gp41和gp120?？梢园慈缦路椒ㄖ鸩綐?gòu)建HIV-1被膜表達載體(a)以多克隆位點多接頭替換來自被膜表達載體(pAmphoEnv)的A-MLV被膜核酸序列借助于限制酶的消化作用，可以使pAmphoEnv載體缺失A-MLV被膜核酸序列。通過連接于雙螺旋寡核苷酸多接頭，可以使被消化的載體重新環(huán)化，此多接頭包含用于插入被膜序列的四個獨特的內(nèi)豐限制性酶切位點。此連接反應可以被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli)，而對于包含正確多接頭序列的分子克隆可分別通過限制性酶切作圖和DNA測序進行鑒定和確認。將多個獨特的克隆位點導入此載體可有利于HIV-1被膜序列的插入?；谒鼈冊贖IV-1被膜序列(LANL HIV-1數(shù)據(jù)庫，www.lanl.gov)中頻繁地出現(xiàn)，可以對多接頭中的限制性酶切位點進行選擇。這種載體可被稱為pCX。通過將報導基因或指示核酸如螢火蟲螢光素酶插入pCX的多克隆位點，并測定被感染的細胞中來自指示核酸或報導基因活性的信號，可以證明pCX載體的功能度。在此使用的“指示核酸”是指編碼蛋白質(zhì)的核酸，DNA或RNA結(jié)構(gòu)，這些核酸結(jié)構(gòu)可直接地或者通過某一反應產(chǎn)生可檢測的或引人注目的信號如顏色或可測定波長的光，或者產(chǎn)生用作指示的特殊DNA或RNA結(jié)構(gòu)，應用眾多定量擴增分析法中的任何一種都可以擴增這種特殊DNA或RNA結(jié)構(gòu)。
(b)將病毒被膜序列插入pCX被膜表達載體將誘變引物用于PCR擴增，可產(chǎn)生包含二個獨特限制性位點(分別為a，b和c，d)的病毒被膜片段，此限制性位點與例如HIV-1被膜開放讀框的起始如終止密碼子相鄰。在被膜開放讀框的二端導入二個獨特的限制性位點，對于在pCX載體的多克隆位點發(fā)現(xiàn)的任何一種酶，都可以提高克隆包藏內(nèi)在限制性位點的HIV-1被膜片段的機會。
在HIV-1的情況下，在被膜基因中帶有已知差異的二個被明確鑒定特征的HIV-1分子克隆NL4-3(誘導合胞體的T-細胞向性實驗室株)和JR-CSF(非誘導合胞體的，巨噬細胞向性初始分離物)，可以被用作PCR擴增的模板。可以用二個限制性酶消化其2600個核苷酸的擴增產(chǎn)物(每個酶在片段的一端切開，例如a和c或b和d)，隨后通過連接反應和轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli)被插入進pCX載體中。對含有合適被膜序列的分子克隆可以通過限制性酶切作圖進行鑒定，并通過DNA測序證實。所形成的質(zhì)粒pHIVenv(NL4-3)和pHIVenv(JR-CSF)可被用于在轉(zhuǎn)染被的細胞中表達HIV-1被膜蛋白(圖1A)。通過測定被轉(zhuǎn)染的細胞中病毒被膜蛋白的合成(蛋白質(zhì)印跡分析)，以及根據(jù)它們模擬被膜缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒載體的能力，可以證明被膜表達載體如pHIVenv載體的功能度。已經(jīng)證明使用人胚胎腎293細胞系可獲得高滴的病毒原種(petropoulos等2000)，但是本發(fā)明不局限于這種細胞系。為了轉(zhuǎn)染從病人得到的，編碼病毒被膜蛋白的核酸，其它適合用作第一種細胞的細胞系包括5.25；HOX；U87；MT2；PM1；CEM等，這些僅作為實例，不是對本發(fā)明的限制。為了表達一個或幾個共受體，最佳的細胞系將通過細胞工程構(gòu)建。
(c)修飾pCX載體以便提高克隆病毒被膜序列的效力為了提高對病毒被膜片段的克隆效力，可以通過在E.coli lac啟動子的控制下，將細菌殺傷基因盒(例如細胞死亡控制b基因(ccdB)或hok殺傷基因家庭成員)插入多克隆位點中(crerdes等1990；Bernard和Counturier1992；Bernard等1993)。這種被修飾的載體被稱為pCXccdB。在表達laci抑制劑的細菌株如JM109，對ccdB殺傷基因的轉(zhuǎn)錄被抑制。這種或等價的細菌株可以被用繁殖攜帶在lac啟動子控制下的ccdB殺傷基因的質(zhì)粒。相反地，在此系統(tǒng)中不過度表達laciq抑制劑的細菌株如DH5a和Top10，也不能保存表達ccdB基因的質(zhì)粒。由于ccdB的活性可殺死轉(zhuǎn)化體?？梢詮膎家供貨商(Life Technologies或Invirogen)獲得DH5a和Top 10細胞。應用這種選擇性克隆手段，可在laiq細菌株繁殖親本表達載體。用二個限制性酶消化此載體，這二個酶都能除去ccdB基因盒，并且對于HIV-1，它們在插入HIV-1被膜序列(a，b，c，d)不矛盾。在連接載體和被膜片段之后，缺乏laciiq的細菌株被轉(zhuǎn)化。一旦被轉(zhuǎn)化，包含細菌的質(zhì)?？梢陨L，此質(zhì)粒中病毒被膜插入片段已取代了ccdB殺傷基因。保留了或室建了ccdB殺傷基因的包含細菌的質(zhì)粒則不能存活。以這種方法，由于質(zhì)粒中包含病毒被膜插入片段，被轉(zhuǎn)化細菌的總數(shù)逐漸增加。而含有ccdB基因的親本載體逐漸減少。構(gòu)建pCXccdB載體對于實現(xiàn)本工程的第1步驟不是必不可少的，但是預期它將顯著地提高克隆來源于病人樣品的HIV-1被膜序列的效力，因此，可以增加保持病毒序列異質(zhì)性的可能性。通過限制性酶切作用和DNA測序可以證實此pCXccdB載體的結(jié)構(gòu)。
(d)將病毒被膜序列插入pCXccdB表達載體中通過產(chǎn)生包含病毒被膜序列和不完全消化的pCXccdB載體DNA的連接反應，可以評估pCXccdB載體的功能度。在細菌轉(zhuǎn)化之后，質(zhì)粒DNA可以從單一的細菌克隆中制備，并且可通過限制性消化作用分析它存在病毒被膜片段，而不存在ccdB序列。通過擴增來自總共13個可獲得的HIV-1克隆的被膜區(qū)，可測試這種方法的可行性，(這些HIV-1克隆為pCRII91US005.11，pCRII-91006.10，pCRII-92US657.1，pCRII-92US711.14，pCRII-91US712.4，PcRII-92US714.1，pCRII-91HT651.11，PCRII-92BR020.4，PCRII-91HT651.1A，pCRII-92HT593.1，pCRII-92HT594.10，pCRII-92HT596.4，pCRII-92HT599.24，可通過AIDS研究試劑參考計劃(ARRRP)，Rockville，Maryland，獲得)。每個片段都可以被插入pCXccdB中，并且通過限制性酶切作圖和/或DNA測序可以證實所形成的pHIVenv表達載體的結(jié)構(gòu)。通過測定被轉(zhuǎn)染細胞中HIV-1被膜蛋白的合成(蛋白質(zhì)印跡分析)以及通過它們模擬被膜缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒載體的能力，可以證明每個pHIVenv載體的功能度。
(2)構(gòu)建包含指示核酸來代替編碼被膜蛋白的生物安全性病毒表達載體為了評價病毒侵入抑制劑，按照在美國專利No 5,837,464和Petropouloe等2000中所述的用于評價抑制劑PR和RT的類似途徑和方法，構(gòu)建了一種生物安全性病毒載體?？梢詫⒈景l(fā)明的這種病毒表達載體與被膜表達載體(上述的)一起共轉(zhuǎn)染進入細胞內(nèi)，產(chǎn)生高滴度的病毒原種?？梢栽u價這種病毒原種對病毒侵入抑制)包括抗病毒藥物和中和抗體的敏感性。在HIV-1的情況下，可以從被明確鑒定特征的HIV-1感染性分子克隆NL4-3產(chǎn)生病毒表達載體。控制病毒基因表達的5′末端重復序列(LTR)可以被修飾，以致在被轉(zhuǎn)染的細胞中病毒基因的轉(zhuǎn)錄被CMV立即早期啟動子驅(qū)動(Naviaux等，1996)。大部分被膜基因都可以缺失)但是重要的控制成分如rev應答成分(RRE)和輔助蛋白編碼區(qū)(rev，tat)被保留。代替缺失的被膜序列，插入了指示核酸，例如在CMV啟動子-增強子序列控制下的螢火蟲螢光素酶報導基因盒(圖1B和3)。通過測定感染細胞中螢光素酶的活性可以對病毒的感染進行監(jiān)測。雖然不可能發(fā)生，但是可以想像，在反轉(zhuǎn)錄病毒載體與例如被轉(zhuǎn)染細胞中的pHIVenv序列之間的質(zhì)粒相互重組可能導致產(chǎn)生感染性HIV-1。在為產(chǎn)生生物安全性載體的努力中，可以在HIV基因組中導入幾個基因改變。例如缺失大部分被膜基因而保留重要的控制序列RRE，而且還可以實現(xiàn)在載體3′LTR的U3區(qū)缺失轉(zhuǎn)錄增強子序列(圖2)。在反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的復制過程中，位于病毒基因組3′末端的U3區(qū)對于被感染細胞中前病毒5′LTR的U3區(qū)起模板作用。這種前病毒在其5′LTR的U3區(qū)缺少啟動子成分，因此在被感染的細胞中不能產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒RNA。這種自我失活(SIN)的策略已被成功地用于幾個包括HIV-1的反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，(Hwang等1997；Miyoshi等1998)。在本發(fā)明的分析法中，不需要在感染細胞中進行病毒基因表達，因為是通過由指示核酸產(chǎn)生的可檢測信號來測定病毒感染作用，例如由其各自的啟動子驅(qū)動產(chǎn)生螢光素酶活性(圖1B)。借助于標準的分子克隆程序可以實現(xiàn)缺失被膜序列和轉(zhuǎn)錄增強子區(qū)(U3)，通過DNA序列分析可以證實每種缺失。
通過以上述的pHIVenv載體共轉(zhuǎn)染293細胞，可以證實這種載體的功能度例如對于HIV-1這種載體被稱為pHIVlueΔU3。由被轉(zhuǎn)染細胞中二種載體產(chǎn)生的病毒蛋白質(zhì)有效的反式互升作用，可以導致產(chǎn)生病毒顆粒。可以從培養(yǎng)上清液中收獲病毒顆粒，并通過蛋白質(zhì)印跡試驗進行分析。通過常規(guī)地應用p24 ELISA，定量PCR或TaqMan分析法，可以定量測定病毒的滴度。
為了實施本發(fā)明不必要產(chǎn)生自我失活的病毒表達載體，但是希望提高分析法的可重復性和生物安全性。
(3)鑒別適合于表達受體和共受體，并支持病毒感染的細胞系可以對以前所述的并已知支持特定病毒感染的不同哺乳動物細胞進行評價。如在此對關(guān)于HIV-1的一個實施方案所論述的，通過如下步驟可以實施此分析法(a)以pHIVenv和pHIVlueΔU3共轉(zhuǎn)染第一種細胞，(b)轉(zhuǎn)染之后收獲病毒，(c)在存在和不存在病毒侵入抑制劑的情況下用這種病毒感染第二種細胞，以及(d)測定被感染細胞中螢光素酶的產(chǎn)生。
表1列舉了評價HIV-1感染的這種細胞系的代表性例子，包括細胞系和共相關(guān)的受體/共受體。這些細胞系中的幾個可以從公共細胞庫中獲得。
從被轉(zhuǎn)染的293細胞培養(yǎng)物中收獲的病毒顆粒，可以被用于感染各種不同的細胞系。在HIV-1的情況下，如上所述pHIVlueΔU3載體在被膜基因和U3啟動子-增強子中含有缺失，因此，以內(nèi)此載體產(chǎn)生的病毒顆粒感染許可的細胞系被限制于單一復制循環(huán)。此循環(huán)包括(a)病毒附著和侵入，如上所述，是由pHIVenv載體以反式產(chǎn)生的病毒被膜蛋白所介導的，(b)借助于RT將單鏈病毒RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA，以及(c)將病毒DNA整合進入宿主細胞的基因組中(前病毒形成)。通過在pHIVlueΔU3載體中缺失必需的病毒啟動子-增強子序列，可以限制通過RNA聚合酶II病毒基因的活躍轉(zhuǎn)錄作用，正常情況下，在感染的細胞內(nèi)，前病毒整合之后發(fā)生這種轉(zhuǎn)錄作用。但是，這種限制作用可以不干擾感染細胞內(nèi)螢光素酶基因表達，因為此基因使用內(nèi)在的CMV啟動子，而不依賴于病毒基因表達所驅(qū)動(圖1B)。感染后產(chǎn)生的螢光素酶活性數(shù)量可以被用作對病毒侵染性的測量。
HIV-1附著和侵入宿主細胞需要與初級受體(CD4)和幾個共受體中的一個最通常是CCR5或CXCR4相互作用?？梢院Y選已知表達CD4，CCR5和CXCR4不同組合的細胞系。具體地說，可測定列舉在表1中的細胞系，這些細胞表達(a)CD4加CCR5，(b)CD4加CXCR4，以及(c)CD4加CCR5或CXCR4。只表達CD4受體的，或者只表達CCR5或CXCR4共受體的細胞系可作為有用的對照，并可以被用于鑒定不需CD4結(jié)合的或利用共受體，而不是CCR5和CXCR4的HIV-1分離物。用于判斷細胞系適合性的主要標準可以是通過螢光素酶產(chǎn)生所測定的侵染性(104-106相對光單位)。此外，還可以根據(jù)生長速度，穩(wěn)定性命力，生和其它作為必要的參數(shù)對細胞系進行鑒定。可以選擇容易保存的，并且例如感染之后可產(chǎn)生大量螢光素酶活性的細胞系，這種細胞還可以被不同被膜受體向性如CD4/CXCR4和CD4/CCR5病毒感染。通過公共細胞庫如ARRRP還可獲得另外幾種支持例如HIV復制和表達HIV-1受體及共受體的被明確鑒定特征的細胞系(例如CEM-NKr-CCR5釋放種類a)。
