專利名稱：：用于接種新生兒的改良的安卡拉痘苗病毒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及病毒用于制備藥物的用途，所述藥物用于接種或治療新生的或產前的(neonatalorprenatalanimal)動物(包括人)，其中所述病毒能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，但不能在新生的或產前的動物(包括人)的體內復制成感染性子代病毒。優(yōu)選病毒為改良的安卡拉痘苗病毒(ModifiedVacciniaVirusAnkara)。本發(fā)明具體涉及接種新生兒以抵抗與接種所用病毒屬于相同病毒組的病毒的感染。另外，本發(fā)明涉及接種新生兒以抵抗選自外源抗原和腫瘤抗原的抗原，其中腫瘤抗原和/或外源抗原不同于與病毒相關的抗原。本發(fā)明還涉及如上文所限定的病毒提高使樹突細胞或其前體細胞活化的因子的水平和/或增加樹突細胞或其前體細胞數(shù)目和/或提高干擾素(IFN)或IL-12的生成和/或細胞性含量(cellularcontent)的用途。
背景技術：
：動物和人類的天然環(huán)境含有多種感染因子，如病毒、細菌或真菌。其中很多感染因子可導致被感染宿主患病。在正常情況下，被感染宿主在一段時間之后可以從感染因子誘發(fā)的疾病中恢復。這種恢復歸功于動物或人類的免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)是人或動物身體的一部分，它負責消滅感染因子。免疫應答分為兩種，即特異性和非特異性(天然(innate))反應，但這兩者密切合作。非特異性免疫應答是抗多種外源物質和感染因子的即發(fā)型防御。在抗病毒的天然免疫應答中，干擾素(IFN)-α和IFN-β是控制最初的病毒復制并活化自然殺傷(NK)細胞以立即殺死感染細胞所必需。細胞內的細菌或寄生蟲病原體誘導IL-12，而IL-12上調NK細胞和/或一些T細胞亞群中的IFN-γ。被IFN-γ活化的NK細胞即可殺死細胞內病原體。另外，IFN-γ也能活化巨噬細胞并使它們能殺死被內化的病原體。迄今為止IFN-α/β最豐富的來源是樹突細胞(DC)，該細胞是一種能策略地分布于全身的特化細胞群體。其中，漿細胞樣DC或CD11c+CD8+DC是最佳的IFN-α/β生產者。被細胞內非病毒病原體感染的CD8+DC是能分泌免疫防御早期步驟所至關重要的IL-12的關鍵細胞。一旦生物體首次受到具體外源物質(抗原)的攻擊，一段時間后可誘發(fā)抗所述物質的特異性免疫應答。特異性免疫應答的起始也需要DC的協(xié)作。這些細胞不斷地從外周淋巴器官轉移至次級淋巴器官、淋巴結或脾臟，在那里使原初(naive)T和B細胞再循環(huán)。DC所攜帶的運送至這些器官的抗原將原初T細胞和B細胞活化為效應T細胞和B細胞。為此，DC不僅攜帶抗原，而且其識別病原體的可塑性(plasticity)允許DC中不同的基因被活化，從而允許T細胞的被病原體調節(jié)的引發(fā)(priming)。特異性免疫應答是高效率的，它負責保護從一種具體感染中恢復的個體抵抗所述具體感染。從而，再次被相同或極類似感染因子感染僅導致很輕微的癥狀或根本不表現(xiàn)癥狀，這是因為已存在針對該感染因子的“現(xiàn)成的特異性免疫力”。所述免疫力和免疫記憶各自持續(xù)較長時間，有時甚至持續(xù)終生。因此，免疫記憶的誘發(fā)可用于接種，即保護個體使其免受具體病原體的感染。為了進行接種，免疫系統(tǒng)用疫苗攻擊，所述疫苗自身應比欲誘發(fā)的免疫應答所抗的病原體的害處要小。疫苗含有或表達那些出現(xiàn)在接種所針對的感染因子表面或由該感染因子表達的表位。因此，生物體可以被包含表位的疫苗免疫，從而抵抗含有該表位的感染因子的感染。典型的疫苗是減毒病毒或滅活病毒(如脊髓灰質炎疫苗或天花病毒疫苗)、重組蛋白(如重組乙肝病毒S-蛋白)、熱滅活的細菌毒素(破傷風梭菌(Clostridiumtetani)毒素)或細菌莢膜壁多糖(肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae))。由于傳染病會在新生兒和乳兒中造成很嚴重的疾病，因此，有必要盡可能早地接種幼小或新生的動物。需要接種的疾病的例子有痘病毒感染，包括天花病毒感染。然而，新生哺乳動物的免疫系統(tǒng)尚未成熟，這一事實使成功接種新生兒的嘗試受阻。據(jù)認為新生嬰兒和哺乳動物的免疫系統(tǒng)需要經過一段時間才能逐漸成熟。對于人類而言，在生命的第一年內逐漸成熟。這就是新生年齡組在周歲前對多種感染易感的原因(Gans等，J.Am.Med.Assoc.(1998)280，527-532)。更具體地，新生嬰兒的B-細胞功能微弱，樹突細胞的初級抗原呈遞有缺陷，T細胞增殖也是有限的(Gans等，J.Am.Med.Assoc.(1998)280，527-532)。剛出生時，脾臟中的T細胞水平比成人低1000倍。為了獲得至少是微弱的免疫，有人建議使用復制型病毒或含有佐劑的制劑來免疫。然而，使用復制病毒總是存在風險，由于T細胞是病毒清除所必需的，不成熟的免疫系統(tǒng)可能被病毒感染或活病毒疫苗所制服(Hassett等，J.Virol.(1997)71，7881-7888)。由于新生兒體內Th-1輔助T細胞的細胞因子生成較弱，嬰兒的反應主要是Th-2型。結果，不能征集細胞毒T細胞，也就無法清除病毒。哺乳動物的情況與人的情況很類似，即出生后的免疫系統(tǒng)尚未成熟。在新生小鼠中，脾臟CD4+T細胞的數(shù)目為80,000，CD8+T細胞的數(shù)目比成年小鼠脾臟中的低1000倍。另外，這些小鼠中的干擾素(IFN)生產系統(tǒng)不成熟。因此，新生小鼠不能通過IFN有效控制感染位點的細胞內病原體的擴增。此外，免疫細胞的低數(shù)目和有可能不足的活化期十分有限，以致于不能應付快速擴增的病原體或接種所用的復制病毒。由于與活病毒疫苗有關的風險，不推薦用復制病毒接種新生動物，包括人。例如，建議不要用已被使用直至天花滅絕的痘苗病毒株，如病毒株Elstee、Copenhagen和NYCBH接種新生兒以抵抗天花病毒。根據(jù)美國最近的推薦，年齡小于12個月的幼兒不應接種迄今為止可以買到的天花病毒疫苗。用含有佐劑的制劑接種新生兒的缺點是大量有害物質被導入體內。因此，只有在緊急情況下，例如在乙肝病毒感染時才會接種人類新生兒。概括地說，應注意出生時免疫系統(tǒng)并不成熟。由于用有復制能力的病毒或含有佐劑的制劑接種具有顯著的缺點，德國年齡小于2個月(EmpfehlungderstandigenImpfkommissionSTICO，2001)或美國6周齡以下(ACIP“RecommendedChildhoodImmunizationSchedule，UnitedSates”)的嬰兒不能被接種。通過妊娠過程中或母乳喂養(yǎng)時從母親轉移至乳兒的母體抗體，可以部分補償免疫系統(tǒng)發(fā)育的延遲。然而，因多種原因，不是所有的嬰兒都能接受母乳喂養(yǎng)。因此，對人而言，有一段約6-8周的非常關鍵的時期，在這段時間內，具有不成熟因而功能不完全的免疫系統(tǒng)的嬰兒不接受母體抗體，此時，接種通常是不成功的，或者十分危險。在哺乳動物，特別是有重要經濟價值的動物，如奶?；蚺惆閯游?，如貓和狗中，情況非常類似。為了降低花費，小牛從母牛處接受的牛奶的量經常急劇減少。取而代之的是，小牛接受奶粉、起子(starter)和特殊濃縮飼料的混合物，有時在出生后一周即開始食用所述混合物。結果，小牛未接受必需量和種類的母體抗體，以致于不成熟的免疫系統(tǒng)對感染非常敏感。另外，喂養(yǎng)小牛的農夫和將它們養(yǎng)成肉牛的農夫經常是不同的人。來自不同養(yǎng)牛場的4至6周齡小牛被集中到一起，運送至其它農場用于產肉。此時，母體抗體水平低，免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，但動物在脅迫條件下被暴露于新的感染因子。這增加了感染風險，而接種可以防止所述風險。在感染壓力大的養(yǎng)貓或養(yǎng)狗場也可發(fā)現(xiàn)類似的情況。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供分別接種新生人和動物的方法，所述接種針對的是外源抗原和分別與人和動物疾病相關的抗原。更具體地，本發(fā)明的目的是提供使新生動物和人的免疫系統(tǒng)加速成熟的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供能接種新生動物，包括人以抵抗痘病毒感染，特別是抗天花病毒感染的方法。