專利名稱：生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素的生物學(xué)方法，所用微生物為Xanthophyllomyces(Phaffia)屬微生物，能在存在抑制焦磷酸法呢酯(farnesyl pyrophosphate)(此后稱為FPP)生物合成甾醇的抑制劑的前提下生產(chǎn)類胡蘿卜素。
已報(bào)道的類胡蘿卜素有600多種不同的種類，來自在細(xì)菌、酵母、真菌和植物中發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素源生物體。現(xiàn)在商業(yè)上以微生物生產(chǎn)的只有其中兩種，β-胡蘿卜素和蝦青素，用于食品和飼料業(yè)。這些類胡蘿卜素作為天然色素以及有益于人體健康的強(qiáng)抗氧化性的功能性物質(zhì)，具有重要的工業(yè)價(jià)值。此外，從商業(yè)前景來看，對(duì)染色劑蝦青素的需求在增長(zhǎng)，尤其是在養(yǎng)魚業(yè)中，比如鮭魚養(yǎng)殖，因?yàn)槲r青素(astaxanthin)使魚類帶鮮明的桔紅色而有助于吸引消費(fèi)者。
其它類胡蘿卜素，例如番茄紅素、玉米黃素、角黃素和β-隱黃素，它們作為天然的色素和抗氧劑也具有重要的工業(yè)價(jià)值。番茄紅素經(jīng)體外試驗(yàn)顯示能有效去除單態(tài)氧。番茄紅素抑制脂質(zhì)過氧化作用，其血清水平與發(fā)生胰腺癌和子宮癌的危險(xiǎn)成反比。水果和蔬菜，例如西紅柿、粉紅葡萄柚、中的紅色、紅葡萄皮、西瓜和紅番石榴之所以呈紅色，都是因?yàn)榉鸭t素。其它膳食資源包括木瓜和杏。玉米黃素是黃色的胡蘿卜素，它是一種氧化的β-胡蘿卜素羥基衍生物。玉米黃素富含于菠菜、玉米和許多其它植物品種中。這是一種強(qiáng)抗氧化劑，在視網(wǎng)膜中也有發(fā)現(xiàn)。公認(rèn)玉米黃素可以起到過濾器的作用，并能防護(hù)來自于眼睛的有害藍(lán)光和抵抗與年齡相關(guān)的斑點(diǎn)樣退化。角黃素是紅色的類胡蘿卜素，在許多植物和動(dòng)物身上都有發(fā)現(xiàn)。用于雞蛋黃、小雞和養(yǎng)殖的鱒魚的著色，以及用于要求更顯桔紅色的食品和化妝品中。角黃素也可起到單態(tài)氧的猝滅劑和自由基的滅火劑的作用。β-隱黃素是黃色的類胡蘿卜素，存在于桔子、芒果、番木瓜、南瓜和許多其它水果中。β-隱黃素也被認(rèn)為是一種預(yù)防癌癥的強(qiáng)抗氧劑。
在能大量生產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物中，法夫紅酵母(Phaffiarhodozyma)是一種最為人所熟知的類胡蘿卜素源菌株。該酵母菌株產(chǎn)生蝦青素，是現(xiàn)在用于供應(yīng)食品和飼料業(yè)所需蝦青素的幾種微生物之一。在近期的分類學(xué)研究中，披露了一種法夫紅酵母的雄分生孢子(sexual cycle)，其遠(yuǎn)距離刺激變形態(tài)(telemorphic state)被命名為Xanthophyllomycesdendrorhous[Golubev，Yeast 11101-110(1995)]。在本申請(qǐng)的描述中，取其眾所周知的名稱法夫紅酵母。
為了提高微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素的水平開展了一些研究，比如，包括使用合適的宿主菌株通過基因工程構(gòu)造重組微生物使其獲得大量生產(chǎn)幾種類胡蘿卜素的能力，這類菌株有大腸埃希氏桿菌、釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母[Misawa等，J.Bacteriol.1726704(1990)；Yamano等，Biosci.Biotech.Biochem.581112(1994)；Miura等，Biotechnol.Bioeng.58306(1998)]，改進(jìn)菌株以獲得高產(chǎn)發(fā)生器，例如來自法夫紅酵母的蝦青素的高產(chǎn)發(fā)生器[Johnson等，Critical Reviews inBiotechnology11297-326(1991)]，改進(jìn)方法以獲得最佳的發(fā)酵工藝，例如已實(shí)施的通過法夫紅酵母(US5,972,642)生產(chǎn)蝦青素的方法。US5,356,809公開了在法夫紅酵母細(xì)胞中加入抗霉素或另一種主要呼吸鏈抑制劑提高了蝦青素的產(chǎn)出。但該方法并不是特別有效和方便。顯然，仍然需要有一個(gè)簡(jiǎn)單有效的方法來提高類胡蘿卜素的產(chǎn)率。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是生產(chǎn)類胡蘿卜素的生物學(xué)方法，其中包括有氧條件下在含水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種能在抑制劑抑制FPP生物合成甾醇的前提下生產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物。
更優(yōu)選使用高度類胡蘿卜素源微生物，例如屬于Xanthophyllomyces(Phaffia)屬的微生物。因而，本發(fā)明所述微生物優(yōu)選的例子是Xanthophyllomyces(Phaffia)屬的微生物。本發(fā)明優(yōu)選的Xanthophyllomyces(Phaffia)菌株得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，U.S.A.稱為Xanthophyllomyces(Phaffia)ATCC96594(根據(jù)布達(dá)佩斯條約再次于1998年4月8日保藏，保藏號(hào)ATCC74438)。
