專利名稱：改變了淀粉分支酶活性的大麥及增加了直鏈淀粉含量的淀粉和含淀粉產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)活性減少的大麥植物，它將導(dǎo)致麥粒淀粉中相應(yīng)的直鏈淀粉含量的增加。同時(shí)，本發(fā)明還涉及谷類、淀粉、食物以及由它們制成的非食物類產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
淀粉約占谷類成熟顆粒重量的45-65％，其由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩類分子組成。直鏈淀粉從本質(zhì)上而言是線形分子，由α-1，4鏈接的葡萄糖苷鍵組成，而支鏈淀粉是高度分支的鍵合線性鏈，由α-1，6鏈接的葡萄糖苷鍵組成。
高等植物胚乳中淀粉的合成是在一系列酶的作用下分四個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行的。首先，通過(guò)利用G-1-P和ATP合成ADP-葡萄糖，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶激活淀粉的單體前體。其次，淀粉合成酶將激活的葡糖基供體ADP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到已存在的α-1，4鍵的未還原端。再次，淀粉分支酶通過(guò)分裂葡聚糖的α-1，4鍵區(qū)域引入分支點(diǎn)，然后將該斷裂鏈轉(zhuǎn)移到受體鏈，形成新的α-1，6鍵。淀粉分支酶是唯一能給α-多葡聚糖引入α-1，6鍵的酶，因而在支鏈淀粉的生成過(guò)程中，它起到了關(guān)鍵性作用。最后，淀粉去分支酶消除部分分支鍵，該作用機(jī)制目前仍不明了(Myers等人著，2000)。
人們已經(jīng)明了高等植物中一般淀粉顆粒的合成至少需要以上四種酶的作用，在高等植物的胚乳中發(fā)現(xiàn)了每種酶的多種異構(gòu)形式，人們基于突變分析(Wang等人著，1998，Buleon等人著，1998)或通過(guò)使用基因轉(zhuǎn)移方法(Abel等人著，1996，Jobling等人著，1999，Scwall等人著，2000)修正基因表現(xiàn)水平提出了單個(gè)異構(gòu)的特殊作用。然而，每種酶的各異構(gòu)形式對(duì)于淀粉生物合成的準(zhǔn)確貢獻(xiàn)目前仍不清楚，而且這些貢獻(xiàn)對(duì)不同物種是否有明顯不同也不清楚。在谷類胚乳中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶有兩種異構(gòu)形式，一種在淀粉質(zhì)體中，另一種在細(xì)胞質(zhì)中(Denyer等人著，1996，Thorbjornsen等人著，1996)。每種異構(gòu)形式由兩類子組(subunit)組成。玉米的收縮(sh2)和脆性(bt2)突變體分別代表大小兩個(gè)子組的損害(Girouz和Hannah合著，1994)。在谷類胚乳中，發(fā)現(xiàn)了四種類型的淀粉合成酶。其中一種異構(gòu)形式完全存在于淀粉顆粒和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)，另兩種異構(gòu)形式分散在顆粒部分和可溶解部分之間(SSI，Li等人著，1999a，SSII，Li等人著，1999b)，第四種異構(gòu)形式完全存在于可溶解部分，SSIII(Cao等人著，2000，Li等人著，1999b，Li等人著，2000)。GBSS對(duì)于直鏈淀粉合成是必要的(詳見(jiàn)Shure等人著，1983)，SSII和SSIII的突變可改變支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)(詳見(jiàn)Gao等人著，1998，Craig等人著，1998)。沒(méi)有關(guān)于SSI突變作用的描述。
在谷類胚乳中，發(fā)現(xiàn)了三種形式的淀粉分支酶，淀粉分支酶I(SBEI)，淀粉分支酶IIa(SBEIIa)和淀粉分支酶IIb(SBEIIb)(Hedman和Boyer合著，1982，Boyer和Preiss合著，1978，Mizuno等人著，1992，Sun等人著，1997)。在玉米和稻谷中，高直鏈淀粉表型源于SBEIIb基因的損害，也被稱為直鏈淀粉增量(ae)基因(Boyer和Preiss合著，1981，Mizuno等人著，1993；Nishi等人著，2001)。在SBEIIb突變型中，胚乳淀粉顆粒呈現(xiàn)不正常形態(tài)，直鏈淀粉含量顯著提高，殘留的支鏈淀粉分支頻率減少，短鏈(＜DP17，特別是DP8-12)比例降低。而且淀粉的膠凝溫度升高。另外，還有一種介于直鏈淀粉和支鏈淀粉的重要聚合物，一般稱之為“中間體”(Boyer等人著，1980，Takeda等人著，1993b)。與此相反，SBEIIa基因中玉米植物突變型由于增變基因(Mu)插入體引起的SBEIIa不足，盡管葉淀粉的蛋白質(zhì)表達(dá)式改變了，胚乳淀粉分支的蛋白質(zhì)表達(dá)式與野生型植物仍沒(méi)有區(qū)別(Blauth等人著，2001)。同樣地，缺乏SBEIIa活性的稻谷植物胚乳中的支鏈淀粉鏈接輪廓也沒(méi)有顯著的改變(Nakamura著，2002)。
鈍1(dull1)突變引起玉米胚乳中淀粉含量的減少和直鏈淀粉水平的增加，變化的幅度取決于基因背景和剩余的支鏈淀粉分支的增加程度(Shannon和Garwood合著，1984)。對(duì)應(yīng)于該突變的基因已通過(guò)使用轉(zhuǎn)位子增變基因進(jìn)行轉(zhuǎn)位子標(biāo)記得以識(shí)別與隔離，并將這種酶編碼為淀粉合成酶II(SSII)(Gao等人著，1998)?，F(xiàn)在人們認(rèn)識(shí)到這種酶在谷類中應(yīng)屬于SSIII家族的一員。突變型胚乳中與鈍1突變有關(guān)的SBEIIa活性水平降低了。在其它谷類中未見(jiàn)有相應(yīng)突變的報(bào)導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)是否與其它谷類如大麥有關(guān)目前尚不明了。
WO94/09144專利建議使用致敏和抗致敏基因改變玉米中淀粉合成酶(SS)和淀粉分支酶的天然比例。但是，沒(méi)有現(xiàn)存資料能夠證實(shí)該建議的分子策略的有效性，也沒(méi)有特別降低SBEIIa活性的建議。
單獨(dú)調(diào)低土豆中SBEI數(shù)量對(duì)于淀粉結(jié)構(gòu)僅會(huì)產(chǎn)生極小的影響(Filpse等人著，1996)，進(jìn)一步的研究確認(rèn)了一些定性變化(Safford等人著，1998)。然而，同時(shí)調(diào)低土豆中SBEII和SBEI而增加的相應(yīng)直鏈淀粉含量將大大高于僅單獨(dú)調(diào)低土豆中SBEII的結(jié)果(Schwall等人著，2000)。
高等植物中有兩類去分支酶，根據(jù)基質(zhì)特征的不同，它們被分別命名為異淀粉酶型去分支酶和支鏈淀粉酶(pullulanase)型去分支酶(Myers等人著，2000)。雖然各同一位置突變?cè)驁D與異淀粉酶型去分支酶基因相同，玉米和稻谷的糖-1突變與這兩類去分支酶缺乏均有關(guān)聯(lián)(James等人著，1995，Kubo等人著，1999)。在衣藻(Chlamydomonas)第七階段突變中(Mouille等人著，1996)，模擬了玉米糖-1突變，單獨(dú)調(diào)低了異淀粉酶活性。表1列出了從谷類克隆的淀粉生物合成基因。
淀粉廣泛應(yīng)用于食品、造紙和化學(xué)工業(yè)。對(duì)于食品或非食品或工業(yè)產(chǎn)品，淀粉的物理結(jié)構(gòu)對(duì)淀粉的營(yíng)養(yǎng)和處理性質(zhì)有著重要的影響。淀粉在某方面的特性可作為其結(jié)構(gòu)的指示物，包括支鏈淀粉鏈長(zhǎng)度分布，結(jié)晶度和結(jié)晶的表現(xiàn)形式如淀粉結(jié)晶的V-復(fù)合體形態(tài)。支鏈淀粉鏈長(zhǎng)度可作為結(jié)晶性和膠凝性改變的指示物，同時(shí)，人們還認(rèn)為它與支鏈淀粉降解性降低有關(guān)聯(lián)。另外，對(duì)于含有大量淀粉的食品，支鏈淀粉鏈長(zhǎng)度的變化會(huì)反映食品的味覺(jué)屬性。淀粉的結(jié)晶性降低可能代表淀粉膠凝溫度降低，人們認(rèn)為它與味覺(jué)屬性加強(qiáng)有關(guān)。
大多數(shù)直鏈淀粉含量高的淀粉有相對(duì)較高的膠凝溫度，這對(duì)一些食品應(yīng)用而言是不利的。膠凝溫度反映了加工這些食品需要的粉碎能量。用這些麥?；虻矸奂庸さ念w粒或面粉制作食品一般需要較高的溫度。因此，含直鏈淀粉的產(chǎn)品一般較貴。另外，消費(fèi)者烹飪直鏈淀粉含量高的面粉制成品或制作食品時(shí)，需要更長(zhǎng)的時(shí)間和更高的溫度。在許多食品應(yīng)用方面，降低或正?；辨湹矸酆扛叩牡矸勰z凝溫度是很有利的。
淀粉成分，特別是抗性淀粉(resistant starch)，對(duì)腸特別是大腸的健康有重要的影響。因此，在諸如玉米的一些谷物中，開發(fā)了直鏈淀粉含量高的淀粉，用在食物中促進(jìn)腸的健康。抗性淀粉的有益影響來(lái)自于為大腸提供營(yíng)養(yǎng)物，使其中的腸內(nèi)微生物群落獲得發(fā)酵生成特殊短鏈脂肪酸的能量來(lái)源。而這些短鏈脂肪酸為腸道粘膜提供營(yíng)養(yǎng)物，增強(qiáng)對(duì)經(jīng)過(guò)大腸的特定營(yíng)養(yǎng)物的吸收，促進(jìn)結(jié)腸的生理性蠕動(dòng)。一般而言，如果抗性淀粉或其它食物纖維得不到供給，結(jié)腸新陳代謝會(huì)相對(duì)不活躍。
在谷物特別是大麥中的另一營(yíng)養(yǎng)成分是β-葡萄糖。β-葡萄糖由葡萄糖單元通過(guò)β-(1-4)和/或β-(1-3)糖苷鍵鏈接而成，人體消化酶不能將它分解，可作為食物纖維的合適來(lái)源。β-葡萄糖可被結(jié)腸內(nèi)的細(xì)菌部分消化，消化過(guò)程產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(主要是醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽)有利于腸和結(jié)腸內(nèi)的粘膜細(xì)胞(Sakata和Engelhard合著，1983)。β-葡萄糖的攝取還可促進(jìn)膽汁酸分泌，減少總血清膽固醇和低密度脂肪蛋白(LDL)，降低患冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)。同樣地，β-葡萄糖還可減少餐后血液中葡萄糖濃度的變化。人們認(rèn)為這些作用是基于胃和腸內(nèi)物質(zhì)粘度的增加。
雖然改良淀粉或葡萄糖能用于食物提供未改良原料不能提供的功能，但由于改良程序的影響，加工過(guò)程會(huì)或者改變其它有價(jià)值組分，或者產(chǎn)生不想要的東西。因此，提供不需改良即可直接用于食物的原料成分更可取。
大麥?zhǔn)鞘澜绲谒拇蠹Z食作物，在制作酒精飲料用于人類消費(fèi)方面相對(duì)利用不足。平均而言，大麥顆粒含有約64％淀粉，11％蛋白質(zhì)和5％β-葡萄糖(一般3-6％)。其余20％是水分，纖維和其它微量組分。
相對(duì)于玉米淀粉結(jié)構(gòu)變化而言，已知的大麥淀粉結(jié)構(gòu)變化是非常有限的。對(duì)應(yīng)于玉米或稻谷中直鏈淀粉增量劑表型，大麥的SBEIIb突變型仍未特征化。與大麥SBEIIa和SBEIIb突變對(duì)應(yīng)的表型目前仍不清楚。特征化程度最高的突變是定義為AC38的光滑和高直鏈淀粉含量突變。高直鏈淀粉Glacier品種(AC38)可將直鏈淀粉含量相對(duì)適度地最大增加到總淀粉的45％。用光滑表型再次突變也已構(gòu)建好并進(jìn)行了分析(Schondelmaier等人著，1992；Fujita等人著，1999)。
高直鏈淀粉含量大麥的其它突變已經(jīng)識(shí)別。對(duì)SSIIa基因進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)突變會(huì)使麥粒淀粉中高水平的直鏈淀粉含量達(dá)到約65-70％(WO 02/37955 A1)。M292和M342突變也充分展示了淀粉合成量減少引起的平均顆粒重量的減少，從喜馬拉雅(Himalaya)系的約51毫克的平均重量分別減少到M292和M342的32和35毫克。盡管該突變型保持了野生型谷類的長(zhǎng)度和寬度，其厚度從Himalaya的2.8毫米平均厚度降低到1.6-1.8毫米厚度，并且其中部區(qū)域基本上沒(méi)有填充，這導(dǎo)致了較差的研磨性。人們發(fā)現(xiàn)谷類長(zhǎng)度(L)對(duì)厚度(T)的比例是突變型等位基因的有用診斷參數(shù)，突變型和野生型種子的L∶T比例分別是大于3.5和小于3.5。突變系的淀粉含量從Himalaya的49.0％分別減少到M292和M342的17.7和21.9％。當(dāng)M292和M342麥粒中直鏈淀粉含量從6.2毫克每個(gè)穎果分別降低到4.0和4.8毫克，支鏈淀粉的含量從Himalaya的18.7毫克戲劇性的降低到突變型的1.6和2.9毫克。這表明相對(duì)高的直鏈淀粉水平是由于支鏈淀粉產(chǎn)量的降低。突變型中谷物β-葡萄糖水平增加到了10％以上。淀粉的膠凝溫度降低。SSIIa突變型改變了胚乳中淀粉顆粒和可溶解部分的SBEIIa和SBEIIb活性的分布，但它們?cè)谂呷橹凶鳛橐粋€(gè)整體沒(méi)有變化(WO 02/37955；Morell等人著，2003)。
雖然這些類型提高直鏈淀粉含量有效，但具有更高的直鏈淀粉含量的大麥淀粉更為可取，特別是當(dāng)它們可同時(shí)改進(jìn)淀粉的合成和其它特性時(shí)，例如，減少收獲后的改良需求。那些淀粉產(chǎn)品相對(duì)不易消化，更利于健康。
一般事項(xiàng)本技術(shù)領(lǐng)域人員可以明白的是，此處描述的發(fā)明除了那些特別提到的以外，還會(huì)有變化和修改。需要理解的是此處描述的發(fā)明已包括了所有變化與修改。本發(fā)明也包括了所有步驟，特征，本說(shuō)明參考或標(biāo)明的組分和化合物，單個(gè)地或共同地，任意兩個(gè)或更多的上述步驟或特征的任意和所有組合。
本說(shuō)明中，除非上下文要求，否則“包括”一詞及其變形應(yīng)理解為包括聲明的整體或步驟、或者整體或步驟的組合，但不得排除其它任何整體或步驟、或者整體或步驟的組合。此處描述的具體范圍僅用于例證目的，本發(fā)明并不局限于此。如同此處描述的一樣，功能等效產(chǎn)品、組分和方法清楚的列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本說(shuō)明書作者引用的詳細(xì)文獻(xiàn)目錄見(jiàn)本說(shuō)明書的最后部分。此處提及的參考文獻(xiàn)此后作為整體引用。此處引用的現(xiàn)有技術(shù)，包括任一份或更多的現(xiàn)有技術(shù)文檔，如果提及的現(xiàn)有技術(shù)在澳大利亞已成為一般通用知識(shí)或成為一般通用知識(shí)的一部分，將不再采取承認(rèn)或建議。
此處的術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于”用于指代起源于列舉物種的特殊整體或整體組，它們不需要直接來(lái)源于該列舉源。
此處核苷酸殘余物的命名參照國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)-國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC-IUB)生物化學(xué)命名委員會(huì)的推薦做法，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，T代表胸腺嘧啶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面可說(shuō)是專注于大麥作物的麥粒，所述大麥作物胚乳中SBEIIa酶活性水平已降低，上述麥粒淀粉中相應(yīng)的直鏈淀粉含量不少于40％(w/w)。相應(yīng)的直鏈淀粉含量高于50％或75％的更合適，麥粒不收縮的更合適。
本發(fā)明的第二方面可說(shuō)是專注于直鏈淀粉含量不低于75％(w/w)的大麥麥粒。
本發(fā)明的第三方面可說(shuō)是專注于本發(fā)明前兩方面麥粒制作的面粉或粗面粉，或這些面粉制作的食品。
本發(fā)明的第四方面可說(shuō)是專注于大麥作物麥粒的淀粉，所述大麥作物胚乳中SBEIIa酶活性水平已降低，上述淀粉不經(jīng)改良且相應(yīng)的直鏈淀粉含量不少于40％(w/w)。在第四方面的特殊形式里，大麥作物胚乳中SBEIIb酶活性水平也已降低。
本發(fā)明的第五方面可說(shuō)是專注于一種包括根據(jù)本發(fā)明第四方面的淀粉、其它食物成分或水的合成物。
本發(fā)明的第六方面可說(shuō)是專注于包括大麥胚乳的淀粉顆粒、其它食物成分或水的合成物，其中淀粉顆粒至少包含有75％(w/w)直鏈淀粉。
本發(fā)明的第七方面可說(shuō)是專注于SBEIIa酶活性水平已降低的大麥作物，其中大麥作物麥粒中淀粉含有的直鏈淀粉不低于40％(w/w)，或者最好是不低于50％或不低于75％。
本發(fā)明的第八方面可說(shuō)是專注于生產(chǎn)胚乳中SBEIIa酶活性水平已降低的，且麥粒中直鏈淀粉含量不低于40％(w/w)的大麥作物的方法。該方法包括以下步驟1)在父本大麥作物中引入遺傳變異；和2)識(shí)別SBEIIa活性減少了的后代作物或父本大麥作物種子。