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，我們意外發(fā)現(xiàn)可以用病毒安全而有效地接種和/或治療新生的或產前的動物(包括人)，其中所述病毒能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，但不能在所述細胞中復制成感染性的子代病毒。特別地，我們已證實本發(fā)明使用的病毒，如MVA，特別是MVA-BN及其衍生物(見下文)可以施用給新生兒，而未顯示出任何有害的效果。用病毒接種動物導致抗接種所用病毒的特異性免疫應答和/或抗外源抗原和下文將詳細解釋的腫瘤抗原的一般性接種。另外，本發(fā)明所用的病毒能誘發(fā)和/或增強免疫系統(tǒng)的成熟，這與樹突細胞數(shù)目和諸如干擾素的因子的增加有關。即使給動物施用的制劑不含有佐劑，用本發(fā)明所用的病毒接種也是可能的。簡單地說，本發(fā)明所用的病毒能(i)在新生兒中引發(fā)有效的免疫應答，(ii)無需佐劑即可被施用和(iii)不具有制服生物體的風險。根據(jù)本發(fā)明，第一次接種之后，產生的保護作用可維持至少5天，優(yōu)選至少7、14或28天。“能感染細胞”的病毒是表面具有能與宿主細胞相互作用的結構的病毒，所述相互作用的程度能使病毒或至少病毒基因組摻入宿主細胞。盡管本發(fā)明所用病毒能感染宿主細胞，但它們不能在感染細胞中復制成感染性子代病毒。在本發(fā)明的上下文中，術語“不能在所述細胞中復制成感染性子代病毒的病毒”指的是其基因組至少部分被轉錄和翻譯成病毒蛋白質或甚至被復制，然而，不能被包裝成感染性病毒顆粒的病毒。因此，本發(fā)明所用病毒是能導致宿主中的失敗感染的病毒。發(fā)生失敗感染的原因有兩個根據(jù)第一個原因，細胞可能對感染敏感，但在所述細胞中復制病毒必需的病毒基因并不是全都能被表達和/或存在于病毒基因組中，因此，該細胞可能不允許病毒復制。針對人細胞的本發(fā)明此類病毒的例子是下文將要詳細解釋的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。根據(jù)第二個原因，失敗感染也可以是用缺損病毒感染細胞而引起的，所述缺損病毒缺乏病毒基因的全補充物。針對人細胞的本發(fā)明此類病毒的例子是DISC-HSV1(缺損的單-周期單純皰疹病毒)，即局限于單個感染周期的單純皰疹病毒(Dilloo等，Blood1997，89119-127)。該病毒缺乏必需的糖蛋白H(gH)基因，但能在表達gH的補充細胞系中生長至高滴度。在允許皰疹病毒生長的非-補充細胞系中，局限于單個感染周期，導致釋放非感染性病毒。術語“不能被復制”優(yōu)選指在接種動物的細胞中根本不能復制的病毒。然而，顯示出能被新生兒不成熟的免疫系統(tǒng)所控制的微弱殘留復制活性的病毒也落入本申請的范圍之內。本發(fā)明的病毒可以是任何能感染動物細胞，但不能在所述細胞中復制成感染性子代病毒的病毒。應理解能感染第一種動物的細胞，但不能在所述細胞中復制成感染性子代病毒的病毒在第二種動物中可能有不同的表現(xiàn)。例如，對于人而言，MVA-BN及其衍生物(見下文)是能感染人細胞，但不能在人細胞中復制成感染性子代病毒的病毒。相同的病毒可在雞中復制，即在雞中，MVA-BN是能在雞細胞中復制成感染性子代病毒的病毒。本領域技術人員已知針對特定動物種類選擇何種病毒。測定病毒是否能在新生的或產前的動物中復制的試驗公開于WO02/42480，該試驗使用了AGR129小鼠品系。該小鼠模型獲得的結果對人也有指示作用。因此，本申請所用術語“不能復制成感染性子代病毒”對應于WO02/42489中針對小鼠所用的術語“不能在體內復制”。下文將描述該試驗的細節(jié)。本發(fā)明的病毒優(yōu)選能在至少一種動物的至少一種細胞中復制。因此，可以在給欲接種和/或治療的動物給藥前擴增病毒。有關例子可參見MVA-BN，該病毒能在CEF細胞中擴增，但在新生的或產前的人中，是不能復制成感染性子代病毒的病毒。在此上下文中，應注意被化學或物理滅活的病毒不具有該優(yōu)選實施方案的所有特性，因為滅活的病毒能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，不能在新生的或產前的動物(包括人)中復制成感染性子代病毒，但這些病毒不能在至少一種動物的至少一種細胞中復制。優(yōu)選病毒是DNA病毒。對于哺乳動物細胞，特別是人細胞而言，更優(yōu)選DNA病毒選自DISC-皰疹病毒和改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。改良安卡拉痘苗病毒(MVA)病毒與痘病毒科正痘病毒屬的成員痘苗病毒相關。在雞胚成纖維細胞上對安卡拉痘苗病毒株(CVA)連續(xù)進行516次傳代即可產生MVA(有關評述可參見Mayr，A等，Infection3，6-14)。長期傳代的后果是所得MVA病毒缺失了約31kb的基因組序列，因此，據(jù)描述其宿主細胞僅局限于鳥細胞(Meyer，H等，J.Gen.Virol.72，1031-1038)。已證實所得MVA在多種動物模型中顯然是無毒力的(Mayr，A.&amp;Danner，K.Dev.Biol.Stand.41225-34)。另外，已在臨床試驗中將MVA毒株用作抗人類天花病的接種用疫苗(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B167，375-390，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。這些研究涉及到120,000多個人，包括高風險的患者，這些研究證實與基于痘苗病毒的疫苗相比，MVA的毒力或感染性減低，但卻保持了良好的免疫原性。本發(fā)明優(yōu)選的毒株是保藏于歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)、保藏號為V00120707的MVA575，以及保藏于同一保藏機構、保藏號為V000083008的MVA-BN以及它們的衍生物。對于人而言特別優(yōu)選的MVA毒株，優(yōu)選為最優(yōu)選的毒株，如MVA-BN及其衍生物的特性概述如下(i)能在雞胚成纖維細胞(CEF)和細胞系BHK中生殖復制，但不能在人細胞系HaCat中生殖復制，(ii)不能在體內復制，(iii)與已知毒株MVA575(ECACCV00120707)相比，在致死攻擊模型中能誘發(fā)較高的免疫原性和/或(iv)與DNA-引發(fā)/痘苗病毒加強的方案相比，痘苗病毒引發(fā)/痘苗病毒加強的方案能誘發(fā)至少基本上相同的免疫力水平。本發(fā)明的優(yōu)選MVA毒株具有特性(ii)，即不能在欲接種或治療的生物體和/或下文解釋的相應檢測系統(tǒng)中復制，優(yōu)選還具有一個上述的其它特性，更優(yōu)選還具有兩個上述的其它特性。最優(yōu)選的是具有上述所有特性的MVA毒株。對人類而言，具有上述所有特性的MVA毒株的例子是MVA-BN。MVA-BN的優(yōu)選衍生物是除了特性(ii)外，還具有至少一個上述特性，更優(yōu)選至少兩個上述特性的衍生物。最優(yōu)選的是具有上述所有特性的MVA-BN衍生物。與測定MVA毒株是否具有一個或多個上述特性(i)至(iv)所用試驗有關的詳細信息可參見WO02/42480。該出版物還公開了如何獲得具有所需特性的病毒。WO02/42480特別提供了MVA-BN和MVA-BN衍生物之特性的詳細定義，并詳細公開了測定MVA毒株是MVA-BN還是其衍生物所用的生物學試驗。換句話說，WO02/42480中公開了MVA-BN的特性，有關評價MVA毒株是MVA-BN還是其衍生物所用生物學試驗的描述，以及獲得MVA-BN或其衍生物的方法。下文簡短概述了本領域技術人員如何獲得具有一個或多個上述特性的MVA毒株，以及他們如何檢測給定的MVA毒株是否具有一個或多個所述特性，并由此判斷所述毒株是否是本發(fā)明的最優(yōu)選病毒。不應將下文的概述理解成對WO02/42480的限制。取而代之的是，將WO02/42480全文列入本文作為參考。在本申請中，所用術語“不能在細胞系HaCAT中生殖復制”(Boukamp等，1988，JCellBiol106(3)761-71)的定義與WO02/42480中的相同。因此，“不能在細胞系HaCat中生殖復制”的病毒是在人細胞系HaCat中擴增比率低于1的病毒。