專利名稱：：HeadloopDNA擴(kuò)增的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及模板分子尤其是核酸的選擇性擴(kuò)增。在一個(gè)特別的方面，本發(fā)明涉及但非限于一種DNA擴(kuò)增的方法及用于該方法中的新引物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明方法的特別應(yīng)用發(fā)明背景聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是基于重復(fù)進(jìn)行雙鏈DNA的變性，隨后的寡核苷酸引物與DNA模板退火，并通過DNA聚合酶進(jìn)行引物延伸這一循環(huán)(例如見Mullis等美國(guó)專利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159所述)。將PCR中使用的寡核苷酸引物設(shè)計(jì)為與所述DNA的相反鏈退火并加以定位以便一個(gè)引物的DNA聚合酶催化的延伸產(chǎn)物可以作為其它引物的模板鏈。PCR擴(kuò)增可以導(dǎo)致分散的DNA的指數(shù)增加，所述DNA長(zhǎng)度由所述寡核苷酸引物的5’末端限定。在并入?yún)⒖嫉?003年2月25日提請(qǐng)的題目為“核酸擴(kuò)增”的共同未決國(guó)際申請(qǐng)中，我們描述了使用一種引物選擇性擴(kuò)增核酸的方法，所述引物包括是非靶核酸中一個(gè)序列的反向重復(fù)的一個(gè)區(qū)域。DNA的PCR擴(kuò)增中的特異性主要通過引物的序列并結(jié)合進(jìn)行退火步驟的溫度而確定。針對(duì)密切相關(guān)的序列，已經(jīng)結(jié)合額外的方案以提供選擇性擴(kuò)增。在序列差異相應(yīng)于限制酶位點(diǎn)之處，可以使用限制酶消化以切割不必要的序列并防止其擴(kuò)增。抑制擴(kuò)增的另一方法是使用寡核苷酸或PNA(肽核酸)分子，其與所述DNA鏈之一在待擴(kuò)增的和/或與引物之一的結(jié)合位點(diǎn)重疊的區(qū)域內(nèi)退火，并防止DNA合成的開始或延長(zhǎng)。將這種寡核苷酸設(shè)計(jì)為優(yōu)先與兩個(gè)相關(guān)序列之一退火并抑制其擴(kuò)增。我們?cè)谙挛拿枋隽耸褂肞CR引物選擇性抑制一或多個(gè)密切相關(guān)的序列擴(kuò)增的一種新方法，所述引物可以在靶序列和抑制的序列上均可引發(fā)(prime)及延伸。發(fā)明揭示第一方面，本發(fā)明提供了一種選擇性擴(kuò)增樣品中靶核酸的方法，所述樣品包含所述靶核酸及至少一種非靶核酸，所述方法包括利用至少一種寡核苷酸引物擴(kuò)增所述核酸，所述引物包含一個(gè)引物區(qū)，其可以在靶核酸及非靶核酸上引發(fā)及延伸；一個(gè)區(qū)域，其是所述至少一個(gè)非靶核酸的擴(kuò)增子的一種內(nèi)在序列的反向重復(fù)，而如果所述靶核酸的擴(kuò)增子存在相應(yīng)的內(nèi)在序列，則所述區(qū)域與所述靶核酸的擴(kuò)增子的相應(yīng)的內(nèi)在序列之間存在至少一個(gè)錯(cuò)配。優(yōu)選地，所述反向重復(fù)是在所述引物的5’末端的延伸。本發(fā)明第一方面的引物也稱為“headloop引物”。發(fā)明詳述本發(fā)明的方法同時(shí)可包含一個(gè)單一引物的應(yīng)用，優(yōu)選所述“擴(kuò)增”是“指數(shù)性的”，并因此利用通常稱為“正向”和“反向”引物的一對(duì)引物，其一與一條核酸鏈互補(bǔ)，另一與該鏈的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。在使用一對(duì)擴(kuò)增引物之處，兩引物之一或兩者均可以包含一條反向重復(fù)序列。所述擴(kuò)增可以通過任何適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增技術(shù)例如PCR進(jìn)行。所述PCR可以是實(shí)時(shí)PCR。所述引物除外所述反向重復(fù)部分的長(zhǎng)度可以是適于擴(kuò)增方法的任何長(zhǎng)度，典型為大約15-35堿基之間。所述引物的反向重復(fù)部分(或者在此稱為頭(head))可以包含許多核苷酸，足以在擴(kuò)增的退火及延伸條件下在匹配的序列上實(shí)現(xiàn)引發(fā)，且典型為大約5-30個(gè)堿基。本發(fā)明的方法特別可應(yīng)用于在從兩或多個(gè)密切相關(guān)的序列中選擇性擴(kuò)增一靶序列。因此，在第二方面，本發(fā)明提供了一種選擇性擴(kuò)增樣品中靶核酸的方法，所述樣品包含所述靶核酸及至少一種密切相關(guān)的非靶核酸，所述方法包含利用至少一種寡核苷酸引物擴(kuò)增所述核酸，所述寡核苷酸引物包含一個(gè)引物區(qū)，其可以在靶核酸及非靶核酸上引發(fā)及延伸；一個(gè)區(qū)域，其是所述至少一種非靶核酸的擴(kuò)增子的一種內(nèi)在序列的反向重復(fù)，而如果所述靶核酸的擴(kuò)增子存在相應(yīng)的內(nèi)在序列，則所述區(qū)域與所述靶核酸的擴(kuò)增子的相應(yīng)的內(nèi)在序列之間存在至少一個(gè)錯(cuò)配。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸可以是甲基化的核酸。因此本發(fā)明的方法可用于實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增甲基化或非甲基化的DNA。因此，在第三方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)第一或第二方面的方法，其中所述靶核酸和非靶核酸是核酸在擴(kuò)增之前通過化學(xué)修飾而形成的。例如，所述方法可應(yīng)用于用亞硫酸氫鈉化學(xué)修飾的DNA，以使得可以選擇性擴(kuò)增甲基化的DNA，同時(shí)抑制非甲基化的序列。所述甲基化的DNA可以是人基因例如GSTP1基因的序列。在國(guó)際專利申請(qǐng)出版物WO99/55905(在此以其全文并入?yún)⒖?中，我們揭示了一種診斷或判斷預(yù)后的分析方法，該分析方法可以檢測(cè)特征在于在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)Pi基因和/或其調(diào)節(jié)側(cè)翼序列內(nèi)的一或多個(gè)位點(diǎn)的胞嘧啶的異常甲基化的疾病或病變(例如前列腺癌、肝癌和乳腺癌)。WO99/55905所描述的分析基于使用甲基化特異性引物，所述引物特異于在GSTP1基因和/或其調(diào)節(jié)側(cè)翼序列內(nèi)的位點(diǎn)的甲基化胞嘧啶。相反，本發(fā)明的方法基于這樣的引物，其能引發(fā)靶核酸和非靶核酸，但其擴(kuò)增靶核酸的選擇性歸功于使用的引物包含這樣的一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域是所述非靶核酸的擴(kuò)增子的一種內(nèi)在序列的反向重復(fù)。本發(fā)明的方法因此提供了WO/9955905中描述的甲基化特異性引物方法學(xué)的另一種方式。因此，第四方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)Pi基因和/或其調(diào)節(jié)側(cè)翼序列內(nèi)的一或多個(gè)位點(diǎn)的胞嘧啶的異常甲基化的分析方法，其中所述分析方法包括將分離的DNA暴露于用于擴(kuò)增GSTP1基因和/或其調(diào)節(jié)側(cè)翼序列內(nèi)一靶區(qū)域的反應(yīng)物及條件下，所述靶區(qū)域是發(fā)生胞嘧啶異常甲基化的一或多個(gè)位點(diǎn)，所述擴(kuò)增使用至少一種寡核苷酸引物進(jìn)行，所述引物包含一個(gè)引物區(qū)，其可以在分離的DNA內(nèi)的靶區(qū)域及非甲基化的非靶區(qū)域上引發(fā)及延伸；以及一個(gè)區(qū)域，其是所述非靶區(qū)域的擴(kuò)增子的一種內(nèi)在序列的反向重復(fù)，但其與所述靶區(qū)域的相應(yīng)內(nèi)在序列之間存在至少一個(gè)錯(cuò)配；(iii)確定擴(kuò)增的DNA的存在情況。