專利名稱：生物技術(shù)制備木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制備木糖醇(xylite)的方法，該方法使用了可將木糖代謝為木糖醇的微生物。
背景技術(shù)：
木糖醇是天然存在的糖醇，由于其在代謝過程的降解是非胰島素依賴的，因此最常在保健食品中被用作糖替代物。
木糖醇還被用于制藥工業(yè)，例如，用于牙膏。
由于與蔗糖相比，木糖醇具有近似的甜度而沒有致癌效應(yīng)，因而被廣泛地應(yīng)用于口香糖、咀嚼片和類似產(chǎn)品。
現(xiàn)有技術(shù)中木糖醇經(jīng)化學(xué)路線合成，高壓高溫下在鎳催化劑上還原木糖，平均生產(chǎn)率為所用木糖的50至60％。
木糖是植物源原料的主要成分，其通過酸性水解或亞硫酸鹽瀝濾，從富含半纖維素的植物殘?jiān)蝎@得。
為了克服化學(xué)方法中木糖醇低生產(chǎn)率的缺點(diǎn)，例如，在EP 0716067中提及，從葡萄糖酸開始，經(jīng)過若干處理步驟，化學(xué)制備木糖醇，從而獲得60至70％的生產(chǎn)率。
這些化學(xué)方法的共同特點(diǎn)是成本高，和/或?yàn)榱送ㄟ^化學(xué)路線制備木糖醇，需要使用與環(huán)境不相容的催化劑。更為突出地，為了此目的而使用了鎳催化劑，鎳催化劑的使用會(huì)導(dǎo)致環(huán)境保護(hù)方面的問題。
此外，這些化學(xué)方法中部分反應(yīng)在70至150℃的高溫和高達(dá)10Mpa的高壓下進(jìn)行。而且，這些化學(xué)方法還需要復(fù)雜的純化和濃縮步驟，以最終獲得純凈的木糖醇。
另一種不同于化學(xué)制備木糖醇的方法，生物技術(shù)方法在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述，其在將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的過程中提供了非常高的生產(chǎn)率。
德巴利氏酵母屬，假絲酵母屬和畢赤酵母屬用作微生物，一方面是因?yàn)?，這些微生物是天然的木糖利用者，可在限氧條件下將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。
該反應(yīng)在輔因子NADH的參與下經(jīng)木糖還原酶(XR)而催化。
作為一種天然的木糖醇形成劑的替換物，微生物經(jīng)如EP 0670161中教導(dǎo)的基因技術(shù)修飾以便經(jīng)此處理后，它們還能夠通過利用其它碳源來形成木糖醇。
EP 0640429中描述了另一種通過生物技術(shù)路線增加木糖醇產(chǎn)量的策略，合成和代謝木糖醇的酵母經(jīng)基因技術(shù)修飾，從而消除了轉(zhuǎn)化所需終產(chǎn)物的酶。
根據(jù)這一發(fā)明的教導(dǎo)，導(dǎo)致所需木糖醇最終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和/或降解的基因表達(dá)被消除或減少了。
現(xiàn)有技術(shù)中還已知以非天然方式還原木糖的微生物，這些微生物經(jīng)基因技術(shù)處理后能夠形成木糖還原酶并因此能夠利用木糖制備木糖醇。
還已知這種木糖還原酶可被強(qiáng)烈地過表達(dá)從而改善生產(chǎn)率。
上述生物技術(shù)方法的共同特征為即使在強(qiáng)烈地過表達(dá)木糖還原酶并且同時(shí)消除了參與木糖醇天然代謝的酶的情況下，也無法足夠有效地提高木糖醇的生產(chǎn)率，以便成本有效地通過生物技術(shù)的方法路線制備木糖醇。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的任務(wù)是提供一種優(yōu)勢(shì)在于自木糖經(jīng)生物技術(shù)制備木糖醇過程中木糖醇的生產(chǎn)率較高的方法，從而使得這一方法具有經(jīng)濟(jì)上的可行性。
本發(fā)明的任務(wù)通過一種生物技術(shù)制備木糖醇的方法得以實(shí)現(xiàn)，該方法使用可將木糖代謝為木糖醇的微生物，并且該方法包括如下工序a)修飾微生物從而減少或消除除木糖還原酶以外的酶對(duì)NADH的氧化，b)在含有木糖和10-40克每升亞硫酸鹽(例如亞硫酸氫鈣，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀)的底物中培養(yǎng)微生物，c)在需氧生長(zhǎng)期和限氧木糖醇生成期培養(yǎng)微生物，以及d)自底物中富集和提取木糖醇。
木糖向木糖醇的轉(zhuǎn)化路線如下
如已描述的那樣，此反應(yīng)在輔因子NADH的參與下經(jīng)木糖還原酶而催化。
如已在本領(lǐng)域文獻(xiàn)中描述且討論過的，在修飾微生物的情況中，通過酶的過表達(dá)，催化該反應(yīng)的木糖還原酶的過量供應(yīng)不會(huì)導(dǎo)致木糖醇產(chǎn)率的大量提高，因此也不能導(dǎo)致木糖醇生成中的經(jīng)濟(jì)上的改善。