在人細胞系HaCat中，用作本發(fā)明載體的病毒的擴增率優(yōu)選為0.8或更低。病毒的“擴增比率”是由感染細胞產生的病毒(輸出Output)與在第一場所感染細胞的病毒最初用量(輸入Input)的比率(“擴增比率”)。輸出和輸入之間的比率為“1”定義了下述擴增狀況其中由感染細胞產生的病毒量與感染細胞的病毒的最初用量相等。保藏號為ECACCV00083008的病毒的“衍生物”優(yōu)選指復制特性與保藏的毒株實質上相同，但其基因組的一個或多個部分顯示出差別的病毒。與保藏病毒具有相同“復制特性”的病毒是在CEF細胞和細胞系BHK、HeLa、HaCat和143B中以與保藏毒株類似的擴增比率復制，而在AGR120轉基因小鼠模型中檢測(見下文)，顯示出類似的體內復制的病毒。本申請中所用術語“不能在體內復制”的定義與WO02/42480中的相同。因此，所述術語指的是如WO02/42480中所解釋的不能在人和小鼠模型中復制的病毒。WO02/42480中所用的小鼠不能產生成熟的B-和T-細胞(AGR129小鼠)。特別地，MVA-BN及其衍生物不能在用腹膜內施用的107pfu病毒感染小鼠之后的至少45天，更優(yōu)選至少60天，最優(yōu)選90天的時間內殺死AGR129小鼠。優(yōu)選顯示出“不能在體內復制”之特性的病毒的進一步的特征在于在用腹膜內施用的107pfu病毒感染小鼠45天，優(yōu)選60天，最優(yōu)選90天之后，從AGR129小鼠的器官或組織中未回收到病毒。也可以使用任何其它小鼠品系來替代AGR129小鼠，所述小鼠品系不能產生成熟的B和T細胞，因此嚴重地無免疫應答，并且對復制病毒高度易感。WO02/42480中解釋了測定MVA毒株是否具有“比已知毒株MVA575更高的免疫原性”所用的致死攻擊實驗的細節(jié)。在所述致死攻擊模型中，在用有復制能力的痘苗病毒株，如WesternReserve毒株L929TK+或IHD-J感染之后，未接種的小鼠死亡。在致死攻擊模型描述的上下文中，用有復制能力的痘苗病毒感染被稱為“攻擊”。攻擊后4天，小鼠通常被殺死，通過使用VERO細胞的標準噬斑試驗測定卵巢中的病毒滴度。測定未接種小鼠和用MVA-BN及其衍生物接種的小鼠的病毒滴度。更具體地，MVA-BN及其衍生物的特征在于在此試驗中，用102TCID50/ml病毒接種之后，卵巢病毒滴度較未接種的小鼠相比降低了至少70％，優(yōu)選降低至少80％，更優(yōu)選降低至少90％。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的病毒，如MVA，特別是MVA-BN及其衍生物可用于引發(fā)/加強給藥?？梢韵仁褂貌《?，特別是本發(fā)明最優(yōu)選使用的MVA毒株，如MVA-BN及其衍生物以及攜有異源序列的相應重組病毒有效引發(fā)天然動物以及對痘病毒有現(xiàn)成的免疫力的動物中的免疫應答，然后再加強所述免疫應答。因此，與DNA-引發(fā)/痘苗病毒加強的方案相比，本發(fā)明最優(yōu)選的病毒能在痘苗病毒引發(fā)/痘苗病毒加強的方案中誘發(fā)至少基本上相同的免疫力水平。如果經WO02/42480中公開的“試驗1”和“試驗2”之一，優(yōu)選為這兩個試驗測定，與DNA-引發(fā)/痘苗病毒加強的方案相比，痘苗病毒引發(fā)/痘苗病毒加強方案中的CTL反應至少基本上相同，即可認為與DNA-引發(fā)/痘苗病毒加強的方案相比，痘苗病毒，特別是MVA毒株能在痘苗病毒引發(fā)/痘苗病毒加強方案中引發(fā)至少基本上相同的免疫力。更優(yōu)選與DNA-引發(fā)/痘苗病毒加強的方案相比，在至少一個試驗中，痘苗病毒引發(fā)/痘苗病毒加強給藥之后的CTL反應較高。最優(yōu)選兩個試驗中的CTL反應都比較高。本發(fā)明使用的病毒可以是非重組病毒，如MVA，即不含有異源核苷酸序列的病毒。非-重組痘苗病毒的例子是MVA-BN及其衍生物?；蛘?，病毒可以是重組病毒，如含有其它對病毒而言為異源的核苷酸序列的重組MVA。本申請所用術語“異源的”指的是一般與天然病毒不密切相關的任意核酸序列組合，也將所述病毒稱為“重組病毒”。異源核酸序列優(yōu)選選自編碼至少一種抗原、抗原表位、有益蛋白質和/或治療性化合物的序列。本申請所用術語“有益蛋白質”指的是任何有助于保護動物以使其免受選自腫瘤抗原和外源抗原的抗原攻擊的蛋白質，其中腫瘤抗原和外源抗原不同于與病毒相關的抗原?；蛘?，更特別地，“有益蛋白質”能有效增加可活化樹突細胞的因子的水平，和/或能有效增加樹突細胞的數(shù)目，和/或能有效增加干擾素(IFN)或IL-12的生成和/或細胞性含量。因此，所述有益蛋白質的例子是干擾素，如IFN-α或IFN-β，IL-12，F(xiàn)lt-3-L和/或GM-CSF?？乖砦豢梢允侨魏文苷T發(fā)免疫應答的表位?？乖砦坏睦邮堑米韵率錾矬w的表位惡性瘧蟲(Plasmodiumfalciparum)，分枝桿菌(Mycobacteria)，流感病毒，選自黃病毒科、副粘病毒、肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒的病毒或導致出血熱的病毒，如漢坦病毒或線狀病毒，即Ebola病毒或Marburg病毒。因此，例如，如果根據(jù)本發(fā)明使用表達異源表位的重組MVA接種新生兒，該治療的結果不僅僅因為其使免疫系統(tǒng)的成熟加速而成為一般性的接種，還是抗異源MVA所表達的異源表位的特異性接種。由重組病毒中的異源核酸編碼的“治療性化合物”可以是例如治療性核酸，如反義核酸或具有所需生物活性的肽或蛋白質。優(yōu)選將異源核酸序列插入病毒基因組的非-必需區(qū)?；蛘?，將異源核酸序列插入病毒基因組的天然缺失位點(有關MVA的情況公開于PCT/EP96/02926中)。本領域技術人員已知如何將異源序列插入病毒基因組，如痘病毒基因組。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的病毒，如MVA、例如用于在活的動物體，包括人體中誘發(fā)免疫應答的藥物組合物和疫苗。藥物組合物一般包括一種或多種藥物可接受的和/或準許的載體、添加劑、抗生素、防腐劑、佐劑、稀釋劑和/或穩(wěn)定劑。所述輔助物質可以是水、鹽水、甘油、乙醇、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。適當載體一般是代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂質聚集體等。為了制備疫苗，應將病毒或其重組體轉變?yōu)樯砜山邮艿男问?。轉變方法是本領域技術人員已知的。對MVA和其它痘病毒而言，可基于制備抗天花接種所用痘病毒疫苗的經驗(如Stickl，H等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392所述)來制備疫苗。例如，將純化的病毒以5×108TCID50/ml的滴度配制于約10mMTris，140mMNaClpH7.4中，并儲存于-80℃。為了制備疫苗注射劑，可在安瓿，優(yōu)選為玻璃安瓿中，將例如101-108個病毒(如MVA)顆粒凍干于100ml含有2％蛋白胨和1％人白蛋白的磷酸緩沖鹽水(PBS)內?；蛘?，通過逐步冷凍干燥制劑中的病毒來生產疫苗注射劑。該制劑中可含有其它添加劑，如甘露糖醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其它添加劑，如抗氧化劑或惰性氣體，穩(wěn)定劑或適于體內給藥的重組蛋白質(如人血清白蛋白)。然后密封玻璃安瓿，將其儲存于4℃至室溫幾個月。然而，只要不需要用，優(yōu)選將安瓿儲存于低于-20℃的溫度下。為了接種或治療，可將凍干物溶解于0.1至0.5ml水溶液，優(yōu)選為生理鹽水或Tris緩沖液，再通過非腸道、肌內或本領域技術人員已知的任何其它給藥途徑，全身性或局部施用所述液體。本領域技術人員可以已知的方式最優(yōu)化給藥模式、劑量和給藥次數(shù)?？赏ㄟ^口服、鼻、肌內、靜脈內、腹膜內、皮內、子宮內和/或皮下給藥施用本發(fā)明的病毒，特別是MVA。在小動物中，優(yōu)選通過非腸道或鼻進行免疫接種，而在較大的動物或人中，優(yōu)選皮下、肌內或口服接種。優(yōu)選以101TCID50(組織培養(yǎng)感染因子量)至109TCID50的劑量施用MVA。如上文所指出的，可在首次接種(“引發(fā)接種”)和二次接種(“加強接種”)中施用治療有效量的本發(fā)明病毒，特別是MVA，如MVA-BN及其衍生物。