所述靶區(qū)域可以是由CpG位點(diǎn)-43至+55(并包含其在內(nèi))所限定的GSTP1基因和/或其調(diào)節(jié)側(cè)翼序列的區(qū)域內(nèi)的一段核酸序列。本發(fā)明第四方面的分離的DNA可以進(jìn)行化學(xué)修飾以將非甲基化的胞嘧啶變換為尿嘧啶，所述化學(xué)修飾可以通過亞硫酸氫鹽處理而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明第四方面的分析方法可用作檢測(cè)受試對(duì)象中疾病或病變的診斷分析方法或判斷預(yù)后分析方法，所述疾病或病變特征在于胞嘧啶的異常甲基化。所述疾病或病變可以例如是前列腺癌、肝癌或乳腺癌。在下文描述的一特殊實(shí)施例中，本發(fā)明的方法用于選擇性擴(kuò)增大量非甲基化的序列中存在的甲基化的DNA。在用亞硫酸氫鈉處理之后，胞嘧啶(C)變換為尿嘧啶(U)，而甲基胞嘧啶保持不變。在這種情況中，所述頭設(shè)計(jì)為下游序列的反向重復(fù)，預(yù)期得自非甲基化的DNA片段經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的變換。在其已經(jīng)拷貝之后，加入的序列在衍生自非甲基化的DNA的片段上自身引發(fā)，導(dǎo)致非甲基化的片段的擴(kuò)增被抑制。由于所述下游序列是加以選擇的以便含有幾個(gè)CpG位點(diǎn)(且亞硫酸氫鹽變換在甲基化的DNA的情況中不發(fā)生)，因此不足以互補(bǔ)以進(jìn)行自身引發(fā)，并因此對(duì)甲基化的DNA片段的擴(kuò)增抑制較小或不抑制。本發(fā)明的方法還可以用于其它方面，例如辨別等位基因變體或突變及基因家族的成員?？梢詳U(kuò)增含有短序列區(qū)域內(nèi)的突變的DNA同時(shí)抑制野生型序列(例如腫瘤抑制基因)的擴(kuò)增。本發(fā)明還可用于通過抑制優(yōu)勢(shì)物種的序列擴(kuò)增而實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增環(huán)境中次要物種(例如細(xì)菌)的DNA。在第五方面，本發(fā)明包括進(jìn)行模板擴(kuò)增的寡核苷酸引物，所述引物包含非靶擴(kuò)增子內(nèi)的一種核酸序列的一個(gè)反向重復(fù)，但其與靶核酸的相應(yīng)序列錯(cuò)配。本發(fā)明進(jìn)一步包括一試劑盒，所述試劑盒包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸引物。本發(fā)明還包括利用這種引物的擴(kuò)增方法及分析方法，以及進(jìn)行這種分析方法的試劑盒。術(shù)語(yǔ)本申請(qǐng)書中所用術(shù)語(yǔ)“引物”及“引物區(qū)”是指一種寡核苷酸，其在存在核苷酸和聚合劑的情況下能作為合成的始發(fā)點(diǎn)。所述引物優(yōu)選是單鏈的，但也可以是雙鏈的。如果引物是雙鏈的，在擴(kuò)增反應(yīng)之前所述的兩條鏈?zhǔn)欠蛛x的。對(duì)本發(fā)明中使用的引物加以選擇以便它們與被擴(kuò)增的序列的不同鏈充分互補(bǔ)，以便所述引物在擴(kuò)增反應(yīng)條件下能與所述序列的鏈雜交。因此所述引物中可以包含非互補(bǔ)的堿基或序列，條件是所述引物與感興趣的序列充分互補(bǔ)以與該序列雜交。所述寡核苷酸引物可以通過本領(lǐng)域熟知的方法制備，或者可以從一生物學(xué)來(lái)源中分離。在固體支持物上合成寡核苷酸引物的方法見美國(guó)專利No.4,458,068所揭示，其內(nèi)容在此并入?yún)⒖?。術(shù)語(yǔ)“PCR”是指一種聚合酶鏈反應(yīng)，其是熱循環(huán)的、聚合酶介導(dǎo)的DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR典型包括核酸、與所述核酸的每個(gè)鏈互補(bǔ)的寡核苷酸引物、一種熱穩(wěn)定DNA聚合酶及脫氧核糖核苷酸，并包括三種獨(dú)特方法，多次重復(fù)進(jìn)行所述方法以擴(kuò)增所述原始核酸。所述三種方法(變性、雜交和引物延伸)通常在獨(dú)特溫度及在獨(dú)特時(shí)間步驟進(jìn)行。然而在許多實(shí)施方案中，所述雜交及引物延伸程序可以同時(shí)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“核酸”是指在合成互補(bǔ)分子中可作為模板的具有特定的相同性的一種分子。所述“核酸”可以是DNA或RNA，例如雙鏈或單鏈DNA或RNA或者雙鏈的DNA-RNA雜種和/或其類似物和衍生物。特別地，“核酸”是指兩個(gè)引物之間及包含所述引物的序列。特異的序列的核酸可以衍生自多種來(lái)源，包括人、哺乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、昆蟲、細(xì)菌、真菌、植物和病毒。在某些實(shí)施方案中，所述靶核酸是這樣的一種核酸，即其存在與否可用于但非限于某些醫(yī)學(xué)或法醫(yī)領(lǐng)域如疾病或癌癥的判斷預(yù)后/診斷、選擇性物種分離、DNA指紋法等。使用本發(fā)明可以擴(kuò)增任何核酸，只要已知所述序列兩端足夠數(shù)量的堿基，以便可以制備寡核苷酸引物，所述引物將與被擴(kuò)增的序列的不同鏈雜交。在PCR中，“靶核酸”可以代表加入反應(yīng)中的核酸的片段或一部分?！胺前泻怂帷笔莵?lái)自另外物種的核酸的相當(dāng)區(qū)域，相同物種或者任何其它相關(guān)來(lái)源中的另外基因。術(shù)語(yǔ)“脫氧核苷三磷酸”是指dATP、dCTP、dGTP和dTTP及其類似物。本發(fā)明申請(qǐng)中所用術(shù)語(yǔ)“聚合劑”是指任何化合物和系統(tǒng)，其可以用于合成一種引物延伸產(chǎn)物。合適的化合物包括但非限于熱穩(wěn)定聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、T.litoralisDNA聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶?！盁岱€(wěn)定聚合酶”是指一種DNA和RNA聚合酶，其能經(jīng)受住非常高的溫度，如接近100℃。通常熱穩(wěn)定聚合酶衍生自生活在極端溫度中的生物體，如衍生自水生棲熱菌(Thermusaquaticus)。熱穩(wěn)定聚合酶例如包括Taq、Tth、Pfu、Vent、deepvent、UlTma及其變體和衍生物?！按竽c桿菌聚合酶I”是指大腸桿菌的DNA聚合酶I全酶。所述“Klenow片段”是指DNA聚合酶I全酶的兩個(gè)蛋白酶解片段中較大的那個(gè)，該片段保留聚合酶活性但喪失與完整酶相關(guān)的5’外切核酸酶活性。“T7DNA聚合酶”是指來(lái)自噬菌體T7的一種DNA聚合酶。“擴(kuò)增子”是在擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的一種多核苷酸產(chǎn)物。本發(fā)明文中提及的“錯(cuò)配(mismatch)”包括這樣的情況，即所述引物的反向重復(fù)區(qū)(頭)中的一個(gè)核苷酸不或不能與衍生自相應(yīng)于非靶核酸的內(nèi)在序列(反向重復(fù)區(qū)衍生自其中)的靶核酸的一部分的靶擴(kuò)增子中的相應(yīng)核苷酸通過Watson-Crick堿基配對(duì)。例如反向重復(fù)區(qū)中的腺嘌呤與靶擴(kuò)增子中相應(yīng)序列中的腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤形成錯(cuò)配。