本發(fā)明的第九方面可說(shuō)是專注于生產(chǎn)胚乳中SBEIIa和SBEIIb酶活性水平均已降低的大麥作物的方法，它包括1)誘變SBEIIa酶活性水平已降低的作物種子；或2)誘變SBEIIb酶活性水平已降低的作物種子；或3)將SBEIIa酶活性水平降低的作物與SBEIIb酶活性水平降低的作物雜交；識(shí)別SBEIIa和SBEIIb酶活性水平均已降低的大麥作物。


圖1是大麥SBEIIa互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)核苷酸序列(序列識(shí)別編號(hào)1)。
圖2是大麥SBEIIb互補(bǔ)脫氧核糖核酸核苷酸序列(序列識(shí)別編號(hào)2)。
圖3是A.tauschii提出的SBEIIa遺傳序列(序列識(shí)別編號(hào)3)(wSBEII-D1)，其對(duì)應(yīng)于T.aestivum提出的六倍體小麥D基因組淀粉分支酶IIa基因。
圖4是部分小麥SBEIIb遺傳序列(序列識(shí)別編號(hào)4)(wbe2b染色體組)。
圖5是雙紐形核糖核酸結(jié)構(gòu)示意圖，其中(A)使用的基因元素順序是啟動(dòng)子，在致敏方向的SBEIIa或SBEIIb遺傳序列(外顯子1，2和3)，基因內(nèi)區(qū)(基因內(nèi)區(qū)3)，在抗致敏方向的SBEIIa或SBEIIb遺傳序列(外顯子1，2，3和4)，轉(zhuǎn)錄終止基因/多聚腺嘌呤序列。(B)ds-SBEIIa和ds-SBEIIb基因轉(zhuǎn)錄形成“發(fā)夾式”核糖核酸結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)帶通過(guò)致敏和抗致敏序列雜交形成的雙紐線區(qū)域。與G和AG核苷酸接界的基因內(nèi)區(qū)序列已剪去。
圖6是大麥ds-SBEIIa和ds-SBEIIb輸異基因系聚合酶鏈反應(yīng)分析。淀粉分支酶IIb引物對(duì)BX17F/AR2bkpnR和SBEIIa引物對(duì)BX17F/AR2akpnR增強(qiáng)了各自結(jié)構(gòu)的第一和第二部分，包括外顯子1，2，3和基因內(nèi)區(qū)3(致敏方向)，用于識(shí)別積極的輸異基因系。GP代表未變形的Golden Promise品種。中央的小巷表示分子大小的標(biāo)記。
圖7是大麥ds-SBEIIa和ds-SBEIIb輸異基因系南部斑點(diǎn)(Southernblot)分析。(A)示出了使用南部斑點(diǎn)雜交的大麥ds-SBEIIa積極輸異基因。預(yù)期的染色體帶尺寸為1836bp。(B)示出了使用南部斑點(diǎn)雜交的大麥ds-SBEIIb積極輸異基因。預(yù)期的染色體帶尺寸為1907bp。GP代表GoldenPromise品種(負(fù)對(duì)比)。
圖8是大麥ds-SBEIIa和ds-SBEIIb輸異基因系西部斑點(diǎn)(Western blot)分析。使用非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳和SBEIIb特殊抗體對(duì)IIb4.3和IIb4.4系列的10顆T1種子(來(lái)自于T0作物的種子)進(jìn)行西部斑點(diǎn)分析，以得到淀粉分支酶IIb的表達(dá)式。小巷1(+)用于Glacier品種正對(duì)比。
圖9是大麥ds-SBEIIa和ds-SBEIIb輸異基因系西部斑點(diǎn)分析。使用非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳，SBEIIa或SBEIIb特殊抗體對(duì)IIa4.1系列的T1種子(來(lái)自于T0作物的種子)進(jìn)行西部斑點(diǎn)分析，以得到SBEIIa或SBEIIb的表達(dá)式。凝膠上的小巷均代表同樣的種子。每個(gè)板的小巷1(+)用于Glacier品種正對(duì)比。
圖10是大麥ds-SBEIIa和ds-SBEIIb輸異基因系西部斑點(diǎn)分析。使用非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳，SBEIIa或SBEIIb特殊抗體對(duì)IIb4.1系列的T1種子(來(lái)自于T0作物的種子)進(jìn)行西部斑點(diǎn)分析，以得到SBEIIa或SBEIIb的表達(dá)式。凝膠上的小巷均代表同樣的種子。每個(gè)板的小巷1(+)用于Glacier品種正對(duì)比。
圖11是大麥ds-SBEIIa輸異基因的淀粉顆粒形態(tài)。對(duì)于ds-SBEIIa和ds-SBEIIb輸異基因種子，單顆種子的淀粉顆粒均可通過(guò)光學(xué)顯微鏡目測(cè)。圖11A，具有野生型淀粉分支酶IIa的種子表達(dá)式(IIa4.2.3系列)。圖11B，缺乏淀粉分支酶IIa的種子表達(dá)式(IIa4.2.5系列)。在缺乏淀粉分支酶IIa而不是SBEI Ib的種子淀粉中，觀察到了重要的形態(tài)變化。
圖12是淀粉顆粒的掃描電子顯微鏡檢查法(SEM)。(A)為野生型淀粉顆粒(IIa 4.2.3系列)，(B)和(C)來(lái)自于ds-SBEIIa輸異基因、胚乳的淀粉顆粒(IIa4.2.5系列)。相對(duì)于野生型，來(lái)自于ds-SBEIIb(鈍化的淀粉分支酶IIb)種子的淀粉顆粒看起來(lái)沒(méi)有形態(tài)變化。
具體實(shí)施例方式
大麥中SBEIIa的改變本發(fā)明是基于大麥胚乳中SBEIIa活性降低導(dǎo)致改良淀粉生產(chǎn)的發(fā)現(xiàn)，特別是大麥麥粒中直鏈淀粉高度累積。這個(gè)非預(yù)期的結(jié)果與玉米和稻谷試驗(yàn)結(jié)果相反，玉米和稻谷試驗(yàn)中SBEIIa沒(méi)有改變支鏈淀粉的輪廓(Blauth等人著，20001，Nakamura著，2000)?？扇〉氖菃蝹€(gè)或許多另外的淀粉生物合成酶活性發(fā)生了改變，更可取的是SBEIIb和SBEIIa的活性降低了?？扇〉倪€有大麥作物顆粒不收縮。
大麥作物的生產(chǎn)方法一方面，本發(fā)明提出了降低大麥胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)活性的方法?；钚缘慕档团c未改良(控制)大麥胚乳相比，活性水平不低于40％，或最好不低于50％、75％，甚至是不低于90％或95％。本方法包含大麥SBEIIa基因表達(dá)式的改變，或可能包含大麥SBEIIa基因突變，從而胚乳中SBEIIa活性降低。
本方法可能包含決定大麥胚乳SBEIIa活性的步驟，較好的是測(cè)量蛋白質(zhì)的水平，例如通過(guò)免疫檢驗(yàn)，或通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法如北部斑點(diǎn)雜交(Northern blot hybridization)分析或反向錄制聚合酶鏈接反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定相應(yīng)的信使核糖核酸(mRNA)水平。本方法還可以包含選擇和篩選大麥作物或谷類胚乳中SBEIIa活性減少者的步驟。選擇步驟可能基于SBEIIa活性或蛋白質(zhì)的降低水平，或者可以基于大麥作物麥粒的表型，如增加的直鏈淀粉含量、或降低的支鏈淀粉含量、或視覺(jué)表型，例如收縮的麥粒。
SBE活性可通過(guò)酶活性簇測(cè)定，例如通過(guò)磷酸化酶刺激試驗(yàn)(Boyer和Preiss合著，1978)。該試驗(yàn)利用磷酸化酶a將葡萄糖1-磷酸鹽轉(zhuǎn)化成甲醇-不溶解的聚合物(α-D-葡萄糖)，測(cè)定其SBE的刺激。SBE活性可通過(guò)碘斑試驗(yàn)測(cè)定，該試驗(yàn)測(cè)量葡萄糖聚合物分支產(chǎn)生的葡萄糖-多碘化復(fù)合物降低的吸光度。SBE活性還可通過(guò)支鏈試驗(yàn)測(cè)定，該試驗(yàn)測(cè)量作為基質(zhì)的已還原直鏈淀粉產(chǎn)生的還原端數(shù)量，接著用異淀粉酶消化(Takeda等人著，1993a)?；钚缘臏y(cè)定最好是在缺乏SBEI或SBEIIb活性的情況下測(cè)量。SBE的異構(gòu)形式表現(xiàn)不同的基質(zhì)特性，例如SBEI顯示分支的直鏈淀粉有更高的活性，而SBEIIa和SBEIIb表示支鏈淀粉基質(zhì)有更高的分支比例。異構(gòu)形式也可根據(jù)轉(zhuǎn)移的葡萄糖鏈長(zhǎng)度區(qū)分。
又一方面，本發(fā)明提供了降低大麥胚乳中多重淀粉生物合成酶活性的方法，其中一種活性是SBEIIa活性。最好是SBEIIa和SBEIIb的活性均被降低，甚至是SBEI的活性也被降低。與SBEIIa化合時(shí)其它可能降低活性的淀粉生物合成酶有SSI，SSII，SSIII。淀粉分支酶也可能發(fā)生變化，例如異淀粉酶或支鏈淀粉酶活性。在另一實(shí)施例中，淀粉生物合成酶活性變化除了發(fā)生在胚乳外，還可能發(fā)生在作物的組織，例如SBEI或SBEII的活性在葉子部位可能增加，以彌補(bǔ)輸異基因?qū)BEIIa進(jìn)行編碼的活性損失-阻止胚乳中分子的基本表達(dá)傾向?；蛘撸ㄟ^(guò)一種或多種淀粉生物合成酶與SBEIIa發(fā)生還原反應(yīng)，淀粉合成可能被進(jìn)一步加速。對(duì)酶的基因編碼可能來(lái)自于任一變化源，例如來(lái)自于細(xì)菌或大麥外的其它來(lái)源，它也可能被修改而改變催化性質(zhì)，例如酶溫度依賴性的變化(WO94/09144)。
又一方面，本發(fā)明提出了增加大麥麥粒中直鏈淀粉水平(淀粉的百分率)的方法，包括減少大麥胚乳中SBEIIa活性的步驟。直鏈淀粉含量應(yīng)不低于50％，最好是不低于60％，65％，70％或75％。在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施例中，作為此處例證，該方法提供了不低于80％或90％的直鏈淀粉含量。
高直鏈淀粉表型可以通過(guò)部分或完全斷裂SBEIIa基因表達(dá)式，或SBEIIa和SBEIIb基因表達(dá)式而取得?；蚴芤种频姆葧?huì)在某種程度上決定大麥麥粒中淀粉的特性。對(duì)從改良的大麥胚乳萃取的蛋白質(zhì)進(jìn)行膠體電泳技術(shù)的任一部位均能揭示SBEIIa和/或SBEIIb活性改良的狀況和范圍。改良可通過(guò)降低SBEIIa和/或SBEIIb活性，完全廢除酶活性，或改變胚乳中SBEIIb或其它酶的分布進(jìn)行。為進(jìn)行這些測(cè)試，大麥胚乳中的淀粉可以被萃取出來(lái)，分析胚乳中的蛋白質(zhì)，如同Rahman et al，1995中略述的一樣。對(duì)可溶和淀粉顆粒部分施行本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的工藝如SDS-PAGE和斑點(diǎn)免疫，識(shí)別出發(fā)生了SBEIIa和/或SBE改變的作物或麥粒。
大麥作物又一方面，本發(fā)明提供了在麥粒的數(shù)個(gè)發(fā)育階段降低了胚乳中SBEIIa活性水平的大麥作物，能夠結(jié)果的大麥作物中的淀粉有相對(duì)較高的直鏈淀粉含量。相對(duì)于野生型，較好地，胚乳中的淀粉分支酶IIa水平的減少量應(yīng)不低于50％，若不低于75％更好，最好是不低于90％或95％。術(shù)語(yǔ)“野生型”具有在遺傳學(xué)領(lǐng)域的通常意義，包括大麥栽培品種或此處講授的未經(jīng)改良的基因型。
本發(fā)明還提供具有期望的父本特征的子代作物和麥粒。
除了降低SBEIIa活性外，本發(fā)明還包含具有變形SBEIIb或其它淀粉生物合成酶活性的大麥作物。降低了SBEIIa和SBEIIb活性的作物可通過(guò)降低了SBEIIa活性的作物與降低了SEBIIb活性的作物雜交而成，或通過(guò)引入輸異基因(transgene)對(duì)抑制SBEIIa和SBEIIb基因表達(dá)的分子進(jìn)行編碼。本發(fā)明還包括其它遺傳背景的突變。原始的突變異種作物可能與含有合意遺傳背景的作物雜交。經(jīng)過(guò)初始雜交，適當(dāng)數(shù)量的回交雜種可用于去除不太合意的背景。合意的遺傳背景可能包括提供商業(yè)產(chǎn)量和其它特性如農(nóng)藝學(xué)表現(xiàn)、非生物應(yīng)力阻抗性或殼更少麥粒的合適基因組合。遺傳背景還可能包括其它變形淀粉生物合成或改良基因，例如直鏈淀粉增量劑表型或大麥高直鏈淀粉冰川(High Amylose Glacier)的amol突變(未知基因)，光滑突變(如在Waxiro品種中發(fā)現(xiàn)的)，高直鏈淀粉含量變化MK6827的突變基因(可從美國(guó)農(nóng)業(yè)部ARS國(guó)家小谷物胚質(zhì)研究所獲得，地址美國(guó)愛(ài)達(dá)荷州阿伯丁市，831290(the USDA ARS National Small Grain Germplasm Research FacilityAberdeen，Idaho 831290 USA))或高直鏈淀粉品種M292和M342(SSIIa基因突變)或修飾基因。另外，將其它二次和三次突變與上述系列的結(jié)合物組合起來(lái)與其它有縮小胚乳(原因基因未知)的大麥系列雜交可能會(huì)得到理想的結(jié)果。
麥粒本發(fā)明還提供含有與野生型相比屬于變形淀粉的大麥麥粒。該變形淀粉至少是在大麥麥粒的胚乳發(fā)育過(guò)程中降低SBEIIa活性的部分后果。與野生型相比，從總淀粉百分率來(lái)看，麥粒含有增加的直鏈淀粉水平和降低的支鏈淀粉含量，野生型含有約25％的直鏈淀粉和75％的支鏈淀粉。最好是在胚乳的發(fā)育過(guò)程中，同時(shí)降低SBEIIa和SBEIIb的活性。更可取的是同時(shí)還降低SBEI的活性。利用本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的測(cè)量方法測(cè)定的直鏈淀粉水平，應(yīng)最少占總淀粉的50％，若不低于60％更可取，最好不低于65％，70％，75％，80％或90％。淀粉顆粒的不正常形態(tài)或在光學(xué)顯微鏡下觀察到的顆粒雙折射的消失或其它方法均能證明直鏈淀粉水平的增加。直鏈淀粉水平的測(cè)定用碘量法更好，它可用分光光度計(jì)(例如，Morrison和Laignelet合著，1983)或高性能液相色譜測(cè)定(HPLC，例如，Batey和Curtin合著，1996)。
大麥作物的麥粒中可能有升高的β-葡萄糖水平，這與更多的碳匯入聚合物而非支鏈淀粉的合成有關(guān)。或者，麥粒中有正常水平的β-葡萄糖，例如在成熟麥粒重量的3.0-6.0％范圍內(nèi)。麥粒中最好是含有升高的直鏈淀粉水平和正常水平的β-葡萄糖。根據(jù)SSIIa突變異種大麥(WO 02/37955)麥粒中淀粉成分，象這樣的組合不是所期望的。麥粒可能含有改變了膠凝溫度的淀粉和/或在后續(xù)的膠凝過(guò)程中改變了膨脹特性。麥粒還最好具有不收縮的表型。
本發(fā)明還提供麥粒制成的面粉和食物。它們可以是未經(jīng)處理的或處理過(guò)的，例如經(jīng)過(guò)分級(jí)或漂白。本發(fā)明還提供有益于食品生產(chǎn)的來(lái)自于特殊大麥作物的麥粒，其胚乳中SBEIIa活性水平已改變，上述麥粒的淀粉有較高的直鏈淀粉含量和降低的支鏈淀粉含量。另外，本發(fā)明包括用其它方法加工的麥粒，因而它們可能是粉碎的、研磨了的、珍珠狀的、粗輾的或裂化的。
淀粉另一方面，本發(fā)明提供來(lái)源于上述大麥作物的麥粒的淀粉，該作物胚乳中SBEIIa活性水平已降低，淀粉中有高的直鏈淀粉含量和降低的支鏈淀粉含量。最好同時(shí)降低SBEIIa和SBEIIb的活性，更可取的是同時(shí)還降低SBEI的活性。另一方面，本發(fā)明提供來(lái)自于大麥作物麥粒的淀粉，它至少含有50％的直鏈淀粉，直鏈淀粉含量若不低于60％更可取，最好直鏈淀粉含量不低于65％，70％，75％，80％或90％。用研磨加工法提純麥粒中的淀粉，例如濕磨加工包括淀粉與蛋白質(zhì)、油和纖維的分離。研磨加工的初始產(chǎn)品是淀粉顆粒的混合物，因此本發(fā)明包括該顆粒物。這些淀粉顆粒物至少含有50％，最好是含有70％，75％或80％的直鏈淀粉。
該淀粉含有升高水平的抗性淀粉，其具有改變了的結(jié)構(gòu)，該改變可通過(guò)包括單個(gè)或多個(gè)由物理上難于接近消化酶的小組的特殊的物理特征證實(shí)，所述消化酶可能是以下結(jié)果的原因高β-葡萄糖含量，變形淀粉顆粒形態(tài)，明顯的與淀粉有關(guān)的脂質(zhì)，結(jié)晶性的改變和變化了的支鏈淀粉鏈長(zhǎng)度分布。直鏈淀粉含量高也有助于提高抗性淀粉的級(jí)別。
本發(fā)明還提供來(lái)自于例示的大麥作物麥粒的淀粉，它含有數(shù)量增加的食物纖維，更優(yōu)的還具有提高的抗性淀粉水平。該增加還是相對(duì)高水平的直鏈淀粉的部分影響的結(jié)果。
降低基因活性的方法輸異基因SBEIIa和其它任意淀粉生物合成或改良基因的活性可通過(guò)誘使作物發(fā)生遺傳變異而改變，該過(guò)程通過(guò)向大麥作物引入輸異基因完成?！斑z傳變異”意味著基因組的改變，在上下文中，它影響SBEIIa的活性，包括點(diǎn)突變、取代、反轉(zhuǎn)、易位和刪除等突變形式，也包括引入輸異基因。此處涉及的“輸異基因”具有生物工藝學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的通常意義，同時(shí)它還包括由脫氧核糖核酸或核糖核酸重組技術(shù)產(chǎn)生或改變的遺傳序列，該遺傳序列已引入有機(jī)體或有關(guān)細(xì)胞。輸異基因可能包括來(lái)源于有機(jī)體或細(xì)胞的遺傳序列，例如抗致敏序列。輸異基因通常包括外來(lái)的核酸，該核酸并不來(lái)源于上述的有機(jī)體或細(xì)胞?！昂敭惢颉敝傅氖呛敭惢虻挠袡C(jī)體或細(xì)胞?！安缓敭惢颉敝傅氖腔蚪M中沒(méi)有任何輸異基因。輸異基因被整合到有機(jī)體或細(xì)胞的基因組中，進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳。