在本發(fā)明的上下文中，術語“動物”也覆蓋人類。更一般地，動物是脊椎動物，優(yōu)選為包括人的哺乳動物。動物的具體例子有如狗、貓的寵物，有重要經濟價值的動物，如小牛、牛、綿羊、山羊、馬、豬和其它動物，如小鼠、大鼠。對于這些動物和人來說，MVA和DISC-HSV是特別優(yōu)選的病毒。如果使用的病毒能感染鳥的細胞，但不能在所述細胞中復制成感染性子代病毒，本發(fā)明還可用于有重要經濟價值的鳥類，如火雞、鴨、鵝和母雞。本說明書中所用術語“家養(yǎng)動物”優(yōu)選指哺乳類家養(yǎng)動物，更優(yōu)選指狗、貓、小牛、牛、綿羊、山羊、豬、馬、鹿。根據(jù)第一個可替代的實施方案，可將本發(fā)明的病毒、特別是MVA-BN及其衍生物用作特異性的疫苗，即用于引發(fā)能保護被接種的新生兒以使其免于疾病的免疫應答，所述疾病是由與接種所用病毒屬于同一病毒組、科或屬的強毒病毒所引起的。例如，可以使用上文所定義的MVA，特別是MVA-BN及其衍生物接種新生嬰兒以抵抗痘病毒感染，特別是抗天花病毒感染。也可以使用MVA，特別是MVA-BN及其衍生物接種脊椎動物以抵抗在獸醫(yī)學上很重要的痘病毒感染。根據(jù)第一個可替代的實施方案，用于接種的病毒可以是非-重組病毒，例如MVA-BN或其衍生物，或者是在病毒基因組中攜有非天然地存在于所述基因組中的基因的重組病毒。優(yōu)選重組病毒攜有有助于刺激免疫應答的其它基因。此類基因的例子是細胞因子基因和干擾素基因。根據(jù)第二個但相關的可替代實施方案，用攜有如上文所定義的異源核酸序列的重組病毒接種新生兒，以誘發(fā)抗異源核酸序列所表達的氨基酸序列的免疫應答。例如，核酸序列可編碼如上文所定義的抗原或抗原表位。該實施方案中的重組病毒的例子是含有編碼抗原的異源核酸的重組MVA，特別是重組MVA-BN或其衍生物，所述抗原來自(i)除MVA以外的病毒，如HIV-1，HIV-2，登革病毒，西尼羅病毒，日本乙型腦炎病毒，麻疹病毒，(ii)腫瘤抗原，(iii)細菌，(iv)真菌。如果重組病毒所表達的抗原是例如HIV抗原，即可使用重組病毒在被接種的新生兒中誘發(fā)抗HIV和防AIDS的免疫應答。在較寬泛的意義上，使用表達抗原或抗原表位的重組病毒誘發(fā)抗衍生出所述異源序列的感染因子和/或含有抗原或抗原表位的感染因子的免疫應答。根據(jù)第三個可替代的實施方案，我們意外發(fā)現(xiàn)可以使用能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，但不能在新生的或產前的動物(包括人)的體內復制成感染性子代病毒的病毒制備藥物，用于保護動物，特別是新生動物(包括人)，使其抗選自腫瘤抗原和外源抗原的抗原，其中腫瘤抗原和/或外源抗原不同于與病毒相關的抗原。根據(jù)第三個可替代的實施方案，用本發(fā)明的病毒，特別是MVA，如MVA-BN及其衍生物接種的新生兒受到保護，能夠抵抗外源抗原，如感染因子的攻擊。因此，本發(fā)明的病毒，特別是MVA是新生兒的一般性疫苗，即通過用本發(fā)明的病毒，特別是MVA接種新生兒，新生兒的免疫系統(tǒng)更有能力對付外源抗原，如病毒。在實施例部分，所舉的例子是用MVA接種，隨后用1型單純皰疹病毒攻擊。因此，如果將本發(fā)明的病毒，特別是MVA用于接種新生兒，在關鍵的一段時間內，接種動物比未接種的動物更能受到抗外源抗原的保護作用，一直到建立起功能性的和成熟的免疫系統(tǒng)為止。根據(jù)本發(fā)明，“腫瘤抗原和/或外源抗原不同于與病毒相關的抗原”。該術語應被理解成根據(jù)此實施方案，本發(fā)明主要不想使用如MVA的病毒誘發(fā)抗病毒本身的免疫應答。取而代之的是使用病毒誘發(fā)能保護宿主以分別抗與病毒不相關的外源抗原和腫瘤抗原的免疫應答或至少是一般性的免疫刺激。術語“與病毒相關的抗原”指的是病毒顆粒的表位和抗原以及被病毒感染的細胞表面因病毒基因組表達所產生的抗原和表位。在此實施方案的上下文中，術語“外源抗原”指的是任何不是動物體的天然部分或組分的抗原和表位。特別地，外源抗原是得自感染因子和毒素的抗原和表位。典型的感染因子是病毒，如皰疹病毒、逆轉錄病毒、狂犬病毒、彈狀病毒、腺病毒；細菌，如沙門氏菌、支原體、腦膜炎球菌、嗜血桿菌；朊病毒或真菌。本發(fā)明的興趣不僅在于接種動物以抵抗外源抗原，在可替代的實施方案中，還適于接種動物以抵抗腫瘤抗原?！澳[瘤抗原”是與某些腫瘤疾病相關的抗原。腫瘤抗原是腫瘤患者的基因組所編碼的最常見的抗原。因此，嚴格說來，腫瘤抗原不是外源抗原。然而，腫瘤抗原在腫瘤中以顯著的量出現(xiàn)，而正常組織中腫瘤抗原的量顯著較低，最常見的情況是在正常組織中根本發(fā)現(xiàn)不了腫瘤抗原。腫瘤抗原的例子是本領域技術人員已知的，包括例如MAGE抗原。由于接種動物能導致免疫系統(tǒng)的活化和/或加速成熟，隨后導致腫瘤細胞的破壞，因此，MVA能有效地抗這些腫瘤抗原。術語“抵抗抗原的保護作用”是指產生針對外源或腫瘤抗原的免疫應答。如果外源抗原是感染因子，宿主則受到抵抗所述感染因子的保護作用，即宿主產生了抗所述抗原的免疫應答。因此，感染因子的感染導致較不嚴重的疾病或根本不導致疾病。不應將術語“保護”理解成總有抗外源或腫瘤抗原的100％保護作用。取而代之的是，本申請所用術語“保護”指的是任何有助于動物分別對付外源抗原和腫瘤抗原的有益效果。根據(jù)本發(fā)明，在首次接種之后，這種保護作用能發(fā)揮至少5天，優(yōu)選為至少7，14或28天。換句話說，如果動物分別在5，7，14和28天之后與所述抗原接觸，被接種和/或治療的動物受到保護，能例如抗外源抗原。在本發(fā)明的上下文中，誘發(fā)或增強免疫系統(tǒng)成熟和/或活化免疫系統(tǒng)可以解釋用本發(fā)明的病毒，特別是用MVA接種新生兒的效果。在本發(fā)明的上下文中，術語“誘發(fā)或增強免疫系統(tǒng)成熟”特別地指與對照相比，能快速增加接種者體內的樹突細胞或其前體。在本說明書中，術語“免疫系統(tǒng)的加速成熟”和“增強免疫系統(tǒng)的成熟”可以互換使用?！盎罨庖呦到y(tǒng)”的特征在于細胞表面能減輕細胞/細胞相互作用或運輸?shù)姆肿雍图に氐谋磉_和/或細胞分泌出所述分子和激素。特定的受體接收這些信號并作出反應。特別的活化標記為Flt3-L，IL-12，IFN-α，MHC-II和CD8，特別是CD8α(見下文)。免疫系統(tǒng)的加速發(fā)育/成熟與活化和/或移動(morbilization)樹突細胞(DC)或其前體細胞的因子的水平增加，和/或樹突細胞及其前體細胞數(shù)目的增加，和/或干擾素或IL-12的生成和/或細胞性含量增加相關。被本發(fā)明的病毒，特別是MVA誘導的DC前體細胞的例子是漿細胞樣DC前體，它對抗病毒感染的防御非常重要，并且似乎能產生IFNα/β。更具體地，增強免疫系統(tǒng)成熟的定義優(yōu)選為DC上存在的表面標記，如MHC-II，CD40和/或CD80/86至少增加2倍。優(yōu)選在血液中可檢測到所述增加。其它可表征增強免疫系統(tǒng)成熟的標記是Flt3-L，IL-12，IFN-α，MHC-II和CD8(見下文)。另外，加速免疫系統(tǒng)成熟優(yōu)選與下述現(xiàn)象相關，即與未接受MVA-BN的對照動物相比，給新生動物施用MVA-BN7天之后，血液和/或脾臟中CD11c陽性細胞的數(shù)目至少增加1.5倍，優(yōu)選至少增加2.0倍。另外，增強免疫系統(tǒng)成熟優(yōu)選與下述現(xiàn)象相關，即與年齡匹配的對照相比，用本發(fā)明的病毒接種新生兒2天之后，F(xiàn)lt3-L的濃度至少增加1.5倍，更優(yōu)選至少增加2.0倍。在此上下文中，應注意能以其表面表型表征的鼠和人DC群體的表型和功能之間有關聯(lián)(Hochrein等，2002.Hum.Immunol.631103)。使用一系列表面標記(MacDonald等，2002.Blood.1004512)的流式細胞計數(shù)可以測定血液中的DC，所述標記也可鑒定出特殊的DC群體，如漿細胞樣DC(Dzionek等，2002.HumImmunol.631133；Dzionek等，2000.J.Immunol.1656037)。使用類似的技術，也可檢測出其它人組織中的DC(Summers等，2001.Am.J.Pathol.159285)。根據(jù)本發(fā)明，也可以使用如上文所定義的病毒來治療新生的或產前的動物，以使活化和/或移動樹突細胞(DC)或其前體細胞的因子的水平增加，和/或樹突細胞及其前體細胞數(shù)目增加，和/或干擾素或IL-12的生成和/或細胞性含量增加。