另外，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)核苷酸由于缺少第二個(gè)核苷酸(即不相配的核苷酸)或者由于存在額外的核苷酸而不能與第二個(gè)核苷酸配對(duì)時(shí)，發(fā)生錯(cuò)配。所述反向重復(fù)區(qū)可含有一個(gè)以上的錯(cuò)配。所述缺少的或額外的核苷酸可以在所述引物的頭部或在靶核酸的內(nèi)在序列中。為了使本發(fā)明更易于理解，我們提供了以下非限制性實(shí)施例。為了更好地理解本發(fā)明但不以任何方式限制本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的一般原則概括示于圖1。給PCR中使用的兩條引物之一或兩者加入5’延伸物(頭)。所述頭的序列是擴(kuò)增子內(nèi)的內(nèi)在序列的反向重復(fù)，將其設(shè)計(jì)為與擴(kuò)增被抑制的序列匹配，但與希望擴(kuò)增的序列充分錯(cuò)配。當(dāng)拷貝時(shí)，所述頭產(chǎn)生3’末端序列，該序列由于其與下游序列的互補(bǔ)性而能自身引發(fā)。這樣將產(chǎn)生長(zhǎng)的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，其不能有效用作進(jìn)一步擴(kuò)增循環(huán)的模板，導(dǎo)致不希望的片段的擴(kuò)增抑制。如果一種引物含有這種頭延伸物，則所述PCR反應(yīng)包括確定擴(kuò)增特異性的三個(gè)區(qū)域，即正向和反向引發(fā)位點(diǎn)及頭引發(fā)位點(diǎn)。通過在正向和反向引物時(shí)均包含一頭，可以將4個(gè)選擇性區(qū)域摻入一個(gè)單一的PCR反應(yīng)中。先前已經(jīng)觀測(cè)到導(dǎo)致出乎意料地高分子量的片段合成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成(VPotamanBioTechniques271110-1114(1999))，發(fā)夾結(jié)構(gòu)已經(jīng)不用于提供選擇性擴(kuò)增。一種發(fā)夾引發(fā)的不同應(yīng)用(其中引物內(nèi)發(fā)生引發(fā))已經(jīng)用于抑制PCR步行(walking)中引發(fā)的假“末端修復(fù)”(Devonetal，NucleicAcidsRes.231644(1995))。這不包括靶序列內(nèi)的headloop引發(fā)。附圖簡(jiǎn)述圖1是使用本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案擴(kuò)增一種靶序列的示意圖。圖2示出來(lái)自大腸桿菌、S.acidophilus和熱氧化硫化桿菌(Sulfobacillusthermosulfidooxidans)的16S核糖體RNA基因的擴(kuò)增的區(qū)域的序列對(duì)比。在所有這三個(gè)物種中均相同的堿基用黑色標(biāo)示，在三個(gè)物種的兩個(gè)中相同的堿基用灰色標(biāo)示。圖中指出了相應(yīng)于引物及相應(yīng)于headloop靶區(qū)域的序列。圖3EHL48Headloop引發(fā)的圖表。圖4大腸桿菌DNA與S.acidophilus或熱氧化硫化桿菌rDNA擴(kuò)增子的混合物以上述所示量制備。擴(kuò)增使用如實(shí)驗(yàn)組所示的反向引物NR-R1i及非選擇性的正向引物NR-F1i或headloop引物EHL48、EHL64或SAHL。在A組中，MgCl2為1.7mM，引物為200nM。在B組中，MgCl2為1.3mM，引物為400nM，在C組中，MgCl2為1.5mM，引物為400nM。在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，通過監(jiān)測(cè)SyberGreen熒光隨著溫度提高而發(fā)生的變化進(jìn)行解鏈曲線分析(在ABIPrism7700實(shí)時(shí)PCR設(shè)備中)。圖5使用400nM的引物SAHL和NR-R1i進(jìn)行所有PCR，輸入rDNA擴(kuò)增子的比率如上述實(shí)驗(yàn)組所示。A組示出其中MgCl2濃度為1.3mM或1.5mM的反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的解鏈圖。在B組和C組中，使用1.3mM的最佳MgCl2濃度。D組示出在無(wú)或有0.6M甜菜堿的條件下進(jìn)行的反應(yīng)，MgCl2為1.5mM。在存在甜菜堿的條件下解鏈溫度的降低是顯而易見的。圖6示出使用不同的headloop引物擴(kuò)增甲基化或非甲基化的質(zhì)粒DNA。圖7示出使用對(duì)照引物CLUR-F2得自甲基化、非甲基化的DNA及DNA混合物的PCR產(chǎn)物的解離曲線。圖8示出使用headloop引物CLUH-F2得自甲基化、非甲基化的DNA及DNA混合物的PCR產(chǎn)物的解離曲線。圖9是通過對(duì)照及headloop引物從質(zhì)粒DNA混合物中擴(kuò)增的對(duì)比，使用Taqman檢測(cè)非甲基化的PCR產(chǎn)物而進(jìn)行。圖10是通過對(duì)照及headloop引物從質(zhì)粒DNA混合物中擴(kuò)增的對(duì)比，使用Taqman檢測(cè)甲基化的PCR產(chǎn)物而進(jìn)行。圖11是通過對(duì)照及headloop引物從基因組DNA混合物中擴(kuò)增的對(duì)比，使用Taqman檢測(cè)非甲基化的PCR產(chǎn)物而進(jìn)行。圖12是通過對(duì)照及headloop引物從基因組DNA混合物中擴(kuò)增的對(duì)比，使用Taqman檢測(cè)非甲基化的PCR產(chǎn)物而進(jìn)行。圖13是GSTP1基因從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的64個(gè)堿基上游至96個(gè)堿基下游的序列，其是未經(jīng)修飾的(上)或者隨后經(jīng)亞硫酸氫鹽變換及PCR擴(kuò)增，假定CpG位點(diǎn)是甲基化的(下，B-M)。CpG位點(diǎn)的-7至+10的位置在序列上示出。圖中示出了正向引物F52A的位置(注意在CpG位點(diǎn)-3的堿基錯(cuò)配)。HeadloopsHlint5-10Ni(GSTintR11i)和Hlint5-10和5-10X(GSTintR1)的堿基引物的位置在其靶序列的下方示出。引物的頭區(qū)在其靶序列的下方示出。就每個(gè)headloop引物而言，用箭頭示出了與其引物部分結(jié)合的頭序列。圖14以1000個(gè)非甲基化分子1個(gè)甲基化分子的比率制備涵蓋被擴(kuò)增的及衍生自甲基化和非甲基化的亞硫酸氫鹽處理的DNA的區(qū)域的兩個(gè)質(zhì)粒的混合物。使用F52A及所示headloop引物進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)條件如文中所述，MgCl2為1.1mM。圖中示出了解鏈曲線圖，相應(yīng)于甲基化序列的峰在右側(cè)。圖15對(duì)代表106非甲基化分子103甲基化分子的質(zhì)粒混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用F52A及headloop引物Hlint5-10和Hlint5-10Ni進(jìn)行擴(kuò)增。MgCl2的濃度在實(shí)驗(yàn)組中示出。圖16使用F52A及headloop引物Hlint5-10對(duì)代表106非甲基化分子103甲基化分子的質(zhì)?；旌衔镞M(jìn)行PCR擴(kuò)增。在EppendorfMastercycler溫度梯度PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的變性圖示在AppliedBiosystemsABI7700設(shè)備中分析。