進而使用標準的程序例如通過對細胞加入聚鹵化季銨鹽(polybrene)修進感染(porter等1998)還可以增強細胞系。例如，對于HIV，為使用本發(fā)明，通過以HIV-1實驗室株感染，并將重組病毒侵染性滴定與用感染性HIV-1得到的侵染性滴度相比較，或者通過以在此所述的病毒表達質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染細胞，并對病毒的產(chǎn)生評分，可以鑒別其它潛在的細胞系。通過應用定量RT-PCR分析法可以對病毒轉(zhuǎn)錄物的積累進行檢查。以類似方式可以鑒別適合于其它病毒的細胞系。
可以優(yōu)化本發(fā)明的分析法條件，使之能夠自動化高效率地檢測病人樣品。還可以優(yōu)化樣品制備方法，以便有效地捕獲病毒基因組RNA和被膜RNA。被優(yōu)化的RT-PCR條件使之能夠擴增病人來源的被膜序列，例如低病毒含量(500拷貝/ml)的HIV-1被膜序列(2600堿基對)。
(4)對本分析法實用性的證明通過如下測定獲得的結(jié)果可證明本發(fā)明分析法的實用性(1)在有明確特征的抑制劑存在時測定對病毒侵入的劑量-依賴性抑制作用；以及(2)在有明確特征的HIV-1和抗體存在時測定對感染的劑量-依賴性抑制作用。
對本發(fā)明病毒侵入分析法的如下應用進行了評價(i)檢測病毒附著和侵入抑制劑(包括對融合，受體和共受體的抑制劑)對HIV-1復制的抑制作用；(ii)測定對HIV-1附著和侵入抑制劑敏感性的改變；以及(iii)檢測抗體的中和作用活性，此抗體是在對針對HIV-1被膜蛋白的疫苗應答反應中產(chǎn)生的。
在優(yōu)選的實施方案中，可通過如下步驟實施本分析法(a)以pHIVenv和pHIVlueΔU3載體共轉(zhuǎn)染第一種細胞，(b)在轉(zhuǎn)染后大約48小時后收獲病毒，(c)在存在和不存在病毒侵入抑制劑時用這種病毒感染第二種細胞，以及(d)在感染后大約48-72小時測定螢光素酶的產(chǎn)生。使用96孔排列方式，可以對較寬濃度范圍的病毒侵入抑制劑測定對HIV-1復制的劑量-依賴性抑制作用。根據(jù)對每種抑制劑的經(jīng)驗，可以確定適合的濃度范圍?？梢砸詫ξ灩馑孛富钚缘陌俜謹?shù)抑制作用數(shù)據(jù)對藥物濃度(log10)作曲線。可以使用計算機軟件進行數(shù)據(jù)分析。抑制作用曲線被用于確定對特定藥物或抗體的50％抑制濃度(IC50)(圖6)。
使用如上述構(gòu)建的pHIVenv載體，對來源于各種被明確鑒定的HIV-1分離物的被膜蛋白進行了鑒定。對于HIV-1，為了確定被膜共受體向性，如上所述可測定對所使用的表達CD4加CXCR4以及CD4加CCR5的細胞的感染作用。已知抑制HIV-1侵入的廣泛多種化合物(表2)包括非特異性作用劑如磺酸化聚陰離子(葡聚糖硫酸酯和肝素)，都可使用本發(fā)明的分析法?；瘜W因子(Chemokine)如Rantos和SDF-1，分別是CCR5和CXCR4化學因子受體的天然配體(見Alklatib等1996，Belul等1996)，也適合于使用本發(fā)明。進而，還使用了病毒侵入抑制劑如T20和T1249(Trimeris公司)，PRO542(Progenics)，5a8(Tanox)來評價本發(fā)明分析法的實用性。
應用標準的生命力或細胞毒性分析法(例如染料排出，MTS，ATP)可評價藥物對靶細胞的毒性。
表現(xiàn)出對融合抑制劑T20敏感性降低的HIV-1突變株(Rimsky等1998)，以及使這種病毒能夠在有藥物存在時復制被膜蛋白(gp41-TM)基因圖)的遺傳決定簇(突變因子)已被描述。
為了證明本發(fā)明的分析法能夠測定藥物敏感性(即抗性)改變，(a)產(chǎn)生了攜帶這種突變型被膜基因的pHIVenv載體，(b)用這種載體和pHIVlueΔU3載體共轉(zhuǎn)梁第一種細胞，(c)收獲帶有這種突變型被膜蛋白的病毒，以及(d)測定此病毒存在T20時的侵染性。通過將帶有突變型被膜蛋白病毒的IC50與缺乏這種明確的藥物抗性突變的IC50相比較，發(fā)現(xiàn)對T20的藥物敏感性降低了。與攜帶缺乏藥物抗性突變的被膜蛋白的病毒相比較，攜帶具有藥物抗性突變的被膜蛋白的病毒可表現(xiàn)出較高的IC50值，也就是說，抑制作用需要較高的藥物濃度(相當于圖8中顯示的數(shù)據(jù))。按照標準的程序，應用標準的定位誘變技術(shù)，可以將藥物抗性突變導入被膜表達載體(pHIVenv)(petropoulos等2000；Ziermann等2000)。
被普遍接受的觀點是，對防止HIV-1感染的有效疫苗，應該誘發(fā)出以廣泛交叉反應中和抗體為特征的強烈體液免疫應答。因此，按常規(guī)是檢測被接種疫苗的個體血清中是否存在針對其免疫原的高滴度中和抗體。最近Mascola和Colleagues應用HIV-1/猴免疫缺損病毒(SIV)嵌合病毒恒河猴模型(SHIV)，已顯示出粘膜接種之后被動轉(zhuǎn)移這種中和抗體將導致病毒數(shù)量減少(Mascola等2000)。本發(fā)明的分析法可被用于快速準確地測定抗體中和病毒的活性，此抗體是在應答針對被膜抗原如HIV-1被膜抗原的的疫苗中產(chǎn)生的。例如，本發(fā)明的分析法可以(a)產(chǎn)生了表達多種已明確特征的被膜蛋白的pHIVenv載體，(b)用這種載體和pHIVlueΔU3載體共轉(zhuǎn)染第一種細胞，(c)收獲病毒，并以序列稀釋的抗體制備物或疫苗接種后的血清溫育此病毒，(d)測定這種病毒對第二種細胞的侵染性?？梢匀缫郧八龊桶凑瘴墨I進行數(shù)據(jù)分析和確定IC50。在HIV-1的情況下，可以選擇代表不同HIV-1基因背景(例如分化體A，B，C，D，E，F(xiàn))的，不同細胞和共受體向性(巨噬細胞/CCR5，T細胞/CXCR4)的，以及不同被膜蛋白(誘導合胞體和不誘導合胞的，實驗室改造的或原始分離物)的病毒(表2)。有效的方式是通過使用加入大約20-100TCID50/孔病毒并必要時作些調(diào)整，從每種病毒制備出具有規(guī)定滴度的原種，以便最優(yōu)化分析法的靈敏度和可重復性。根據(jù)以前證實的中和使用特性可以對抗體制備特性可以對抗體制備物進行選擇，這些特性是功能性的，例如它們中和和初始分離物的能力，或者是物理性的，例如它們結(jié)合特異性和gp120或gp41抗原表位的能力(表2)按照科學文獻中所述的常規(guī)性病毒中和作用分析法，對比這些明確特征的抗體制劑的活性，可以對本發(fā)明分析法的效能進行判斷。使用來自HIV-1感染的廣泛代表性個體種類的血清，可以確立能使分析法具有最大靈敏度，并使細胞毒性最低的血清稀釋度的適當范圍。細胞毒性可應用標準的活力分析法或細胞毒性分析法進行測定(例如染料排出，MTS，ATP)。
提供下面的實施例以便對本發(fā)明作進一步說明和解釋，不應看作是對任何方面的限制。
實施例1測定表型藥物對HIV-1侵入抑制劑的敏感性此實施例提供了一種方式和方法，用于準確并可重復地測定對HIV-1附著和侵入(此后統(tǒng)稱為侵入)抑制劑的敏感性。根據(jù)本實施例，可以使測定對HIV-1抑制劑敏感性的方式和方法適合于其它病毒，包括但不限于其它的lentiviruses(如HIV-2)，其它的反轉(zhuǎn)錄病毒(如HTLV-1和2)、hepadnaviruses(人乙型肝炎病毒)，黃病毒(人丙型肝炎病毒)以及皰疹病毒(人細胞肥大病毒)。此實施例還進一步提供了一種方式和方法，用于測定對侵入抑制劑敏感性的改變(增加或降低)。
采用這種方式和方法適合于在美國專利No.5,837,464(國際專利申請?zhí)朩O 97/27319)中所述的表型藥物的敏感性和抗性試驗的途徑，進行侵入抑制劑敏感性測定，此專利在此被引入作為參考。
為了表達由病人來源的HIV被膜序列所編碼的被膜多蛋白(gp160)，設(shè)計了一個載體(pHIVenv)，作為被膜表達載體的一個實例(圖1)。隨后借助于細胞蛋白酶切開gp160，產(chǎn)生表面亞單位(gp120SU)和跨膜亞單位(gp41TM)，在HIV-1病毒顆粒的表面包含這種被膜蛋白。為了表達基因組和亞基因組病毒RNA和除了膜多蛋白以外的所有HIV蛋白，設(shè)計了作為病毒表達載體實例的第二個載體(pHIVluc或pHIVlucΔU3)(圖1A和1B)。
在本申請中，病人來源的片段相當于HIV-1被膜多蛋白(gp160)的編碼區(qū)(～2.5KB)，并且代表(a)使用病毒RNA，借助于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)擴增的被膜序列，此病毒RNA是從來源于被HIV感染個體的病毒中分離出的；或者代表(b)來源于HIV-1分子克隆的被膜序列，此序列包含有通過親分子克隆(典型地是NL4-3)定位診復所導入的特定突變。
應用標準的程序?qū)嵤┎《綬NA的分離(例如RNAgets總RNA分離系統(tǒng)，Promega Madison WI或RNAzol，Tel-試驗，F(xiàn)riendswood，TX)。RT-PCR過程被分為二步。使用反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄酶[例如Superscript II(Initrogen，生命技術(shù)公司)，Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Roche Molecnlar Systems公司Branchburg.NT)或者禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶(Boehringer Mannheim，IndianapohI，IN)將病毒RNA拷貝成為單鏈cDNA。然后使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶[例如Tag(Rocle Molecwlar Systems公司，Brawchbwrg.NS)，Tth(RoeheMolacnlar Systenvs公司，Branehbarg WJ)，Primezyme(從棲熱brockianms菌分離出的，Biometra，Goteingen，德國)]，或者熱穩(wěn)定性聚合酶的組合，如被描述用于實施“長PCR”(long PCR)(Barnes.W.M.(1994).Pruc.Natl.Acad.Sci.USA 91.2216-2220)的酶組合[例如高保真PCR延伸系統(tǒng)(Taq+pwo)，(Boehringer Mannheim，Indianapolis.IN)，或者Gene Amp XLPCR試劑盒(Tth tVent)，(Rocke分子系統(tǒng)公司，Branchbarg NJ)，Adnantage-2(CloneTech)]，將此cDNA擴增至高拷貝數(shù)。
寡-dT(寡脫氧胸苷酸)被用于將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成為單鏈cDNA。被膜PCR引物，正向引物Xho/pm和反向引物Mlu/Xba(表3)被用于擴增病人來源的片段。設(shè)計這些引物，以便擴增編碼gp160被膜多蛋白的～2.5KB被膜基因，同時在PCR擴增產(chǎn)物的5′末端導入Xho I和PinAI識別位點，在PCR擴增產(chǎn)物的3′末端導入Mlu I和Xba I位點。
應用在美國專利No.5,837,464(國際專利申請?zhí)朩O97/27319)中所述，稍加修改的限制性內(nèi)切核酸酶消化，DNA連接以及細菌轉(zhuǎn)化方法，將病人來源的片段(25KB被膜序列擴增產(chǎn)物)插入HIV-1被膜表達載體中。用XhoI或Pin AI在其5′末端，以及用Mlu I或Xba I在其3′末端，消化此～2.5KB擴增產(chǎn)物。用DNA連接酶將形成的消化產(chǎn)物連接，成為被修飾pCXAS或pCXAT表達載體如5′XhoI/Pin AI位點和3′Mlu I/Xba I位點。對pCXAS和pCXAT載體的構(gòu)建已有描述(在基本專利的CPT中，我認為它是美國專利No.5,837,464(國際專利申請?zhí)朩O 97/27319)的實施例6)。除了存在于pCXAS和pCXAT中的Xho I，Mlu I和Xba I限制性位點之外，被修飾為pCXAS和pCXAT載體還包含Pin AI限制性位點。通過定位誘變將Pin AI位點導入Xho I和Mlu I位點之間，以致四個位點以如下順序定位于5′至3′末端Xho I，Pin AI，Mlu I和Xba I。在優(yōu)選的實施方案中，同Pin AI和Mlu I消化此2.5KB擴增產(chǎn)物，并連接成為被修飾pCXAS表達載體的5′Pin AI位點和3′Mlu I位點。連接反應產(chǎn)物被用于轉(zhuǎn)化E.Coli。在30-37□培育24-36小時之后，從E.Coli培養(yǎng)物中分離純化出表達載體質(zhì)粒DNA。為了確保表達載體制備物可充分地代表存在于指定病人血清中的HIV準種，將許多(＞100)無關(guān)的E.Coli轉(zhuǎn)化體集中在一起，用于制備pHIVenv質(zhì)粒DNA。為了表達病人病毒來源的被膜蛋白，以這種方式裝配的載體被統(tǒng)稱為pHIVenv(圖1和3)。