已闡明用MVA-BN接種之后，漿細胞樣樹突細胞制備出顯著更多的IL-12，所產生的IFN-α增加，并能上調MHC-II和CD8a。施用本發(fā)明所用病毒之后IL-12的增加倍數(shù)優(yōu)選為2倍、更優(yōu)選為100倍、500倍、1000倍、2500倍或5000倍。與年齡匹配的對照相比，用本發(fā)明的病毒，最優(yōu)選用MVA-BN或其衍生物接種新生兒2天之后，F(xiàn)lt3-L的濃度增加倍數(shù)優(yōu)選為1.5倍，更優(yōu)選為2.0倍。術語“活化樹突細胞或其前體”指的是通過由激素和刺激物驅動的尚不清楚的細胞期，DC成熟為抗原呈遞細胞。DC的中間體被稱為前體。這些不成熟的DC到達外周。不同的(抗原性)刺激物活化DC。在被活化的樹突細胞中被上調的活化標記特別地是Flt3-L，IL-12，IFN-α，MHC-II和CD8a(見下文)。應注意激素如GM-CSF導致外周產生更多不成熟的DC。因為GM-CSF導致骨髓、血液和外周器官(細胞不得不遷移至此)中產生更多的DC前體，該現(xiàn)象被稱為“樹突細胞或其前體的移動”。該定義也用于本說明書中。因此，如果欲使活化樹突細胞(DC)或其前體細胞的因子的水平增加，和/或樹突細胞或其前體細胞數(shù)目增加，和/或干擾素或IL-12的生成和/或細胞性含量增加，接種動物(包括人)特別有用。能活化樹突細胞的因子具體包括Flt3-L(Lyman等，Cell1993，751157-1167)和GM-CSF。本發(fā)明的典型干擾素是IFN-α和IFN-β。本發(fā)明所用的病毒誘導Flt3-L，假定因所述誘導而觀察到一些有益效果。在本申請的上下文中，新生動物或人被定義為尚不具有成熟免疫系統(tǒng)的動物或人。成熟免疫系統(tǒng)的特征在于能完全活化先天免疫系統(tǒng)，并且所有已知的T和B細胞功能和產物皆已到位，特別是免疫球蛋白同種型，如IgA和IgE。因此，不成熟的免疫系統(tǒng)的特征在于相對于成年動物或人而言，T細胞、B細胞和樹突細胞的數(shù)目較少，IFN的產量也較低，次級淋巴器官未完全成熟。更具體地，本發(fā)明上下文中的“新生兒”的定義為與成年動物的脾臟CD4+細胞平均數(shù)目相比，具有的脾臟CD4+細胞數(shù)目優(yōu)選要少至少2倍，更優(yōu)選少至少20倍，更優(yōu)選少至少200倍，更優(yōu)選少至少2,000倍，最優(yōu)選少至少20,000倍的新生動物。對4周齡的小鼠而言，免疫系統(tǒng)是成熟的。對人而言，可能需要6個月至1年才能成熟。對貓和狗而言，免疫系統(tǒng)通常在6月齡時成熟，對小牛、綿羊和豬而言，免疫系統(tǒng)在4-12周齡時成熟。優(yōu)選在免疫系統(tǒng)成熟之前，用本發(fā)明的病毒，特別是MVA進行接種。然而，由于在出生后成熟速度幾乎呈指數(shù)增長，因此最優(yōu)選在出生后盡可能早地用本發(fā)明的病毒，特別是MVA進行接種。由于在所有相關的家養(yǎng)動物和人中，免疫系統(tǒng)不會在早于出生后4周的時間內成熟，一般優(yōu)選在出生后4周內，更優(yōu)選在出生后2周內，甚至更優(yōu)選在出生后1周內，最優(yōu)選在出生后3天內，用本發(fā)明的病毒，特別是MVA進行接種。這些一般性的期限可用于所有重要的家養(yǎng)動物，特別是所有重要的家養(yǎng)哺乳動物，包括人。本領域技術人員應意識到下述事實在本發(fā)明的上下文中，甚至年齡較大的動物也被當成是新生動物，因此，當出生4周后免疫系統(tǒng)仍不成熟時，也可對年齡較大的動物進行成功接種。因此，對人而言，可以在出生后6個月內，更優(yōu)選在出生后3個月內，更優(yōu)選在出生后2個月內，更優(yōu)選在出生后4周內，更優(yōu)選在出生后2周內，甚至更優(yōu)選在出生后1周內，最優(yōu)選在出生后3天內進行接種。由于如果將病毒施用于不成熟的免疫系統(tǒng)，將能觀察到本發(fā)明的病毒，特別是MVA作為一般性疫苗的最佳效果，優(yōu)選接種甚至尚未出生的動物，包括人。對有重要經濟價值的動物，如?；蜇i而言，必需進行出生前接種。如果胎盤允許病毒通過，簡單地通過接種母體動物即可接種出生前的動物。因此，在具有胎盤內皮絨毛膜的動物，如狗、貓、大鼠和小鼠中或具有胎盤血絨毛膜的動物，如包括人的靈長類動物中，接種母體動物以接種出生前動物非常有應用前景。在具有胎盤絨毛膜上皮的動物，如牛和綿羊中或具有胎盤韌帶絨毛膜的動物，如豬和馬中，優(yōu)選通過子宮給藥接種出生前動物。當然，對于具有胎盤內皮絨毛膜或血絨毛膜的動物而言，也可進行這種給藥方式。由于本發(fā)明的病毒，特別是MVA能導致免疫系統(tǒng)的加速成熟，并且由于本發(fā)明的病毒，特別是MVA因此可用作一般性的疫苗，故被接種的動物受到抗多種疾病的保護。更具體地，可以使用本發(fā)明的病毒，特別是MVA接種貓以利于一般性的健康和抗貓皰疹病毒或貓感染性腹膜炎。可以給狗使用本發(fā)明的病毒，特別是MVA以利于一般性的健康和抗呼吸道相關(病毒)疾病?？梢越o豬，特別是增肥的豬使用本發(fā)明的病毒，特別是MVA以利于一般性的健康和抗嗜血桿菌或支原體感染。應指出優(yōu)選實施方案是在新生的或產前的動物中使用本發(fā)明的病毒，特別是MVA，以保護所述動物，使其抗外源抗原和/或腫瘤抗原，其中腫瘤抗原不同于與接種所用病毒相關的抗原。然而，該實施方案并不局限于新生的或產前的動物。取而代之的是，在另一個實施方案中，本發(fā)明可以對所有年齡的動物實施，因為也可以在成年動物中觀察到有益效果。因此，根據(jù)該實施方案，如上文所定義的病毒，特別是MVA-BN及其衍生物可用于保護動物(包括人)以抵抗選自腫瘤抗原和外源抗原的抗原，其中腫瘤抗原和/或外源抗原不同于與病毒相關的抗原。如上所述，本發(fā)明所用的病毒能感染動物細胞，但不能在所述細胞中復制成感染性的子代病毒。上文針對新生兒給出的所有信息、定義，包括對保護作用期限的定義，實施例以及優(yōu)選、更優(yōu)選和最優(yōu)選的實施方案也適用于本實施方案，根據(jù)此實施方案，病毒也可施用于成年動物。與新生動物相反，成年動物的免疫系統(tǒng)已經成熟。不過，由于某些疾病或僅僅因為動物的年齡，動物免疫系統(tǒng)可能被削弱。特別是在無免疫應答的群體和老年群體中，給動物施用本發(fā)明的病毒，特別是MVA可特別地通過增加活化和/或移動樹突細胞(DC)或其前體細胞的因子的水平，和/或增加樹突細胞或其前體細胞的數(shù)目，和/或增加干擾素或IL-12的生成和/或細胞性含量，而具有有益效果。因此，甚至在成年動物中，施用本發(fā)明的病毒，特別是MVA可導致免疫系統(tǒng)對付外源抗原和/或腫瘤抗原的能力提高。換句話說，本發(fā)明所用的病毒可用于一般性地活化免疫系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及用于制備給動物(包括人)施用的藥物的本發(fā)明的病毒，特別是MVA，其中所述藥物能增加活化樹突細胞的因子的水平，和/或增加樹突細胞的數(shù)目，和/或增加干擾素(IFN)或IL-12的生成和/或細胞性含量。上文給出的所有針對其它實施方案的定義也可用于本實施方案。根據(jù)此實施方案，本發(fā)明的主要目的不是誘發(fā)抗外源抗原和/或腫瘤抗原的保護作用。取而代之的是，此實施方案的目的是治療疾病，所述疾病的特征為活化樹突細胞的因子水平低，和/或樹突細胞的數(shù)目不足或太少，和/或干擾素(IFN)或IL-12的生成和/或細胞性含量低。因此，根據(jù)此實施方案，用本發(fā)明的病毒，特別是MVA治療能保護動物使其免受變態(tài)反應或自身免疫病。如果給新生動物施用本發(fā)明的病毒，特別是MVA，該治療也非常有應用前景。另外，根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的病毒，如MVA，特別是MVA-BN及其衍生物可特別地用于在無免疫應答的動物，如被SIV感染的猴(CD4＜400/μl血液)或無免疫應答的人中誘發(fā)免疫應答。術語“無免疫應答”描述了個體的免疫系統(tǒng)狀況，它僅顯示出不完全的免疫應答，或抗感染因子的防御效力降低。本發(fā)明還涉及通過施用本發(fā)明的病毒，特別是改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，保護動物(包括人)以抵抗選自腫瘤抗原和外源抗原的抗原的方法，其中腫瘤抗原和/或外源抗原不同于與病毒相關的抗原。