圖中示出了在指定溫度及在無(wú)或有800mM甜菜堿的條件下進(jìn)行反應(yīng)的PCR產(chǎn)物的變性圖示。圖17是在反向鏈合成期間在引物L(fēng)UH-F2拷貝之后在“非甲基化”DNA上loopback引發(fā)的示意圖。實(shí)施例實(shí)施例1針對(duì)不同細(xì)菌16S核糖體RNA基因的選擇性headloopPCR16S核糖體DNA的擴(kuò)增通常用于鑒別細(xì)菌物種及已經(jīng)確定了大量物種的序列。某些高度保守的區(qū)域的存在使得可以設(shè)計(jì)擴(kuò)增基本上所有細(xì)菌核糖體DNA的引物對(duì)。圖2示出細(xì)菌物種的16S核糖體RNA的靶區(qū)域及“通用”引物NR-R1i和NR-F1i結(jié)合的區(qū)域，所述細(xì)菌物種是大腸桿菌、Sulfolobulusacidophilus及Sulfolobulusthermosulfidooxidans。正向引物NR-L1i用作設(shè)計(jì)抑制大腸桿菌(EHL前綴)或S.acidophilusrDNA的DNA擴(kuò)增的headloop引物的基礎(chǔ)(見表)。圖3示出了EHL48引物的headloop引發(fā)的實(shí)例。在開始引發(fā)循環(huán)之后，在隨后的循環(huán)中反向引物的延伸導(dǎo)致?lián)饺肱c在合成的鏈3’末端的EHL48“頭”互補(bǔ)的序列。這些頭序列可以折回形成環(huán)狀(loopback)并與其在擴(kuò)增子內(nèi)的互補(bǔ)靶序列退火。所述頭形成了與大腸桿菌靶序列的完美匹配并因此能引發(fā)及延伸形成一延伸的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。期望這種結(jié)構(gòu)在進(jìn)一步擴(kuò)增中是難以恢復(fù)的。就S.acidophilus擴(kuò)增子而言，所述頭序列與互補(bǔ)區(qū)域有4個(gè)錯(cuò)配，這樣防止引發(fā)并使得鏈在進(jìn)一步的PCR循環(huán)中可被利用。(在上表中分別示出了頭及引發(fā)區(qū)，然而應(yīng)清楚所述頭位于所述引物區(qū)的5’并與其是連續(xù)的)。在含有以下物質(zhì)的25μl溶液中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR2×PCR主Mix(Promega)12.5μl正向引物(終濃度400nM)1.0μl反向引物(終濃度400nM)1.0μlDNA1.0μlSyberGreen(原液的1∶1000稀釋液)0.2μl水9.5μl在AppliedBiosystemsABIPrism7700設(shè)備上使用如下循環(huán)條件進(jìn)行反應(yīng)95°1分鐘72°30秒在擴(kuò)增循環(huán)之后，反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈圖通過測(cè)定隨著溫度在20分鐘從60℃升至100℃而發(fā)生的SyberGreen熒光中的變化而確定。大腸桿菌rDNA擴(kuò)增的抑制大腸桿菌DNA與S.acidophilus或熱氧化硫化桿菌的DNA的混合物使用非選擇性引物NR-F1i和NR-R1i，或者使用headloop引物EHL48或EHL68及反向引物NR-R1i進(jìn)行擴(kuò)增(圖4)。擴(kuò)增產(chǎn)物通過確定其解鏈圖而分析——大腸桿菌rDNA產(chǎn)物在大約77-78℃解鏈，而S.acidophilus和熱氧化硫化桿菌擴(kuò)增子在大約91℃解鏈。注意對(duì)照PCR產(chǎn)物比headloopPCR產(chǎn)物短，因此在略低溫度解鏈，還觀測(cè)到了由于模塊中管位置(tubeposition)所致的略微不同。從1∶1的DNA混合物開始，當(dāng)使用非選擇性引物時(shí)，大腸桿菌與S.acidophilus的PCR產(chǎn)物的比率為大約1∶2。EHL48和EHL64headloop引物有效抑制大腸桿菌擴(kuò)增子的擴(kuò)增，因?yàn)楫a(chǎn)物的解鏈曲線示出僅存在S.acidophilusrDNA(A組)。另外EHL48在存在等量熱氧化硫化桿菌DNA的條件下有效抑制大腸桿菌的擴(kuò)增(B組)。當(dāng)DNA的比率提高至50∶1時(shí)(C組)，見到熱氧化硫化桿菌擴(kuò)增子的實(shí)際富集。另一種headloop引物EHL2a，其定向與PCR引發(fā)位點(diǎn)鄰近的序列，示出較高水平的熱氧化硫化桿菌DNA富集；大腸桿菌DNA的區(qū)域中的解鏈圖表明異常DNA結(jié)構(gòu)形成。對(duì)與EHL48和EHL64定向的相同區(qū)域，但被設(shè)計(jì)為與S.acidophilus序列退火并在其上引發(fā)的Headloop引物SAHL也測(cè)試其抑制S.acidophilusrDNA擴(kuò)增的能力(D組)。從50∶1的S.acidophilus與大腸桿菌rDNA的混合物開始，S.acidophilusDNA的擴(kuò)增明顯抑制而且產(chǎn)物示出略微過量的大腸桿菌擴(kuò)增子。鎂的濃度及甜菜堿對(duì)headloop抑制PCR的作用在許多headloopPCR中，我們注意到如果游離Mg2+終濃度降低則擴(kuò)增的選擇性得以提高。在圖5所示實(shí)施例中，在存在超過50倍的S.acidophilusDNA的情況下，使用SAHLheadloop引物，當(dāng)Mg2+濃度從1.5mM降低至1.3mM時(shí)，大腸桿菌DNA擴(kuò)增的選擇性顯著提高。反應(yīng)中dNTPs的濃度總和為0.8mM，剩余游離Mg2+濃度為0.5mM。就此擴(kuò)增而言，將游離Mg2+濃度降低至0.3mM抑制任何擴(kuò)增。在B和C組中，示出在存在超過250和500倍S.acidophilusrDNA的情況中大腸桿菌rDNA的檢測(cè)。甜菜堿先前已經(jīng)示出可提高G+C豐富的DNA的擴(kuò)增。還發(fā)現(xiàn)加入甜菜堿可提高h(yuǎn)eadloopPCR的選擇性。在圖3中，D組在含有0.6M甜菜堿的反應(yīng)中大腸桿菌擴(kuò)增子的比例顯著提高。這些實(shí)施例表明headloopPCR引物抑制選擇的靶DNA，大腸桿菌或S.acidophilus16SrDNA的擴(kuò)增的功能，并表明headloop抑制與PCR引發(fā)位點(diǎn)鄰近及至多相隔40個(gè)堿基的靶區(qū)域的效力。實(shí)施例2甲基化DNA的選擇性headloopPCR為分析或檢測(cè)DNA的甲基化，首先將其用亞硫酸氫鹽處理，該程序使C變換為U(并因此在拷貝后最終變換為T)。然而，甲基化的任何C(通常在CpG位置)對(duì)這種變換有抗性。因?yàn)榧谆头羌谆问降腄NA片段具有不同的序列，因此可能設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增甲基化形式的引物。在此所用的負(fù)責(zé)引發(fā)的引物的節(jié)段設(shè)計(jì)為對(duì)甲基化和非甲基化的DNA形式均同樣起作用，沒有偏向。為達(dá)到此目的，選擇沒有CpG的靶DNA片段區(qū)域。在這種區(qū)域中，不管片段的全部甲基化狀況如何，得自亞硫酸氫鹽變換的DNA序列是相同的。選擇性富集甲基化形式通過在PCR中使用的兩種引物之一或兩者中引入一5’延伸物而實(shí)現(xiàn)。所述頭的序列是選擇的DNA片段下游序列的反向重復(fù)。當(dāng)拷貝該頭時(shí)產(chǎn)生3’末端序列，其由于與下游序列互補(bǔ)而能自身引發(fā)。這樣產(chǎn)生了長(zhǎng)發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，不期望其有效用作進(jìn)一步擴(kuò)增循環(huán)的模板，導(dǎo)致不希望的片段擴(kuò)增的抑制。