令人驚奇的是，已發(fā)現(xiàn)木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的反應(yīng)強(qiáng)烈地依賴于輔因子NADH的可獲得性并受其限制。
根據(jù)本發(fā)明的概念，應(yīng)以這樣的方式修飾微生物例如，消除微生物其它的NADH消耗酶系，例如線粒體NADH脫氫酶，乙醇脫氫酶和磷酸甘油脫氫酶。
本發(fā)明的修飾微生物的效果是基于上述酶顯示了與這種輔因子較強(qiáng)親和力的事實(shí)基礎(chǔ)上的。
如果NADH優(yōu)先被與木糖還原酶相競(jìng)爭(zhēng)的酶氧化成NAD(P)，所需的輔因子就無法提供至高木糖醇生產(chǎn)率所需的程度。
根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)用經(jīng)遺傳修飾的微生物的結(jié)果是經(jīng)本發(fā)明的方法實(shí)質(zhì)地提高了木糖醇的生產(chǎn)率。因此，這種方法與以前的化學(xué)方法相比，是一種具有吸引力的替換方法，因?yàn)槠淇朔缟纤鰹榱私鉀Q同一任務(wù)的其它生物技術(shù)方法的缺陷。
而且，本發(fā)明方法的特殊優(yōu)勢(shì)在于，其可以使用可再生的原料并且與常規(guī)的化學(xué)方法相比，不存在因使用鎳催化劑而引起的環(huán)境損害。
此外，生物技術(shù)方法自身固有反應(yīng)條件相對(duì)溫和的特點(diǎn)，因此通常較化學(xué)方法更易于與環(huán)境相容。實(shí)例中的描述顯示了個(gè)別微生物，特別是酵母，怎樣先經(jīng)修飾然后被用于制備木糖醇。
糖酵母菌屬酵母對(duì)生物技術(shù)方法具有重要意義。在這些酵母中，NADH經(jīng)不同的代謝路線被氧化。特別值得提及的是醇發(fā)酵、由外線粒體NAHD脫氫酶制備和氧化甘油。這些酶與NADH的親和力較木糖還原酶更高，因此輔因子優(yōu)先被這些酶氧化。
由于NADH經(jīng)此概述的分解路線而消耗，因此提供于木糖還原的NADH供應(yīng)受到限制，無法制備更多的木糖醇。
根據(jù)本發(fā)明，可通過如下方法提高細(xì)胞質(zhì)中可用的NADH的含量以及因而參與木糖還原酶反應(yīng)的NADH量失活微生物中一種或幾種導(dǎo)致NADH氧化的酶或抑制其表達(dá)。
酵母的內(nèi)膜線粒體不能透過NADH；因此，酶系的修飾針對(duì)與氧化相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)NADH脫氫酶。
在釀酒酵母中，基因NDE1和NDE2編碼外NADH脫氫酶，然而GPD1和GPD2編碼磷酸甘油脫氫酶。根據(jù)本發(fā)明，上述一種或幾種基因的抑制導(dǎo)致可替換代謝路線中NAD消耗的減少，并使得可用于木糖還原酶的NADH達(dá)到更高程度。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，向釀酒酵母中加入濃度為10至40克每升的亞硫酸鹽(例如亞硫酸氫鈣，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀)底物時(shí)，同等地抑制了葡萄糖降解為乙醇。因此，甘油產(chǎn)量增加。
根據(jù)本發(fā)明，通過基因技術(shù)抑制消耗NADH的磷酸甘油脫氫酶的表達(dá)可抵消甘油的形成。
在這些條件下，木糖醇的產(chǎn)量輔因子NADH而提高，NADH由于磷酸甘油脫氫酶受到抑制而被額外地提供，從而被自木糖形成木糖醇的木糖還原酶利用。
本發(fā)明使用經(jīng)修飾微生物的方法的這一效果被一個(gè)實(shí)例證明是可以實(shí)現(xiàn)的，特別是使用了經(jīng)重組DNA技術(shù)修飾的微生物基因?？商鎿Q地，微生物的修飾可通過受控的或隨機(jī)的基因突變而實(shí)現(xiàn)。
微生物的這種修飾可以這樣的方式進(jìn)行，在第一步中，破壞和/或處理利用NADH輔因子的酶序列，使其不能被微生物制備或僅能被活性減弱了的酶合成。
基因技術(shù)修飾微生物的這些方法是技術(shù)狀態(tài)的一部分。以這樣的方式遺傳處理的微生物提高了木糖醇的產(chǎn)量并將其累積于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，木糖醇可通過結(jié)晶和/或色譜方法自此生長(zhǎng)培養(yǎng)基中富集和/或提取。下面實(shí)例中的描述舉例說明了微生物修飾和木糖醇回收的方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1首先，描述表達(dá)異種木糖還原酶的制備酵母株。