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療動物(包括人)以增加活化樹突細胞的因子的水平，和/或增加樹突細胞的數(shù)目，和/或增加干擾素(IFN)或IL-12的生成和/或細胞性含量的方法，所述方法包括施用改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。發(fā)明簡述病毒用于制備藥物的用途，所述藥物用于接種或治療新生的或產前的動物(包括人)，其中所述病毒能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，但不能在新生的或產前的動物(包括人)的體內復制成感染性子代病毒。治療或接種新生的或產前的動物(包括人)的方法，所述方法包括施用病毒，其中所述病毒能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，但不能在新生的或產前的動物(包括人)的體內復制成感染性子代病毒。接種或治療新生的或產前的動物(包括人)的病毒，其中所述病毒能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，但不能在新生的或產前的動物(包括人)的體內復制成感染性子代病毒。如上所述的用途、方法或病毒，其中病毒是DNA病毒。如上所述的用途、方法或病毒，其中病毒選自DISC-皰疹病毒和改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。如上所述的用途、方法或病毒，其中MVA毒株是保藏于歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，保藏號為V00083008的MVA-BN及其衍生物。如上所述的用途、方法或病毒，其中通過口服、鼻、肌內、靜脈內、腹膜內、皮內、子宮內和/或皮下給藥施用MVA。如上所述的用途、方法或病毒，其中在首次接種(“引發(fā)接種”)和二次接種(“加強接種”)中施用治療有效量的MVA。如上所述的用途、方法或病毒，其中給動物(包括人)施用其量至少為101TCID50(組織培養(yǎng)感染因子量)的MVA。如上所述的用途、方法或病毒，其中接種用于抵抗痘病毒感染。如上所述的用途、方法或病毒，其中痘病毒感染是天花病毒感染。如上所述的用途、方法或病毒，其中病毒基因組含有至少一個異源核酸序列。如上所述的用途、方法或病毒，其中異源核酸序列選自編碼至少一種抗原、抗原表位和/或治療性化合物的序列。如上所述的用途、方法或病毒，其中接種用于抵抗衍生出所述異源序列的感染因子或含有至少一種抗原或抗原表位的感染因子。如上所述的用途、方法或病毒，其中接種是為了保護動物(包括人)以抵抗選自腫瘤抗原和外源抗原的抗原，其中腫瘤抗原和/或外源抗原不同于與病毒相關的抗原。如上所述的用途、方法或病毒，其中外源抗原選自感染因子和毒素。如上所述的用途、方法或病毒，其中感染因子選自病毒、細菌、朊病毒和真菌。如上所述的用途、方法或病毒，其中使用接種或治療以誘發(fā)或增強免疫系統(tǒng)的成熟和/或活化。如上所述的用途、方法或病毒，其中使用治療(i)增加活化和/或移動樹突細胞或其前體細胞的因子的水平，(ii)增加樹突細胞或其前體細胞的數(shù)目，或(iii)增加干擾素(IFN)或IL-12的生成和/或細胞性含量。如上所述的用途、方法或病毒，其中活化樹突細胞的因子是Flt3-L和/或GM-CSF。如上所述的用途、方法或病毒，其中干擾素是IFNα和/或IFNβ。含有上述病毒的藥物組合物。含有上述病毒的疫苗。附圖簡述圖1A在出生后24-48小時內，用106p.f.u.MVA或DISCHSV-1注射新生小鼠一次，或用生理鹽水(NaCl)處理新生小鼠以用作對照。在出生后7天，通過流式細胞計數(shù)，用全DC標記CD11c測定外周血中的這些細胞。圖中顯示出3至5次實驗的平均和標準誤差。圖1B與圖1A相同的實驗。然而，通過流式細胞計數(shù)測定脾臟中的CD11c細胞。圖1C與圖1A相同的實驗。然而，通過流式細胞計數(shù)測定腹膜液中的CD11c細胞。圖2如左欄所示，用MVA-BN接種小鼠。2周后，通過流式細胞計數(shù)測定脾臟和血液中CD11c+單和CD11c+/CD8+雙陽性細胞的百分比。圖3在1和5天齡時，用MVA或作為對照的NaCl注射新生小鼠。8天齡時，通過ELISA測定這些小鼠血清中的鼠Flt3-L，所給出的數(shù)值單位為pg/ml。圖4在出生24-48小時之內，用106p.f.u.MVA注射新生小鼠一次，或用NaCl處理以用作對照。7天齡時，將所有小鼠暴露于100×LD50HSV-1毒株F。監(jiān)測存活小鼠的數(shù)目達21天。圖5按圖4的方法處理小鼠。數(shù)據(jù)表示用100LD50HSV-1的9次不同的攻擊實驗。沒有對照動物在攻擊中存活。圖6在出生當天用MVA-BN接種，隨后進行致死痘苗病毒攻擊的成年小鼠的存活。用MVA-BN(2.5×107TCID50)接種3窩、每窩各6只1天齡幼仔(18只小鼠)，4周齡(成年小鼠)時，用致死劑量的痘苗病毒進行攻擊。MVA-BN接種顯然能在新生小鼠中誘發(fā)保護性的免疫力，該免疫力一直能持續(xù)到成年期。實施例下述實施例將進一步闡明本發(fā)明。本領域技術人員應能較好地理解不能以任何方式將所提供的實施例解釋成本發(fā)明提供的技術僅限于用在這些實施例中。實施例1(i)MVA-BN和DISC-HSV在新生動物中誘導CD11c+和CD8+表型的DC第一套實驗新生小鼠的IFN系統(tǒng)不成熟，因此具有天生的免疫缺陷。目前已知為IFN最佳生產者的DC的數(shù)目和活化狀態(tài)尚未被分析。通過多種刺激物可在體外及體內誘導DC。在這些研究中，檢測了受控的MVA-BN復制是否能誘導DC，并且分析了它們的表型。在出生后1-2天內，有些情況下在出生后5天，用106噬斑形成單位(p.f.u.)的MVA-BN或僅用鹽水注射小鼠組。通過FACS分析兩組中各個小鼠的血液和脾細胞，并比較數(shù)據(jù)。7至8只小鼠的數(shù)據(jù)表明用MVA-BN治療使CD11c+細胞增加2-3倍，伴隨著MHCII表達的增加以及CD4或CD8型T細胞存在量的增加，成熟B細胞的標記CD19/54的減少表示這些細胞遷移至除脾臟以外的器官中，或者表示B細胞前體早就征集至其它譜系，特別是攜有早期B細胞標記(B220)的漿細胞表型的DC中。三個不同實驗的數(shù)據(jù)顯示出再現(xiàn)性和顯著差異。用不同的復制受控的病毒疫苗DISC-HSV-1進行的實驗在新生兒引發(fā)之后，誘發(fā)出類似量的CD11c+細胞。結果簡述于圖1A-C。為了進一步研究血液和脾臟中的DC亞群并分析用MVA-BN治療的長期效果，分析2周齡動物血液和脾臟中的細胞。在此時間點，經治療動物的脾臟中的CD11c+細胞數(shù)目約兩倍于1周齡動物，但在出生時用病毒單次治療導致2周后脾臟中這些細胞的數(shù)目增加3倍(圖2)。在血液中也觀察到類似的效果，不同之處在于CD11c+/CD8a+約高4倍。在出生后7天用MVA-BN單次治療導致CD11c+/CD8a+增加13至40倍，而對CD11c+細胞的效果較不顯著。正如所預期的，在出生時和第7天進行的兩次接種對CD11c+細胞具有顯著效果。多種效果示于圖2。第二套實驗與對照小鼠相比，在出生時用2.5×107TCID50MVA-BN接種的1周齡小鼠的脾臟和血液中顯示出不同的免疫相關細胞群體的組合(表1)。在血液中，CD8陽性淋巴細胞群體增加，NK細胞的數(shù)目也有所增加。CD11c陽性細胞的數(shù)目約比對照高3倍，B-細胞(B220和CD19雙陽性的細胞)的百分比顯著降低。經免疫動物和對照之間脾臟中的細胞總數(shù)不變。與血液中相反，接種動物的脾臟比對照具有更多的CD4陽性T淋巴細胞，NK細胞的數(shù)目未增加。與血液類似，CD8陽性淋巴細胞的相對數(shù)目增加，而B-細胞數(shù)目減少。與對照相比，CD11c陽性細胞的百分比約高3倍。當4只未治療的對照的脾臟中CD11c陽性細胞的數(shù)目為3.6％，而4只經MVA-BN接種的小鼠中的相應數(shù)值為4.8％時，我們首先認為用MVA-BN接種5天后，樹突細胞的百分比有差異。與對照相比，相同量的經UV-滅活的MVA-BN在接種新生小鼠之后不會導致細胞群體發(fā)生任何顯著改變(數(shù)據(jù)未顯示)?？梢匀我膺x擇最初的接種劑量。