降低SBEIIa活性的方法包括將輸異基因引入大麥的可再生細(xì)胞和從變形細(xì)胞再生成含輸異基因的大麥作物的步驟。支鏈淀粉合成涉及的淀粉分支酶包括SBEI、SBEIIa和SBEIIb，本發(fā)明包含單獨(dú)減少的SBEIIa表達(dá)或與變形SBEIIb或SBEI結(jié)合的表達(dá)。因此，輸異基因可能比這些基因的任一種更不活躍。此外，由于輸異基因(例如如下所示的為雙紐形核糖核酸編碼，抗致敏，或核糖核酸構(gòu)成酶)直接將SBEIIb或SBEI基因表達(dá)作為目標(biāo)，或它可能間接地導(dǎo)致SBEIIb或SBEI表達(dá)的改變，SBEIIb和/或SBEI的鈍化可能是直接的。例如，輸異基因的核糖核酸不僅按照序列的同一性或堿基對(duì)把SBEIIa基因/核糖核酸作為目標(biāo)，而且通過(guò)改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或分布，導(dǎo)致SBEIIb或SBEI的減少。另外，本發(fā)明專注于聯(lián)合已改變活性的SBEIIa和單個(gè)或多個(gè)其它支鏈淀粉合成酶的變體，它們包括SSI，SSII，SSIII和異淀粉酶或支鏈淀粉酶等去分支酶。任一或所有這些酶的表達(dá)可通過(guò)引入輸異基因而改變。
在大麥支鏈淀粉合成基因中有一些知名的脫氧核糖核酸序列，其中任意一種均可作為大麥基因鈍化設(shè)計(jì)輸異基因的基礎(chǔ)。它們包括SBEIIa(基因銀行(GenBank)入藏登記號(hào)為AF064562和AF064560)，SBEIIb(基因銀行入藏登記號(hào)為AF064563和AF064561)。大麥SBEI基因的同系物可使用基于脫氧核糖核酸序列的序列將它與其它谷類區(qū)分，例如對(duì)于小麥?zhǔn)褂媚切┰诎l(fā)給Li等人著的專利說(shuō)明書WO 99/14314中陳述的技術(shù)。SBEI的小麥tauschii序列與小麥D基因組中SBEI基因極其同源，與大麥基因高度相似，它可在已出版的專利說(shuō)明書WO 99/14314或其引用文件中查到，該文件已合并到此處供參考。小麥SBEI序列可通過(guò)入藏登記號(hào)AF076679在基因銀行數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索。來(lái)自小麥和其它密切關(guān)聯(lián)物種的其它支鏈淀粉合成基因同系物也可用于修改大麥的基因表達(dá)水平。這些基因或其片段可通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法獲得，包括PCR放大或使用示蹤探針雜交。
此處使用的“嚴(yán)格的雜交條件”意思是如果在探針序列和目標(biāo)序列間同一性不低于90％，最好是不低于95％，雜交將會(huì)發(fā)生。嚴(yán)格的雜交條件例子是在以下條件下整晚培育含50％甲酰胺溶液，5×SSC(1×SSC＝150mM氯化鈉，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯，和20μg/ml變形修剪的脫氧核糖核酸載體，如鮭精脫氧核糖核酸，隨后在約65℃，用0.1×SSC清洗雜交載體。其它雜交和清洗條件是眾所周知的，并且例示在Sambrook等人著，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，冷泉港，紐約(1989)，特別是第11章。
用于構(gòu)造輸異基因的同系物域與相應(yīng)的大麥基因同一性應(yīng)不低于85％，不低于90％更好，最好是在適當(dāng)區(qū)域的同一性達(dá)到95-100％。最好是輸異基因明確地將大麥胚乳中支鏈淀粉合成基因的表達(dá)作為目標(biāo)，并且對(duì)作物中任意位置的支鏈淀粉合成產(chǎn)生較少或最少影響。這可通過(guò)使用合適的控制序列達(dá)到目的，如胚乳-輸異基因中確定的啟動(dòng)子。
抗致敏已知的改變，特別是明確減少作物中基因活性，基因工程或輸異基因方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。大麥作物引入遺傳變異的方法包括合適的抗致敏分子表達(dá)，它可彌補(bǔ)目標(biāo)基因核糖核酸的不足并能與之雜交。一般認(rèn)為抗致敏分子干擾目標(biāo)基因信使核糖核酸的翻譯、處理或穩(wěn)定性，從而鈍化其表達(dá)。設(shè)計(jì)抗致敏序列的方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，其范例可從以下位置查找美國(guó)專利第5190131號(hào)，歐洲專利說(shuō)明書0467349-A1，0223399-A1和0240208，上述專利文件合并到此以供參考。在作物中使用抗致敏技術(shù)已由Bourque(1995)和Senior(1998)評(píng)論。Bourque列出了大量的范例說(shuō)明了抗致敏序列在作物系統(tǒng)作為鈍化基因使用方法的使用過(guò)程。她還同時(shí)指出完全抑制酶的活性沒(méi)有必要，因?yàn)椴糠忠种聘赡軐?dǎo)致系統(tǒng)出現(xiàn)可測(cè)量的變化。Senior(1998)指出抗致敏方法目前已成為控制基因表達(dá)的非常成熟的技術(shù)。
大麥SBEIIa，SBEIIb，SBEI或其它支鏈淀粉生物合成基因的抗致敏分子能夠以大麥信使核糖核酸序列為基準(zhǔn)或以源于其它物種的脫氧核糖核酸或信使核糖核酸序列的同系現(xiàn)象為基準(zhǔn)，例如小麥。抗致敏序列應(yīng)對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)基因或形成影響控制整個(gè)基因表達(dá)或剪切事件的次序。例如抗致敏序列能對(duì)應(yīng)于大麥SBEIIa或其它基因的標(biāo)的編碼區(qū)域，或5’-未轉(zhuǎn)換區(qū)域(untranslatedregion，UTR)或3’-未轉(zhuǎn)換區(qū)域或它們的結(jié)合。它可作為基因內(nèi)區(qū)序列的部分補(bǔ)償，該序列在轉(zhuǎn)錄中或轉(zhuǎn)錄后都可能被剪切掉，特別是目標(biāo)基因的外顯子序列。考慮到未轉(zhuǎn)換區(qū)域更大的擴(kuò)散性，瞄準(zhǔn)這些區(qū)域可提供更專一的基因抑制。抗致敏序列的長(zhǎng)度最少應(yīng)有19個(gè)連續(xù)的核苷酸，有50個(gè)核苷酸更好，最好是有不低于100，200，500或1000個(gè)核苷酸?？墒褂醚a(bǔ)充整個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的全長(zhǎng)序列。其長(zhǎng)度最好有100-2000個(gè)核苷酸?？怪旅粜蛄信c轉(zhuǎn)錄目標(biāo)的同源程度應(yīng)不低于85％，不低于90％更好，最好是95-100％?？怪旅艉颂呛怂岱肿涌砂幌喔傻男蛄?，這些序列有穩(wěn)定分子的功能。
協(xié)同抑制另一可使用的分子生物方法是協(xié)同抑制。協(xié)同抑制的機(jī)理目前仍不完全明了，但人們認(rèn)為它包含了轉(zhuǎn)錄后基因壓制(post-transcriptional genesilencing，PTGS)，從這方面看，它與抗致敏抑制的許多范例非常相似。它通過(guò)將基因或其片段的額外拷貝沿啟動(dòng)子表達(dá)的致敏方向引入作物。就上述抗致敏序列而論，致敏片段的尺寸、與目標(biāo)基因區(qū)域的對(duì)應(yīng)性和與目標(biāo)基因的相同程度是很重要的。在一些實(shí)例中，遺傳序列的附加拷貝會(huì)干擾目標(biāo)作物基因的表達(dá)。具體實(shí)施協(xié)同抑制的方法可參考專利說(shuō)明書WO 97/20936和歐洲專利說(shuō)明書0465572。
雙紐形核糖核酸-間接基因抑制另一可用來(lái)向大麥作物引入遺傳變異的方法是雙紐形核糖核酸間接基因抑制。本方法也包括轉(zhuǎn)錄后基因壓制(PTGS)。本方法中，引入了脫氧核糖核酸指導(dǎo)部分雙紐形核糖核酸產(chǎn)品的合成。因此，脫氧核糖核酸中有致敏和抗致敏序列，當(dāng)轉(zhuǎn)錄成核糖核酸時(shí)，能雜交形成雙紐形核糖核酸區(qū)域。在較優(yōu)的實(shí)施例中，致敏和抗致敏序列用含有基因內(nèi)區(qū)的隔離區(qū)域分開，當(dāng)轉(zhuǎn)錄成核糖核酸時(shí)，該基因內(nèi)區(qū)被切割掉。該排列可導(dǎo)致更高的基因抑制效率。雙紐區(qū)域可能含有一個(gè)或兩個(gè)核糖核酸分子，從任意一個(gè)或兩個(gè)脫氧核糖核酸區(qū)域轉(zhuǎn)錄。雙紐分子的存在從作物系統(tǒng)內(nèi)部觸發(fā)，破壞雙紐形核糖核酸和從目標(biāo)作物基因轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的核糖核酸，有效的減少或消除目標(biāo)基因的活性。實(shí)施本技術(shù)的方法可參照澳大利亞專利說(shuō)明書99/292514-A和專利說(shuō)明書WO99/53050。雜交的致敏和抗致敏序列長(zhǎng)度應(yīng)都不少于19個(gè)連續(xù)的核苷酸，50個(gè)核苷酸更好，最好是有不低于100，200，500或1000個(gè)核苷酸?？墒褂脤?duì)應(yīng)于整個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的全長(zhǎng)序列。其長(zhǎng)度最好有100-2000個(gè)核苷酸?？怪旅粜蛄信c轉(zhuǎn)錄目標(biāo)的同源程度應(yīng)不低于85％，不低于90％更好，最好是95-100％。抗致敏核糖核酸分子可包含不相干的序列，這些序列有穩(wěn)定分子的功能。
核糖酶核糖酶可用于引入遺傳變異，該遺傳變異負(fù)責(zé)鈍化大麥中期望的基因表達(dá)。核糖酶是帶有酶或催化功能的核糖核酸分子，能在特定場(chǎng)所分裂由一個(gè)或兩個(gè)雜交序列定義的其它核糖核酸分子。核糖核酸的分裂鈍化了目標(biāo)基因的表達(dá)。核糖酶還可用作抗致敏分子，有助于基因鈍化。核糖酶有一個(gè)或更多個(gè)催化域，特別是存在于雜交序列之間的頭錘型和發(fā)夾型核糖酶。其它可用的核糖酶主題包括核糖核酸分離，I或II組基因內(nèi)區(qū)，肝炎三角病毒類型。本文已參考?xì)W洲專利說(shuō)明書0321201和專利號(hào)為6,221,661的美國(guó)專利。在輸異基因作物中使用核糖酶鈍化基因已有實(shí)證，例如Wegener等人著(1994)提出的。
遺傳結(jié)構(gòu)/載體本發(fā)明提供了獨(dú)立的包括核糖核酸和較好為脫氧核糖核酸的核酸分子，所述核糖核酸和脫氧核糖核酸為基因抑制分子編碼。特別地，核酸為抗致敏、致敏(協(xié)同抑制)、雙紐形核糖核酸或核糖酶分子編碼。核糖酶分子瞄準(zhǔn)大麥SBEIIa遺傳序列，有效地鈍化了它在大麥麥粒胚乳中的表達(dá)。本發(fā)明還提供了包括獨(dú)立的核酸分子，單個(gè)或多個(gè)控制元素如啟動(dòng)子、增強(qiáng)劑、轉(zhuǎn)錄中止子或多聚腺苷酰作用序列在內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)。這些元素在本技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的。遺傳結(jié)構(gòu)還包括基因內(nèi)區(qū)序列，它幫助作物中輸異基因的表達(dá)，特別是如同大麥一樣的單子葉作物。術(shù)語(yǔ)“基因內(nèi)區(qū)”使用其通常意思，表示經(jīng)過(guò)了轉(zhuǎn)錄但不對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因片段，它在開始翻譯前被從核糖核酸剪去?；騼?nèi)區(qū)可合并成5’-未轉(zhuǎn)換區(qū)域，或在輸異基因?qū)σ逊g產(chǎn)品進(jìn)行編碼時(shí)合并成編碼區(qū)域，或放在轉(zhuǎn)錄區(qū)域的任意位置。
本發(fā)明還提供包括遺傳結(jié)構(gòu)載體，例如質(zhì)粒載體。術(shù)語(yǔ)“載體”含有能在體內(nèi)或體外表達(dá)的表達(dá)載體，和能從一個(gè)細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)換載體。載體含有提供細(xì)胞復(fù)制的序列，例如大腸桿菌或土壤桿菌等原核生物。載體是含有T-脫氧核糖核酸序列的二元載體，規(guī)定在序列邊緣至少有一個(gè)T-脫氧核糖核酸邊緣序列，它能夠引入大麥細(xì)胞中。本發(fā)明還提供含載體的細(xì)胞，例如土壤桿菌或可再生的大麥細(xì)胞，如未成熟的胚胎角質(zhì)細(xì)胞。或者，該細(xì)胞能轉(zhuǎn)換成含有輸異基因的大麥細(xì)胞。
啟動(dòng)子/中止基因本發(fā)明的輸異基因或其它遺傳結(jié)構(gòu)可包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域(啟動(dòng)子)，它能夠控制或構(gòu)成大麥胚乳的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是特定的組織，具有選擇表達(dá)的性能或只存在于胚乳。啟動(dòng)子或者從確定的胚乳(如高分子量的麥谷蛋白啟動(dòng)子，小麥SSI啟動(dòng)子，小麥SBEII啟動(dòng)子，小麥GBSS啟動(dòng)子)選出，或者從不確定的胚乳(如泛激素啟動(dòng)子，或CaMV35S，或增強(qiáng)型35S啟動(dòng)子)選出。啟動(dòng)子受許多因素的影響，如光、熱或壓力。通常，啟動(dòng)子可用待表達(dá)的遺傳序列5’提供，其結(jié)構(gòu)可能含有其它增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的元素，如nos 3’或ocs 3’多聚腺苷酰作用區(qū)域或轉(zhuǎn)錄中止基因。脫氧核糖核酸圖示區(qū)域可合并到含有適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記基因序列和其它元素的載體中，或合并到載體中與含有這些序列的載體協(xié)同變換。
大麥轉(zhuǎn)化方法在本技術(shù)領(lǐng)域，通過(guò)引入外源性核酸向作物引入遺傳變異，為作物原生質(zhì)體或未成熟作物胚胎的再生服務(wù)的單子葉作物如大麥的轉(zhuǎn)化方法是眾所周知的，見(jiàn)范例，Wan和Lemaux(1994)；Tingay等人著(1997)；Nehra在加拿大的專利申請(qǐng)?zhí)枮?092588專利申請(qǐng)；加拿大國(guó)家研究理事會(huì)(NationalResearch Council of Canada)在澳大利亞的專利申請(qǐng)，編號(hào)為61781/94；日本煙草公司(Japan Tobacoo Inc.)在澳大利亞的專利申請(qǐng)，編號(hào)為667939；Monsanto公司國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US97/10621；美國(guó)專利5589617。其它方法在專利說(shuō)明書WO99/14314種有陳述。載有期望的核苷酸序列或遺傳結(jié)構(gòu)和選擇性記號(hào)的載體可引入可再生大麥細(xì)胞，該細(xì)胞來(lái)自于培養(yǎng)作物的組織，或外置體，或何時(shí)的作物系統(tǒng)如原生質(zhì)體。選擇性的標(biāo)記基因可為大麥細(xì)胞提供抗生素或除草劑保護(hù)，或允許使用甘露糖等基質(zhì)。選擇性的標(biāo)記更可為大麥細(xì)胞提供潮酶素保護(hù)?？稍偕拇篼溂?xì)胞優(yōu)先來(lái)自于未成熟的胚胎角質(zhì)，成熟的胚胎，源于上述組織的愈合組織，或分生組織。
變化的作物可能含有選擇性的標(biāo)記基因，或那些在再生過(guò)程中或再生后能去除的基因，例如通過(guò)刪除去除基因組中的選擇性標(biāo)記基因，或?qū)⑦x擇性的標(biāo)記基因與SBEIIa-抑制性輸異基因分開。
輸異基因或突變組合成染色體的作物可進(jìn)行篩選，例如通過(guò)使用合適的特別適用于輸異基因的核酸探頭，或通過(guò)表型觀察。多種方法可用于確認(rèn)轉(zhuǎn)化作物的存在。例如，聚合酶鏈接反應(yīng)(PCR)可用于放大轉(zhuǎn)化作物的獨(dú)特序列，用膠體電泳技術(shù)或其它方法探測(cè)放大了的產(chǎn)品?？捎脗鹘y(tǒng)方法從作物中萃取脫氧核糖核酸，用引子引發(fā)聚合酶鏈接反應(yīng)(PCR)可區(qū)分變化的作物與未發(fā)生變化的作物。例如，可設(shè)計(jì)用引子放大來(lái)自于變化載體的脫氧核糖核酸區(qū)域，將載體讀入結(jié)構(gòu)中，和用利害基因設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)引子。如果作物已順利變化，引子將僅放大其片段。確認(rèn)正變化的另一方法是南部斑點(diǎn)雜交，它在本技術(shù)領(lǐng)域非常著名。轉(zhuǎn)化或突變的作物可以識(shí)別，也就是說(shuō)，通過(guò)表型可將它與未轉(zhuǎn)化的或野生型作物區(qū)分開，例如與選擇性標(biāo)記基因的現(xiàn)狀進(jìn)行對(duì)比，或用免疫學(xué)方法分析現(xiàn)有的特殊蛋白質(zhì)，或通過(guò)缺少某種蛋白質(zhì)，如用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)胚乳中SBEIIa蛋白質(zhì)。篩選作物時(shí)使用可通過(guò)觀測(cè)麥粒表型特點(diǎn)區(qū)分的示蹤物，例如通過(guò)視覺(jué)檢查或測(cè)量收縮的麥粒，或測(cè)定升高的直鏈淀粉含量，或用顯微鏡檢查雙反射的存在。