酵母中異種木糖還原酶的表達(dá)是現(xiàn)有技術(shù)的一部分，描述于例如WO91/15588中。
Pichia stipitis在100ml YPD(11培養(yǎng)基中包含10g酵母提取物，20g蛋白胨和20g葡萄糖，pH＝6.5)中于30℃培養(yǎng)過夜。10ml培養(yǎng)基中的細(xì)胞經(jīng)離心成團(tuán)并分離染色體DNA，參照Kaiser等(1994)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。這一DNA用作XYL1基因956bp無內(nèi)含子(introne-free)開放讀碼框PCR擴(kuò)增的模板(Amore等1993)。所得片斷在1％瓊脂糖凝膠中分離并使用Genomed的“JETQUICK Gel Extraction Spin Kit”進(jìn)行純化。質(zhì)粒經(jīng)相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶處理并經(jīng)上述方法純化。使用p425GPD作為載體以在釀酒酵母菌中的表達(dá)。此載體是多拷貝質(zhì)粒且包含作為選擇標(biāo)記物的釀酒酵母菌LEU2基因(Mumberg等1995)。此載體經(jīng)相同的限制性核酸內(nèi)切酶切為片斷并相應(yīng)地純化。XYL1基因的開放讀碼框扎結(jié)于載體中，通過質(zhì)粒制備和限制性分析鑒定重組質(zhì)粒。在使用此方法制備的質(zhì)粒(p425GPD-PsXYL1)中，XYL1的轉(zhuǎn)染易于受強(qiáng)GPD啟動(dòng)子的控制，并確保釀酒酵母菌中外源XR的高表達(dá)。釀酒酵母菌株KOY50(MATa；his3Δ1；leu2Δ；ura3Δ0)被p425GPD-PsXYL1轉(zhuǎn)化，參照Schietstl和Gietz的方法(1989)。分離并分析了Leucin-原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例2通過基因NDE1和NDE2基因替換失活NADH脫氫酶位于線粒體的細(xì)胞溶質(zhì)的NADH脫氫酶與XR競(jìng)爭(zhēng)輔因子NADH。為了減少細(xì)胞溶質(zhì)的NADH消耗，通過適宜的DNA片斷基因替換使得基因NDE1和NDE2失活。與NDE1起始密碼子5’端40bp同源和終止密碼子3’端40bp同源的替換片斷經(jīng)PCR擴(kuò)增。此片斷包含裂殖酵母屬稷酒的his5+基因和補(bǔ)充有釀酒酵母菌的his3突變(Wach等1997)。擴(kuò)增后，如上述方法分離純化此片斷。根據(jù)Schiestl和Gietz(1989)的方法使用替換片斷轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株KOY50。分離組氨酸原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體。使用診斷PCR證實(shí)此片斷正確整合與NDE1取代。這一菌株(KOY50Δndel)經(jīng)p425GPD-PsXYL1轉(zhuǎn)化，如實(shí)施例1所述，并用于制備木糖醇。
如上述方法構(gòu)建NDE2同源替換片斷，用以制備nde1/nde2雙突變體。此時(shí)使用kanMX組件(Wach等1994)作為選擇性標(biāo)記物。此組件使轉(zhuǎn)化體可耐受G418(geneticine)。轉(zhuǎn)化后，KOY50Δnde1細(xì)胞置于包含G418的培養(yǎng)基上?？剐钥寺〗?jīng)診斷PCR測(cè)試以確定正確插入了替換片斷并使NDE2失活。所得菌株(KOY50Δnde1Δnde2)經(jīng)p425GPD-PsXYL1轉(zhuǎn)化，如實(shí)施例1所述，并用于制備木糖醇。
實(shí)施例3編碼磷酸甘油脫氫酶的基因GPD1和GPD2的基因替換細(xì)胞質(zhì)的磷酸甘油脫氫酶GPD1p和GPD2p利用NADH作為輔因子。它們的失活優(yōu)先導(dǎo)致通過使用XR將木糖還原為木糖醇對(duì)細(xì)胞溶質(zhì)的NADH的氧化。在基因替換時(shí)，使用了釀酒酵母菌株KOY50Δnde1和/或KOY50Δnde1Δnde2。
這兩菌株均負(fù)有ura3Δ0突變。為了此分裂作用，使用了含有與GPD1和GPD2同源的片斷，如實(shí)施例2中對(duì)于NDE1的描述。包含白色假絲酵母URA3基因的片斷作為選擇性標(biāo)記物。此選擇性標(biāo)記物側(cè)翼的DNA部分彼此相同(Goldstein等1999)。白色假絲酵母的URA3補(bǔ)充釀酒酵母菌中ura3突變。
尿嘧啶代謝未受損的細(xì)胞與ura3突變細(xì)胞相反，對(duì)于5-氟orodic acid(5-FOA)敏感。將分裂盒整合入基因組后，在重復(fù)DNA部分上生成自發(fā)同源重組并因此失去URA3標(biāo)記物。發(fā)生這樣的重組的克隆可被簡(jiǎn)便的分離，因?yàn)樗鼈兡苣褪?-FOA。