滴定接種物之后，我們選擇標準劑量2.5×106TCID50進行接種(比最初實驗低10倍)。此劑量可誘導最多數(shù)目的DC(表2)。表1.用2.5×107TCID50MVA-BN免疫接種1周后，在新生小鼠血液和脾臟細胞中誘導的改變*Mann-WhitneyU-檢驗表2.1天齡wt小鼠和用MVA治療后7天內的、基因被定向破壞的小鼠脾臟中CD11c陽性細胞的誘導aWt＝C57BL/6或129Sv/Ev小鼠。b重組活化基因缺失的RAG小鼠(即沒有功能性的T和B細胞)。cI型(IFN-α和-β)和II型(IFN-γ)IFN受體基因被定向破壞的AG129。(ii)MVA-BN優(yōu)先誘導漿細胞樣樹突細胞(pDC)根據(jù)其它作者的看法，將也表達CD45RA或CD45R的CD11c陽性細胞看成是pDC(Asselin-Paturel等，2001，NatImmunol，121144)。我們想知道MVA-BN是否能誘使pDC增加。為此進行了進一步的實驗，其中分析了CD11c陽性細胞上的CD45RA或CD45R。與兩個對照組(未治療組3.0±0.3％，p＝0.01；UV-滅活的MVA-BN治療組3.0±0.2％，p＝0.006，Mann-WhitneyU-試驗)相比，經MVA-BN治療的小鼠中，CD11c和CD45R雙陽性細胞的百分比顯著較高(5.6±0.7％)。(iii)用MVA-BN治療的新生小鼠具有升高的血清Flt3-L水平Flt3-L是導致成年動物DC水平提高的造血因子。在人以及可能在小鼠中，該因子最豐富的來源是活化的T細胞。為了測定DC數(shù)目的增加是否是誘導的Flt3-L造成的，比較經MVA-BN治療的小鼠的血清與經模擬治療的動物的血清中該因子的存在。與經模擬治療的動物的血清相比，在第2和第5天接受治療的動物的血清中具有2倍的Flt3-L水平。因此，F(xiàn)lt3-L可能是一種負責增加DC數(shù)目的因子(圖3)。施用MVA-BN之后，評價新生小鼠中Flt3-L誘導的時間進程。在新生小鼠中，MVA-BN接種在24小時內誘導Flt3-L濃度的增加。48小時之后，誘導達到最大值，第7天時仍存在誘導，而第7天通常是分析脾細胞并檢測HSV-1抗性的時間(見下文)。與年齡匹配的對照動物相比，在經接種的小鼠中，接種后24小時和48小時，血清中的Flt3-L濃度增加2倍。實施例2(i)經MVA-BN治療的新生小鼠能在100至500LD50HSV-1的攻擊中存活出生后1或2天，用標準劑量的MVA-BN治療小鼠組，并在7-8天齡時用100至500LD50單純皰疹病毒1(HSV-1)進行攻擊(圖4)。經MVABN治療的小鼠能在HSV1攻擊中存活，而所有對照小鼠都在接種攻擊病毒后的5-6天內死亡。為了進一步支持這些觀察結果，用40只經MVABN治療的小鼠和45只對照小鼠進行9次攻擊實驗。80％以上經病毒治療的小鼠能在攻擊中存活，而對照小鼠全部死亡(圖5)。在分開的一套實驗中，用MVA-BN治療出生時的小鼠(2.5×106TCID50/小鼠)。第8天，用103(1LD50)或105(100LD50)PFUHSV-1進行攻擊。用MVA-BN接種之后，65％的小鼠能在可殺死100％對照小鼠的病毒劑量(100LD50)中存活，而90％的小鼠能在可殺死45.5％對照小鼠的劑量(1LD50)中存活。在其它實驗中，用HSV-1感染以7只為一組的、用UV-滅活MVA-BN接種過的小鼠。其中的5只在7天內死亡。其余2只動物停止生長并在第22和29天死亡。因此，用MVA-BN治療的小鼠已獲得增加的HSV-1抗性，這與活的MVA-BN，而不是滅活的MVA-BN相關。在用不具有功能性T細胞的小鼠所做的對照實驗中，已測定用MVA-BN接種后的抗HSV-1保護作用不是MVA-BN誘導的交叉-反應的細胞毒T-淋巴細胞所致。檢測用MVA-BN接種之后，DC細胞是否負責保護小鼠以使其免受HSV-1感染。為此，從經MVA治療的小鼠中轉移細胞4小時之后，用5×104PFUHSV-1攻擊首次用于實驗的8天齡小鼠。在第一個實驗中，將出生當天用MVA-BN治療過的8天齡小鼠的脾細胞分成DC富集(低密度)和DC貧瘠(高密度)組分。從DC富集組分中接受了5×106個細胞的小鼠50％能在攻擊中存活，而所有接受了少10倍的DC富集懸浮液的小鼠或未經治療的小鼠都在5天內死亡。第二種方法是將從出生當天用MVA-BN治療過的8天齡小鼠中正分離的CD11c陽性細胞轉移至首次用于實驗的年齡匹配的小鼠體內。含有80％以上來自MVA-BN治療小鼠的CD11c陽性細胞的2×106脾細胞懸浮液能保護首次用于實驗的小鼠，使其免受HSV-1感染。相反，4只未經治療的幼鼠以及其它8只未經治療的動物在攻擊后死亡。另外，接受相同量脾細胞的小鼠或從陰性組分中接受相當于1個脾臟的細胞量(50×106個細胞)的小鼠未顯示出增加的HSV-1抗性。因此，CD11c陽性細胞能保護小鼠，使其免受HSV-1感染。現(xiàn)有技術中已描述施用MVA之后，在約24小時的時間范圍內，有短期的保護作用(Vilsmeier，B.，Berl.Munch.Tierarztl.Wschr.112(1999)，329-333)。盡管所述出版物中所用的病毒不是不能在所用新生的或產前的動物體內復制成感染性子代病毒的病毒，檢測Vilsmeier所公開的作用模式是否類似于本申請所描述的作用模式。更具體地，Vilsmeier公開了MVA，特別是滅活的MVA能誘導paramunity約達24小時。為了檢測paramunity作用是否也能被看成是本申請公開的保護作用，用MVA-BN或滅活的MVA-BN接種出生24小時的小鼠。用致死劑量的HSV-1(105PFUHSF-1f)攻擊7天齡小鼠。未接種的對照小鼠在攻擊6天后死亡。用滅活的MVA-BN接種的小鼠也未獲得抗HSV-1攻擊的保護。這些小鼠中的DC細胞數(shù)目未提高。相反，用未滅活的MVA-BN接種的小鼠獲得了抗HSV-1攻擊的顯著保護作用。攻擊30天后，80％以上的小鼠仍然存活。接種2天后，在血清中發(fā)現(xiàn)了升高的血清Flt3-L。脾臟中的DC數(shù)目增加。增強的Flt3-L與DC數(shù)目增加有關。這進一步證實了paramunity作用不負責所觀察到的保護作用。(ii)MVA-BN在新生動物中誘導一直持續(xù)至成年期的特異性免疫力用MVA-BN(2.5×107TCID50)(腹膜內)接種1天齡C57BI/6小鼠(組的大小為18)。接種后4周，當認為小鼠成年時，用致死劑量(1×104TCID50)的痘苗病毒WesternReserve(VV-WR)攻擊這些小鼠。除了一只動物外，所有其它經MVA-BN接種的動物都能存活。相反，所有用安慰劑接種的動物都在7天內死亡，并表現(xiàn)出嚴重的臨床癥狀，如毛皮發(fā)皺、體重減輕和活力下降。顯然，這能清楚地闡明MVA-BN接種不僅對新生動物是安全的，而且能誘導抗致死痘苗病毒(MVA-BN的相關病毒)感染的保護性免疫應答。<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="853">申請人或代理人檔案號BN44PCT國際申請?zhí)?lt;/table></tables>關于微生物保藏的說明(細則13之二)<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="853">A.以下說明涉及說明書第6頁，第13行所述的微生物。B.保藏事項其它保藏在補充頁中□歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)保藏單位名稱EuropeanCollectionofCellCultures保藏單位地址(包括郵政編碼和國名)英國，WiltshireSP4OJG，Salisbury，應用微生物學和研究中心CenterforAppliedMicrobiology&amp;ResearchSalisburyWiltshireSP4OJGUnitedKingdom保藏日期2000年12月07日保藏號00120707C.補充說明(必要時)本欄內容有補充頁□我們要求，所述被保藏的微生物的樣品，只能根據(jù)相關專利法規(guī)，例如，EPC法規(guī)28(4)；英國專利法規(guī)1995，附錄2，第3段；澳大利亞細則3.25(3)；丹麥專利實施條例22和33(3)；以及任何另一指定國的相應的法律法規(guī)，發(fā)放給獨立的專業(yè)人員，而前提是此種行為在指定國是可行的并且也是被指定國的法律所充許的。D.本說明是為下列指定國作的(如果說明不是為所有指定國而作的)E.