突變引入遺傳變異可導(dǎo)致大麥胚乳中SBEIIa和其它酶活性減少，遺傳變異可通過(guò)在相應(yīng)基因或基因的控制序列內(nèi)經(jīng)合適的突變獲得?；蚴芤种频某潭葧?huì)在某種程度上決定淀粉制成品的特性。突變可能切斷或無(wú)效，這些對(duì)淀粉的性質(zhì)有重大的影響，但是，滲漏突變體可充分減少支鏈淀粉生物合成酶活性，使大麥淀粉或麥粒產(chǎn)生感興趣的特性，并導(dǎo)致支鏈淀粉結(jié)構(gòu)變化。其它染色體的重排也是有效的，它們包括刪除，反轉(zhuǎn)，復(fù)制或點(diǎn)突變。
可通過(guò)化學(xué)或輻射方法產(chǎn)生突變，例如對(duì)種子用EMS或疊氮化鈉(Zwar和Chandler，1995)處理，或γ放射。突變的隔離可通過(guò)篩選出已發(fā)生誘變的作物或種子完成。例如，已發(fā)生誘變的大麥群體可篩選出以獲得麥粒中高的直鏈淀粉含量和/或長(zhǎng)過(guò)普通支鏈淀粉鏈長(zhǎng)度的分布，或通過(guò)ELISA損耗SBEIIa蛋白質(zhì)，或改變麥粒的形態(tài)(Green等人著，1997)。對(duì)缺乏一種SBE活性的大麥基因型優(yōu)先進(jìn)行篩選，例如在SBEIIb-負(fù)面背景。突變隨后與有期望的基因背景的突變作物雜交，引入期望的基因背景；同時(shí)進(jìn)行適當(dāng)數(shù)量的回交，除去原來(lái)的不受歡迎的父系背景。
為SBEIIa或其它有關(guān)支鏈淀粉合成的酶編碼的基因發(fā)生突變一般會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的直鏈淀粉含量的增加。由于碳從支鏈淀粉向直鏈淀粉轉(zhuǎn)移，單個(gè)麥粒中直鏈淀粉量可能增加?；蛘呷绻溋Ｖ械矸郛a(chǎn)量發(fā)生了重大下降，單個(gè)麥粒中直鏈淀粉量可能減少。任意一種情況下，相應(yīng)的直鏈淀粉水平在淀粉中所占的百分率都是上升的。
適于食品生產(chǎn)另一方面，本發(fā)明提供了適于食品生產(chǎn)的大麥，大麥作物麥粒的胚乳在麥粒發(fā)育階段就降低了SBEIIa的活性，上述麥粒中的淀粉有相對(duì)較高的直鏈淀粉含量和和低的支鏈淀粉含量。本發(fā)明的大麥作物產(chǎn)出的麥粒更適合于食品生產(chǎn)，特別是商業(yè)食品生產(chǎn)。該食品生產(chǎn)包括面粉或其它可用于商業(yè)食品生產(chǎn)制品成分的生產(chǎn)。
期望的大麥基因背景包括考慮農(nóng)作物產(chǎn)量和其它特性。該特性可能包括想要冬季大麥還是春季大麥，農(nóng)藝學(xué)性能，抗病性和非生物壓力抵抗性。在澳大利亞，人們希望的大麥栽培品種有Sloop，Schooner，Chebec，F(xiàn)ranklin，Arapiles，Tantangara，Galleon，Gairdner或Picola。該例子僅適用于澳大利亞特定生產(chǎn)區(qū)，其它品種適合于其它生長(zhǎng)區(qū)。推薦的本發(fā)明的大麥品種產(chǎn)量應(yīng)在多個(gè)生長(zhǎng)區(qū)的產(chǎn)量不低于相應(yīng)野生型品種產(chǎn)量的80％，若不低于90％更可取，更可取的是不低于95％。在受控的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)中，產(chǎn)量可輕易測(cè)量。若大麥作物外殼更少或是“裸露的”，它會(huì)更受歡迎，因?yàn)榇篼滬溋Ｍ馄さ拇嬖跒辂溋５募庸?lái)了更大的困難。
麥粒的淀粉含量不應(yīng)低于約12％(w/w)或15％，不低于25％更理想，不低于35％更好，最好是能接近野生型的45-50％(w/w)含量。淀粉含量低于野生型品種的可能原因是降低了支鏈淀粉水平。對(duì)于商業(yè)食品生產(chǎn)，由于可生產(chǎn)相對(duì)價(jià)值較高的直鏈淀粉含量高的產(chǎn)品，該麥粒仍然有用。其它期望的特性包括研磨麥粒的產(chǎn)量。雖然大多數(shù)麥粒形式均可生產(chǎn)珍珠麥，某種結(jié)構(gòu)的麥粒特別抗研磨。對(duì)商業(yè)應(yīng)用可能產(chǎn)生影響的另一特性是麥粒生產(chǎn)產(chǎn)品的著色。麥粒的削皮處或其它部分顯示出比一般部分更有效的著色性，可能會(huì)局限其商業(yè)應(yīng)用于較小范圍，如作為有色面包(總體有色或片段有色)的成分。大麥通常的顏色是紫色，會(huì)很亮且著色能力強(qiáng)，在大多數(shù)食品中是不受歡迎的。另一可能促使大麥具有更高價(jià)值的方面是從麥粒中提取淀粉的程度，提取比例越高用處越大。麥粒的外形是影響其商業(yè)用途的另一特征，它可影響到麥粒研磨的難易程度。例如，直鏈淀粉含量高的MK6827作物大麥顆粒非常細(xì)長(zhǎng)，難于研磨和加工。方便測(cè)量細(xì)長(zhǎng)型的顆粒和相應(yīng)的有用性的是顆粒長(zhǎng)度與厚度的比率(L/T比率)。該比率反映了淀粉的性質(zhì)。平均而言，該比率應(yīng)低于5.5，變化范圍在4-5之間更好，最好是低于3.5。
為取得更高的產(chǎn)量和達(dá)到本發(fā)明需實(shí)現(xiàn)的益處，如含高水平直鏈淀粉的淀粉的生產(chǎn)，或選擇性的改變淀粉中鏈長(zhǎng)度的分布，期望麥粒能完全填充。因此，最好是有不收縮的表型。然而，在麥粒較少填充時(shí)，發(fā)明的其它方面更易滿足。麥粒較少填充時(shí)，淀粉中糊粉層或微生物的比例會(huì)更高，從而大麥面粉或其它產(chǎn)品會(huì)含有更多的糊粉層有益成分。產(chǎn)品中糊粉層含量高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品中含有更高的某種維生素含量，如葉酸，或更高的礦物質(zhì)，如鈣，與較高的抗性淀粉水平和/或β-葡萄糖水平結(jié)合可產(chǎn)生協(xié)同影響，如增強(qiáng)大腸對(duì)礦物質(zhì)的吸收。
為使直鏈淀粉含量最大化，大麥作物除了降低SBEIIa活性外，還應(yīng)有其它表型特征。因此遺傳背景可能包括另外的在AC38發(fā)生的amol突變(原因基因不清楚)或光滑突變(例如在Waxiro品種的發(fā)現(xiàn))。另外，在其它可得到的胚乳縮小的大麥突變異種中，可能發(fā)生雙重突變。胚乳縮小的原因基因目前尚不清楚。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法，淀粉很容易與大麥麥粒分離開，例如Schulman等人著(1991)提出的方法。在工業(yè)規(guī)模，可使用干磨法和濕磨法。來(lái)源于本發(fā)明的大麥作物的淀粉有相對(duì)較高的直鏈淀粉含量。大麥作物中淀粉含有不低于35-45％直鏈淀粉的可認(rèn)為直鏈淀粉含量較高。本發(fā)明提供來(lái)自于大麥作物麥粒的淀粉，它至少含有50％(w/w)的直鏈淀粉，直鏈淀粉含量若不低于60％更可取，最好直鏈淀粉含量不低于65％，70％，75％，80％或90％。
需要理解的是論及的相應(yīng)直鏈淀粉水平與總淀粉含量有關(guān)，因而淀粉的剩余物主要是淀粉的中間類型或者是支鏈淀粉或者是兩者的混合物。
β-葡萄糖眾所周知，大麥中β-葡萄糖的水平變化范圍較廣，占大麥重量從約4％到約18％，但通常而言，主要變化范圍是4％到約8％(例如，Izydorcyk等人著，2000)。已開發(fā)了增強(qiáng)型大麥品種，例如，β-葡萄糖占大麥重量約從15％到18％，但具有光滑表型。
本發(fā)明預(yù)期的β-葡萄糖水平依賴于遺傳背景，其中支鏈淀粉合成酶的活性，包括SBEIIa，均被減少。具體的例子表明相應(yīng)的普通β-葡萄糖合成，然而，本發(fā)明的變體擬得到升高的相應(yīng)β-葡萄糖水平。因而大麥作物麥粒的β-葡萄糖含量約為總未去殼麥粒重量的3-6％(w/w)。本發(fā)明的另一種變體表示β-葡萄糖含量高于6％，或更高，例如6-8％。測(cè)得的光滑突變異種的β-葡萄糖水平高到15-18％，例如，品種Prowashonupana，商業(yè)銷售名為SustagrainTM，(ConAgraTM特殊谷物產(chǎn)品公司，奧馬哈，內(nèi)布拉斯加州(ConAgraTMSpeciallyGrain Products Company，Omaha，Neb.)，美國(guó))，目前本發(fā)明的目標(biāo)是β-葡萄糖水平同它一樣高，或更高。
膠凝溫度膠凝是淀粉微粒的分子次序受到破壞，伴隨著性質(zhì)方面不可逆變化，如微粒膨脹，微晶熔解，雙折射喪失，粘度增加和淀粉溶液化。玉米的ae(直鏈淀粉增加)突變導(dǎo)致淀粉中高的直鏈淀粉含量表明其膠凝溫度比普通玉米的更高(Fuwa等人著，1999，Krueger等人著，1987)。另一方面，大麥sex6突變?nèi)狈Φ矸酆铣擅窱Ia活性，產(chǎn)生的淀粉具有較低的膠凝溫度，膠凝峰值點(diǎn)的熱焓與對(duì)照植物產(chǎn)生的淀粉相比有所減少(Morell等人著，2003)。
另一方面，如同差示掃描量熱法測(cè)定結(jié)果所示，淀粉的膠凝溫度有了變化。與野生型作物相比，該變化或者是升高，或者是降低。淀粉在膠凝溫度變化的同時(shí)，有相對(duì)較高的直鏈淀粉含量。膠凝溫度降低時(shí)，與其它大麥品種生產(chǎn)的淀粉直鏈淀粉含量升高相比，直鏈淀粉含量有所減少，或者與大麥淀粉中含有正常直鏈淀粉水平相比，直鏈淀粉含量有所減少。本發(fā)明另一可選擇變體是企圖使膠凝溫度不變或相對(duì)于野生型大麥淀粉的膠凝溫度略有升高。野生型大麥淀粉的典型膠凝溫度用差示掃描量熱法測(cè)定的第一個(gè)峰值溫度約為56℃。
膨脹體積與野生型淀粉相比，本淀粉在過(guò)量熱水中膨脹率很有特色。膨脹體積的通常測(cè)定方法是將淀粉或面粉與過(guò)量水混合，加熱提高溫度，到溫度高于90℃。用離心法收集樣品，膨脹體積用樣品中沉淀物質(zhì)的干重質(zhì)量表示。當(dāng)想增加食品制備中的淀粉含量時(shí)，低膨脹特性是有用的，特別是在制作含水食物時(shí)。
結(jié)晶性與普通的從大麥中分離出的淀粉相比，本發(fā)明挑選的大麥變體的淀粉結(jié)構(gòu)在結(jié)晶性方面存在差別，其結(jié)晶度有所降低。淀粉結(jié)晶性降低被認(rèn)為同增強(qiáng)味覺(jué)性能有關(guān)，并有助于更光滑的口感。淀粉結(jié)晶性的降低是由于單種或多種支鏈淀粉合成酶的活性水平降低，結(jié)晶性測(cè)定的典型方法是X-射線結(jié)晶學(xué)法。
支鏈淀粉鏈長(zhǎng)度的分布支鏈淀粉結(jié)構(gòu)變化的測(cè)定是通過(guò)測(cè)定鏈長(zhǎng)度的分布，或淀粉的聚合度。鏈長(zhǎng)度分布可在用異淀粉酶去分支后，使用熒光輔助碳水化合物電泳法(FACE)測(cè)定。本發(fā)明淀粉中的支鏈淀粉鏈長(zhǎng)度分布范圍是5-60，高于野生性作物淀粉去分支后測(cè)定的分布情況。鏈長(zhǎng)度更長(zhǎng)的淀粉的相應(yīng)分支頻率更低。因而存在支鏈淀粉時(shí)，淀粉可能有更長(zhǎng)的支鏈淀粉鏈長(zhǎng)度分布。
食物特性淀粉是人類飲食中碳水化合物的主要來(lái)源，本發(fā)明的麥粒及其制品可用于準(zhǔn)備食物。食物可被人或動(dòng)物消耗，例如，家畜生產(chǎn)或?qū)櫸锸称贰Ｔ从谧冃未篼溩魑锏柠溋Ｈ菀自谑称诽幚沓绦蚴褂?，因此本發(fā)明包括磨碎的、研磨的、碎塊的、圓形的或碾壓的谷物或產(chǎn)品，它們?cè)从诠阮惣庸せ蛏鲜龃篼溩魑锏恼麄€(gè)麥粒，包括面粉。這些產(chǎn)品可用于各種各樣的食品，例如粉狀制品如面包、蛋糕、餅干和其相似物，或者食品添加劑如增稠劑或粘合劑，或制作麥芽或其它大麥飲料，面條和即食湯。源于本發(fā)明麥粒的顆?；虍a(chǎn)品特別適用于早餐谷類。本發(fā)明的淀粉含直鏈淀粉量大，可生產(chǎn)用于糖果工業(yè)的高強(qiáng)度凝膠，或允許較少的成型時(shí)間和固化時(shí)間。它們還可用作涂層，例如，減少油炸馬鈴薯或其它食物的油類吸附量。
食物纖維在本說(shuō)明書中，食物纖維指碳水化合物和碳水化合物的消化產(chǎn)物，它們?cè)诮】等梭w的小腸中不被吸收，進(jìn)入大腸。包括抗性淀粉，β-葡萄糖和其他可溶和不可溶的碳水化合物的的聚合物。它還至少包括在大腸中由駐留的微生物群落發(fā)酵的部分碳水化合物的一部分。
本發(fā)明的淀粉含有相對(duì)較高的食物纖維水平，更獨(dú)特的直鏈淀粉和隨意提高的β-葡萄糖水平。本發(fā)明的麥粒中食物纖維含量可能或非單獨(dú)來(lái)自于增加的相應(yīng)胚乳中直鏈淀粉含量。β-葡萄糖處于提高的水平，有助于提高食物纖維水平。
本發(fā)明的某些方面可能起因于糊粉層和微生物的聯(lián)合作用以及與高水平飲食纖維的聯(lián)合。特別地，在麥粒中有相對(duì)較高水平的糊粉或微生物時(shí)，它也可能出現(xiàn)。首先，大麥有一個(gè)重要的比其它經(jīng)濟(jì)谷類均要厚的糊粉層，它有三個(gè)細(xì)胞糊粉層。其次，當(dāng)大麥顆粒輕輕收縮時(shí)，胚乳的總量會(huì)減少，而糊粉層和微生物總量會(huì)相對(duì)上升。因而大麥有相對(duì)高水平的某種有益元素或與升高的抵抗力結(jié)合的維生素，該元素包括二價(jià)陽(yáng)離子如有生物作用的Ca++和維生素如葉酸或抗氧化劑如生育酚和生育三烯酚。鈣對(duì)于生長(zhǎng)、骨骼的沉積和其它鈣化組織是必需的，可降低在以后的生命中患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)。攝取葉酸可保護(hù)神經(jīng)管免受損害并降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，從而增強(qiáng)抗性淀粉與β-葡萄糖聯(lián)合作用的影響。葉酸還被認(rèn)為可降低患某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。生育酚和生育三烯酚帶來(lái)抗氧化劑的益處，一般認(rèn)為它們可降低癌癥和心臟病的風(fēng)險(xiǎn)，還有減少食品組分氧化帶來(lái)的不受歡迎的影響的作用，如脂肪酸可導(dǎo)致惡臭。研磨產(chǎn)品的一種特別形式是其中含有糊粉層。為增加糊粉層的數(shù)量，需采用特殊的研磨程序。該方法參見(jiàn)Fenech等人著(1999)。因而，源于麥粒研磨或加工含有糊粉層和微生物的產(chǎn)品會(huì)有額外的營(yíng)養(yǎng)好處，不需要從單獨(dú)從其它來(lái)源添加這些元素。
抗性淀粉抗性淀粉被定義為淀粉和不被健康人體小腸吸收但進(jìn)入大腸的淀粉消化產(chǎn)物的總稱。因而，抗性淀粉不包括能被小腸消化和吸收的產(chǎn)物。抗性淀粉包括物理上難于接近的淀粉(RS1型)，抗性顆粒(RS2)，逆行淀粉(RS3)和化學(xué)改良淀粉(RS4)。
改變的淀粉結(jié)構(gòu)和特別是本發(fā)明具有高直鏈淀粉水平的淀粉作為食物消耗時(shí)可引起抗性淀粉的增加。如果β-葡萄糖處于升高的水平，抗性淀粉還可能增加，它傾向于將β-葡萄糖與淀粉微粒結(jié)合到一起，發(fā)揮保護(hù)作用。淀粉可能處于RS1型，就某種程度上而言，難于消化。用V-復(fù)合結(jié)晶性測(cè)量的淀粉脂類結(jié)合體也有助于抗性淀粉水平的升高。在這種情況下，由于脂類的存在引起淀粉物理上難于接近，導(dǎo)致抗性上升。相應(yīng)地，它可能被認(rèn)為是RS1淀粉。例子中的大麥作物淀粉由于淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)可能會(huì)難于消化，相應(yīng)地，它可能被認(rèn)為是RS2淀粉。每一種這些特性可能單獨(dú)出現(xiàn)或作為一個(gè)整體出現(xiàn)。
可以理解本發(fā)明的一個(gè)好處是它可提供具有特別營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的產(chǎn)品，而且，它達(dá)到該目的不需要改良淀粉或改變大麥麥粒的其它成分。但是，有人可能希望對(duì)淀粉，β-葡萄糖或麥粒的其它成分進(jìn)行改良，本發(fā)明包括那些改變了的組分。改良的方法是非常著名的，包括用傳統(tǒng)方法抽出淀粉或β-葡萄糖或其它組分，改良淀粉增加抗型。淀粉或β-葡萄糖可通過(guò)用熱和/或水分處理改良，或進(jìn)行以下處理物理處理(例如球磨研磨)，酶處理(例如使用α-或β-淀粉酶，pullalanase或類似物)，化學(xué)水解(使用液體或氣體試劑進(jìn)行干法或濕法水解)，氧化處理，用雙官能團(tuán)試劑交叉結(jié)合(例如偏磷酸三鈉，氯氧化磷)，或羧甲基化作用。
血糖生成指數(shù)血糖生成指數(shù)(GI)是試驗(yàn)食物的影響和白面包或葡萄糖對(duì)血糖濃度變化的影響的對(duì)比。血糖生成指數(shù)是度量餐后食物對(duì)血清中葡萄糖濃度的可能影響和為保持血糖動(dòng)態(tài)平衡對(duì)胰島素的需求。由于高直鏈淀粉含量和β-葡萄糖含量高的影響，本發(fā)明提供的重要產(chǎn)品屬于具較低血糖生成指數(shù)的低熱產(chǎn)品。低熱產(chǎn)品可能以源于研磨大麥麥粒的面粉夾雜物為基礎(chǔ)。然而，它可能希望初次處理麥粒時(shí)去除麥粒重量的10％或20％，從而移去糊粉層并盡可能移去微生物。圓化步驟的作用是減少脂質(zhì)含量，從而降低食物的熱值。該食物可作填充物，增強(qiáng)大腸健康，在提供低熱食物產(chǎn)品的同時(shí)，減少餐后血清中葡萄糖和脂質(zhì)的濃度的作用。使用該圓化產(chǎn)品將導(dǎo)致糊粉層和微生物提供的營(yíng)養(yǎng)益處會(huì)減少。用圓化產(chǎn)品生產(chǎn)的面粉有更好的外觀，因?yàn)橛迷摲椒ㄖ瞥傻漠a(chǎn)品會(huì)更白。