所述頭序列設(shè)計(jì)為是期望得自經(jīng)亞硫酸氫鹽變換的非甲基化的DNA的下游序列的反向重復(fù)。在摻入后，加入的序列使衍生自非甲基化的DNA的片段自身引發(fā)，引起非甲基化的片段擴(kuò)增抑制。因?yàn)檫x擇的下游序列含有幾個(gè)CpG位點(diǎn)(在甲基化的DNA的情況中在此不發(fā)生亞硫酸氫鹽變換)，因此不足以互補(bǔ)并使得自身引發(fā)，并因此對(duì)“甲基化”的DNA片段的擴(kuò)增產(chǎn)生較小或不抑制。這些實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒在這項(xiàng)研究中使用質(zhì)粒#77和#58。它們得自衍生自經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的人GST片段的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的pGEM-T(Promega)中的插入體。這些質(zhì)粒中的插入體的序列如下所示#77“甲基化的GST片段”或“M”CGGCGCGttAGTTCGtTGCGtAtAtTTCGtTGCGGTttTtTTtGGAtTttAGGGCGttttTtTGCGGtCGACGttCGGGGTGtAGCGGtCGtCGGGGtTGGGGtCGGCGGGAGTtCGCGGGAtttTttAGAAGAGCGGtCGGCGtCGTGAtTtAGtAtTGGGGCGGAGCGGGGCGGGAttAtttTTATAAGGtTCGGAGGtCGCGGAGttTTCGtTGGAGTTTCGtCGtCGtAGTtTTCGttAttAGTGAGTACGCGCGGttCGCGTtttC當(dāng)所述DNA在CpG位置是甲基化的，這個(gè)序列相應(yīng)于期望得自亞硫酸氫鹽處理的人GST片段的擴(kuò)增的序列。簡(jiǎn)便起見將其稱為“甲基化DNA”。本發(fā)明示出了所述插入體的全部序列。所述DNA片段中第一個(gè)CpG是-41，最后一個(gè)(在圖中大多數(shù)是3’)是CpG+10。#58“非甲基化的GST片段”或“U”-39引物F2LUHF2HeadAAAACACTACAAAACCACA＜CLUHF2HeadAAAACACTACAAAACCACAC＜FTF2HeadAAAACACTACAAAACCACACAAAGTTtGtTGtGtAtAtTTtGtTGtGGTttTtTTttTGtTG-29引物R1T當(dāng)所述DNA在CpG位置是非甲基化的時(shí)，這個(gè)序列相應(yīng)于期望得自亞硫酸氫鹽處理的人GST片段的擴(kuò)增的序列。簡(jiǎn)便起見將其稱為“非甲基化DNA”。本發(fā)明示出了在擴(kuò)增的區(qū)域內(nèi)的所述插入體的序列，從CpG位點(diǎn)-39至-29。正向引物F2和反向引物R1T靶區(qū)域的序列在框中標(biāo)示。在其反向互補(bǔ)序列下方示出了headloop引物L(fēng)UHF2、CLUHF2和FTF2的頭部分。序列中所用符號(hào)意義如下T原始序列中的T殘基t期望自原始序列中C殘基經(jīng)亞硫酸氫鹽變換而得的T殘基C甲基化的C殘基(由于部分CpG序列)并因此對(duì)亞硫酸氫鹽處理的變換具有抗性t得自經(jīng)變換的C的T殘基，盡管該C在CpG序列中但卻是非甲基化的。使用的引物變換特異性引物將變換特異性引物設(shè)計(jì)為包含幾個(gè)t(從C變換而來(lái))，以便其將選擇性擴(kuò)增已通過亞硫酸氫鹽處理而成功變換的DNA片段。通過消除含有CpG位點(diǎn)的區(qū)域，這些引物應(yīng)能擴(kuò)增DNA片段而不管其在CpG殘基的甲基化狀態(tài)如何，即甲基化和非甲基化形式的片段均應(yīng)同樣好地被擴(kuò)增。F25’GGTtTTAGGGAATTTtttttR1T5’CACCTTTCCCAaaTCCCCAa在后一情況中的堿基(a&amp;t)相應(yīng)于原始序列中變換的C。這些引物與靶片段雜交的區(qū)域在上圖表中以方框標(biāo)示。引物結(jié)合的區(qū)域在DNA片段的甲基化和非甲基化形式中相同。Headloop引物通過在兩種引物之一或兩者中引入一特殊的5’延伸物而實(shí)現(xiàn)針對(duì)非甲基化形式的片段的選擇。為清晰示出所述原理的證據(jù)，僅產(chǎn)生一種具有特殊5’延伸物的引物。顯而易見，如果兩個(gè)引物均被修飾則在此所報(bào)道的任何作用均預(yù)期是顯著放大的。選擇F2作為引物以針對(duì)這些測(cè)試加以修飾。如下所示在F2引物中加入5’延伸物(框中所示)。LUHF2CLUHF2CLURF2FTF2LUHF2、CLUHF2和FTF2均具有5’延伸物，所述延伸物是非甲基化的DNA片段內(nèi)的序列的反向重復(fù)。因此就LUHF2而言，的5’延伸物定向于F2引發(fā)位點(diǎn)下游的ttttGtGATGTtttGGtGt序列。所述堿基如下A與原始序列中T互補(bǔ)的Aa與原始序列中變換的C(U)互補(bǔ)的A，非CpG位點(diǎn)部分a與原始序列中變換的C(U)互補(bǔ)的A，CpG位點(diǎn)部分CLURF2引物是對(duì)照引物。其與CLUHF2在其5’延伸物具有相同數(shù)目的A、C和T，但順序與GST基因的相關(guān)區(qū)域內(nèi)的任何序列均不匹配。方法使用AppliedBiosystems7700設(shè)備進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。整個(gè)過程中使用相同的“反向”引物R1T。使用Sybergreen監(jiān)測(cè)擴(kuò)增。使用的反向引物R1T為1μM。使用的F2為200nM。使用的所有其它引物均為40nM。使用基于PlatinumTaqPolymerase(Invitrogen)及補(bǔ)給緩沖液的熱啟動(dòng)系統(tǒng)。DNA輸入M＝106的#77分子，甲基化的質(zhì)粒U＝108的#58分子，非甲基化的質(zhì)粒M*U104#77加上108#58的混合物(混合物，超出10,000×的非甲基化的質(zhì)粒)。結(jié)果甲基化的(106個(gè)分子)或非甲基化的(108個(gè)分子)質(zhì)粒與三種不同的headloop引物L(fēng)UH-F2、CLUH-F2和FT-F2組合反向引物R1T用于PCR中，使用Sybergreen檢測(cè)擴(kuò)增(圖6)。所有這三個(gè)引物均相似效力擴(kuò)增甲基化的質(zhì)粒。就非甲基化的質(zhì)粒而言，盡管在反應(yīng)中使用多100倍的質(zhì)粒，但PCR產(chǎn)物的仍出現(xiàn)明顯延時(shí)。引物L(fēng)UH-F2和FT-F2在甲基化和非甲基化DNA之間的擴(kuò)增中顯著不同。當(dāng)使用短亞硫酸氫鹽變換的特異性引物F2或者含有不相關(guān)的5’延伸序列引物CLUR-F2并與組合R1T作為反向引物時(shí)，甲基化和非甲基化的引物均被擴(kuò)增。使用引物CLUR-F2和R1T獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物通過解鏈曲線分析加以評(píng)估，其解離曲線示于圖7。將所述樣品加熱并監(jiān)測(cè)當(dāng)DNA鏈分離時(shí)發(fā)生的Sybergreen熒光的降低。由于解鏈溫度不同而可以區(qū)分這兩種形式的擴(kuò)增的DNA，非甲基化的片段的GC較少，因此在較低溫度約76℃解鏈，而甲基化DNA解鏈溫度為大約80℃。所述質(zhì)粒的混合物(非甲基化質(zhì)粒的10000倍)產(chǎn)生一種PCR產(chǎn)物，其與非甲基化質(zhì)粒提供的產(chǎn)物相似，這表明正如所期望的“非甲基化”產(chǎn)物占優(yōu)勢(shì)。注意AppliedBiosystems7700模塊中樣品的位置略微影響結(jié)果，因此解鏈曲線峰的位置即使在一式兩份的樣品中也不期望是相同的。