為了轉(zhuǎn)錄HIV基因組RNA和亞基因組mRNA，并且表達除被膜多蛋白之外的所有蛋白質(zhì)，設(shè)計了基因組HIV表達載體pHIVluc和pHIVlucΔU3(圖1B)。在這些載體中，已使一部分被膜基因缺失，以便接納功能性指示基因盒，在本方案中，“螢火蟲螢光素酶”被用于監(jiān)測在存在或不存在抗病毒藥物時病毒復制的能力。在pHIVlucΔU3中，已使一部3′U3區(qū)缺失，以便在被感染的細胞中，阻止病毒RNA從5′LTR轉(zhuǎn)錄。
使用如下細胞實施對HIV-1侵入抑制劑的敏感性分析由人胚腎細胞系293組成的包裝(packqging)宿主細胞(細胞培養(yǎng)器材，UC舊金山，SF，CA)以及由表達CD4(HT4)加CCR5，及CXCR4的人骨肌瘤(HOS)細胞系，或者表達CD4和CCR5或CD4和CXCR4的星形膠質(zhì)細胞瘤(U-87)細胞系組成的靶宿主細胞。
使用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3進行藥物敏感性測定。通過以抗性試驗載體DNA轉(zhuǎn)染色裝的(Packaging)宿主細胞(HEK293)，產(chǎn)生了包含被膜蛋白的擬型HIV顆粒，此被膜蛋白是由病人來源的片段編碼的。在轉(zhuǎn)染后(大約48小時)收集病毒顆粒，用于感染表達HIV受體(即CD4)和共受體(即CXCR4，CCR5)的靶細胞(HT4/CCR5/CSCR4，或U-87/CD4/CXCR4，或U-87/CD4/CCR5)。感染后(大約72小時)，使靶細胞裂解，測定螢光素酶活性，為了成功地感染靶宿主細胞并產(chǎn)生螢光素酶活性，HIV必須完成一個復制循環(huán)。在感染細胞中檢測的螢光素酶活性數(shù)量被用作“侵染性”的直接測定值(圖1和2)。如果由于任何一種原因(例如缺乏適當?shù)氖荏w或共受體，抑制性藥物活性，中和抗體結(jié)合)，病毒則不能進入靶細胞，螢光素酶活性被削弱。通過將存在藥物時的侵染性與不存在藥物時的侵染性相比較，來測定藥物敏感性。通過將“待測”病毒的敏感性與明確特征的參照病毒(野生型)的敏感性相比較，可以定量測定相對藥物敏感性，此參照病毒是來源于HIV-1的一個分子克隆，例如NL4-3或HXB2。
將包裝的宿主細胞接種在10cm直徑的平皿內(nèi)，平板后1天用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3轉(zhuǎn)染此宿主細胞。應用磷酸鈣共沉淀技術(shù)實施轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后從1小時到24小時，以新鮮的培養(yǎng)基替換含有DNA沉淀的細胞培養(yǎng)基。一般在轉(zhuǎn)染后2天收獲含有病毒顆粒的細胞培養(yǎng)基，并使此細胞培養(yǎng)基通過0.45mm的濾器過濾。在感染之前，將靶細胞在細胞培養(yǎng)基中作平板接種。一般在感染時(偶爾在感染前1天)將侵入抑制藥物加入靶細胞。典型地是在感染后3天用steady-Glo試劑(Promega)和光度計測定靶細胞的螢光素酶活性。
在一個實施方案中，證實了對融合抑制藥物(T-20，也被稱為DP178，Trimeris，Research Triangle Park.NC)的敏感性(圖4)。在不存在T-20時，以及存在T20寬濃度范圍(X、軸、log10分度)時，感染表達CD4、CCR5和CXCR4的靶細胞(HT4/CCR5/CXCR4)。通過將存在T-20時感染細胞中產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量與不存在T-20時產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量相比較確定了對病毒復制的百分數(shù)抑制作用(y-軸)。對R5向性的(JRCSF，91US005.11)，X4向性的(NL4-3，92HT599.24)和雙向性的(92HT593.1)病毒進行了測定。通過確定抑制病毒復制作用50％所需要的T-20濃度來定量測定藥物敏感性(IC50，圖4中縱虛線所顯示的)。與具有較高IC50值的病毒相比，具有較低IC50值的病毒對T-20比例敏感。
在還有的另一實施方案中，可以對廣泛的多種侵入抑制劑的敏感性進行測定。這些抑制劑包括但不限于表4(抗-HIV藥物表)中列舉的藥物和化合物。
在第二個實施方案中，證實了對屬于4-(哌啶-1-基)丁烷類化合物Dorn C.D等2001，F(xiàn)inke P.E.等2001；Merck，west Point.PA)的CCR5抑制劑的敏感性。在不存在CCR5抑制劑時，以及存在CCR5抑制劑寬濃度范圍(X-軸，log10分度)時，感染表達CD4和CCR5(R5細胞)的靶細胞(U87/CD4/CCR5)。通過將存在CCR5抑制劑進感染細胞中產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量與不存在CCR5抑制劑時產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量相比較，確定了對病毒復制的百分數(shù)抑制作用(Y-軸)。對R5向性(JRCSF)，X4向性(NL4-3)和雙向性的(92HT593.1)病毒進行了測定。通過確定抑制病毒復制作用50％所需要的CCR5抑制劑的濃度來定量測定藥物敏感性(IC50，如圖8中縱虛線所顯示的)。與具有較高IC50值的病毒相比，具有較低IC50值的病毒對CCR5抑制劑比較敏感。X4向性病毒不感染U-87/CD4/CCR5靶細胞。
在第三個實施方案中，證實了對CXCR4抑制劑(AMD3100；AnorMED)的敏感性。在不存在CXCR4抑制劑時，以及存在CXCR4抑制劑寬濃度范圍時(X-軸，log10分度)時，感染表達CD4和靶細胞(U-87/CD4/CXCR4，)。通過將存在CXCR4抑制劑時感染細胞中產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量與不存在CXCR4抑制劑時產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量相比較，確定了對病毒復制的百分抑制作用(y軸)。對R5向性的(JRCSF)，X4向性的(NL4-3)和雙向性的(92HT593.1)的病毒進行了測定。通過確定抑制病毒復制作用50％所需的CXCR4抑制劑的濃度來定量測定藥物敏感性(IC50，如圖9中縱虛線所顯示出)。與具有較高IC50值的病毒相比，具有較低IC50值的病毒對CXCR4抑制劑比較敏感。
還可以測定對CD4抑制劑(例如鼠單克隆抗體5A8，Tamox，Houston.TX)的敏感性?？稍诓淮嬖贑D4抑制藥物時，以及存在CD4抑制藥物寬濃度范圍時(X-軸，log10分度)，感染表達CD4和一個或二個共受體的靶細胞(例如HT4/CCR5/CXCR4，U-87/CD4/CXCR4，或U-87/CD4/CCR5)。通過將存在CD4抑制劑時感染細胞中產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量與不存在CD4抑制劑時產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量相比較，可以確定對病毒復制的百分抑制作用(y軸)?？梢詫5向性的(例如JRCSF)，X4向性的(例如NL4-3)和雙向性的(例如92HT593.1)病毒進行了測定。通過確定抑制病毒復制作用50％所需的CD4抑制劑的濃度(IC50)，可以定量測定藥物敏感性。與具有較高IC50值的病毒相比，具有較低IC50值的病毒對CD4抑制劑比較敏感。
實施例2發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化和鑒定新型和新穎的病毒侵入抑制劑在一個實施方案中，本發(fā)明的病毒侵入分析法可被用于鑒別抑制病毒侵入的新型化合物/化學物質(zhì)。可以在存在大化學文庫(高效率篩選的，HTS)中的某一成員時，感染表達CD4和一個或二個共受體的靶細胞(例如HT4/CCR5/CXCR4，U-87/CD4/CXCR4，或U-37/CD4/CCR5)。通過將存在特定化合物時被感染靶細胞中產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量與不存在此化合物時產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量相比較，可以確定化合物抑制病毒復制(“擊中”)的能力。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明的病毒侵入分析法可被用于優(yōu)化通過HTS鑒別的導向性化合物的抗病毒活性?？梢詼y定被化學修飾的導向性化合物的衍生物，以便發(fā)現(xiàn)具有病毒侵入抑制活性增強的特定衍生物?？稍跊]有候選抑制劑存在時，以及存在候選抑制劑的寬濃度范圍(X-軸log10分度)時，感染表達CD4和一個或二個共受體的靶細胞(例如HT4/CCR5/CXCR4，U-87/CD4/CXCR4，或U-87/CD4/CCR5)。通過將存在候選抑制劑時的感染細胞中產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量與不存在候選抑制劑時產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量相比較，可以確定對病毒復制的百分數(shù)抑制作用(y-軸)。通過確定抑制病毒復制作用50％所需的候選抑制劑濃度(IC50)，可定量測定藥物敏感性。與具有較高IC50值的衍生物相比，具有較低IC50值的衍生化合物是比較有效的病毒侵入抑制劑(具有比較高的抗病毒活性)。
還有另一實施方案中，本發(fā)明的病毒侵入分析法可以被用于鑒定候選的新型病毒侵入抑制藥物的作用機制，以及對抗可能具有不同敏感性的各種病毒的抗病毒活性?？梢栽跊]有候選的新型侵入抑制藥物存在時，以及存在侵入抑制藥物的寬濃度范圍時(X-軸log10分度)，感染表達CD4和一個或二個共受體的靶細胞(例如HT4/CCR5/CXCR4，U-87/CD4/CXCR4，或U-87/CD4/CCR5)。通過將存在新型侵入抑制劑時感染細胞中產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量與不存在新型侵入抑制劑時產(chǎn)生的螢光素酶數(shù)量相比較，可以確定對病毒復制的百分數(shù)抑制作用(y軸)。R5向性(例如JRCSF)，X4向性(例如NL4-3)和雙向性的(例如92HT593.1)病毒都可以被測定。通過確定抑制病毒復制作用50％所需的新型侵入抑制劑濃度(IC50)，可以定量測定藥物敏感性。
為了確定此新型侵入抑制劑是否通過阻斷CCR5或CSCR4共受體而起作用，以U-87/CD4/CCR5細胞對此新型抑制劑測試R5向性病毒，用U-87/CD4/CXCR4細胞對此新型抑制劑測試X4向性病毒。對R5病毒感染的抑制作用指示CCR5共受體拮抗作用，而相反地，對X4病毒感染的抑制作用指示CXCR4共受體拮抗作用，對R5和X4病毒感染的抑制作用可能指示CD4拮抗作用，或者是對膜融合的抑制作用。
為了鑒定新型抑制劑對抗某一類病毒的活性，這類病毒表現(xiàn)出對其它相同種類式不同種類的病毒侵入抑制劑具有抗性，或者具有敏感性降低，可以使用此新型侵入抑制藥物，以本發(fā)明的病毒侵入分析法測試從藥物抗性病毒名單中選取的病毒。選取的病毒可包括對CCR5抑制劑，CXCR4抑制劑，CD4抑制劑或膜融合抑制劑具有不同敏感性水平的病毒。選取的病毒還可包括具有一個或幾個特異性突變的病毒，這些突變與對于一種或幾種侵入抑制劑敏感性降低成具有抗性有關(guān)。
實施例3鑒別導致改變對病毒侵入抑制劑敏感性的被膜氨基酸取代/突變本實施例提供了一種方式和方法，用于鑒別HIV-1被膜中賦予對病毒侵入抑制劑敏感性降低/抗性的突變。本實施例還提供了一種方式和方法，用于定量測定特異性被膜突變賦予的對侵入抑制劑敏感性降低的程度。
以本發(fā)明的侵入分析法測定了來源于病人樣品的被膜序列，或來源于病人樣品的單一克隆，或通過定位誘變工程構(gòu)建含有特定突變的被膜序列，以便根據(jù)明確鑒定的參照標準(例如NL4-3，HXB2)定量測定藥物敏感性。
在一個實施方案中，對于演變中的病人樣品(從相同病人在不同時間點收集的病毒)測定了其敏感性。例如，在治療開始之前，在改變藥物治療之前或之后，或者在疾病進程的病毒學(RNA拷貝數(shù))，免疫學(CD4 T-細胞)，或臨床(機遇性感染)標志改變之前或之后，測定對侵入抑制劑的敏感性。