非食品應(yīng)用本發(fā)明提供改良淀粉，它具有提高了的直鏈淀粉水平或降低了支鏈淀粉水平，其性質(zhì)可滿足任何工業(yè)需求。淀粉廣泛應(yīng)用于非食品行業(yè)，包括造紙、紡織、瓦楞紙板加工和粘合劑工業(yè)(Young，1984)。未改良淀粉的物理性質(zhì)限制了它在某些方面的應(yīng)用，常需要進(jìn)行化學(xué)改良。而化學(xué)改良往往非常昂貴或有其它缺點(diǎn)。本發(fā)明提供了收獲后需要較少改良的淀粉，特別是與其它物理性質(zhì)結(jié)合降低了支鏈淀粉含量。例如，用本發(fā)明的麥粒制成的淀粉和產(chǎn)品的糊化溫度、抗剪切壓力、膜強(qiáng)度和/或抗水性可能被改變。該淀粉也可用于制備可生物降解的、蓬松的包裝材料替代聚苯乙烯。
可理解的是，雖然本發(fā)明的不同方面均已給出了各種各樣的指標(biāo)，此后該發(fā)明將專注于兩個(gè)或多個(gè)方面的聯(lián)合作用。
例子例1.材料與方法愈合組織誘導(dǎo)介質(zhì)來(lái)自于大麥胚胎的含麥草畏(Dicamba)(2.5mg/l)的BCI-DM介質(zhì)用作愈合組織誘導(dǎo)物。每升介質(zhì)的組成如下MS salt Macro(10x stock) 100mlMS micro(100x stock) 10ml鐵(200x stock)5ml乙二胺四乙酸(EDTA)(200x stock)5ml麥芽糖15.0g硫胺-氯化氫(1mg/ml) 1ml肌醇 250mg酪蛋白水解物 1g麥草畏(1mg/ml)2.5ml脯氨酸345mg將pH值調(diào)節(jié)到5.8，然后加入3.5g/l的植物凝膠。對(duì)介質(zhì)進(jìn)行高壓蒸氣滅菌之后，加入150mg/l的提門叮(Timentin)和50mg/l的潮霉素(Hygromycin)。
大麥再生介質(zhì)大麥卡麗(calli)在含有BAP(1mg/l)的FHG介質(zhì)中再生FHG-I Macro(10x stock) 100mlFHG-II Micro(100x stock)10ml硫胺-氯化氫(1mg/ml) 1ml鐵(200x stock) 5ml乙二胺四乙酸(200x stock)5mlBAP(1mg/ml) 1ml肌醇100mg谷氨酰胺730mg麥芽糖 62g將pH值調(diào)節(jié)到5.8，然后加入3.5g/l的植物凝膠。對(duì)介質(zhì)進(jìn)行高壓蒸氣滅菌之后，加入150mg/l的提門叮(Timentin)和20mg/l的潮霉素。
碳水化合物測(cè)定與分析應(yīng)用Schulman等人著(1991)方法將淀粉與大麥麥粒分開。
利用Megazyme公司(Bray，Co Wicklow，愛(ài)爾蘭共和國(guó))提供的總淀粉分析成套工具測(cè)定淀粉含量。淀粉含量與對(duì)照植物含量相對(duì)比。從總麥粒重量中減去淀粉重量得到麥粒中總的非淀粉含量以確定是否總重量的減少是由于淀粉含量的減少。
用HPLC方法測(cè)定分隔開去分支淀粉后直鏈淀粉含量或直鏈淀粉/支鏈淀粉比率，或利用Batey和Curtin(1996)中列出的碘結(jié)合法進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)言之，淀粉溶解在二甲基亞砜(DMSO)中去脂并在乙醇中再沉淀。將淀粉重新溶解在二甲基亞砜并加入水，進(jìn)一步稀釋，再加入碘/碘化鉀溶液，在605nm測(cè)定溶液的吸光度。直鏈淀粉含量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線用含0-100％直鏈淀粉的直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物繪制。未去分支淀粉的直鏈淀粉/支鏈淀粉比率的分析應(yīng)按照Case等人著(1998)中的順序進(jìn)行。
利用Megazyme公司(Bray，Co Wicklow，愛(ài)爾蘭共和國(guó))提供的成套工具測(cè)定β-葡萄糖水平。
采用熒光輔助碳水化合物電泳法(FACE)對(duì)淀粉去分支情況和鏈長(zhǎng)度分布進(jìn)行分析，使用毛細(xì)管電泳單元按照Morell et al(1998)中的規(guī)定進(jìn)行分析。
差示掃描量熱法(DSC)用差示掃描量熱法測(cè)定淀粉中由于直鏈淀粉和支鏈淀粉比率的改變引起的膠凝溫度的變化。用Pyris 1差示掃描量熱法(Perkin Elmer，Norwalk CT，美國(guó))測(cè)定膠凝溫度。淀粉與水按照2份水1份淀粉的比率混合，將混合物(40-50mg，準(zhǔn)確稱量)放入不銹鋼平底鍋中并密封。在從20℃到140℃范圍內(nèi)掃描樣品，溫升速度為10℃每分鐘，用空的不銹鋼平底鍋?zhàn)鳛閰⒈?。使用Pyris軟件測(cè)定膠凝溫度和焓。
RVA分析應(yīng)用快速粘度分析儀(Rapid-Visco-Analyser)(RVA，Newport ScientificPty Ltd，Warriewood，悉尼)測(cè)定面粉粘度，使用條件見(jiàn)Batey等人著，1997的報(bào)道。為了抑制α-淀粉酶，在所有試驗(yàn)中使用濃度為12mM硝酸銀。測(cè)定參數(shù)包括峰值粘度(最大熱糊化粘度)，保持強(qiáng)度，最后粘度和糊化溫度。
面粉膨脹面粉膨脹體積根據(jù)Konik-Rose等人著(2001)提出的方法測(cè)定。在規(guī)定的溫度下，收集膠凝物質(zhì)，然后測(cè)定樣品與水混合前后樣品的重量，得出水的吸收量。
例2將SBE基因與大麥隔離建立大麥互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)和染色體組庫(kù)利用噬菌體載體，用標(biāo)準(zhǔn)方法制作大麥互補(bǔ)脫氧核糖核酸和染色體組庫(kù)(Sambrook等人著，1989)。用ZipLox載體(生命技術(shù))按照試劑的供應(yīng)協(xié)議制作互補(bǔ)核糖核酸庫(kù)。用Y1090(ZL)大腸桿菌應(yīng)力測(cè)定的庫(kù)的滴定度是2×106pfu。從E.Lagudah(CSIRO)得到的大麥脫氧核糖核酸染色體組庫(kù)是根據(jù)Morex.多樣性制作。脫氧核糖核酸用MboI消化并綁定到EcoRI/BamHI消化EMBL3cos載體?？寺∑慰稍赟alI消化過(guò)程中釋放出來(lái)。
將淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb遺傳序列與H.vulgare染色體組庫(kù)隔離庫(kù)篩選條件是在25％甲酰胺，5×SSC，0.1％SDS，10x Denhardts溶液，100μg/ml鮭精脫氧核糖核酸等的混合溶液中雜化16小時(shí)，雜化溫度為42℃，接著用2×SSC，0.1％SDS在65℃清洗3×1小時(shí)(介質(zhì)緊縮)?？寺『琒BEIIa和SBEIIb基因或其中實(shí)質(zhì)部分單獨(dú)且按次序進(jìn)行。脫氧核糖核酸序列與表1中列出的入藏登記號(hào)的序列被確定兩種關(guān)注的基因均已與大麥隔離。SBEIIa和SBEIIb互補(bǔ)脫氧核糖核酸序列可通過(guò)特別的啟動(dòng)子應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈接反應(yīng)(RT-PCR)獲得，這在本技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的。大麥SBEIIa和SBEIIb互補(bǔ)脫氧核糖核酸序列見(jiàn)圖1和2，小麥SBEIIa和SBEIIb染色體組序列見(jiàn)圖3和4。
表1.谷類作物中淀粉分支酶基因特性


例3構(gòu)造轉(zhuǎn)化試驗(yàn)改變大麥SBEIIA和SBEIIB表達(dá)雙紐形核糖核酸(dsRNA)構(gòu)造用于減少大麥SBEIIa或SBEIIb基因的表達(dá)。在該構(gòu)造中，對(duì)應(yīng)于部分SBEIIa或SBEIIb基因的期望核酸序列出現(xiàn)在啟動(dòng)子的致敏和抗致敏方向以便于表達(dá)的含互補(bǔ)區(qū)域核糖核酸能組成堿基對(duì)并形成雙紐形核糖核酸。致敏和抗致敏序列間的間隔區(qū)含有基因內(nèi)區(qū)序列，它在轉(zhuǎn)化的作物中作為核糖核酸的一部分被轉(zhuǎn)錄時(shí)，會(huì)被剪切掉以形成緊密的“發(fā)夾”式雙紐形結(jié)構(gòu)。有人發(fā)現(xiàn)由于雙紐形核糖核酸結(jié)構(gòu)的影響，基因內(nèi)區(qū)的夾雜物可增進(jìn)基因壓制的效率(Smith等人著，2000)。期望的核酸與高分子量麥谷蛋白(HMWG)啟動(dòng)子序列(DX5亞組基因啟動(dòng)子，入藏登記號(hào)X12928，Anderson等人著，1989)和來(lái)自于土壤桿菌(nos3’)中胭脂堿合酶基因的中止子序列相連接。
含有SBEIIa或SBEIIb致敏/抗致敏片段的雙紐形核糖核酸結(jié)構(gòu)，由于在大麥和小麥基因之間高度的序列等同性，源于小麥SBEIIa和SBEIIb基因，最初在載體pDV03000上產(chǎn)生然后被切掉并綁定到大麥轉(zhuǎn)化載體pWBVec8。該結(jié)構(gòu)的示意圖參見(jiàn)圖5。pWBVec8載體含有許多限制性內(nèi)切酶活動(dòng)場(chǎng)所，期望的脫氧核糖核酸序列在該處形成。
SBEIIa雙紐形核糖核酸結(jié)構(gòu)含有小麥SBEIIa基因經(jīng)聚合酶鏈接反應(yīng)放大的1536bp核苷酸序列(基因銀行入藏登記號(hào)AF338431，見(jiàn)圖3)。它包括由所有外顯子1、2和部分外顯子3組成的468bp序列(核苷酸位置見(jiàn)圖3中1058到1336，1664到1761和2038到2219)，該序列兩面均有EcoRI和KpnI限制性場(chǎng)所(片段1)；由部分外顯子3和4、SBEIIa的整個(gè)基因內(nèi)區(qū)3組成的512bp序列(核苷酸位置見(jiàn)圖3中2220到2731)，該序列兩面均有KpnI和SacI場(chǎng)所(片段2)；和由SBEIIa的外顯子1，2和3組成的528bp片段(核苷酸位置見(jiàn)圖3中1058到1336，1664到1761和2038到2279)，其兩面均有BamHI和SacI場(chǎng)所(片段3)。然后綁定片段1，2和3以便于片段3序列沿片段1的抗致敏方向綁定到片段2。將pDV03000載體的遺傳結(jié)構(gòu)命名為pDV03-IIa，將雙紐形核糖核酸基因命名為ds-SBEIIa。
SBEIIb雙紐形核糖核酸結(jié)構(gòu)的策略是類似的。SBEIIb結(jié)構(gòu)含有小麥SBEIIb基因經(jīng)聚合酶鏈接反應(yīng)放大的1607bp片段(序列輪廓見(jiàn)圖4)。它包括由所有外顯子1、2和部分外顯子3組成的471bp序列(核苷酸位置見(jiàn)圖4中489到640，789到934和1598到1769)，該序列兩面均有EcoRI和KpnI限制性場(chǎng)所(片段1)；由部分外顯子3和4、淀粉分支酶IIb的整個(gè)基因內(nèi)區(qū)3組成的589bp序列(核苷酸位置見(jiàn)圖4中1770到2364)，該序列兩面均有KpnI和SacI場(chǎng)所(片段2)；和由SBEIIb的外顯子1，2和3組成的528bp片段(核苷酸位置見(jiàn)圖4中489到640，789到934和1598到1827)，其兩面均有BamHI和SacI場(chǎng)所(片段3)。然后綁定片段1，2和3以便于片段3序列沿片段1的抗致敏方向綁定到片段2。將pDV03000載體的SBEIIb雙紐形核糖核酸遺傳結(jié)構(gòu)命名為pDV03-IIb，將雙紐形核糖核酸基因命名為ds-SBEIIb。
使用限制性內(nèi)切酶sApaI和NotI將啟動(dòng)子-致敏/抗致敏-中止子盒子插入二位載體pWBVec8中。將pWBVec8中的SBEIIa結(jié)構(gòu)命名為pVec8-IIa，將pWBVec8中的淀粉分支酶IIb結(jié)構(gòu)命名為pVec8-IIb。結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖5。
使用的小麥SBEIIa序列和相應(yīng)的大麥SBEIIa序列間的同一性經(jīng)間隙程序比較結(jié)果為93％。類似地，使用的小麥SBEIIb序列和相應(yīng)的大麥SBEIIb序列間的同一性為92％。雙紐形核糖核酸技術(shù)對(duì)于壓制雙紐形區(qū)域中序列同一性高于85％的基因表示是有效的，因此期望用小麥序列構(gòu)造的雙紐形結(jié)構(gòu)能對(duì)大麥序列有效。
例4大麥轉(zhuǎn)化用根癌土壤桿菌或生物彈作為媒介的大麥轉(zhuǎn)化方法已有敘述(Tingay等人著，1997；Wan等人著，1994)，可用于轉(zhuǎn)移含輸異基因的作物產(chǎn)生的脫氧核糖核酸。本例中，如上所述二元載體中的基因結(jié)構(gòu)通過(guò)三系結(jié)合方法引入到劇毒的土壤桿菌菌株，然后用它將含抑制基因的T-脫氧核糖核酸(ds-SBEIIa或ds-SBEIIb)和選擇性的標(biāo)記基因(為抗潮霉素和CaMV35S啟動(dòng)子表示編碼)引入未成熟大麥胚胎胚鱗的可再生細(xì)胞中，過(guò)程如下。
在開花12-15天之后，將正在發(fā)育的Golden Promise品種大麥種子從溫室中的成年作物的穗狀花序移開，在20％(v/v)漂白液中消毒10分鐘，然后用95％乙醇漂洗一次，再用無(wú)菌水漂洗七次。胚胎(大約尺寸為1.5到2.5mm)在無(wú)菌條件下從種子中移出，并且切斷與胚胎相連的軸。胚胎切邊并放置到放有愈傷組織誘導(dǎo)介質(zhì)的陪替氏培養(yǎng)皿中。土壤桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)合子(菌株AGL1)在MG/L液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(1升溶液中含5g甘露醇，1g L-谷氨酸，0.2gKH2P04，0.1g NaCl，0.1g MgSO4.7H2O，5g胰化(蛋白)胨，2.5g酵母抽提物，和1μg生物素，pH7.0)，培養(yǎng)基還含壯觀霉素(50mg/l)、利福平(20mg/l)和培養(yǎng)時(shí)通風(fēng)溫度為28℃，培養(yǎng)到濃度約為2-3×108細(xì)胞/ml，然后取約300μl細(xì)胞懸浮液加入到放有胚胎的陪替氏培養(yǎng)皿中。2分鐘后，多余的液體上浮，胚胎發(fā)生翻轉(zhuǎn)造成切邊(胚鱗的葉腋?jìng)?cè))朝上。將胚胎轉(zhuǎn)移到放有愈傷組織誘導(dǎo)介質(zhì)的新培養(yǎng)皿，在24℃下放在黑暗處2-3天。將胚胎轉(zhuǎn)移到有選擇性的愈傷組織誘導(dǎo)介質(zhì)(50μg/ml潮霉素和150μg/ml提門叮)。在24℃下將胚胎放在該介質(zhì)上置于黑暗處2周。將健康的愈傷組織分開并放在新的選擇介質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)，在24℃的黑暗環(huán)境中再培養(yǎng)2周。緊接著，胚胎放到含細(xì)胞分裂素的再生介質(zhì)中在24℃的光亮環(huán)境中培養(yǎng)2周，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到含細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的根形成介質(zhì)中培養(yǎng)三個(gè)2周。再將幼體植物轉(zhuǎn)移到土壤混合物中放到潮濕的工作臺(tái)上培養(yǎng)2周，最后將幼體植物轉(zhuǎn)移到溫室?？偣灿?00個(gè)使用pVec8-IIb的胚胎和300個(gè)使用pVec8-IIa的胚胎用本方法處理，來(lái)自于7calli用于IIb變化的18顆植物和來(lái)自于14calli用于IIa變化的18顆植物在選擇性的介質(zhì)中存活，表明它們順利地變化到了該基因結(jié)構(gòu)。不是所有發(fā)生了變化具有選擇性標(biāo)記基因的植物都有望綜合了淀粉分支酶IIa或淀粉分支酶IIb的抑制基因；用接下來(lái)的例子中的方法會(huì)很容易地將它們區(qū)分。
例5.大麥作物和麥粒轉(zhuǎn)化成帶雙紐形核糖核酸結(jié)構(gòu)的分析大麥作物或其子代的種子和作物中是否存在輸異基因可通過(guò)聚合酶鏈接反應(yīng)(PCR)技術(shù)或南部斑點(diǎn)(Southern blot)雜交分析方法確定。用標(biāo)準(zhǔn)方法從假定發(fā)生了轉(zhuǎn)化的作物采取葉子樣品用于脫氧核糖核酸的制備。
已轉(zhuǎn)化大麥作物PCR分析-輸異基因的測(cè)定用于篩分存在的ds-SBEIIa輸異基因的正向和反向引子分別是BX17 3’(5’-CAA CCA TGT CCT GAA CCT TCA CC-3’)序列識(shí)別編號(hào)為5和AR2akpnR(5’-GGT ACC CCA TCT CCT GGT TTT GGG ACA AC-3’)序列識(shí)別編號(hào)為6。這個(gè)引子對(duì)從含有ds-淀粉分支酶IIa輸異基因的作物中，將對(duì)應(yīng)于輸異基因HMWG啟動(dòng)子序列位置的569bp產(chǎn)品，放大到圖3中核苷酸2219位置。用于篩分存在的ds-淀粉分支酶IIb輸異基因的正向和反向引子分別是BX17 3’(同上)和AR2bkpnR(5’-GGT ACC GTC CAT TTC CCG GTG GTG GCA G-3’)序列識(shí)別編號(hào)7。這個(gè)引子對(duì)從含有ds-淀粉分支酶IIb輸異基因的系列中，將對(duì)應(yīng)于輸異基因HMWG啟動(dòng)子序列位置的571bp產(chǎn)品，放大到圖4中核苷酸1768位置。PCR放大在20μl的反應(yīng)器中進(jìn)行，反應(yīng)器中有2.5單位Hotstar Taq，1×緩沖提供的酶含有1.5mM MgCl2，0.125mM每個(gè)脫氧核苷酸三磷酸鹽(dNTPs)，1μM每個(gè)正向和反向引子和100ng脫氧核糖核酸。PCR程序包括開始在95℃下變形5分鐘，然后循環(huán)36次，在95℃下30秒，在59℃下1分鐘和在72℃下2分鐘，最后在72℃下5分鐘內(nèi)結(jié)束。