使用headloop引物CLUH-F2重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鲆锱cCLUR-F2具有相同長(zhǎng)度的延伸物(圖8)。單獨(dú)擴(kuò)增甲基化和非甲基化的質(zhì)粒產(chǎn)生具有期望的解鏈曲線的PCR產(chǎn)物。10,000∶1的非甲基化及甲基化質(zhì)粒的混合物的擴(kuò)增產(chǎn)物與表示甲基化和非甲基化的DNA的混合物的解鏈曲線解離，甲基化的DNA占優(yōu)勢(shì)。因此，甲基化的形式成功擴(kuò)增，盡管最初存在超出10,000倍的非甲基化的質(zhì)粒。使用Taqman探針證實(shí)headloop引物效力Taqman探針可以在擴(kuò)增期間監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物。制備選擇性檢測(cè)甲基化和非甲基化的GSTP1序列的探針。探針PRBM這是一種Taqman探針，將其設(shè)計(jì)為如果其能與擴(kuò)增的產(chǎn)物雜交則在PCR期間裂解。裂解導(dǎo)致FAM染料的熒光增強(qiáng)。FAM＝羧基熒光素，TAMRA＝羧基四甲基羅丹明探針PRBU這是一種Taqman探針，將其設(shè)計(jì)為如果其能與擴(kuò)增的產(chǎn)物雜交則在PCR期間裂解。裂解導(dǎo)致TET染料的熒光增強(qiáng)。TET＝四氯熒光素，TAMRA＝羧基四甲基羅丹明結(jié)果使用對(duì)照的變換特異性引物F2和CLUR-F2或者兩種headloop引物L(fēng)UH-F2和FT-F2組合反向引物R1T擴(kuò)增非甲基化和甲基化的質(zhì)粒的混合物。使用PRB-U和PRB-M探針監(jiān)測(cè)非甲基化的和甲基化的產(chǎn)物的擴(kuò)增(圖9和10)。與對(duì)照引物相比，非甲基化的DNA的擴(kuò)增基本上(FT-F2)或幾乎完全(LUH-F2)被抑制。如圖10所示，當(dāng)使用PRBM檢測(cè)甲基化DNA的擴(kuò)增時(shí)，顯然甲基化的DNA由受試引物L(fēng)UHF2和FTF2選擇性擴(kuò)增，甚至在原始輸入DNA含有超出10,000倍的非甲基化的形式時(shí)結(jié)果也如此。使用對(duì)照引物因?yàn)槠湫纬扇绱诵”壤漠a(chǎn)物以致檢測(cè)不到甲基化的DNA。實(shí)施例3從亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA中擴(kuò)增從其中GSTP1基因是甲基化的LNCaP前列腺癌細(xì)胞中及從期望GSTP1基因是非甲基化的胎盤中分離DNA。將來(lái)自LNCaP和胎盤的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的通過位于感興趣的區(qū)域之外的引物擴(kuò)增。將所述引物GSATA56(GTTTTGTGAAGAGGGTGTGTAAGTTT)和R4(AAAACCTTTCCCTCTTTCCCAAA)設(shè)計(jì)為不管甲基化狀況如何而擴(kuò)增亞硫酸氫鹽處理的DNA，并位于headloop引物和R1T擴(kuò)增的區(qū)域之外。這兩種引物的混合物可用于模擬這樣的情況，即盡管存在超量的正常(非甲基化的GSTP1)DNA但仍需要檢測(cè)少量腫瘤衍生的DNA(甲基化的GSTP1)的情況。以下實(shí)驗(yàn)中使用的混合物是指“LP(1∶100).)1/10,000稀釋的使用GSTAS56和R4自亞硫酸氫鹽處理的LNCaPDNA擴(kuò)增得到的PCR第一次循環(huán)產(chǎn)物加上1/100稀釋的使用GSTAS56和R4自亞硫酸氫鹽處理的胎盤DNA擴(kuò)增得到的PCR第一次循環(huán)產(chǎn)物。這個(gè)混合物用作實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)的輸入物，以示出所述新引物怎樣富集足夠的甲基化DNA以進(jìn)行檢測(cè)，盡管所述起始物具有大量的非甲基化的DNA。結(jié)果示于圖11和12。當(dāng)使用對(duì)照引物F2時(shí)，幾乎所有的產(chǎn)物均衍生自非甲基化的DNA(如通過PRBU檢測(cè)的那樣)。然而，當(dāng)使用具有5’延伸物的headloop引物時(shí)，甲基化的DNA被選擇性擴(kuò)增并僅產(chǎn)生低水平的非甲基化的DNA。實(shí)施例4對(duì)GSTP1基因的第二個(gè)區(qū)域的headloop抑制PCR將Headloop引物設(shè)計(jì)為GSTP1基因的轉(zhuǎn)錄序列內(nèi)的一區(qū)域的亞硫酸氫鹽處理的DNA。引物的序列示于下表。引物GSTR11i和GSTHLint5-10Ni中在相應(yīng)于CpG位點(diǎn)的位置包含次黃嘌呤核苷，在CpG位點(diǎn)亞硫酸氫鹽變換的DNA根據(jù)甲基化狀況可以是C或U。相似地，F(xiàn)52A引物在CpG位點(diǎn)中C的位置含有一有意錯(cuò)配(A)，免得偏離甲基化或非甲基化DNA的擴(kuò)增不均。<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="819">引物ωHEADω引發(fā)區(qū)F52AGGGATTATTTTTATAAGGTTAGGAGGTGSTintR1CCCATACTAAAAACTCTAAACCCCATHLint5-10TGTGTGGTTTGTGTTTTTGCCCATACTAAAAACTCTAAACCCCATHLint5-10XTGTGTGGTTTGTGTTTTTGGGGATGCCCATACTAAAAACTCTAAACCCCATGSTintR11iCTCTAAACCCCATCCCCIAAAHLint5-10NiTGTGTGGTTTGTGTTITTGCTCTAAACCCCATCCCCIAAAI＝次黃嘌呤核苷</table></tables>所有PCR均使用F52A作為正向引物。Headloop引物使用GSTintR1(HLint5-10和HLint5-10X)或GSTintR11i(HLint5-10Ni)。引物的位置在圖13中GSTP1基因的該區(qū)域的序列上示出。使用這些引物的PCR用于鑒別有助于使用haedloop引物優(yōu)化選擇性擴(kuò)增的因子。引物終濃度為200nM，其它反應(yīng)成分如上所述。除非特別說明則PCR循環(huán)條件如下95°2分鐘隨后進(jìn)行在60℃-95℃溫度范圍20分鐘的解離曲線分析。三種headloop引物的效力使用質(zhì)粒DNA進(jìn)行對(duì)比，所述質(zhì)粒DNA衍生自擴(kuò)增的亞硫酸氫鹽處理的DNA的克隆并相應(yīng)于甲基化或非甲基化的GSTP1序列。將質(zhì)粒DNA以107非甲基化分子∶104甲基化分子的比率混合，并使用不同的headloop引物組合F52A正向引物進(jìn)行擴(kuò)增(圖14)。使用這三種headloop引物觀測(cè)到富集1000或更多倍的甲基化序列，而使用HLint5-10X示出非甲基化序列的擴(kuò)增最大程度抑制。Mg2+濃度變化的作用示于圖15。在存在1.1，1.3或1.5mMMgCl2的情況下使用HLint5-10Ni或HLint5-10X進(jìn)行擴(kuò)增。在這兩種情況中，隨著MgCl2水平降低均出現(xiàn)選擇性呈濃度依賴性提高。這種作用使用許多不同的headloop引物均可觀測(cè)到。最佳headloop選擇性在允許靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增所使用的最低Mg2+水平一致性觀測(cè)到。在大多數(shù)情況中，這相應(yīng)于游離Mg2+為0.3mM的水平。本發(fā)明示出甜菜堿提高16S核糖體RNA基因序列的headloop擴(kuò)增的選擇性。甜菜堿及退火/延伸溫度的變化對(duì)來(lái)自亞硫酸氫鹽處理的DNA的甲基化和非甲基化序列的選擇性擴(kuò)增的作用示于圖16。0.8M的甜菜堿充分地提高h(yuǎn)eadloopPCR的選擇性；甜菜堿的最佳作用在0.6-1.2M范圍可見。