對病人HIV樣品的基因型分析可以借助于任何一種廣泛可利用的DNA序列法，分析代表病人樣品集合體的被膜序列，或者來源于病人集合體的克隆。在本發(fā)明的一個實施方案中，應用病毒RNA純化法，RT/PCR和二脫氧核苷酸鏈末端化學測序以及毛細管凝膠電泳技術(shù)(應用生物系統(tǒng)，F(xiàn)oster City，CA)，確定了病人樣品的HIV序列。將病人病毒集合體或克隆的被膜序列與參照序列，其它病人的樣品相比較或者如果可能與開始治療之前從相同病人獲得的樣品相比較。測定此基因型的序列，此序列可能不同于參照序列或治療前的序列，并且與侵入抑制劑敏感性改變有關(guān)。定位突變體的侵入抑制劑敏感性通過構(gòu)建一種被膜表達載體(pHIVenv)，對于與適應性改變相關(guān)的基因型改變進行了檢測，此表達載體在規(guī)定的，藥物敏感性基因背景上(例如NL4-3參照株)包含特定的突變。突變可以被單獨摻入，和/或以同其它被認為將調(diào)節(jié)侵入抑制劑敏感性的突變組合的形式被摻入。應用任何一種廣泛可利用的定位誘變法，將被膜突變導入pHIVenv載體中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，為了定位誘變使用了mega引物PCR法(Sarkar G.和Summer.S.S 1990)。應用實施例1中所述的病毒侵入分析法，對含有特異性被膜突變或突變組和PHIVenv載體進行了測定。將含有被膜突變病毒的藥物敏感性與遺傳確定的藥物敏感性病毒的藥物敏感性相比較，此敏感性病毒缺少被測試中的特異性突變。侵入抑制劑敏感性的明顯改變可歸因于被導入PHIVenv載體中的特異性突變。
在本發(fā)明的一個實施方案中，證明對融合抑制劑T-20的敏感性降低，是由gp41被膜蛋白中特異性藥物抗性突變引起的(圖7)。在不存在T-20時，以及存在T-20寬濃度范圍時(X-軸，log10分度)，感染表達CD4，CCR5和CXCR4的細胞。通過將存在T-20時感染細胞產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量與不存在T-20時產(chǎn)生的熒光素酶數(shù)量相比較，確定了對病毒復制的百分數(shù)抑制作用(Y-軸)。測試了其gp41跨膜被膜蛋白中含有一個或二個特異性突變的等基因病毒(在圖例中發(fā)紅光的)Rimsky等；J.Viyol.72986-993)。通過確定抑制病毒復制作用50％所需要的T-20濃度(IC50，以縱虛線所顯示的)對藥物敏感性作定量測定。與具有較高IC50值的病毒相比具有較低IC50值的病毒對T-20比較敏感。
在一個實施方案中，藥物抗性突變被導入被明確鑒定的X4向性(NL4-3)和R5向性(JRCSF)的病毒中。應用本發(fā)明的病毒侵入分析法測定3了T-20敏感性(圖7)。通過以HIV-1 HXB2株的IC50除待測病毒的IC50，對每種病毒確定了其T-20敏感性改變倍數(shù)(FC)。在科技文獻中對類似突變型病毒的T-20敏感性已有報導(Rimaky等)。在本實施方案中，與野生型病毒(GIV)相比，在gp41的GIV基元序列中(DIV，GIM，SIV)帶有一個突變的病毒對T-20敏感性比較低。與GIV基元序列中帶有一個突變或不帶有突變的病毒相比，在GIV基元序列中(DIM，SIM，DTV)帶有二個突變的病毒對T-20敏感性比較低。
在另一實施方案中，通過對敏感性和抗性病毒的被膜基因進行測序，鑒別了可能賦予對侵入抑制劑敏感性降低(或提高)的突變。將對敏感性病毒和抗性病毒推論的氨基酸序列進行比較，以便發(fā)現(xiàn)侯選的藥物抗性突變。通過將這種突變導入藥物敏感性病毒，并且以本發(fā)明的病毒侵入分析法測定此突變病毒的敏感性，此特定突變致使藥物敏感性改變的能力可被證實或被否定。在此所述的實施例中，對于表現(xiàn)出不同的T-20敏感性的病毒將其HIV-1 gp41跨膜被膜蛋白的第一組七個重復序列(HR-1)中的一小段氨基酸序列排列成一線。最顯著的氨基酸表示已知引起對T-20敏感性降低的突變。
類似的表型和基因型分析可被用于鑒別具有如下功能的被膜氨基酸序列(a)改變/影響對CCR5或CXCR4抑制劑的敏感性，(b)規(guī)定X4，R5和雙向，以及(c)誘發(fā)中和抗體。
在一個實施方案中，證實了由特定的氨基酸序列/突變引起的對共受體(CCR5，CXCR4)抑制劑敏感性降低。
在另一實施方案中，證實了由特定的氨基酸序列/突變引起的對受體(CD4)抑制劑敏感性降低。
實施例4確定HIV-1的共受體和受體向性本實施例提供了用于確定HIV-1的共受體向性的方式和方法。本實施例還提供了用于確定HIV-1的受體向性的方式和方法。
在一個實施方案中，鑒別了利用CCR5共受體的病毒。在相關(guān)的實施方案中，鑒別了利用CXCR4共受體的病毒。在另一相關(guān)的實施方案中，鑒別了利用CCR5和CXCR4的病毒。在另一相關(guān)的實施方案中，鑒別了利用共受體而不是CCR5或CXCR4的病毒。
在另一實施方案中，鑒別了利用CD4受體的病毒。在相關(guān)的實施方案中，鑒別了利用CD8的病毒。在另一相關(guān)的實施方案中，鑒別了不需要CD4或CD8感染細胞的病毒。
在本實施方案中，使用了二戶細胞系實施本分析法。一個細胞系表達CD4加CCR5(U87/CD4/CCR4)，在本申請中也被稱為R5細胞。另一細胞系表達CD4和CXCR4(U87/CD4/CCR5)，在本申請中也被稱為X4細胞。通過用重組病毒原種感染單一的細胞培物來進行本發(fā)明的病毒侵入分析法，此重組病毒原種來源于用pHIVenv和pHIVlnc或pHIVlncΔU3載體轉(zhuǎn)染的細胞。pHIVenv載體包含病人病毒來源的序列，并表達HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在本實施方案中，使用在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的R5和X4靶細胞對病毒進行測定(圖3A)。一般情況下，是在感染之前1天平板接種R5和X4細胞。在下列情況下實施以每種病毒原種感染細胞。不存在藥物(沒有任何藥)時，存在抑制濃度優(yōu)先抑制R5向性病毒的藥物(CCR5抑制劑，如哌啶乙烷化合物)時，以及存在抑制濃度的優(yōu)先抑制X4向性病毒的藥物(CXCR4抑制劑，如AMD3100)時。通過比較在存在和不存在藥物時，每種細胞類型中產(chǎn)生的螢光素酶活性數(shù)量來確定共受體向性。在此實施方案中，是通過比較每種病毒優(yōu)先感染(產(chǎn)生螢光素酶活性)R5細胞或X4細胞的能力，或者如果病毒是雙向性則是感染X4和R5的能力，來說明此分析法的結(jié)果。還測定了CCR5或CXCR4抑制劑特異性阻斷感染(抑制螢光素酶活性)的能力(圖3B)。在此實施方案中，X4向性病毒感染X4細胞，但不感染R5細胞，并且對X4細胞的感染作用可被CXCR4抑制劑(AMD3100)阻斷。在此實施方案中，R5向性病毒感染R5細胞，但不感染X4細胞，并且對R5細胞的感染作用可被CCR5抑制劑是(哌啶-1基丁烷化合物)阻斷。在此實施方案中，雙向性或X4和R5混合向性病毒感染X4細胞和R5細胞，并且對R5細胞的感染可被CCR5抑制劑阻斷，對X4細胞的感染可被CXCR4抑制劑阻斷。在此實施方案中，無存活力的病毒在X4細胞或者在R5細胞中都不能復制(不產(chǎn)生螢光素酶活性)。
在另一實施方案中，使用3個或更多的細胞系實施本分析法。-3細胞系表達CD4加CCR5(U87/CD4/CCR5)，在本申請中也被稱為R5細胞。另一細胞系表達CD4和CXCR4(U87/CD4/CCR4)，在本申請中也被稱為X4細胞。附加的細胞系表達CD4加其它候選的HIV-1共受體，包括但不限于BONID，BOB等，見表1。這些附加的細胞系表達其它的侯選共受體，但不表達CCR5或CXCR4。通過用重組病毒原種感染單一的細胞培養(yǎng)物來進行本發(fā)明的病毒侵入分析法，此重組病毒原種來源于用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3載體的轉(zhuǎn)染的細胞。pHIVenv載體含有病人病毒來源的序列，并表達HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在此實施方案中，使用在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細胞對病毒進行測定，對R5細胞，X4細胞，以及表達CD4加候選共受體的細胞系以每種病毒原種實施感染。通過比較每種細胞類型中產(chǎn)生的螢光素酶活性數(shù)量來確定共受體向性。在此實施方案中，是通過比較每種病毒優(yōu)先感染(產(chǎn)生螢光素酶活性)R5細胞或X4細胞的能力，或者感染表達候選共受體的細胞系的能力來說明分析試驗的的結(jié)果，在此實施方案中，X4向性病毒感染X4細胞但不感染R5細胞。在此實施方案中，R5向性病毒感染R5細胞但不感染X4細胞。在此實施方案中，雙向性或X4和R5向性混合病毒既感染X4細胞又感染R5細胞。在此實施方案中，對表達另外候選共受體(不是CCR5或CXCR4)的細胞系的感染，歸因于對另一共受體的向性。在此實施方案中，無活力的病毒在X4或R5細胞中不能復制。
在另一實施方案中，使用了四種細胞系進行分析試驗，第一種細胞系表達CD4加CCR5(U87/CD4/CCR5)在本申請中也被稱為R5細胞，第二種細胞系表達CD4和CXCR4(U87/CD4/CCR4)，在本申請中也被稱為X4細胞。第三種細胞系表達CD8加CCR5(U87/CD8/CCR5)，在本申請也被稱為CD8/R5細胞。第四種細胞系表達CD8 goCXCR4(U87/CD8/CCR4)，在本申請中也被稱為CD8/X4。通過以重組病毒原種感染單一的細胞培養(yǎng)出來實施病毒侵入分析，此重組病毒原種是來自用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3載體的轉(zhuǎn)化的細胞。pHIVenv載體包含病人病毒來源的序列，表達HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在此實施方案中，使用在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細胞對病毒進行測定。用每種病毒原種對R5細胞，X4細胞，CD8/R5細胞和CD8/X4細胞實施感染。通過比較每種細胞類型中產(chǎn)生的螢光素酶活性數(shù)量來確定共受體向性。在此實施方案中，是通過比較每種病毒優(yōu)先感染(產(chǎn)生螢光素酶活性)R5細胞，X4細胞，CD8/R5細胞，或CD8/X4細胞的能力來說明分析試驗的的結(jié)果，在此實施方案中，CD4向性病毒感染X4細胞和/或R5細胞。在此實施方案中，CD8向性病毒感染CD8/R5細胞和/或CD8/X4細胞。在此實施方案中，雙向性(CD4和CD8受體利用)病毒感染X4細胞和/或R5細胞加CD8/X4。和/或CD8/R5細胞。在此實施方案中，感染表達CD8的細胞素而不感染表達CD4的細胞系被歸因于CD8受體向性。在此實施方案中，無活力的病毒在X4細胞或R5細胞中都不能復制。
在進一步的相關(guān)實施方案中，使用二種細胞系進行分析試驗。第一個細胞系表達CD4加CCR5和CXCR4(HT4/CCR5/CXCR4)。第二種細胞系表達CD8加CCR5和CXCR4(HOS/CD8/CCR5/CXCR4)。通過用重組病毒原種感染單一的細胞培養(yǎng)物來實施病毒侵入分析試驗，此重組病毒原種是來源于用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3載體轉(zhuǎn)染的細胞。pHIVenv載體包含病人病毒來源的序列，表達HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在此實施方案中，使用在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細胞對病毒進行測定。用每種病毒原種對HT4/CCR5/CXCR4細胞和HOS/CD8/CCR5/CXCR4細胞實施轉(zhuǎn)染。通過比較每種細胞類型中產(chǎn)生的螢光素酶活性數(shù)量來確定共受體向性。在此實施方案中，是通過比較每種病毒優(yōu)先感染(產(chǎn)生螢光素酶活性)HT4/CCR5/CXCR4細胞或HOS/CD8/CCR5/CXCR4細胞的能力來說明分析試驗結(jié)果。在此實施方案中，CD4向性病毒感染HT4/CCR5/CXCR4細胞，但不感染HOS/CD8/CCR5/CXCR4細胞。在此實施方案中，CD8向性病毒感染HOS/CD8/CCR5/CXCR4細胞，但不感染HT4/CCR5/CXCR4細胞。在此實施方案中，雙向性(CD4和CD8受體利用)病毒既感染HT4/CCR5/CXCR4細胞，又感染HOS/CD8/CCR5/CXCR細胞。在此實施方案中，感染表達CD8的細胞系但不感染表達CD4的細胞系，被歸因于CD8受體的向性。在此實施方案中，無活力的病毒在X4和R5細胞中都不能復制。