對(duì)于大麥SBEIIa和SBEIIb結(jié)構(gòu)，均確認(rèn)為正向轉(zhuǎn)換體(圖6)。表2示數(shù)據(jù)概要。
表2.大麥SBEIIa和SBEIIb輸異基因系PCR和南部雜交結(jié)果概要

a轉(zhuǎn)化事件編號(hào)。具相同編號(hào)者為從同一愈傷組織分離得來(lái)，可能相同也可能獨(dú)立。不同編號(hào)獨(dú)立轉(zhuǎn)換體。
(f)弱；(vf)很弱；nr無(wú)結(jié)果已轉(zhuǎn)化大麥南部斑點(diǎn)雜交分析南部斑點(diǎn)雜交分析是對(duì)來(lái)自于含輸異基因作物和其子代ds-SBEIIa和ds-淀粉分支酶IIb的脫氧核糖核酸進(jìn)行分析以確認(rèn)PCR結(jié)果。用標(biāo)準(zhǔn)方法從作物制備的脫氧核糖核酸，經(jīng)EcoR1消化，在1％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在Hybond N+尼龍膜上留下斑點(diǎn)(Amersham)。從SBEIIa(見(jiàn)圖3位置2220到2731)和SBEIIb(見(jiàn)圖4位置2019到2391)基因的基因內(nèi)區(qū)3區(qū)域產(chǎn)生無(wú)線電標(biāo)記的探針。這些片斷是相對(duì)的ds-SBEIIa和ds-SBEIIb結(jié)構(gòu)(例3)的一部分，使用Megaprime脫氧核糖核酸標(biāo)記體系(Amersham PharmaciaBiotech UK Ltd)進(jìn)行放射性標(biāo)記并用于雜交。雜交在含25％(v/v)甲酰胺、5×SSC、0.1％SDS、10x Denhardt’s溶液和100μg/ml鮭精脫氧核糖核酸的混合溶液中進(jìn)行，在42℃反應(yīng)16小時(shí)，然后用2×SSC，0.1％SDS在65℃漂洗3×1小時(shí)。該尼龍膜經(jīng)放射自顯影術(shù)處理顯示正雜交帶在對(duì)應(yīng)于作物結(jié)構(gòu)顯陽(yáng)性的小巷中(圖7)。雜交中沒(méi)有檢出內(nèi)成的大麥淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb基因片段，這是因?yàn)槭褂玫男←溁騼?nèi)區(qū)3探針導(dǎo)致了序列發(fā)散。
PCR和南部雜交分析結(jié)果概要見(jiàn)表2。一般而言，PCR和南部雜交結(jié)果的相關(guān)性很好。由于假陰性的影響，可能會(huì)出現(xiàn)差異性，但它可很容易地通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)來(lái)解決。所有兩種方法包括4ds-SBEIIa南部獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件(IIa4.1，IIa4.2，IIa5和IIa6)和5 ds-SBEIIb獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件(事件編號(hào)為IIb2，IIb3，IIb4，IIb5和IIb9)均證實(shí)作物輸異基因結(jié)果為陽(yáng)性。
用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)方法分析大麥胚乳蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化作物中，為確定ds-SBEIIa和ds-SBEIIb輸異基因?qū)Υ篼淪BEIIa和SBEIIb基因表示的影響，使用非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳和西部斑點(diǎn)分析方法測(cè)定發(fā)育麥粒中胚乳組織的特定蛋白質(zhì)表示。因?yàn)門1種子(種子來(lái)源于T0作物)需分離輸異基因，在開花20天后，從每個(gè)T0作物選取10顆正在發(fā)育的T1麥粒，分析其中每個(gè)麥粒胚乳的淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb蛋白質(zhì)表示。為保存T1作物，從正在發(fā)育的麥粒中取出胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，以重新生成T1作物。從母性組織取出的胚乳(0.2g)均勻分散到600μl的50mM Kpi緩沖液中(42mM K2HPO4和8mM KH2PO4)，pH7.5，含有5mM乙二胺四乙酸，20％甘油，5mM二硫蘇糖醇和1mM Pefabloc。樣品研磨后在13,000g速度下離心分離10分鐘，上清液等分后在-80℃冷凍保存，直到使用。蛋白質(zhì)水平用牛血清白蛋白制成的標(biāo)準(zhǔn)Coomassie試劑測(cè)定。從胚乳中萃取的總可溶蛋白質(zhì)放在那些小巷中，每個(gè)里面約放20μg，在8％非變形聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，該凝膠含0.34M Tris-HCl(pH8.8)、丙烯酰胺(8.0％)、過(guò)硫酸銨(0.06％)和本甲基乙二胺(0.1％)。電泳之后，按照Morell等人著(1997)規(guī)定的步驟，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜，與淀粉分支酶IIa或淀粉分支酶IIb中的特殊抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。用于檢測(cè)SBEIIa的抗體是來(lái)源于野兔的3KLH，該抗體可干擾序列識(shí)別編號(hào)為8的肽AASPGKVLVPDESDDLGC(次序?yàn)閺腟BEIIa的N-端開始)合成，使用時(shí)需先稀釋到1∶5000。用于檢測(cè)淀粉分支酶IIb的抗體是R6，該抗體可干擾序列識(shí)別編號(hào)為9的肽AGGPSGEVMIGC(推測(cè)其次序?yàn)閺牡矸鄯种窱Ib的N-端開始)合成，使用時(shí)需先稀釋到1∶6000。使用的第二級(jí)抗體是GAR-HRP共軛(1∶3000稀釋)，對(duì)應(yīng)的免疫反應(yīng)帶可用AmershamECL-檢測(cè)系統(tǒng)檢定。
來(lái)自于含ds-SBEIIa或ds-SBEIIb基因轉(zhuǎn)化作物的正在發(fā)育的T1種子中蛋白質(zhì)表示被分割成1∶2∶1比例，即強(qiáng)帶中-弱帶無(wú)帶對(duì)應(yīng)于一些轉(zhuǎn)化系列(例如，見(jiàn)圖8和9)。該比例符合期望的均質(zhì)結(jié)合體劃分比例(野生型＝無(wú)輸異基因)均質(zhì)結(jié)合體輸異基因純合子。源于拯救胚胎的T1作物成熟后產(chǎn)生T2種子，它通過(guò)多聚酶鏈接反應(yīng)篩選后，蛋白質(zhì)表示分析確認(rèn)了T1種子輸異基因的遺傳狀況。
這些數(shù)據(jù)表明雙紐形核糖核酸結(jié)構(gòu)在減少大麥胚乳中SBEIIa和SBEIIb的基因表示方面有效。
含ds-SBEIIa輸異基因種子中SBEIIb基因的表達(dá)和含ds-SBEIIb種子中SBEIIa基因的表達(dá)也可通過(guò)西部斑點(diǎn)(Western blot)方法分析。出乎意料地，含輸異基因種子中的ds-SBEIIa，例如轉(zhuǎn)化事件IIa 4.1，相對(duì)于SBEIIb大大降低。圖9表明來(lái)自于IIa 4.1.8系列的種子中SBEIIb僅有低水平的表達(dá)(注意7條小巷中有4條屬于很弱的帶)。該系列含ds-SBEIIa輸異基因，其SBEIIa表達(dá)可忽略。然而，含輸異基因種子中的ds-SBEIIb沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相反的影響。種子中SBEIIa的表達(dá)沒(méi)有變化，而SBEIIb完全被ds-SBEIIb壓制(圖10)，例如含輸異基因系列轉(zhuǎn)化事件IIb4和IIb2。該包含外顯子1-3區(qū)域被用于ds-SBEIIa和ds-SBEIIb兩者的雙紐形結(jié)構(gòu)。該區(qū)域SBEIIa和SBEIIb序列對(duì)齊結(jié)果表明僅有約70％同一性。具有100％同一性的最長(zhǎng)伸展是在外顯子2的21bp區(qū)域。盡管由于序列的同源性，SBEIIb的表示仍有可能被ds-SBEIIa結(jié)構(gòu)壓制，同時(shí)，通過(guò)其它機(jī)理，SBEIIb活性也可能由于ds-SBEIIa輸異基因影響而降低。
SBEIIa和SBEIIb基因表示水平也可通過(guò)在信使核糖核酸高水平使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如北部雜交或RT-PCR方法準(zhǔn)確測(cè)定，例如，使用來(lái)自于非保存區(qū)域的探針或能在特定場(chǎng)所與單個(gè)基因雜交而不與其它基因反應(yīng)的引子對(duì)，例如在3’未翻譯區(qū)域。通過(guò)比較兩個(gè)基因序列，這樣的區(qū)域或場(chǎng)所很容易識(shí)別。
例6.麥粒組成與含量分析，包括淀粉麥粒的組成與含量，特別是淀粉，可使用諸如例1描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定。
采用如上所述方法萃取完可溶性蛋白質(zhì)之后，在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)到來(lái)自個(gè)體胚乳樣品的淀粉顆粒，該樣品來(lái)自于含ds-SBEIIa輸異基因的正在發(fā)育的種子。在檢查的五種轉(zhuǎn)換事件中，有三種事件，即IIa 4.1，IIa 4.2和IIa 13，其胚乳中SBEIIa的表達(dá)已減少，在這些正在發(fā)育的胚乳中，可看到淀粉顆粒形態(tài)的重要變化(例如見(jiàn)圖11)，但對(duì)于存在更低程度的基因鈍化的事件IIa 5或IIa 6中，卻看不到這種變化。例如，來(lái)自于IIa 4.2.5種子的淀粉，由于在蛋白質(zhì)免疫斑中沒(méi)有SBEIIa帶，與IIa 4.2.3中在蛋白質(zhì)免疫斑中有SBEIIa強(qiáng)帶(表3)的種子正常顆粒相比，發(fā)生了嚴(yán)重變形。光學(xué)顯微照片的觀測(cè)結(jié)果被掃描電子顯微照片結(jié)果證實(shí)，掃描電子顯微照片也可用于直接觀察淀粉顆粒。為進(jìn)行該項(xiàng)工作，使凈化的淀粉飛濺開來(lái)呈金黃色，并在室溫下實(shí)用15Kv電壓進(jìn)行掃描。已降低SBEIIa表達(dá)的種子在掃描電子顯微照片下可看到扭曲的不規(guī)則形狀，例如，IIa 4.2.5種子與IIa 4.2.3種子顆粒變形的比較(圖12)。
用顯微照片檢查時(shí)，與含有ds-SBEIIa的作物相比，轉(zhuǎn)化后具有ds-SBEIIb的作物呈現(xiàn)了胚乳淀粉顆粒的正常形態(tài)，例如IIb 4.1系列(見(jiàn)表3)。這說(shuō)明，SBEIIb表達(dá)的單獨(dú)降低不會(huì)實(shí)質(zhì)性地改變淀粉顆粒的形態(tài)。
表3.含輸異基因的大麥ds-SBEIIa和ds-SBEIIb系列中T1胚乳組織的淀粉顆粒形態(tài)

雙折射是指物質(zhì)沿兩個(gè)方向折射光的能力，當(dāng)用光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，它會(huì)在每個(gè)淀粉顆粒上產(chǎn)生被稱為“馬爾他十字”黑色的交叉。雙折射是在顆粒內(nèi)部聚合物組織結(jié)構(gòu)有序程度的指示器(Thomas和Atwell合著，1999)。在偏振光照射下，與來(lái)自于IIa 4.2.3的種子(野生型)相比，IIa 4.2.5種子胚乳中的淀粉顆粒(SBEIIa活性已降低)的雙折射發(fā)生了重大損失。平均而言，IIa 4.2.5種子顆粒中有44.8％沒(méi)有雙折射，和IIa 4.2.3種子的2.2％形成對(duì)比(表4)。淀粉顆粒中雙折射的喪失與其中直鏈淀粉含量的增加有較大的相關(guān)性。
表4.含有輸異基因的大麥ds-SBEIIa系列的T1胚乳中淀粉顆粒雙折射

含有輸異基因種子的麥粒重量分析，來(lái)自于溫室中成熟的作物，來(lái)自于含ds-SBEIIa的IIa 4.2系列，表明麥粒重量沒(méi)有發(fā)生重大減少，因此，淀粉的生產(chǎn)，甚至是種子中淀粉顆粒高度扭曲(表5)。這與大麥中觀測(cè)到的麥粒重量減少相反其中所述大麥?zhǔn)荢SIIa基因的突變異種，其淀粉產(chǎn)量發(fā)生了重大減少(Morell等人著，2003)。這里表明了平均麥粒重量，也表明了野外成熟大麥胚乳中SBEIIa活性降低了的品種產(chǎn)量基本正常。
表5.含輸異基因大麥的SBEIIa中IIa4.2系列中T1種子麥粒重量

含輸異基因大麥麥粒中直鏈淀粉和支鏈淀粉水平種子中淀粉顆粒發(fā)生形變?cè)诖篼溨兄辨湹矸酆扛叩那闆r下曾有報(bào)道(Morell等人著，2003)，在低支鏈淀粉(LAPS)含量玉米中，淀粉中約含90％直鏈淀粉也曾有發(fā)生形變的報(bào)道(Sidebottom等人著，1998)。直鏈淀粉含量可通過(guò)粒度排除后，用高性能液相色譜(HPLC)測(cè)定，其中液相為90％(w/v)二甲基亞砜(DMSO)；或者如例1所述的使用碘藍(lán)值(碘量法)測(cè)定?？筛鶕?jù)麥粒重量和直鏈淀粉含量，計(jì)算麥粒中直鏈淀粉沉積總量，并將含輸異基因系列與對(duì)照系列中直鏈淀粉總量進(jìn)行對(duì)比。
淀粉被從T1代、來(lái)自含有ds-SBEIIa基因的輸異基因作物的T2代(可能是ds-SBEIIa的純合子)或來(lái)自于IIa 4.2.5系列和IIb 4.3.8系列的雜交(含有ds-SBEIIa和ds-SBEIIb)的大麥麥粒中分離出來(lái)，隔離ds-SBEIIa，直鏈淀粉含量可通過(guò)應(yīng)用Morrison和Laignelet(1983)提出的比色法測(cè)定。測(cè)定來(lái)自于如下五個(gè)池中的麥粒樣品的淀粉中直鏈淀粉含量。在650nm吸光度下的讀數(shù)用從標(biāo)準(zhǔn)樣品(由土豆直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，直鏈淀粉含量范圍為0到100％)導(dǎo)出的回歸方程換算成直鏈淀粉含量的百分率，Y＝137.38x-30.361，此處x代表在650nm測(cè)得的吸光度，Y代表直鏈淀粉含量的百分率。
樣品池1從含輸異基因的IIa 4.1系列中選出的7顆T1種子，其中的淀粉顆粒嚴(yán)重變形。
池2從含輸異基因的IIa 4.1系列中選出的6顆T1種子，其中的一些顆粒有變形。
池3從含輸異基因的IIa 4.1系列中選出的7顆T1種子，其顆粒具有正常外觀。
池4從含輸異基因的IIa 4.2.5系列中選出的6顆T2種子，其中的顆粒嚴(yán)重變形。
池5來(lái)自于IIa 4.2.5和IIb 4.3.8(ds-SBEIIb含輸異基因系列)雜交的5顆F1種子，其中的淀粉顆粒嚴(yán)重變形。
對(duì)照大麥SSIIa突變異種M292(Morel等人著，2003)，大麥cv Himalaya和SSIIa小麥突變異種(Yamamori等人著，2000)。
具有降低了的SBEIIa活性的大麥麥粒淀粉，根據(jù)變形淀粉顆粒，顯示有超過(guò)80％直鏈淀粉。直鏈淀粉含量與淀粉顆粒變形程度同步增加，對(duì)比池1，2和3(表6)。池1，2中的直鏈淀粉含量高于來(lái)自于SSIIa突變異種大麥系列M292的淀粉(表6)。池5中是來(lái)自于ds-SBEIIa和ds-SBEIIb含輸異基因系列雜交得到的F1麥粒，其直鏈淀粉含量更高(＞90％)。需要注意的是，用本方法測(cè)得的吸光度值可能會(huì)受到支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的輕微影響。
表6.降低了SBEIIa活性的含有輸異基因大麥系麥粒中直鏈淀粉含量


這意味著這些麥粒淀粉中支鏈淀粉含量有相當(dāng)程度的減少，從野生型中的約75％到低于20％，或甚至低于10％，因?yàn)楣阮惖矸蹘缀跬耆芍辨湹矸酆椭ф湹矸劢M成。
例7.大麥SBEIIA基因突變導(dǎo)致沒(méi)有SBEIIa表達(dá)的大麥淀粉SBEIIA基因突變可通過(guò)γ射線輻射或化學(xué)誘變實(shí)現(xiàn)，例如乙基甲基磺酸鹽(ethyl methane sulfonate，EMS)。對(duì)于γ射線誘導(dǎo)的突變，種子的照射劑量為由60Co源產(chǎn)生的20-50kR，(Zikiryaeva和Kasimov合著，1972)。EMS誘變通過(guò)用EMS(0.03％，v/v)處理種子實(shí)現(xiàn)(Mullins等人著，1999)。突變異種的麥?；谠黾拥闹辨湹矸酆亢妥兓牡矸埯溋Ｐ螒B(tài)進(jìn)行識(shí)別，并用上述方法證實(shí)。SBEIIa的突變異種能夠重新誘變，子代除了SBEIIa外，還篩選有損失的SBEIIb，或者SBEIIa突變異種可用SBEIIb突變異種雜交，以合并突變產(chǎn)生不含輸異基因的大麥品種，該品種的胚乳中實(shí)質(zhì)性缺乏SBEII活性。