還觀測(cè)到HLint5-10headloop的效果依賴于退火/延長(zhǎng)溫度。討論通過headloop引發(fā)的PCR擴(kuò)增抑制的原理在圖1中以圖表形式示出及在圖3和17中示出了特異性序列的實(shí)例。正如所示出的，在5’延伸物摻入及隨后拷貝之后，3’末端產(chǎn)生，其能與相同DNA鏈中的下游區(qū)域堿基配對(duì)。這種堿基配對(duì)及引發(fā)的效力期望依賴于頭區(qū)域的長(zhǎng)度和序列成分及其與擴(kuò)增子內(nèi)的內(nèi)在序列匹配的精確度。就EHL48headloop引物而言，大腸桿菌序列(正確匹配)及S.acidophilus擴(kuò)增子(4個(gè)錯(cuò)配)之間互補(bǔ)性中的差異足以進(jìn)行選擇性擴(kuò)增S.acidophilusrDNA。就LUHF2headloop引物而言(圖17)，下游區(qū)域中下劃線的那些堿基相應(yīng)于原始片段中CpG序列中潛在甲基化的C。在CpG-甲基化的DNA的情況中，下游區(qū)域中下劃線的位置含有G而不是A，期望無(wú)分子內(nèi)雙鏈體發(fā)生。如果圖3和17中以圖表示出的結(jié)構(gòu)能在PCR期間形成，則可設(shè)想延伸將從堿基配對(duì)的3’末端發(fā)生，產(chǎn)生具有長(zhǎng)反向重復(fù)的單鏈的片段。這種片段很可能在變性后通過“snapback”形成發(fā)夾環(huán)，之后引物能與其雜交，因此防止新拷貝合成及該片段擴(kuò)增。由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成依賴于有效headloop退火及引發(fā)，因此享有相同堿基引物但與摻入的頭序列未充分匹配的序列將持續(xù)擴(kuò)增。為如上述試驗(yàn)所示選擇性擴(kuò)增甲基化的DNA，擴(kuò)增的有效headloop引發(fā)及抑制僅針對(duì)非甲基化的形式發(fā)生。未選擇性擴(kuò)增甲基化的DNA，所述headloop引物方法可以獨(dú)立使用或者可與其它選擇性擴(kuò)增方法組合使用，例如與“甲基化特異性PCR”(Herman等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)939821-6(1996))組合使用。在實(shí)施例中示出擴(kuò)增子內(nèi)的靶序列的位置根據(jù)其上頭形成延伸的引物位置而改變。在EHL48和EHL64headloop引物的情況中，headloop引發(fā)的靶區(qū)域是所述堿基引物下游的40個(gè)堿基。就其它headloop引物而言，靶序列在所述堿基引物的引發(fā)末端附近(Hlint5-10)，或者覆蓋所述引物3-5個(gè)堿基(EHL2a、SAHL、LUHF2、CLUHF2、FTF2、Hlint5-10Ni和Hlint5-10X)。就許多headloop引物而言，我們已經(jīng)鑒別了擴(kuò)增的選擇性在游離Mg2+濃度較低時(shí)或者在存在甜菜堿的情況中得以提高。選擇性也可以通過降低headloop引物的濃度而得以改良。其它反應(yīng)條件如退火溫度(圖16)、循環(huán)時(shí)間及緩沖液成分也可以改變headloopPCR的效力。所述實(shí)驗(yàn)包括將5’頭延伸物加入僅一個(gè)引物對(duì)中，在PCR中產(chǎn)生3點(diǎn)特異性?？梢詫㈩^摻入正向和反向這兩種引物上，提供4點(diǎn)特異性，進(jìn)一步提高選擇性。在本說明書中，術(shù)語(yǔ)“包含”是指包含一指定的元件、整數(shù)或步驟，或者元件、整數(shù)或步驟組合，但不除外任何其它元件、整數(shù)或步驟，或者元件、整數(shù)或步驟組合。另外，本說明書中包含的對(duì)任何文獻(xiàn)、法案、材料、設(shè)備、文章等的討論其目的僅用于交待本發(fā)明的背景。不能認(rèn)為這些事件的任何或全部構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分，或是在本申請(qǐng)的每一個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前既已存在于澳大利亞的與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域的一般知識(shí)。最后，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到在不偏離廣泛闡述的本發(fā)明的精神或范圍的前提下，對(duì)本發(fā)明可以做如特異的實(shí)施方案所示的許多改變和/或修改。因此本發(fā)明的實(shí)施方案僅是加以例證而無(wú)限制之意。權(quán)利要求1.一種選擇性擴(kuò)增包含靶核酸及至少一種非靶核酸的樣品中所述靶核酸的方法，所述方法包含利用至少一種寡核苷酸引物擴(kuò)增所述核酸，所述引物包含一個(gè)引物區(qū)，其能在所述靶核酸及非靶核酸上引發(fā)及延伸；以及一個(gè)區(qū)域，其是所述至少一種非靶核酸的擴(kuò)增子的一種內(nèi)在序列的反向重復(fù)，而如果所述靶核酸的擴(kuò)增子存在相應(yīng)的內(nèi)在序列，則所述區(qū)域與所述靶核酸的擴(kuò)增子的相應(yīng)的內(nèi)在序列之間存在至少一個(gè)錯(cuò)配，所述反向重復(fù)區(qū)位于所述引物區(qū)的5’。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴(kuò)增步驟使用至少一種包含所述引物區(qū)和反向重復(fù)區(qū)的正向引物。3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增步驟使用至少一種包含所述引物區(qū)和反向重復(fù)區(qū)的反向引物。4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中使用正向和反向引物，其中每個(gè)引物均包含所述引物區(qū)和反向重復(fù)區(qū)。5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述擴(kuò)增技術(shù)是實(shí)時(shí)PCR等。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述引物除了所述反向重復(fù)部分之外的長(zhǎng)度為大約15-35個(gè)堿基單位。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述引物的反向重復(fù)序列的長(zhǎng)度為大約5-30個(gè)堿基單位。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述引物的反向重復(fù)部分包含足夠的核苷酸以在擴(kuò)增的退火和延伸條件下在一匹配的序列上進(jìn)行引發(fā)。10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增的選擇性通過在預(yù)選的游離Mg2+濃度進(jìn)行擴(kuò)增而加以控制。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述擴(kuò)增在游離Mg2+濃度低于大約0.7mM的情況下進(jìn)行。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述游離Mg2+濃度為大約0.5mM或更低。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述游離Mg2+濃度為大約0.3mM。14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增在存在甜菜堿的情況下進(jìn)行。15.權(quán)利要求14的方法，其中存在的所述甜菜堿的量為大約400mM到大約1.2M。16.