在另一實施方案中，使用二種細胞系進行分析試驗。第一種細胞系表達CD4加CCR5和CXCR4(HT4/CCR5/CXCR4)，第二種細胞系表達CCR5和CXCR4但不表達CD4或CD8產(chǎn)(HOS/CCR5/CXCR4)。通過用重組病毒原種感染第一細胞培養(yǎng)物來實施病毒侵入分析試驗，此重組病毒原種來源于用在pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucΔU3載體轉(zhuǎn)染的細胞。pHIVenv載體包含病人病毒來源的序列，表達HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41 TM)。在此實施方案中，使用在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細胞對病毒進行測定。用每種病毒原種對HT4/CCR5/CXCR4細胞和HOS/CCR5/CXCR4細胞實施感染。通過比較每種細胞類型中產(chǎn)生的螢光素酶活性數(shù)量來確定CD4和CD8無關(guān)性感染。在此實施方案中，是通過比較每種病毒優(yōu)先感染(產(chǎn)生螢光素酶活性)HT4/CCR5/CXCR4細胞或HOS/CCR5/CXCR4細胞的能力來說明分析試驗結(jié)果。在此實施方案中，CD4依賴性病毒感染HT4/CCR5/CXCR4細胞，但是不感染HOS/CCR5/CXCR4細胞。在此實施方案中，CD4無關(guān)的病毒感染HOS/CCR5/CXCR4細胞，又感染HT4/CCR5/CXCR4細胞。在此實施方案中，對缺乏CD4表達細胞系的感染被歸因于CD4無關(guān)性感染，在此實施方案中，無活力的病毒在X4和R5細胞中都不能復制。
實施例5鑒別導致共受體和變體向性改變的HIV-1被膜氨基酸取代/突變本實施例提供了一種方式和方法，用于鑒別確定或改變共受體向性(X4對R5對雙X4/R5)的HIV-1被膜氨基酸序列。此實施例還提供了一種方式和方法，用于鑒別確定除CXCR4或CCR5之外的共受體利用的HIV-1被膜氨基酸序列。本實施例還提供了一種方式和方法，用于鑒別確定變體向性(CD4對CD8)的HIV-1被膜序列。
以本發(fā)明的侵入分析法測定了來源于病人樣品的被膜序列，或來源于病人樣品的單一克隆，或通過定位誘變工程構(gòu)建含有特定突變的被膜序列，以便如在實施例4中所述確定共受體向性。
在一個實施方案中，對于演變中的病人樣品(從相同病人在不同時間點收集的病毒)測定了其共受體向性。例如，在治療開始之前，在改變藥物治療之前或之后，或者在疾病進程的病毒學(RNA拷貝數(shù))，免疫學(CD4 T-細胞)，或臨床(機遇性感染)標志改變之前或之后，測定共受體向性。
在另一實施方案中，對于從大量不同病人收集的樣品測定了其共受體向性。在進一步的實施方案中，對于從代表不同病毒和病人群的大量病人收集的樣品，測定了其共受體向性。這種病人群可能包括但不限于新感染的病人，慢性感染病人，處于疾病發(fā)展的病人，以及正接受抗病毒治療或免疫治療的病人。這種病毒群可能包括但不限于具有不同遺傳特征的病毒(分化體A，B，C，D，E，F(xiàn)，G)，對抗病毒藥物敏感的病毒，具有對于抗病毒藥物敏感性/抗性降低的病毒。對病人HIV樣品的基因型分析可以借助于任何一種廣泛可利用的DNA測序法，分析代表病人樣品集合體的被膜序列，或者來源于病人集合體的克隆。在本發(fā)明的一個實施方案中，應用病毒RNA純化法，RT/PCR和二脫氧核苷酸鏈末端化學測序，以及毛細管凝膠電泳技術(shù)(應用的生物系統(tǒng)，F(xiàn)osterCity.CA)，確定了病人樣品的HIV序列。將病人病毒集合體或克隆的被膜序列與參照序列，其它病人的樣品相比較，或者如果有可能與開始治療之前從相同病人獲得的樣品相比較。確定此基因型的序列，此序列不同于參照序列或治療前的序列，并且與侵入抑制敏感性改變有關(guān)。
遺傳特征性病毒的共受體和受體向性通過構(gòu)建被膜表達載體(pHIVenv)，對于與共受體向性相關(guān)的被膜氨基酸序列進行了測定，此表達載體在規(guī)定的基因背景上(例如NL4-3對應X4向性，JRCSF對應R5向性)包含特定的突變。突變可以被單獨摻入，和/或以同其它被認為將調(diào)節(jié)共受體利用的突變組合的形式被摻入。應用任何一種廣泛可利用的定位誘變法，將被膜突變導入pHIVenv載體中。在本發(fā)明的一個實施方案中，為了定位誘變使用了mega-引物PCR法(Sarkar Q，和Summer S.S.1990)。應用實施例1中所述的病毒侵入分析法，對含有特異性被膜突變或突變組的pHIVenv載體進行了測定。將含有被膜突變病毒的共受體向性與遺傳確定的病毒的共受體向性相比較，此后者病毒缺少被測試中的特異性突變。通過將此突變導入明確鑒定的參照病毒，并以實施例4中所述的病毒侵入分析法測定此突變型病毒的共受體向性，此特定突變致使共受體向性改變的能力可被證實或被否定。明顯的共受體向性改變被歸因于導入pHIVenv載體中的特定突變。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過測定gp120表面被膜蛋白V3環(huán)內(nèi)的氨基酸序列，鑒別了R5向性的遺傳決定簇。通過比較大量X4向性病毒和R5向性病毒的氨基酸序列，對所測定的氨基酸序列進行鑒別。選擇在X4與R5病毒之間的穩(wěn)定差異進行測定。通過定位誘變構(gòu)建了以明確鑒定的X4親本克隆(如NL4-3，HXB2)為基礎(chǔ)的等基因病毒，并如實施例4中所述測定其共受體向性，此X4親本克隆在其gp120被膜蛋白的V3環(huán)中含有特異性“R5候選”突變。在不存在R5抑制劑(哌啶-1基乙烷化合物)和X4抑制劑(AMD3100)時，以及存在抑制濃度的R5和X4藥物時，感染表達CD4加CCR5(如U-87/CD4/CCR5)或表達CD4加CXCR4(U-87/CD4/CCR4)的細胞。使X4向性病毒改變成R5向性病毒的氨基酸取代鑒定為R5向性的遺傳決定簇。
在本發(fā)明的相關(guān)實施方案中，是通過測定gp120表面被膜蛋白V3環(huán)內(nèi)的氨基酸序列，鑒別X4向性遺傳決定簇。通過比較大量X4向性病毒和R5向性病毒的氨基酸序列，對所測定的氨基酸序列進行鑒別。選擇X4與R5病毒之間的穩(wěn)定差異進行測定。通過定位誘變構(gòu)建了以明確鑒定的R5親本克隆(如JRCSF)為基礎(chǔ)的等基因病毒，并如實施例4中所述測定其共受體向性，此R5親本克隆在其gp120被膜蛋白的V3環(huán)中含有特異性“X4候選”突變。在不存在R5抑制劑(哌啶-1基乙烷化合物)和X4抑制劑(AMD3100)時，以及存在抑制濃度的R5和X4藥物時，感染表達CD4加CCR5(如U-87/CD4/CCR5)或表達CD4加CXCR4(U-87/CD4/CCR4)的細胞。使R5向性病毒改變成X4向性病毒的氨基酸取代鑒定為X4向性的遺傳決定簇。
在本發(fā)明相關(guān)的實施方案中，是通過測定整個gp120表面膜蛋白中的氨基酸序列，鑒別X4或R5向性的遺傳決定簇。
在本發(fā)明相關(guān)的實施方案中，是通過測定gp41跨膜被膜蛋白中的氨基酸序列，鑒別X4或R5向性的遺傳決定簇。
在本發(fā)明相關(guān)的實施方案中，是通過測定gp120表面被膜蛋白V3環(huán)內(nèi)的氨基酸序列，鑒定規(guī)定利用除CCR5和CXCR4之外的共受體的遺傳決定簇。通過比較病毒的氨基酸序列對所測定的氨基酸序列進行了鑒別，這種病毒在不表達CXCR4或CCR5，但表達其它候選共受體的細胞內(nèi)能夠復制。選擇在這些非-X4，非-R5病毒與X4和R5病毒之間，氨基酸序列的穩(wěn)定差別進行測定。通過定位誘變構(gòu)建了以明確鑒定的X4(如NL4-3)或R5(如JRCSF)親本克隆為基礎(chǔ)的等基因病毒，并且如實施例4中所述測定其共受體向性，這種X4或R5親本克隆在其gp120被膜蛋白的V3環(huán)中含有特異性“非-X4，非-R5候選”突變。在不存在R5抑制劑(哌啶-1基乙烷化合物)和X4抑制劑(AMD3100)時，以及存在抑制濃度的R5和X4藥物時，感染表達CD4加CCR5的(如U-87/CD4/CCR5)，表達CD4加CXCR4的(U-87/CD4/CCR4)和表達CD4加其它候選共受體的(U87/CD4/X)細胞。賦予對非-X4，非-R5共受體向性的氨基酸取代鑒定為對特定共受體向性的遺傳決定簇。
在本發(fā)明相關(guān)的實施方案中，通過測定整個gp120表面被膜蛋白中的氨基酸序列，鑒別了對其它共受體向性的遺傳決定簇。
在本發(fā)明相關(guān)的實施方案中，通過測定gp41跨膜被膜蛋白中的氨基酸序列，鑒別了對其它共受體向性的遺傳決定簇。
在本發(fā)明的另一實施方案中，通過測定gp120表面被膜蛋白V3環(huán)內(nèi)的氨基酸序列，鑒別了規(guī)定HIV-1利用CD8(除此之外還有CD4，或者代替CD4)作為受體的遺傳決定簇。通過比較病毒的氨基酸序列對所測定的氨基酸序列進行鑒別，這種病毒在不表達CD4但表達CD8的細胞內(nèi)能夠復制。選擇在這些CD4向性病毒與CD8向性病毒之間，氨基酸序列的穩(wěn)定差異進行測定。通過定位誘變構(gòu)建3以明確鑒定的CD4向性(如NL4-3，JRCSF)親本克隆為基礎(chǔ)的等基因病毒，并且如實施例4中所述測定其CD8受體向性，這種CD4向性親本克隆在其gp120被膜蛋白的V3環(huán)中含有特異性“CD8候選”突變。感染表達CD4加CCR5(如U-87/CD4/CCR5)，CD4加CXCR4(U-87/CD4/CCR4)，CD8加CCR5(如U-87/CD8/CCR5)，CD8加CXCR4(U-87/CD8/CCR4)的細胞。使之能夠在表達CD8但不表達CD4的細胞內(nèi)復制的氨基酸取代被鑒定為CD8向性的遺傳決定簇。
在本發(fā)明相關(guān)的實施方案中，通過測定整個gp120表面被膜蛋白內(nèi)的氨基酸序列，鑒別了CD8向性的遺傳決定簇。
在本發(fā)明相關(guān)的實施方案中，通過測定gp41跨膜被膜蛋白內(nèi)的氨基酸序列，鑒別了CD8向性的遺傳決定簇。
實施例6測定HIV-1抗體的中和作用本實施例提供了一種方式和方法，用于測定對HIV-1的抗體介導的中和作用，在本申請中也被稱為病毒中和作用。本實施例還提供了一種方式和方法，用于測定HIV-1感染的病人體內(nèi)抗體的病毒中和作用活性。本實施例還提供了一種方式和方法，用于測定以治療性疫苗和候選疫苗接種的個人或動物體內(nèi)抗體的病毒中和活性。本實施例還提供了一種方式和方法，用于測定以保護性(預防性)疫苗和候選疫苗接種的個人或動物體內(nèi)抗體的病毒中和活性。
本實施例還提供了一種方式和方法，用于測定特異性單克隆或多克隆抗體的病毒中和活性，或者制備這種抗體。
為了評價抗體介導的中和作用，以本發(fā)明的侵入分析法測試了來源于病人樣品的被膜序列，或來源于病人樣品的單一克隆，或通過定位誘變而包含特定突變的工程構(gòu)建的被膜序列。
在一個實施方案中，對演變的病人樣品(從相同病人在不同時間點采集此病毒)的抗體介導的中和作用進行了評價。例如，在疫苗接種之前，在疫苗接種的過程中，以及在疫苗接種過程完成之后逐步增加的時間點檢測病毒中和作用。在相關(guān)的實施方案中，在以侯選疫苗接種之前，在重復接種的過程中，以及在接種過程完成之后逐步增加的時間點，對動物的血清進行檢測，所用動物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豬和牛。在一個實施方案中，對預防性疫苗和候選疫苗檢測其病毒中和作用。在另一實施方案中，對治療性疫苗檢測了其病毒中和作用。
在另一實施方案中，對從大量不同的病人收集的樣品檢測其病毒中和作用。在進一步的實施方案中，對從大量代表不同病人群和不同病毒群的病人收集的樣品檢測其病毒中和作用?！安∪巳骸笨砂ǖ幌抻?，新感染的病人。慢性感染病人，具有病情加深的HIV/AIDS病人。具有病情快速發(fā)展的病人，具有病情緩慢發(fā)展的病人(一般被稱為長期無進展性病人)，正在接受抗病毒治療或免疫治療(如白介素-2或其它細胞因子)的病人，疫苗接種的和未疫苗接種的個體?！安《救骸卑ǖ幌抻?，具有不同遺傳特征和地區(qū)來源的病毒(分化體A、B、D、E、F、G)，對于抗病毒藥物敏感性的病毒，對于抗病毒藥物具有敏感性降低和抗性的病毒，初始分離物，適合于在培養(yǎng)的細胞中生長的分離物(通常被稱為實驗室適應病毒)，含胞體誘導(SI)病毒，非含胞體誘導(NSI)病毒，巨噬細胞(M)向性病毒，T-細胞(T)向性病毒和雙向性(M和T)病毒。
對病人抗體的鑒定(病人抗體對標準病毒成員)在本實施方案中，使用表達HIV-1受體CD4-加HIV-1共受體CCR5和CXCR4的靶細胞系(HT4/CCR5/CXCR4)進行分析試驗，這種細胞系能夠既對R5向性病毒又對X4向性病毒檢測抗體的中和活性。在相關(guān)的實施方案中，使用了二種靶細胞系進行分析試驗，一種細胞系表達CD4加CCR5(U-87/CD4/CCR5)，被用于測試R5向性病毒。另一細胞系表達CD4加CXCR4(U-82/CD4/CXCR4)，被用于測試X4向性病毒。通過以重組病毒原種感染單一的靶細胞培養(yǎng)物進行病毒侵入分析試驗，此病毒原種來源于用PHIVenv和PHIVlme或PHIVlmcΔU3載體轉(zhuǎn)染的包裝宿主細胞。在此實施方案中，PHIVenv載體包含確明鑒定的特定病毒的被膜序列，表達HIV-1被膜蛋白(gp120 SU，gp41TM)。這類病毒代表“標準的病毒成員”(見上面病毒群的敘述)，某些，但不是全部可能構(gòu)成標準成員組的適當病毒的例子被列舉在表4中，使用標準病毒成員是為了比較從許多不同的病人和/或動物(見上面病人群的敘述)得到的血清中和抗體活性。在本實施方案中，是使用在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的靶細胞對病毒進行測定。通常是在感染前一天平板接靶細胞。對于HT4/CCR3/CXCR4接種5000個細胞/孔，或者對于U-87/CD4/CCR5和U-87/CD4/CXCR4接種10000個細胞/孔。在感染靶細胞之前，將各種病毒原種與被檢測的血清或抗體制備物予先共溫育(一般是1小時)。對不稀釋的和以逐步增加稀釋度(通常是4-5個連續(xù)的10倍稀釋)的血清或抗體制備物進行測試。也在不存在抗體(無抗體)時以各種病毒原種感染靶細胞。通過比較存在和不存在抗體時靶細胞內(nèi)產(chǎn)生的熒光素酶活性數(shù)量來測定病毒中和作用。在本實施方案中，是通過比較各種抗體優(yōu)先阻止靶細胞感染的能力(降低或消除熒光素酶活性)來說明分析試驗的結(jié)果?？赏ㄟ^記錄能夠阻止靶細胞感染的最高抗體稀釋度(最大稀釋度)來定量病毒中和作用的活性(例如能夠降低不存在抗體時所產(chǎn)生的熒光素酶活性50％的最高稀釋度)。