例8.SBEI基因克隆，構(gòu)造抑制SBEI在大麥中的表達(dá)SBEI基因的隔離可通過(guò)將探針雜交到大麥互補(bǔ)脫氧核糖核酸或染色體組庫(kù)實(shí)現(xiàn)，或通過(guò)多聚酶鏈接反應(yīng)(PCR)方法實(shí)現(xiàn)。PCR引子設(shè)計(jì)可基于小麥基因的同源性，例如基于基因銀行AF076679闡述的脫氧核糖核酸序列。使用的引子可以是序列識(shí)別編號(hào)為10的5’ACGAAGATGCTCTGCCTCAC 3’和序列識(shí)別編號(hào)為11的5’GTCCAACATCATAGCCATTT 3’，它應(yīng)能產(chǎn)生約1015bp的PCR產(chǎn)品。
SBEI基因序列用于構(gòu)造抑制基因結(jié)構(gòu)，通過(guò)與上述用于SBEIIa和SBEIIb的相似形式引入大麥中。
例9.將SBEIIA突變異種與其它淀粉合成突變異種結(jié)合到一起含輸異基因作物的ds-SBEIIa與減少了活性的SBEIIa與大麥系列M292(SSIIa突變異種)和高直鏈淀粉Glacier品種(HAG)雜交。確立了以下雜交1)IIa 4.1.10系列x HAG2)IIa 4.1.16系列x HAG3)IIa 4.1.20系列x M2924)IIa 4.1.19系列x HAGF1作物可自我繁殖，突變的系列純合可通過(guò)遺傳和分子分析識(shí)別。將ds-SBEIIa輸異基因與SSIIa突變結(jié)合可生產(chǎn)非常高的直鏈淀粉含量的淀粉，它還含有高的β-葡萄糖含量。將ds-SBEIIa輸異基因與HAG突變結(jié)合可進(jìn)一步改良淀粉組分，除了直鏈淀粉含量高，功能性也會(huì)增強(qiáng)。
例10.田間種植的大麥特性測(cè)定了多個(gè)田間種植的大麥品種的去殼麥粒重量和β-葡萄糖含量，包括M292和M342系列(ssIIa突變異種，大致含60-65％直鏈淀粉)。由結(jié)果(表7)可知M292和M342麥粒的去殼麥粒尺寸變小了，但β-葡萄糖含量相對(duì)于野生型品種(3.0-6.0％β-葡萄糖)有所增加。田間種植的在該條件下長(zhǎng)成的野生型麥粒平均重量范圍是35-45g/1000去殼麥粒，野生型品種麥粒β-葡萄糖含量的變化范圍是3-6％。
表7.田間種植的大麥的去殼麥粒重量和β-葡萄糖水平


a給出了重復(fù)值，用于在現(xiàn)場(chǎng)分別出圖。
熟知本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員會(huì)很清楚，在不違反本發(fā)明范圍的情況下，這些方法可能會(huì)進(jìn)行修改和變化。
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序列表<110>聯(lián)邦科技產(chǎn)業(yè)研究組織<120>改變了淀粉分支酶活性的大麥及增加了直鏈淀粉含量的淀粉和含淀粉產(chǎn)品<160>11<210>1<211>2554<212>DNA<213>大麥<220>
<223>SSBEIIa cDNA<400>1ggcgagatgg cggaagtaaa catgacaggg ggggctgcag aaaaacttga atcttcagaa 60ccgactcagg gtattgcgga aacaatcact gatggtgtaa ccaaaggagt taaagaacta 120gtcgttgggg agaaaccgca agttgtccca aaaccaggag atgggcaaaa aatatacgag 180attgacccaa cgctgaaaga ttttcggagc catcttgact accgatacag cgaatacaag 240agaattcgtg ctgctattga ccaacatgaa ggtggattgg aagttttttc tcgtggttat 300gaaaagcttg gatttacccg cagtgctaaa ggtatcactt accgagaatg ggctcctgga 360gcgcattctg cagcattagt aggtgacttc aacaattgga acccaaatgc agatactatg 420accagagatg attatggtgt ttgggagatt ttcctcccta acaatgctga tggatcccct 480gctattcctc atggctcacg tgtaaagata cggatggata ctccatctgg tgtgaaggat 540tcaatttctg cttggatcaa gttctctgtg caggctccag gtgaaatacc attcaatggc 600atatattatg atccacctga agaggagaag tatgtcttcc aacatcctca acctaaacga 660ccagagtcac taaggatata tgaatcacac attggaatga gcagcccgga accgaagata 720aattcatatg ctaattttag ggatgaggtg ctgccaagaa ttaaaaggct tggatacaat 780gcagtgcaga taatggcaat ccaggagcat tcatactatg cgagctttgg gtaccatgtt 840actaattttt ttgcaccaag tagccgtttt ggaactccag aggacttaaa atccttgatc 900gatagagcac atgagcttgg tttgcttgtt cttatggata ttgttcatag tcattcgtca 960aataataccc ttgacggttt gaatggtttc gatggcactg atacacatta cttccacggt 1020ggtccacgtg gccatcattg gatgtgggat tctcgtctgt tcaactatgg gagttgggaa 1080gtattaagat tcttactgtc aaacgcgaga tggtggcttg aagaatataa gtttgatgga 1140tttcgatttg atggggtgac ttccatgatg tatactcacc atggattaca aatgacattt 1200actgggaact atggcgagta ttttggattc gccactgatg ttgatgcggt ggtttactta 1260atgctggtca acgatctaat tcatggactt tatccggatg ctgtatccat tggtgaagat 1320gtcagcggaa tgcctacatt ttgcatccct gtcccagatg gtggtgttgg ttttgactat 1380cgcctgcata tggctgtagc agataaatgg attgaactcc tcaagcaaag tgacgaatct 1440tggaaaatgg gcgatattgt gcacacccta acaaatagaa ggtggcttga gaagtgtgtc 1500acttatgcag aaagtcatga tcaagcacta gttggtgaca agactattgc attctggttg 1560atggataagg atatgtatga tttcatggct ctggatagac cttcaacccc tcgcattgat 1620cgtggcatag cattacataa aatgatcagg cttgtcacca tgggtttagg tggcgaaggc 1680tatcttaatt tcatgggaaa tgagtttggg catcctgaat ggatagattt tccaagaggt 1740ccgcaaactc ttccaaccgg caaagttctc cctggaaata acaatagtta tgataaatgc 1800cgccgtagat ttgatcttgg agatgcagat tttcttagat atcgtggtat gcaagagttc 1860gatcaggcaa tgcagcatct tgaggaaaaa tatgggttta tgacatctga gcaccagtat 1920
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<223>SSBEIIb cDNA<400>2ggcgagatgg cggcgccggc gttcgcagtt tccgcggcgg ggatcgcccg gccatcggct 60cgtcgatcca gcggggcaga gccgagatcg ctgctcttcg gccgcaacaa gggcacccgt 120ttcccccgtg ccgtcggcgt cggaggttct gggtggcgcg tggtcatgcg cgcgggcggc 180ccgtccgggg aggtgatgat ccctgacggc ggtagtggcg gaagcggaac accgccttcc 240atcgagggtt ccgttcagtt cgagtctgat gatctggagg ttccattcat cgacgatgaa 300ccaagcctgc acgatggagg tgaagatact attcggtctt cagagacata tcaggttact 360gaagaaattg atgctgaagg cgtgagcaga atggacaaag aatcatccac ggtgaagaaa 420atacgcattg tgccacaacc cggaaatgga cagcaaatat acgacattga cccaatgctc 480cgagacttta agtaccatct tgagtatcga tacagcctat ataggagaat acgttcagac 540attgatgaat acgatggagg catggatgta ttttcccgcg gctacgagaa gtttggattt 600gttcgcagcg ctgaaggtat cacttaccga gaatgggctc ctggagcaga ttctgcagca 660ttagttggcg acttcaacaa ttgggatcca actgcagacc atatgagcaa aaatgacttg 720ggtatttggg agatttttct gccaaacaat gcagatggtt cgccgccaat tcctcatggc 780tcacgggtga aggtgcggat ggatactcca tctgggacaa aggattcaat tcctgcttgg 840atcaagtact ccgtgcagac tccaggagat ataccataca atggaatata ttatgaccct 900cctgaagagg agaagtatgt attcaagcat cctcaaccta aacgaccaaa atcattgcgg 960atatatgaaa cacatgttgg catgagtagc ccggaaccaa agatcaacac atatgcaaac 1020ttcagagatg aggtgcttcc aagaattaaa agacttggat acaatgcagt tcaaataatg 1080gcaatccaag agcattcata ctatggaagc tttgggtacc atgttaccaa tttctttgca 1140ccaagtagcc gttttgggtc cccagaagat ttaaaatcct tgattgatag agctcacgag 1200cttggtttgc ttgtcctgat ggatgttgtt cacagtcacg catcaagtaa taccttggac 1260ggtttgaatg gttttgatgg cacggataca cattactttc atggcggctc acggggccat 1320cactggatgt gggattctcg tgtgttcaac tacgggaata aggaagttat aaggtttcta 1380ctttccaatg caagatggtg gctagaggaa tataagttcg atggtttccg attcgacggc 1440gcgacctcca tgatgtatac ccaccatgga ttacaagtaa cctttacagg gagctaccat 1500
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<223>SSBEIIa基因<400>3agaaacacct ccattttaga tttttttttt gttcttttcg gacggtgggt cgtggagaga 60ttagcgtcta gttttcttaa aagaacaggc catttaggcc ctgctttaca aaaggctcaa 120ccagtccaaa acgtctgcta ggatcaccag ctgcaaagtt aagcgcgaga ccaccaaaac 180aggcgcattc gaactggaca gacgctcacg caggagccca gcaccacagg cttgagcctg 240acagcggacg tgagtgcgtg acacatgggg tcatctatgg gcgtcggagc aaggaagaga 300gacgcacatg aacaccatga tgatgctatc aggcctgatg gagggagcaa ccatgcacct 360tttcccctct ggaaattcat agctcacact tttttttaat ggaagcaaga gttggcaaac 420acatgcattt tcaaacaagg aaaattaatt ctcaaaccac catgacatgc aattctcaaa 480ccatgcaccg acgagtccat gcgaggtgga aacgaagaac tgaaaatcaa catcccagtt 540gtcgagtcga gaagaggatg acactgaaag tatgcgtatt acgatttcat ttacatacat 600gtacaaatac ataatgtacc ctacaatttg ttttttggag cagagtggtg tggtcttttt 660tttttacacg aaaatgccat agctggcccg catgcgtgca gatcggatga tcggtcggag 720acgacggaca atcagacact caccaactgc ttttgtctgg gacacaataa atgtttttgt 780aaacaaaata aatacttata aacgagggta ctagaggccg ctaacggcat ggccaggtaa 840
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<211>6550<212>DNA<213>節(jié)節(jié)麥<220>
<223>局部SSBEIIb基因<400>4aagctttgta gccttgcacg ggctccccaa caaactgcct cactcgattg tcaaaaaagt 60aaaaatgatt gtagaaaaaa aaactgactc actcgtcact accctaccgt cctacatgac 120acctggccgc aagacgacgc cgtcctcctg ccgcgcgcgt ccgcgatcac accaccgcaa 180aaaccaaaac ctcttcgccg gtgcgtccca cgctaccatc catgcagccg tccgcccgcg 240cgcgcgttgc ccgcaccacc cgctggcggc caccacgccg ccactctcgc gtgaaggctc 300cgtccgcttc ctcctagttc cactctctct ccgtgctagc agtatatagc atccgccctc 360cgccccctcc caatcttaga acacccctcc ctttgcctcc tcatttcgct cgcgtgggtt 420taagcaggag acgaggcggg gtcagttggg cagttaggtt ggatccgatc cggctgcggc 480ggcggcgacg ggatggctgc gccggcattc gcagtttccg cggcggggct ggcccggccg 540tcggctcctc gatccggcgg ggcagagcgg agggggcgcg gggtggagct gcagtcgcca 600tcgctgctct tcggccgcaa caagggcacc cgttcacccc gtaattattt gcgccacctt 660tctcactcac attctctcgt gtattctgtc gtgctcgccc ttcgccgacg acgcgtgccg 720attccgtatc gggctgcggt gttcagcgat cttacgtcgg ttccctcctg gtgtggtgat 780gtctgtaggt gccgtcggcg tcggaggttc tggatggcgc gtggtcatgc gcgcgggggg 840gccgtccggg gaggtgatga tccctgacgg cggtagtggc ggaacaccgc cttccatcga 900cggtcccgtt cagttcgatt ctgatgatct gaaggtagtt ttttttttgc atcgatctga 960aggtacttga catatactac tgtattaccc tgagtaaata ctgccaccat atttttatgg 1020ttcgcttgaa atacctgttt acttgctacg gttttcactt tcattgagac gtcggacgaa 1080attcactgaa ttcctataat ttggtagaca ccgaaatata tactactcct tccgtcccat 1140aatataagag cgtttttggc accttatatt atagggcgga gggagtacct tttaggtcaa 1200aatattgtgg tagtttcaat tgtatacaag aattcaaata ttttttttaa aaaaaaatca 1260actaattggt tgagtttcaa gtgaagcgtt ttggtccttt ggctgagatg taaaccgaaa 1320tcactgaaat tcatagtagc cgaaacttta atagaactga aactcaaaat ctgctatccg 1380gcgaaattct aaagatttgc ttatttcaca cgtaggttgc agtacaccct ctttctaatt 1440tattggggaa ggggtattat tatcttgtta gtacctgcct gcatgacaat tgaaatctaa 1500gacaaaacac catatgcgag gcctacacac ggtaggttgg tttacaacta tgtgtgccac 1560agttcgtctg aactttttgt ccttcacatc gtgttaggtt ccattcattg atgatgaaac 1620aagcctacag gatggaggtg aagatagtat ttggtcttca gagacaaatc aggttagtga 1680agaaattgat gctgaagaca cgagcagaat ggacaaagaa tcatctacga gggagaaatt 1740acgcattctg ccaccaccgg gaaatggaca gcaaatatac gagattgacc caacgctccg 1800agactttaag taccatcttg agtatcggta tgcttcgctt ctattgtgtg cactttaaaa 1860acaatttaca gtctttgata agatgtgaat ggctgcttgc tgtgacacga aactcttgaa 1920gttcgtagtc actcttgtgt gttcatggtt ctgaggtaac atggtaaccg aacaaaaata 1980ggaaagtggc aagcactgca atgtgagcta ctgataacca cccattgtaa ttgggtacac 2040tgattaatat atatgtcttc atgggctcta ttttttttca atatctatgc caattgaaca 2100acaatgcttt gtggacgggt gttcttttac cctcttcttc tatcaataga tgatatgcat 2160actcatgcgt atcctacaaa aaattgaaca acaatgccac tttcccccgt gttgcttttg 2220taaggatgaa acacatatgt ccagatcaaa ctatactagc agtctaactg tgccttaatg 2280