一種物種選擇方法，所述方法包括如下步驟a)在存在至少一種引物的情況下選擇性擴(kuò)增一個(gè)分離的核酸樣品，所述分離的核酸樣品包含分離自一或多個(gè)物種的混合物的核酸，其中所述引物包含一個(gè)區(qū)域，其在在一系列物種或亞種中是基本保守的核酸上能引發(fā)及延伸；和一個(gè)區(qū)域，其是一預(yù)選的物種或亞種所特有的內(nèi)在非保守的序列的擴(kuò)增子的反向重復(fù)；和b)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的存在情況。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述物種選自動(dòng)物、細(xì)菌、真菌或植物。18.權(quán)利要求16或17的方法，用于在物種群體中選擇一或多個(gè)物種。19.權(quán)利要求18的方法，用于選擇性擴(kuò)增分離的核酸，所述核酸是來(lái)自次要物種和優(yōu)勢(shì)物種的核酸的混合物，其中所述引物的反向重復(fù)區(qū)是所述優(yōu)勢(shì)物種的核酸的擴(kuò)增子的非保守的內(nèi)在區(qū)域的反向重復(fù)。20.權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸是DNA。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述DNA是編碼核糖體RNA的基因的一部分。22.權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述物種是細(xì)菌。23.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述引物的反向重復(fù)部分是一預(yù)選物種的16S核糖體DNA的擴(kuò)增子內(nèi)的一個(gè)區(qū)域的反向重復(fù)。24.權(quán)利要求16-24中任一項(xiàng)的方法，其包括權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法。25.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，用于辨別一個(gè)基因家族的成員之間的等位基因變體或突變。26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種靶核酸或至少一種非靶核酸含有甲基化的核酸。27.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行甲基化核酸或非甲基化核酸的選擇性擴(kuò)增。28.權(quán)利要求27的方法，其中進(jìn)行甲基化核酸的選擇性擴(kuò)增。29.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在擴(kuò)增之前對(duì)所述至少一種靶核酸或至少一種非靶核酸進(jìn)行一個(gè)修飾步驟。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述非靶核酸在所述修飾步驟期間被修飾。31.權(quán)利要求29或30的方法，其中所述修飾步驟是化學(xué)修飾。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述修飾步驟將非甲基化的胞嘧啶變換為能與腺嘌呤形成堿基對(duì)的另一核苷酸，而甲基化的胞嘧啶未改變或被變換為能與鳥嘌呤形成堿基對(duì)的一核苷酸。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述修飾步驟將非甲基化的胞嘧啶變換為尿嘧啶。34.權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述化學(xué)修飾步驟是進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。35.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述引物的反向重復(fù)部分包含足夠數(shù)目的核苷酸以允許在所述修飾的非靶核酸的匹配序列上退火和延伸，并包含足夠的錯(cuò)配以便不允許在所述未修飾的靶核酸上退火和/或延伸。36.一種檢測(cè)在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)Pi基因和/或其調(diào)節(jié)側(cè)翼序列內(nèi)的一或多個(gè)位點(diǎn)的胞嘧啶的異常甲基化的分析方法，其中所述分析方法包括將分離的DNA暴露于用于擴(kuò)增所述GSTP1基因和/或其調(diào)節(jié)側(cè)翼序列內(nèi)一靶區(qū)域內(nèi)的反應(yīng)物和條件下，所述靶區(qū)域是發(fā)生胞嘧啶異常甲基化的一或多個(gè)位點(diǎn)，所述擴(kuò)增使用至少一種寡核苷酸引物進(jìn)行，所述引物包含一個(gè)引物區(qū)，其在所述分離的DNA內(nèi)的甲基化的靶區(qū)域和非甲基化的非靶區(qū)域上均能引發(fā)和延伸；和一個(gè)區(qū)域，其是所述非靶區(qū)域的擴(kuò)增子的內(nèi)在序列的反向重復(fù)，但其與所述靶區(qū)域的相應(yīng)的內(nèi)在序列之間存在至少一個(gè)錯(cuò)配；以及確定擴(kuò)增的DNA的存在情況。37.權(quán)利要求36的分析方法，其中所述靶區(qū)域位于由CpG位點(diǎn)-43至+55(并包含其在內(nèi))所限定的GST-Pi基因和/或其調(diào)節(jié)側(cè)翼序列的區(qū)域內(nèi)。38.權(quán)利要求36或37的分析方法，其中對(duì)所述分離的DNA進(jìn)行化學(xué)修飾以在擴(kuò)增之前將非甲基化的胞嘧啶變換為尿嘧啶。39.權(quán)利要求38的分析方法，其中所述化學(xué)修飾通過亞硫酸氫鹽處理而實(shí)現(xiàn)。40.權(quán)利要求36-39中任一項(xiàng)的分析方法，用作診斷受試對(duì)象的疾病或病變的分析方法或判斷其預(yù)后的分析方法，所述疾病或病變特征在于胞嘧啶的異常甲基化。41.權(quán)利要求40的分析方法，其中所述疾病或病變是癌癥。42.權(quán)利要求41的分析方法，其中所述癌癥是前列腺癌、肝癌或乳腺癌。43.用于核酸擴(kuò)增的一種寡核苷酸引物，所述引物包括一個(gè)區(qū)域，其是非靶擴(kuò)增子內(nèi)的一核酸序列的反向重復(fù)，但其與靶核酸的相應(yīng)的序列之間存在至少一個(gè)錯(cuò)配；以及一個(gè)引物區(qū)，其可以在靶核酸和非靶核酸上引發(fā)和延伸。44.一個(gè)PCR試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求43的寡核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供了一種選擇性擴(kuò)增包含靶核酸及至少一種非靶核酸的樣品中所述靶核酸的方法，所述方法包括通過至少一種寡核苷酸引物擴(kuò)增所述核酸，所述引物包含一個(gè)引物區(qū)，其可以在靶核酸和非靶核酸上引發(fā)并延伸的一個(gè)引物區(qū)；以及一個(gè)區(qū)域，其是所述至少一種非靶核酸的擴(kuò)增子的一種內(nèi)在序列的反向重復(fù)，而如果所述靶核酸的擴(kuò)增子存在相應(yīng)的內(nèi)在序列，則所述區(qū)域與所述靶核酸的擴(kuò)增子的相應(yīng)的內(nèi)在序列之間存在至少一個(gè)錯(cuò)配。文檔編號(hào)C12Q1/68GK1650029SQ03809391公開日2005年8月3日申請(qǐng)日期2003年2月26日優(yōu)先權(quán)日2002年2月26日發(fā)明者基思·蘭德,彼得·勞倫斯·莫洛伊申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織