對病人HIV-1的鑒定(病人病毒對標準抗體成員)本實施方案中，使用表達HIV-1受體CD4加HIV-1共受體CCR5和CXCR4的靶細胞系(HT4/CCR5/CXCR4)進行分析試驗。這種細胞系能夠即對R5向性病毒又對X4向性病毒檢測抗體的中和活性。在相關(guān)的實施方案中，使用了二種靶細胞系進行分析試驗，一種細胞系表達CD4和CCR5(U-87/CD4/CCR5)，被用于測試R5向性病毒。另一細胞系表達CD4加CXCR4(U-87/CD4/CXCR4)，被用于測試X4向性病毒。通過以重組病毒原種感染單一的靶細胞培養(yǎng)物進行病毒侵入分析試驗，此病毒原種來源于用PHIVenv和PHIVlwe或PHIVlucΔU3載體轉(zhuǎn)染的包裝宿主細胞。在此實施方案中PHIVenv載體包含病人病毒來源的被膜序列，表達HIV-1被膜蛋白(gp120 SU，gp41TM)，在此實施方案中，使用了來自不同病人群(見上面病人群的敘述)的病毒，和/或來自不同的病毒群(見上面病毒群的敘述)的病毒來構(gòu)建PHIVenv載體。以病毒侵入分析法測定來源于PHIVenv載體的擬型HIV，以便確定它們對明確鑒定的特異性抗體制物成員的中和作用是否敏感。這類抗體代表“標準抗體成員”。某些但不是全部可能構(gòu)成標準成員的適當抗體的例子被列舉在表4中。在本實施方案中，是使用在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的靶細胞對病毒中和作用進行測定。通常是在感染前一天平板接種靶細胞，對于HT4/CCR5/CXCR4接種5000個細胞/孔，或者對于U-87/CD4/CCR5和U-87/CD4/CXCR4接種10000個細胞/孔。在感染之前，將各種病人來源的病毒原種與標準抗體成員中的各種抗體制備物共同溫育(通常是1小時)。對不稀釋的和以不同稀釋度(通常是4-5個連續(xù)的10倍稀釋)的血清或抗體制備物進行測試。也在不存在抗體(無抗體)時以各種病毒原種感染靶細胞。通過比較在存在和不存在抗體時靶細胞內(nèi)產(chǎn)生的熒光素酶活性數(shù)量來測定病毒中和作用。在本實施方案中，是通過比較各種抗體優(yōu)先阻止靶細胞感染的能力(降低或消除熒光素酶活性)來說明分析試驗的結(jié)果?？赏ㄟ^記錄能夠阻止靶細胞感染的最高抗體稀釋度(最大稀釋度)來定量病毒中和作用的活性(例如能夠降低不存在抗體時所產(chǎn)生的熒光素酶活性50％的最高稀釋度)。
對病人HIV-1的鑒定(病人病毒對病人抗體)；本實施例提供了一種方法，用于檢測病人體內(nèi)中和抗體應答反應的形成，以及可逃避中和應答反應的瘤病株的形成。在本實施方案中，使用表達HIV-1受體CD4加HIV-1共受體CCR5和CXCR4的靶細胞系(U87/CD4/CCR5/CXCR4或HT4/CCR5/CXCR4)進行分析試驗。這種細胞系能夠即對R5又對X4向性的病毒檢測抗體的中和活性。在相關(guān)的實施方案中，使用了二種靶細胞系進行分析試驗，一種細胞系表達CD4加CCR5(U-87/CD4/CCR5)被用于測試R5向性病毒。另一種細胞系表達CD4加CXCR4(U-87/CD4/CXCR4)，被用于測試X4向性病毒。通過以重組病毒原種感染單一的靶細胞培養(yǎng)物進行病毒侵入分析試驗，此病毒原種來源于用PHIVenv和PHIVΔ或PHIVΔDU3載體轉(zhuǎn)染的包裝宿主細胞。在此實施方案中，PHIVenv載體包含病人病毒來源的被膜序列，表達HIV-1被膜蛋白(gp120SU，gp41TM)，在此實施方案中，使用了不同的病毒群來構(gòu)建PHIVenv載體。此不同的病毒群來源于連續(xù)的(即演變的)血漿標本(即從相同病人在不同時間點采集的病毒)。以病毒侵入分析法測定來源于PHIVenv載體的擬型HIV，以便確定它們對來源于病人連續(xù)血漿標本的抗體成員的中和作用是否敏感。因此，在本實施方案中，相同的病人既是病毒群的來源，又是抗體的來源。在此實施方案中，是使用在例如96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的靶細胞對病毒進行測定。通常對于靶細胞U-87/CD4/CCR5/CXCR4和U-87/CD4/CCR5和U-87/CD4/CXCR4細胞系以10000個細胞/孔作平板接種，或者對于HT4/CCR3/CXCR4細胞系5000個細胞/孔，作平板接種。在感染當天平板接種靶細胞。在感染靶細胞之前，將各種病毒原種與被測定的血清或抗體制備物共同預溫育(一般是1小時)。對不稀釋的和以逐步增加稀釋度(通常是4-5個連續(xù)的10倍稀釋)的血清或抗體制備物進行測試。也在不存在抗體(無抗體)時以各種病毒原種感染靶細胞。通過比較存在和不存在抗體時靶細胞產(chǎn)生的熒光素酶活性數(shù)量來測定病毒中和作用。在本實施方案中，是通過比較來源于病人不同時間點的抗體，優(yōu)先阻止來源于病人不同時間點的擬型病毒感染靶細胞的能力(降低或消除熒光素酶活性)來說明分析試驗的結(jié)果?？赏ㄟ^記錄能夠阻止靶細胞感染的最高抗體稀釋度(最大稀釋度)來定量病毒中和作用的活性(例如能夠降低不存在抗體時所產(chǎn)生的熒光素酶活性50％的最高稀釋度)。因此，本實施方案使研究人員能夠分析病人體內(nèi)不同免疫學特性的HIV株和中和抗體應答反應的隨時間共同發(fā)展進程。
本方法被用于一組14個自然治療的初期HIV感染病人。以2-4個月的間隔從每個病人抽取血漿樣品，持續(xù)6-39個月的范圍(平均跟蹤18個月內(nèi))。將病毒與連續(xù)5倍稀釋的抗體共溫育，并用于感染表達CD4加CCR5和CXCR4共受體的靶細胞。發(fā)現(xiàn)14個病人中的12個對病毒產(chǎn)生了強中和抗體應答反應。來自代表性病人的數(shù)據(jù)被顯示在圖10中。但是，每種后續(xù)的病毒都一致并迅速地逃避了同時發(fā)生的中和抗體應答反應。峰值中和作用滴度(在1∶339-1∶4627的范圍內(nèi)平均1∶1497的稀釋度)在病毒出現(xiàn)后持續(xù)發(fā)展了n個月。并且此后應答反應繼續(xù)提高，持續(xù)數(shù)月至一年。與對于來自相同病人的晚期病毒相比較，對于早期病毒的中和抗體滴度一段都比較高。對于異源性R5初始病毒(JR-CSF)的中和作用應答反應弱而遲緩。對于X4實驗室株(NL4-3)應答反應隨時間增加，但是在不同病人中強度不同。對于自體病毒中和抗體應答反應的大小與血漿HIV RNA平均量或HIV感染的持續(xù)時間無關(guān)。因此，病毒逃避中和作用的比率是驚人的，并且表明中和抗體對于病毒晃進化可以發(fā)揮以前未被認識的選擇性強制作用水平。這些數(shù)據(jù)對于自然界發(fā)史和疫苗的開發(fā)具有主要的啟示。
實施例7鑒別誘發(fā)，改變或阻止中和抗體應答反應的HIV-1被膜氨基酸序列本實施例提供了一種方式和方法，用于鑒別對HIV-1感染誘發(fā)/促進或改變，或阻止抗體介導的中和作用(在本申請中也被稱為病毒中和作用)的HIV-1被膜氨基酸序列。
為了如在實施例6中所述確定共受體向性，以侵入分析法測試了來源于病人樣品的被膜序列，或來源于病人樣品的單一克隆，或者通過定位誘變而包含特定突變的工程構(gòu)建的被膜序列。
在一個實施方案中，對演變的病人樣品(從相同病人在不同時間點采集的病毒)的抗體介導的中和作用進行評價。例如，在疫苗接種之前，在疫苗接種的過程中，以及在疫苗接種過程完成之后逐步增加的時間點檢測病毒中和作用。在一個實施方案中，對預防性疫苗檢測其病毒中和作用。在另一實施方案，對治療性疫苗檢測其病毒中和作用。
在另一實施方案中，對從大量不同的病人收集的樣品檢測其病毒中和作用。在進一步的實施方案中，對從大量代表不同病毒群和不同病人群的病人收集的樣品檢測其病毒中和作用。這種病人群可包括但不限于，新感染的病人，慢性感染病人，具有病情加深的病人，正接受抗病毒治療或免疫治療的病人，疫苗接種的和未疫苗接種的個體。這種病毒群可包括但不限于，賄不同遺傳特征的病毒(分化體A、B、C、D、E、F、G)，對于抗病毒藥物敏感性的病毒，對于抗病毒藥物具有敏感性降低和抗性的病毒，初始分離物，或適合于在培養(yǎng)的細胞中生長的分離物(通常被稱為實驗室適應病毒)，中胞體誘導(SI)病毒或非合胞體誘導(NSI)病毒，巨噬細胞(M)向性病毒，T-細胞(T)向性病毒和雙向性(M和T)病毒。
對病人HIV樣品的基因型分析可以借助于任何一種廣泛可利用的DNA測序法，分析代表病人樣品集合體的被膜序列，或者來源于病人集合體的克隆。在本發(fā)明的一個實施方案中，應用病毒RNA純化法，RT/PCR和二脫氧核苷酸鏈末端化學測序，以及毛細管凝膠電泳技術(shù)(應用生物系統(tǒng)，F(xiàn)oster Citg，CA)，確定了病人樣品的HIV序列。將病人病毒集合體或克隆的被膜序列與參照序列，其它病人的樣品相比較，或者如果有可能，與開始治療之前從相同病人獲得的樣品相比較。確定比基因型的序列，此序列不同于參照序列或治療前的序列，并且與侵入抑制劑敏感性改變有關(guān)。
遺傳特征性病毒的抗體介導的中和作用通過構(gòu)建被膜表達載體(pHIVenv)，對于與病毒中和作用相關(guān)的被膜氨基酸序列進行了測定，此表達載體在規(guī)定的基因背景上(例如NL43對應X4向性，JRCSF對應R5向性)包含特定的突變。突變可被單獨摻入，和/或以同其它被認為將調(diào)節(jié)病毒中和作用的突變組合的形式被摻入。應用任何一種廣泛可利用的定位誘變法，將被膜突變導入pHIVenv載體中。在本發(fā)明的一個實施方案中，為了定位誘變使用了mega-引物PCR法(Sarkar G，和Summer S.S.1990)。應用實施例6中所述的病毒侵入分析法，對含有特異性被膜突變或突變組的pHIVenv載體進行了測定?？梢赃x擇物異性抗體制備物(即明確鑒定的單克隆或多克隆抗體制備物)，來自HIV感染病人的血清，或來自已接種疫苗個體的血清，比較其中和性。將對含有被膜突變病毒的抗體中和作用與對遺傳確定的病毒的抗體中和作用相比較，此遺傳確定的病毒缺少被測試中的特異性突變。通過將此突變導入明確鑒定的參照病毒，并以實施例6中所述的病毒侵入分析法測定此突變型病毒的抗體介導的中和作用，此特定突變賦予、改變或阻止抗體中和作用的能力可被證實或被否定。明顯的病毒中和作用改變被歸因于導入pHIVenv載體中的特定突變。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過測定gp120表面被膜蛋白V3環(huán)內(nèi)氨基酸序列，鑒別了病毒中和作用的遺傳決定簇。通過比較大量病毒的氨基酸序列，對所測武的氨基酸序列進行鑒別，這些病毒能夠或者不能夠被各種明確鑒定的抗體制開物、病人血清或來自已疫苗接種個體的血清中和。選擇在能夠被中和與不能中和的病毒之間V3環(huán)內(nèi)氨基酸序列的穩(wěn)定差異進行測定。通過定位誘變構(gòu)建了以明確鑒定的親本克隆(如NL43，HXB2，JRCSF)為基礎(chǔ)的等基因病毒，并如實施例6中所述測定其抗體介導的中和作用，此親本克隆在其gp120被膜蛋白的V3環(huán)中含有特異性“病毒中和作用候選”突變。感染表達CD4加CCR5(如U-87/CD4/CCR5)，CD4加CXCR4(U-87/CD4/CCR4)，或CD4加CCR5和CXCD4(TH4/CCR5/CXCR4)細胞?？烧T導，改變或阻止抗體中和作用的氨基酸取代被認為對病毒中和作用是重要的。
在本發(fā)明相關(guān)的實施方案中，是通過測定整個gp120表面被膜蛋白內(nèi)的氨基酸序列，鑒別病毒中和作用的遺傳決定簇。
在本發(fā)明相關(guān)的實施方案中，是通過測定gp41跨膜被膜蛋白中的氨基酸序列，鑒別病毒中和作用的遺傳決定簇。
實施例8測定時病毒侵入抑制劑的敏感性，以便指導治療決定。
本實施例提供了一種方式和方法，以便應用病毒侵入抑制劑敏感性指導對HIV-1的治療。本實施例還進一步提供了一種方式和方法，以便應用病毒侵入抑制劑敏感性指導對病人的治療，這些病人以前已接受病毒侵入抑制劑的抗病毒治療。本發(fā)明還進一步提供了方式和方法以便應用病毒侵入抑制劑敏感性指導對病人的治療，這些病人以前未接受過病毒侵入抑制劑的治療。