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tacaatacca cttttatgtg tttttacttc tattgcaggt accatgttac caatttcttt 5040gcaccaagta gccgttttgg gtccccagaa gatttaaaat ctttgattga tagagctcac 5100gagcttggct tggttgtcct catggatgtt gttcacaggt acttaatgta atttgaggtt 5160ggcgtgttaa gttcacatta atcttaattc tttatttcaa ttcctatggc ctctctccta 5220gattggaaca gtaaaagcat catccagttt gtataaattg ctaaaagaac attttacatg 5280ttaagtattt tcaattacta tgaaacatat aaatttacat acttattgat tttacgacag 5340aagtaccgat ctcacaagat gaacaattgg ttgatcacat atcatttcat actacaatac 5400aagaaaatga atagagaacg agttaatatt agccttggta aaatcagcaa cttgtttgga 5460aataaagtat agtgatgcca gtgcaaanaa caaggcatca agttggtttc agctcccacg 5520gtcggtgcta gctgtcaagg gtaatttgca cgtagtcgca catagatttg tgtgggagtg 5580gaaagtaacc acagattgtc cgaggaacac gggacacacg tcttagccac aggtttgggc 5640tccccttgat gcgggtagta gctttactcc ttatatgaaa ttatctcaag atagatttca 5700atttggggtt acacttanga actcancaag ttaaggatca actcnctgag ttctatacga 5760ctgatctttg accgagatat cttgatcagg ctaagtanca aaatccaggc cttgagatgt 5820tgaacatgtc cttcattttg ggctgggtgc ccttgggcat aaggtgtngt ccttccttca 5880tgtgcttctt gcagcgtatg acataaacnt cctctgagtt ggtanatgca cggttccctt 5940tgaggaaatc aggggtagtc gcatctnggg aaagttggtc acccangcat ggatcctcng 6000cgcacaccgg gcaaacacgg tgaaaccact tctcctcgac actagctaac ttgacattca 6060agcaaactaa gaatataact ttatntctaa atgaaccgga caccctcctt gtgcctgcac 6120ctacagagta caatgccagt tttggactga actcttgtgt tcatgtatgt gctaatnaca 6180taggttctaa ccatgattct aaatagcgcg ttataactcc actatagtaa tgctatagcg 6240tttanaagat cccgcactaa gggaccttag tccaaataca tgatcaaaca ttttacatag 6300cgcgctatag ctatttaaaa ctatggtcac ccgctaagag gcataactcg ctatttaaaa 6360ctatggttct aacttttaat ctattttatg tcttggtcca aagccccttt ttgttctata 6420gctttacctt tgggttgaga tcacccttaa cccattggta atcctggttg atttactcca 6480tcctttcttg cgtagcttta cttttggttt tttgtttctc acagtcacgc gtcaaataat 6540accttggacg 6550<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>引物<400>5caaccatgtc ctgaaccttc acc 23<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<223>引物<400>6ggtaccccat ctcctggttt tgggacaac 29
<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>引物<400>7ggtaccgtcc atttcccggt ggtggca27<210>8<211>18<212>PRT<213>人工序列<223>蛋白質(zhì)片段<400>8Ala Ala Ser Pro Gly Lys Val Leu Val Pro Asp Glu Ser Asp Asp1 5 10 15Leu Gly Cys<210>9<211>12<212>PRT<213>人工序列<223>蛋白質(zhì)片段<400>9Ala Gly Gly Pro Ser Gly Glu Val Met Ile Gly Cys1 5 10<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>引物<400>10acgaagatgc tctgcctcac 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>引物
<400>11gtccaacatc atagccattt 20
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于大麥作物的麥粒，其特征在于所述大麥作物胚乳中具有已降低的淀粉分支酶IIa活性，所述麥粒淀粉中直鏈淀粉相對(duì)含量不低于40％(w/w)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的麥粒，其特征在于所述的大麥作物胚乳中還具有已降低的淀粉分支酶IIb活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的麥粒，其特征在于所述的大麥作物中包含表現(xiàn)為淀粉分支酶Iia的抑制劑的外源性核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的麥粒，其特征在于所述抑制劑引起淀粉分支酶IIa酶表達(dá)水平降低。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的麥粒，其特征在于所述麥粒不收縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的麥粒，其特征在于所述麥粒的淀粉含量不低于25％(w/w)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的麥粒，其特征在于所述麥粒的淀粉含量不低于35％(w/w)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的麥粒，其特張?jiān)谟谒鳆溋５牡矸酆考s為45-50％(w/w)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的麥粒，其特征在于所述麥粒的平均長(zhǎng)度對(duì)厚度的比率低于約3.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的麥粒，其特征在于所述麥粒的平均重量不低于約36mg。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的麥粒，其特征在于淀粉的相對(duì)的直鏈淀粉含量不低于60％(w/w)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的麥粒，其特征在于淀粉的相對(duì)的直鏈淀粉含量不低于70％(w/w)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的麥粒，其特征在于淀粉的相對(duì)的直鏈淀粉含量不低于80％(w/w)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的麥粒，其特征在于所述麥粒被碾碎、研磨、圓化、碾軋、磨成粗谷粉、碾軋成粗碎谷物或保持整粒。
15.一種大麥麥粒，其特征在于包含具有相對(duì)直鏈淀粉含量不低于75％(w/w)的淀粉。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的大麥麥粒，其特征在于所述直鏈淀粉含量用碘量法測(cè)定。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的大麥麥粒，其特張?jiān)谟谒鳆溋Ｖ泻?-6％(w/w)β-葡萄糖。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的大麥麥粒，其特征在于所述麥粒中含有6-8％(w/w)β-葡萄糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)所述的麥粒的面粉或粗面粉。
20.一種來(lái)自于大麥作物麥粒的淀粉，其特征在于所述大麥作物胚乳中具有已降低的淀粉分支酶IIa的活性水平，所述淀粉未被改良，直鏈淀粉的相對(duì)含量不低于40％(w/w)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的淀粉，其特征在于所述大麥作物胚乳中還具有已降低的淀粉分支酶IIb活性水平。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的淀粉，其特征在于所述的大麥作物中包含表現(xiàn)為淀粉分支酶Iia的抑制劑的外源性核酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的淀粉，其特征在于所述抑制劑引起淀粉分支酶IIa酶表達(dá)水平降低。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的淀粉，其特征在于所述淀粉中直鏈淀粉相對(duì)的含量不低于60％(w/w)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的淀粉，其特征在于所述淀粉中直鏈淀粉的相對(duì)含量不低于70％(w/w)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的淀粉，其特征在于所述淀粉中直鏈淀粉的相對(duì)含量不低于80％(w/w)。
27.一種合成物，其特征在于包括根據(jù)權(quán)利要求20到26中任一項(xiàng)所述的淀粉、以及另一種食物成分或水。
28.一種合成物，其特征在于包括大麥胚乳的淀粉顆粒、另一種食物成分或水，其中淀粉顆粒中的淀粉含有不低于75％(w/w)的直鏈淀粉。
29.一種具有降低的淀粉分支酶IIa酶活性水平的大麥作物，其特征在于所述大麥作物麥粒中的淀粉中直鏈淀粉的相對(duì)含量不低于40％(w/w)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物胚乳中具有降低的的淀粉分支酶IIb酶活性水平。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的大麥作物，其特征在于包含表現(xiàn)為淀粉分支酶IIa的抑制劑的外源性核酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的大麥作物，其特征在于所述抑制劑引起淀粉分支酶IIa酶表達(dá)水平降低。
33.根據(jù)權(quán)利要求29所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物的麥粒不收縮。
34.根據(jù)權(quán)利要求29所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物的麥粒淀粉含量不低于25％(w/w)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物的麥粒淀粉含量不低于35％(w/w)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物的麥粒淀粉含量約為45-50％(w/w)。
37.根據(jù)權(quán)利要求29所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物的麥粒平均長(zhǎng)度對(duì)厚度的比率低于約3.5。
38.根據(jù)權(quán)利要求29所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物的麥粒平均重量不低于約36mg。
39.根據(jù)權(quán)利要求29所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物的淀粉中直鏈淀粉的相對(duì)含量不低于60％(w/w)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物的淀粉的直鏈淀粉相對(duì)含量不低于70％(w/w)。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的大麥作物，其特征在于所述大麥作物的淀粉的直鏈淀粉的相對(duì)含量不低于80％(w/w)。
42.一種可生成淀粉至少含有40％直鏈淀粉的麥粒的大麥作物的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)向父系大麥作物或種子中引入遺傳變異；和(2)識(shí)別步驟(1)中父系大麥作物或種子產(chǎn)生的子代作物或種子，其中子代作物或種子的胚乳中具有降低的淀粉分支酶IIa活性。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于所述步驟(1)引入遺傳變異包括引入表現(xiàn)為淀粉分支酶IIa的抑制劑的外源核酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于所述步驟(1)的方法包括作為作物來(lái)源的父系大麥作物或種子的突變。
45.一種生產(chǎn)胚乳中具有降低的淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb酶活性水平的大麥作物的方法，其特征在于包括(1)誘變具有降低的淀粉分支酶IIa活性水平的作物的種子；或(2)誘變具有降低的淀粉分支酶IIb活性水平的作物的種子；或(3)將具有降低的淀粉分支酶IIa活性水平的作物與具有降低的淀粉分支酶IIb活性水平的作物雜交；以及識(shí)別具有降低的淀粉分支酶IIa和降低的淀粉分支酶IIb活性的大麥作物。
46.一種大麥淀粉顆粒，其特征在于，含有降低的淀粉分支酶IIa蛋白質(zhì)水平，含有的淀粉中直鏈淀粉含量不低于40％(w/w)。
全文摘要
大麥中淀粉分支酶IIa活性水平降低，將導(dǎo)致其生產(chǎn)的麥粒中有相對(duì)較高的直鏈淀粉含量。另外，大麥中還可包含降低的淀粉分支酶IIb活性水平。本發(fā)明的大麥麥?？赡芫哂胁皇湛s的表型，盡管其支鏈淀粉合成途徑發(fā)生了損害。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1652681SQ03810456
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月9日
發(fā)明者阿麥德·里賈納, 馬太·肯尼迪·莫維爾, 薩德奎·拉曼 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科技產(chǎn)業(yè)研究組織