補充說明(必要時)下列說明將隨后向國際局提供(指出說明的類別，例如“保藏物的編號”)</table></tables>PCT/RO/134表(1998年7月)應用微生物學和研究中心以及歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心本文件在此證明，根據(jù)1977年頒布的布達佩斯條約，該病毒(保藏號V00120707)已于2000年12月7日被歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心接受為專利保藏。Dr.PJPacker質量經理，ECACC附錄3第14頁布達佩斯條約關于用于專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格收件人BAVARIANNORDICRESEARCHINSTITUTEGMBHFRAUNHOFERSTRASSE18BD-82152MARTINSRIED德國保藏人的姓名和地址當適用于細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。Ormsp/4(只此一頁)附錄3第24頁布達佩斯條約關于用于專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格收件人存活證明BAVARIANNORDICRESEARCH由下一頁所指明的國際保藏單INSTITUTEGMBH位根據(jù)細則10.2出具FRAUNHOFERSTRASSE18BD-82152MARTINSRIED德國應接到此存活證明的單位的名稱和地址1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。2對于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。3用打叉表示選定。表格BP/4(第1頁)附錄3第25頁4如果要求該信息并且如果檢驗為陰性，則填寫此項。分析試驗的證書產物描述MVA-575保藏號00120707批準人＿＿ECACC質量主管日期＿＿＿＿分析試驗的證書產物描述MVA-575保藏號00120707批準人＿＿ECACC質量主管日期＿＿＿＿關于微生物保藏的說明(細則13之二)PCT/RO/134表(1998年7月)應用微生物學和研究中心以及歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心本文件在此證明，根據(jù)1977年頒布的布達佩斯條約，該病毒(保藏號V00083008)已于2000年8月30日被歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心接受為專利保藏。Dr.PJPacker質量經理，ECACCBP/4表格(第1頁)附錄3第25頁4如果要求該信息并且如果檢驗為陰性，則填寫此項。附錄3第24頁布達佩斯條約關于用于專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格收件人存活證明BAVARIANNORDICRESEARCH由下一頁所指明的國際保INSTITUTEGMBH藏單位根據(jù)細則10.2出具FRAUNHOFERSTRASSE18BD-82152MARTINSRIED德國應接到此存活證明的單位的名稱和地址1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。2對于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。3用打叉表示選定。附錄3第14頁布達佩斯條約關于用于專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格收件人BAVARIANNORDICRESEARCHINSTITUTEGMBHFRAUNHOFERSTRASSE18BD-82152MARTINSRIED德國保藏人的姓名和地址當適用于細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。Ormsp/4(只此一頁)權利要求1.病毒用于制備藥物的用途，所述藥物用于接種或治療新生的或產前的動物，包括人，其中所述病毒能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，但不能在新生的或產前的動物(包括人)的體內復制成感染性子代病毒。2.用于接種或治療新生的或產前的動物(包括人)的病毒，其中所述病毒能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，但不能在新生的或產前的動物(包括人)的體內復制成感染性子代病毒。3.根據(jù)權利要求1或2中任一項的用途或病毒，其中所述病毒是DNA病毒。4.根據(jù)權利要求1至3中任一項的用途或病毒，其中所述病毒選自DISC-皰疹病毒和改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。5.根據(jù)權利要求4的用途或病毒，其中所述MVA毒株是保藏于歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，保藏號為V00083008的MVA-BN及其衍生物。6.根據(jù)權利要求4至5中任一項的用途或病毒，其中所述MVA通過口服、鼻、肌內、靜脈內、腹膜內、皮內、子宮內和/或皮下給藥施用。7.根據(jù)權利要求4至6中任一項的用途或病毒，其中所述MVA在首次接種(“引發(fā)接種”)和二次接種(“加強接種”)中以治療有效量施用。8.根據(jù)權利要求4至7中任一項的用途或病毒，其中所述MVA施用給動物(包括人)的量至少為101TCID50(組織培養(yǎng)感染因子量)。9.根據(jù)權利要求4至8中任一項的用途或病毒，其中所述接種用于抵抗痘病毒感染。10.根據(jù)權利要求9的用途或病毒，其中所述痘病毒感染是天花病毒感染。11.根據(jù)權利要求1至10中任一項的用途或病毒，其中所述病毒的基因組含有至少一種異源核酸序列。12.根據(jù)權利要求11的用途或病毒，其中異源核酸序列選自編碼至少一種抗原、抗原表位和/或治療性化合物的序列。13.根據(jù)權利要求11至12中任一項的用途或病毒，其中所述接種用于抵抗衍生出所述異源序列的感染因子或含有至少一種抗原或抗原表位的感染因子。14.根據(jù)權利要求1至8或11至12中任一項的用途或病毒，其中所述接種是為了保護動物(包括人)以抵抗選自腫瘤抗原和外源抗原的抗原，其中所述腫瘤抗原和/或外源抗原不同于與所述病毒相關的抗原。15.根據(jù)權利要求14的用途或病毒，其中所述外源抗原選自感染因子和毒素。16.根據(jù)權利要求15的用途或病毒，其中所述感染因子選自病毒、細菌、朊病毒和真菌。17.根據(jù)權利要求1至8中任一項的用途或病毒，其中所述接種或治療用于誘發(fā)或增強免疫系統(tǒng)的成熟和/或活化。18.根據(jù)權利要求1至8中任一項的用途或病毒，其中所述治療用于(i)增加使樹突細胞或其前體細胞活化和/或移動的因子的水平，(ii)增加樹突細胞或其前體細胞的數(shù)目，或(iii)增加干擾素(IFN)或IL-12的生成和/或細胞性含量。19.根據(jù)權利要求18的用途或病毒，其中使樹突細胞活化的因子是Flt3-L和/或GM-CSF。20.根據(jù)權利要求18至19中任一項的用途或病毒，其中干擾素是IFNα和/或IFNβ。全文摘要本發(fā)明涉及病毒用于制備藥物的用途，所述藥物用于接種或治療新生的或產前的動物(包括人)，其中所述病毒能感染新生的或產前的動物(包括人)的細胞，但不能在新生的或產前的動物(包括人)的體內復制成感染性子代病毒。優(yōu)選病毒為改良的安卡拉痘苗病毒。本發(fā)明具體涉及接種新生兒以抵抗與接種所用病毒屬于相同病毒組的病毒的感染。另外，本發(fā)明涉及接種新生兒以抵抗選自外源抗原和腫瘤抗原的抗原，其中腫瘤抗原和/或外源抗原不同于與病毒相關的抗原。本發(fā)明還涉及如上文所限定的病毒提高能活化樹突細胞或其前體細胞的因子水平和/或增加樹突細胞或其前體細胞數(shù)目和/或提高干擾素(IFN)或IL－12的生成和/或細胞性含量的用途。文檔編號C12N7/00GK1646158SQ03808786公開日2005年7月27日申請日期2003年4月16日優(yōu)先權日2002年4月19日發(fā)明者保羅·查普林,馬克·蘇特,馬塞厄斯·阿克曼,馬科·弗朗奇尼,薩拜因·沃爾斯蒂特,漢斯·P·赫夫蒂申請人:巴法里安諾迪克有限公司