在一個實施方案中，病人的病毒對病毒侵入抑制劑的敏感性被用于指導對病人的治療，這些病人正處于抗病毒治療失敗的狀況，包括使用了一種或幾種病毒侵入抑制劑。治療失敗(也被稱為病毒學失敗)一般被定義為部分抑制性抗病毒治療，導致通常在病人血漿中存可檢測的病毒濃度。指導可包括但不限于，(a)指明可利用的藥物治療選擇，(b)選擇更積極的治療方式，(c)澄清治療的病人中病毒數(shù)量增加的病因?qū)W(即不良的附著，藥物抗性)，以及(d)減少使用無活性潛在毒性的藥物。在本實施方案中，抗性試驗載體來源于病人的病毒樣品，可應用表型病毒侵入分析法測定其對各種病毒侵入抑制劑的敏感性。病毒侵入抑制劑包括但不限于，融合抑制劑(如T-20，T-1249)，共受體拮抗劑(AMD3100，AMD8664，TAK779，PR0542，和哌啶-1基乙烷化合物)，以及CD4拮抗劑(MAb 5A8)。適合的治療決定是基于病毒侵入分析試驗的結(jié)果(例如見圖4B)和補充的相關(guān)性實驗室測試結(jié)果以及臨床信息。
在另一實施方案中，病人的病毒對病毒侵入抑制的敏感性被用于指導對病人的治療，這些病人以前示接受過用包括一種或幾種病毒侵入抑制劑的抗病毒治療方式。指導可包括但不限于(a)指明可利用的藥物治療選擇，(b)選擇更積極的治療方式，(c)了解對病毒侵入抑制劑的基本敏感性，以及(d)減少使用無活性和潛在毒性的藥物?；诙€原因，在病人的治療中確定病毒侵入抑制劑的基本敏感性是重要的。第一，病毒對侵入抑制劑的天然敏感性可以廣泛地改變(例如見圖4A)。第二，病毒侵入抑制劑的使用增加將無凝會導致產(chǎn)生藥物抗性變異體，這種變異體可被傳播給新感染的個體。在此實施方案中，抗性試驗載體來源于病人的病毒樣品可應用表型病毒侵入分析法測定其對各種病毒抑制劑的敏感性。病毒侵入抑制劑包括但不限于融合抑制劑(如T-20，T-1249)，共受體拮抗劑(AMD3100，AMD8664，TAK779，PR0542，和哌啶-1基乙烷化合物)，以及CD4拮抗劑(MAb5A8)。適合的治療決定是基于病毒侵入分析試驗的結(jié)果和補充的相關(guān)性實驗室測試結(jié)果以及臨床信息。
實施例9測定HIV-1共受體向性，以便指導治療決定本實施例提供了一種方式和方法，以便應用HIV-1共受體(CCR5，CXCR4)向性指導對HIV-1的治療。本實施例還進一步提供了一種方式和方法，以便應用HIV-1共受體向性指導對病人的治療，這些病人正處于抗病毒藥物治療失敗中，本發(fā)明還進一步提供了應用HIV-1共受體向性，指導治療被HIV-1新感染病人的方式和方法。
本實施例提供了應用病毒HIV-1共受體向性，指導治療HIV-1的方式和方法。本實施例還進一步提供了應用HIV-1共受體向性指導治療病人的方式和方法，這些病人以前已接受了用病毒侵入抑制劑的抗病毒治療。本發(fā)明還進一步提供應用HIV-1共受體向性指導治療病人的方式和方法，這些病人以前未接受用病毒侵入抑制劑的治療。
在一個實施方案中，病人的病毒共受體向性被用于指導對病人的治療，此病人正正處于抗病毒治療失敗的狀況，包括使用了一種或幾種共受體拮抗劑。治療失敗(也被稱為病毒學失敗)一般被定義為部分抑制性抗病毒治療，導致通常在病人血漿中存在可檢測的病毒濃度。指導可包括但不限于，(a)了解治療的病人中病毒數(shù)量增加的病因?qū)W(即不良的附著，藥物抗性，共受體細胞改變)，(b)指明可利用的藥物治療選擇，(c)選擇更積極的治療方式，以及(d)減少使用無活性和潛在毒性的藥物。對接受用CCR5拮抗劑治療的病人監(jiān)測共受體向性具有重要的臨床價值，因為藥物的壓制可能導致轉(zhuǎn)變?yōu)镃XCR4共受體向性，與R5病毒(CCR5共受體向性)相比較，X4病毒(CXCR4共受體向性)與更不良的預后有關(guān)。在此實施方案中，抗性試驗載體來源于病人的病毒樣品，可應用表型病毒侵入分析法測定其對各種共受體拮抗劑的敏感性。適合的治療決定是基于病毒侵入分析試驗的結(jié)果(例如見圖4B)和補充的相關(guān)性實驗室測試結(jié)果以及臨床信息。
在另一實施方案中，病人病毒的共受體向性被用于指導對病人的治療，這些病人以前未接受過用包括一種或幾種共受體拮抗劑的抗病毒治療方式。指導可包括但不限于，(a)了解基本的共受體向性，(b)指明可利用的藥物治療選擇，(c)選擇更積極的治療方式，(d)減少使用無活性和潛在毒性的藥物。確定基本的共受體向性具有重要的臨床價值。用適合的共受體向性具有重要的臨床價值。用適合的共受體拮抗劑(R5對X4向性)治療，或者用幾種拮抗劑(雙向性或混合向性)治療，都很可能導致更有效的和特久的響應。在此實施方案中，抗性試驗載體來源于病人的病毒樣品，可應用表型病毒被侵入分析法測定其對各種病毒侵入抑制劑的敏感性。共受體拮抗劑包括但不限于(AMD3100，AMD8664，TAK779，PR0542，)，以及哌啶-1基丁8烷化合物。適合的治療決定是基于病毒侵入分析試驗的結(jié)果和補充的相關(guān)性實驗室測試結(jié)果以及臨床信息。
表1細胞
表2代表性病毒和藥劑
aR5(CCR5共受體)，X4(CXCR4共受體)SI(誘導合胞體的)，NSI(非誘導合胞體的)，A，B，C，D，E，F(xiàn)(被膜分化體名稱)bAIDS研究和參照藥劑單目表3試驗擴增HIV被膜的引物
表4(第1組)抗-HIV藥物


FDA批準的藥物以黑體字顯示，紅色＝中斷開發(fā)，蘭色＝開發(fā)前景不肯定表4(第2組)
參考文獻1.Adachi，A.，H.E，Gendelman，S.Koenig，T.Folks，R.Caney，A.Rabson，and M.A.Martin.1986.Production of Acquired Immunodeficiency Syndrome-associatedRetrovirus in Human and Nonhuman Cells Transfected with an Infectious MolecularClone.J.Virol.59284-291.
2.Alkhatib，G.，C.Combadiere，C.C.Broder，Y.Feng，P.E.Kennedy，P.M.Murphy，and E.A.Berger.1996.CC CKR5A Rantes，MIP-lalpha，MIP-1 Beta Receptoras a Fusion Cofactor for Macrophage-tropic Hiv-1.Science 272；1955-8.
3 Allaway G.P.，Ryder A.M.，Beandry G.A.，and Maddon P.J.1993.SynergisticInhibition of HIV-1 Envelope-Mediated Cell Fusion by CD4-based Molecules inCombinatin with Antibodies to Gp120 or Gp41.Aids Res.Hum.Retroviruses9581-7.
4.Baba，M.，O.Niahimura，N.Kanzald，M.Okamoto，H.Sawada，Y.Iizawa，M.Shiraishi，Y.Aramaki，K.Okonogi，Y.Ogawa，K.Meguro，and M.Fujino.1999.ASmall-moleculc，Nonpeptide CCR5 Antagonist with Highly Potent and SelectiveAnti-hiv-1 Activity.Proc.Natl，Acad.Sci.USA 965698-703.
5.Baxter，J.，D.Mayers，D.Wentworth，J.Neaton，and.T.Merigan，1999.A PilotStudy of the Short-term Effects of Antiretroviral Management Based on PlasmaGenotypic Antiretroviral Resistance Testing(Gart)in Patients Failing AntiretroviralTherapy.Presented at the 6th Conference on Retroviruses and OpportunisticInfections.Chicago，II.
6.Bernard P.，Kczdy K.e.，Van Melderen L.，Steyaert J.，Wyns L.，Pato M.L.，HigginsP.N.，and Couturier M.1993.The F Plasmid CcdB protein Induces EfficientATP-dependent Dna Cleavage by Gyrase.J Mol.Biol.23534-41.
7.Bernard，P.and Couturier，M.1992.Cell Killing by the F Plasmid Ccdb proteinInvolves Poisoning of DNAtopoisomerase II Complexes.J.Mol.Bio.226735-45.
8.Bleul，C.C.，M.Farzan，H.Choe，C.Parolin，I.Clark-Lewis，J.Sodroski，and T.A.Springer，1996，The Lymphocyte Chemoattractant Sdf-1 Is a Ligand for Lestr/fusinand Blocks Hiv-1 Entry.Nature 382829-33.
9.Bridger G.J，Skerlj R.T.，Padmanabhan S.，Martellucci S.A.，Henson G.W.，StruyfS.，Witvrouw M.，Schols D.，and De Clercq E.1999.Synthesis andStructure-activity Relationships of Phenylenebis(methylene)-linkedBis-azamacrocycles That Inhibit HIV-1 and HIV-2 Replication by Antagonism ofthe Chemokine Receptor CXCR4.J.Med.Chem.423971-81.
10.Carpenter，C.J.，Cooper D.A.，F(xiàn)ischl，M.A.，Gatell J.M.，Gazzard B.G.，HammerS.M.，Hirsh M.S.，Jacobsen D.M.，Katzenstein D.A.，Montaner J.S.，Richman D.，Saag M.S.，Schechter M.，Schooley R.T.，Thompson M.A.，Vello S.，Yeni P.G.，andVolberding P.A.2000.Antiretroviral Therapy in Adults.JAMA283381-89.
11.CDC(Centers for Disease Control and Prevention).HIV/AIDS Surveillance Report，1999；11(no.1).
12.Coffin，J.M.1995，HIV Population Dynamics in VivoImplications for GeneticVariation，Pathogenesis，and Therapy.Science267483-489.
13.DHHS(Dcpartment of Health and Human Services).Henry Kaiser FamilyFoundationGuidelines for the Use of Antirctrovirals Agents in HIV-infectedAdults and Adolescents.(Jan 28，2000).
14.Gerdes，K.，L.K.Poulsen.T.Thisted，A.K.Nielson，J.Martinussen，and P.H.Andreasen.1990.The Hok Killer Gene Family in Gram-negative Bacteria.The MewBiologist2946-956.
15.Hertogs，K.，M.P.De Béthune，V.Miller，T.Inens，P.Schel，A.V.Cauwenberge，C.Van Den Eynde，V.Van Gerwen，H.Azijn，M.Van Houtte，F(xiàn).Pccters，S.Staszewski，M.Conant，S.Bloor，S.Kemp，B.Larder，and R.Pauwels.1998.ARapid Mcthod for Simultaneous Detection of Phenotypic Resistance to Inhibitors ofprotease and Reverse Transcriptase in Recombinant Human ImmunodeficiencyVirus Type 1 Isolates from Patients Treated with Antiretroviral Drugs.Antimicrob.Agents Chemother.42269-276.
16.Hwang，J.-j.，L.Li，W.f.Anderson.1997.A Conditional Self-inactivatingRetrovirus Vector That Uses a Tetracycline-responsive Expprssion System.J.Virol.717128-7131.