上述DNA片斷經(jīng)PCR擴(kuò)增并純化。CPD1基因替換片斷根據(jù)Schiestl和Cietz(1989)在釀酒酵母KOY50Δnde1和/或KOY50Δnde1Δnde2中的方法轉(zhuǎn)化。
尿嘧啶原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體在相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上分離。通過診斷PCR替換GPD1。接著，此方法構(gòu)建的菌株經(jīng)5-FOA耐受選擇。在5-FOA耐受的菌株中，通過診斷PCR檢測(cè)URA3標(biāo)記物的損失。最后，如上所述，在進(jìn)一步的工作中失活GPD2。
這樣構(gòu)建的菌株經(jīng)p425GPD-PsXYL1轉(zhuǎn)化，如實(shí)施例1所述，并用于制備木糖醇。
實(shí)施例4通過四分體分析(tetrad analysis)脫氫酶失活的菌株的制備為了制備幾種脫氫酶失活的菌株，首先分別失活各相關(guān)基因，如實(shí)施例2中所述。隨后雜交育種各突變體并因此形成deploid菌株的孢子，進(jìn)行四分體分析。
雙突變體可在非親代雙型(NPD)中簡(jiǎn)便地鑒定。KOY50株用于失活GPD1和GPD2，如實(shí)施例2中對(duì)于NDE1的描述，各自被基因替換。雜交相反配對(duì)型的轉(zhuǎn)化體，所得菌株在相應(yīng)培養(yǎng)基上導(dǎo)致孢子形成(sporilate)。四分體測(cè)試組氨酸原養(yǎng)型。NPD四分體GPD1/GPD2雙零突變體作為組氨酸-原養(yǎng)型單孢子的克隆而被分離，經(jīng)p425GPD-PsXYL1轉(zhuǎn)化，并用于制備木糖醇。
權(quán)利要求
1.使用可將木糖代謝為木糖醇的微生物制備木糖醇的生物技術(shù)方法，該方法包括如下步驟a)修飾微生物從而減少或消除除木糖還原酶以外的酶對(duì)NADH的氧化，b)在含有木糖和每升10-40克亞硫酸鹽(例如亞硫酸氫鈣、亞硫酸鈉或亞硫酸鉀被用作亞硫酸鹽)的底物中培養(yǎng)所述微生物，c)在需氧生長(zhǎng)期和限氧木糖醇生成期培養(yǎng)所述微生物，d)自底物中富集和提取木糖醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于經(jīng)修飾的微生物中至少一種酶的表現(xiàn)活性減弱或沒有活性，這些酶為磷酸甘油脫氫酶，外線粒體NADH脫氫酶或乙醇脫氫酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于此微生物中編碼磷酸甘油脫氫酶、外線粒體NADH脫氫酶或乙醇脫氫酶的基因的表達(dá)被消除或減弱了。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其特征在于所用的微生物是假絲酵母屬、糖酵母菌、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、裂殖酵母屬和德巴利式酵母屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于使用釀酒酵母時(shí)，NED1、NED2、GPD1和GPD2中至少一種基因被消除或失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其特征在于半乳糖、甘露糖、葡萄糖或阿拉伯糖被用于底物中作為進(jìn)一步的碳源。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)制備木糖醇的方法，其中使用了可將木糖代謝為木糖醇的微生物。本發(fā)明方法包括如下步驟a)對(duì)微生物進(jìn)行修飾，以便減少或排除木糖還原酶以外的酶對(duì)NADH的氧化；b)在包含木糖和10－40克每升的亞硫酸鹽(例如，亞硫酸氫鈣，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀)的底物中培養(yǎng)此微生物；c)在需氧生長(zhǎng)期和限氧木糖醇生成期中培養(yǎng)此微生物；以及d)富集并自底物中收回木糖醇。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1653187SQ03811033
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2003年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月15日
發(fā)明者托馬斯·沃爾瑟, 卡伊·奧斯特曼, 漢斯-弗里德·利斯特尼克, 托馬斯·布萊, 格哈德·羅德爾 申請(qǐng)人:德累斯頓科技大學(xué)