17.Japour，A.J.，D.L.Mayers，V.A.Johnson，D.R.Kuritzkea，L.A.Beckett，J.M.Arduino，J.Lane，B.R.J.，P.S.Reichelderfer，R.T.D-aquila，C.S.Crumpacker，T.R.-S.Group，T.A.C.T.Group，and V.C.R.W.Group.1993.StandardizedPeripheral Blood Mononuclear Cell Culture Assay for Derermination of DrugSusceptibilities of Clinical Human Immunodefiency Virus Type 1 Isolates.Antimicrob.Agents Chemoter.371095-1101.
18.Judice J.K.，Tom J.Y.，Huang W.，Wrin T.，Vennari J.，Petropoulos C.J.，andMcdowell R.S.1997.Inhibition HIV Type 1 Infectivity by ConstrainedAlphahelical PeptidesImplications for the Viral Fusion Mechanism.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413426-30.
19.Kilby JM，Hopkins S，Veneua Tm，Dimassimo B，Cloud Ga，Lee Jy，Alldrdge L，Hunter E，Larmbert D，Bolognesi D，Matthews T，Johnson Mr.Nowak Ma，ShawGm，and Saag Ms.1998.Potent Suppression of HIV-1 Replication in Humans byT-20，a Peptide Inhibitor of Gp41-mediated Virus Entry.Nat Med.41302-7.
20.Mascola，J.R.，G.Stiegler，T.C.Vancott，H.Katinger，C.B.Carpenter，C.E.Hanson，H.Beary，D.Hayes，S.S.Frankel，D.L.Birx，and M.G.Lewis.2000.Protection ofMacaques Against Vaginal Transmission of a Pathogenic HIV-1/siv Chimeric Virusby Passive Infusion of Neutralizing Antibodies.Nature Med.6207-210.
21.Miyoshi，H.，B.Ulrike，M.Takahashi，F(xiàn).H.Gage，and I.M.Verma.1998.Development of a Self-inactivating Lentivirus Vector.J.Virol.728150-5157.
22.Naviaux，R.K.，E.Costanzi，M.Haas，and I.M.Verma.1996.The Pcl VectorSystemRapid production of Helper-free，High-titer，Recombinant Retroviruses，J.Virol，705701-5705.
23.Petropoulos，C.J.，N.T.Parkin，K.L.Limoli，Y.S.Lie，T.Wrin，W.Huang，H.Tian，D.Smith，G.A.Winslow，D.Capon and J.M.Whitcomb.2000.A Novel PhenotypicDrug Susceptibility Assay for HIV-1.Antirnicrob.Agents & Chem.44920-928.
24.PhRMA(Pharmaceutical Research and Manufacturers of America).New Medicinesin Developrncnt for Aids，1999.Http//www.phrma.org.
25.Piketty，C.，E.Race，P.Castiel，L.Belec，G.Peytavin，A.si-mohamed，G.Gonzalez-canali，L.Weiss，F(xiàn).Clavel，and M.Kazatchkine.1999.Efficacy of aFive-drug Combination Including Ritonavir，Saquinavir and Efavirenz in PatientsWho Failed on a Conventional Triple-drug RegimenPhenotypic Resistance toprotease Inhibitors predicta Outcome of Therapy.Aids13f71-f77.
26.Porter，C.C.，K.V.Lukacs，G.Box，Y.Takeuchi，and M.K.L.Collins.1998.Cationic Liposomes Enhance the Rate of Transduction by a Recombinant RetroviralVector in Vitro and in Vivo.J.Virol.724832-4840.
27.Reimann K.A.，Cate R.L.，Wu Y.，Palmer L.，Olson D.，Waite B.C.，Lctvin N.L.，andBurkly L.C.1995.In Vivo Administration of CD4-specific Monoclonal AntibodyEffect on provirus Load in Rhesus Monkeys Chronically Infected with the SimianImmunodeficiency Virus of Macaques.Aids Res.Hum，Retroviruses 11517-25.
28.Retrovirusca.Coffin，J.，S.Hughes，H.Varnus(Eds).1997.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.
29.Richman，D.1998.Nailing down Another HIV Targct.Nature Med.41232-1233.
30.Rimsky，L.T.，D.C.Shugars，and T.J.Matthews.1998.Determinants of HumanImmunodeficiency Virus Type 1 Resistance to Gp41-derived Inhibitory Peptides.J.Virol，72986-993.
31.Rodriguez-roasdo，R.，Briones，C.and Soriano，V.1999.Introduction of HIVDrug-resistance Testing in Clinical Practice.Aids 131007-1014.
32.Shinazi，R.F.，Larder，B.A.，and Mellors，J.W.1999.Mutations in Retrovial GenesAssociated with Drug Resistance.Intl.Antiviral News；746-49.
33.Shi C.，and J.W.Mellors.1997.A Recombinant Retroviral System for Rapid inVivo Analysis of Human Immunodefiency Virus Type 1 Susceptibility to ReverseTransctiptase Inhibitors.Antimicrob、Agents Chemother 412781-2785.
34.Stephenson，J.1999.New Class of Anti-HIV Drugs.Jama 2821994.
35.Who，Unaids/World Health Organization，ReportAids Epidemic UpdateDecember 1999.Http//www.unaids.org/publications/documents/epidemiology.
36.Wild，C.，T.Oak，C.Mcdanal，D.Bolognesi，and T.Matthews.1992.A SyntheticPeptide Inhibiter of HIV Replication；Correlation Between Solution Structure andViral Inhibition.Proc，Natl.Acad.Sci，USA 8910537-10541.
37.Zennou，V.，F(xiàn).Mammamo，S.Paulous，D，Mathcz，and F.Calvel，1998.Loss ofViral Fitness Associatcd with Multiple Gag and Gag-pol processing Defects inHuman Immunodetiency Virus Type l Variants Selected for Resistance to ProteaseInhibitor in vivo.J.Virol723300-06.
38.Ziermann，R.，K.Limoli，K.Das，E.Amold，C.J.Petropoulos，and N.T.Parkin.2000.A Mutation in HIV-1 Protease，N88s That Causes in Vitro Hypersensitivity toAmprensvir.J.Virol.744414-4419.
序列表<110>Richman，DouglasWrin，MaryPetropoulos，ChristosLittle，SusanHuang，WeiParkin，NeilWhitcomb，Jeanette<120>應用重組病毒分析試驗評價病毒受體/共受體用途以及病毒侵入抑制劑的組合物和方法<130>11068-027-228<150>US10/077,027<151>2002-02-15<160>10<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ggagcattta caagcagcaa cacagc 26<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ttccagtcav acctcaggta c21
<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3agaccaatga cttayaagg 19<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gggctcgaga ccggtcagtg gcaatgagag tgaag 35<210>5<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gggctcgaga ccggtgagca gaagacagtg gcaatga 37<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>6gggctcgaga ccggtgagca gaagacagtg gcaatg36<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gggtctagaa cgcgttgcca cccatcttat agcaa 35<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gggtctagaa cgcgtccact tgccacccat bttatagc 38<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9gggtctagaa cgcgtccact tgccacccat btta 34<210>10<211>38<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10gatggtctaa gacgctgttc aatatccctg cctaactc 38
權(quán)利要求
1.一種用于檢測在病毒感染的病人體內(nèi)能夠阻止感染的抗體應答反應形成的方法，此方法包括(a)使一種宿主細胞與來自病人的抗體制備物接觸，其中該宿主細胞含有編碼來自病人的病毒蛋白的核酸以及產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸，(b)測定宿主細胞所產(chǎn)生的可檢測信號的數(shù)量，以及(c)將步驟(b)中測定的信號數(shù)量與不存在抗體制備物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在抗體制備物時測定的信號數(shù)量減少，指示病人已經(jīng)形成了能夠阻止感染的對病毒蛋白質(zhì)的抗體應答反應。
2.一種用于檢測在病毒感染的病人體內(nèi)能夠阻止感染的抗體應答反應形成的方法，此方法包括(a)將如下二種成分轉(zhuǎn)染進入第一種細胞i)編碼來自病人的病毒蛋白質(zhì)的核酸，和ii)缺少編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸，而包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含病毒蛋白質(zhì)的病毒顆粒，該病毒蛋白質(zhì)是由從病人獲得的核酸編碼的；(b)使步驟(a)中產(chǎn)生的病毒顆粒與來自病人的抗體制備物接觸；(c)使步驟(b)中的病毒顆粒和抗體制備物與第二種細胞接觸，其中第二種細胞表達該病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；(d)測定由第二種細胞所產(chǎn)生的可檢測信號數(shù)量，以便確定此病毒顆粒的侵染性，以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在抗體制備物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中存在抗體制備物時測定的信號數(shù)量減少，指示病人已經(jīng)形成了能夠阻止感染的對病毒蛋白質(zhì)的抗體應答反應。
3.一種用于檢測在病毒感染的病人體內(nèi)能夠阻止感染的抗體應答反應形成的方法，此方法包括(a)將如下二種成分轉(zhuǎn)染進入第一種細胞i)編碼來自病人的病毒蛋白質(zhì)的核酸，和ii)缺少編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含病毒蛋白質(zhì)的病毒顆粒，該病毒蛋白質(zhì)是由從病人獲得的核酸編碼的；(b)使步驟(a)中產(chǎn)生的病毒顆粒與來自病人的抗體制備物接觸；(c)使步驟(b)中的病毒顆粒和抗體制備物與第二種細胞接觸，其中第二種細胞表達該病毒與之結(jié)合的細胞表面受體，并且第二種細胞含有產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸；(d)測定由第二種細胞所產(chǎn)生的可檢測信號數(shù)量，以便確定病毒顆粒的侵染性，以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在抗體制備物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中存在抗體制備物時測定的信號數(shù)量減少，指示病人已經(jīng)形成了能夠阻止感染的對病毒蛋白質(zhì)的抗體應答反應。
4.權(quán)利要求1，2或3的方法，其中的病毒蛋白質(zhì)是被膜蛋白。
5.權(quán)利要求1，2或3的方法，其中的病毒蛋白質(zhì)是衣殼蛋白。
6.一種用于檢測在病毒感染的病人體內(nèi)能夠阻止感染的抗體應答反應形成的方法，此方法包括a)培育包含如下二種成分的第一種細胞i)編碼來自病人的病毒蛋白質(zhì)的核酸，和ii)缺少編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸，而包含產(chǎn)生可檢測信號的指示核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含病毒蛋白質(zhì)的病毒顆粒，該病毒蛋白質(zhì)是由從病人獲得的核酸編碼的；(b)使在步驟(a)中產(chǎn)生的病毒顆粒與來自病人的抗體制備物接觸；(c)使步驟(b)中的病毒顆粒和抗體制備物與第二種細胞接觸，其中第二種細胞可表達此病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；(d)測定由第二種細胞產(chǎn)生的可檢測信號數(shù)量，以便確定該病毒顆粒的侵染性，以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在抗體制備物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在抗體制備物時測定的信號數(shù)量減少，指示病人已經(jīng)形成了能夠阻止感染的對病毒蛋白質(zhì)的抗體應答反應。
7.權(quán)利要求6的方法，其中(i)中的核酸是(ii)中病毒表達載體的組成部分。
8.權(quán)利要求6的方法，其中(i)中的核酸被整合進入第一種細胞的基因組中。
9.權(quán)利要求6的方法，其中(ii)中的病毒載體被整合進入第一種細胞的基因組中。
10.權(quán)利要求6的方法，其中(i)中的核酸和(ii)中的病毒載體被整合進入第一種細胞的基因組中。
11.權(quán)利要求6的方法，其中的病毒蛋白質(zhì)是衣殼蛋白。
12.權(quán)利要求6的方法，其中的病毒蛋白質(zhì)是被膜蛋白。
13.權(quán)利要求12的方法，其中(i)中的核酸是(ii)中病毒表達載體的組成部分。
14.權(quán)利要求12的方法，其中(i)中的核酸被整合進入第一種細胞的基因組中。
15.權(quán)利要求12的方法，其中(ii)中的病毒載體被整合進入第一種細胞的基因組中。
16.權(quán)利要求12的方法，其中(i)中的核酸和(ii)中的病毒載體被整合進入第一種細胞的基因組中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于鑒別化合物是否抑制病毒侵入細胞的方法，此方法包括(a)從被該病毒感染的病人獲得編碼病毒被膜蛋白的核酸；(b)將如下二種成分共轉(zhuǎn)染進入第一種細胞；(i)步驟(a)中的核酸，以及(ii)缺少編碼被膜蛋白的核酸，而包含產(chǎn)生不檢測信號的指示核酸的病毒表達載體，以致第一種細胞可產(chǎn)生包含被膜蛋白的病毒顆粒，此被膜蛋白是由從病人獲得的核酸編碼的；(c)在有化合物存在時，使步驟(b)中產(chǎn)生的病毒顆粒與第二種細胞接觸，其中此第二種細胞表達病毒與之結(jié)合的細胞表面受體；(d)測定由第三種細胞所產(chǎn)生的信號數(shù)量，以便確定此病毒顆粒的侵染性，以及(e)將步驟(d)中測定的信號數(shù)量與不存在此化合物時產(chǎn)生的信號數(shù)量相比較，其中，存在化合物時測定的信號數(shù)量減少，指示該化合物可抑制病毒侵入第二種細胞。
文檔編號C12Q1/70GK1646706SQ03808536
公開日2005年7月27日 申請日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月15日
發(fā)明者D·里奇曼, M·T·林, S·利特爾, C·J·佩特羅普洛斯, N·T·帕金, J·M·懷特坎布, 黃微 申請人:瓦羅洛吉克公司