因而本發(fā)明特別地涉及到一種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，其中包括培養(yǎng)一種Xanthophyllomyces(Phaffia)屬的微生物在抑制劑抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的前提下生產(chǎn)類胡蘿卜素，一種用于有氧條件下在含水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生產(chǎn)類胡蘿卜素的底物，以及從所述微生物的細(xì)胞或從培養(yǎng)基中分離出所得到的類胡蘿卜素。
尤其是，對(duì)于本發(fā)明所述的生物學(xué)方法，更優(yōu)選抑制甾醇途徑的初始反應(yīng)，該反應(yīng)由角鯊烯合酶催化。
據(jù)報(bào)道，角鯊烯合酶(在本領(lǐng)域也稱作角鯊烯合成酶)抑制劑可以降低細(xì)胞的甾醇水平。角鯊烯合酶是一種催化甾醇生物合成甾醇初始關(guān)鍵步驟的酶。兩分子的FPP縮合形成角鯊烯。
因而，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是生產(chǎn)類胡蘿卜素的生物學(xué)方法，其中包括培養(yǎng)一種能在抑制劑抑制角鯊烯合酶的前提下生產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物。
已報(bào)道了幾種角鯊烯合酶抑制劑[Biler等，Current PharmaceuticalDesign21-40(1996)]。報(bào)道的角鯊烯合酶抑制劑大致有三類，銨離子基角鯊烯合酶抑制劑、含F(xiàn)PP類似物的磷，和羧化物基抑制劑。本發(fā)明優(yōu)選任一種角鯊烯合酶抑制劑。這些角鯊烯合酶抑制劑優(yōu)選的例子之一是銨離子基角鯊烯合酶抑制劑。
而且，優(yōu)選的銨離子基角鯊烯合酶抑制劑之一是苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑[Brown等，Journal of MedicinalChemistry384157-4160(1995)]。已知有很多苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑，比如，包括[3-(3-烯丙基-聯(lián)苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-甲基-N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-環(huán)戊基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-環(huán)丁基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(2-烯丙基-4-丁酰胺基苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-氯-苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-丙基苯氧基)丙胺，和N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)-1-甲基丙胺，和其生物學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明實(shí)施例中所使用的優(yōu)選的角鯊烯抑制劑包括[3-(3-烯丙基-聯(lián)苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺和N-甲基-N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺。
類胡蘿卜素一般通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種類胡蘿卜素源微生物來進(jìn)行生產(chǎn)，培養(yǎng)基中包括適合于細(xì)胞的常量營(yíng)養(yǎng)物或微量營(yíng)養(yǎng)物，如糖蜜、蔗糖或葡萄糖，用作細(xì)胞生長(zhǎng)的糖源，也作為類胡蘿卜素生長(zhǎng)的底物，以及氮源如玉米浸漬液、酵母提取物、硫酸二銨、磷酸銨、氨水或脲，磷源如磷酸銨和磷酸和加入的微量營(yíng)養(yǎng)物或礦物鹽如硫酸鎂、硫酸鋅和生物素或脫硫生物素。
進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)優(yōu)選的條件是pH值的范圍在4到8之間，且溫度范圍在15到26℃之間，培養(yǎng)時(shí)間24到500小時(shí)，更優(yōu)選的培養(yǎng)條件是pH值的范圍在5到7之間，且溫度范圍在18到22℃之間，培養(yǎng)時(shí)間48到350小時(shí)。
進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，進(jìn)行通氣和攪拌通常會(huì)使類胡蘿卜素的生產(chǎn)取得良好的結(jié)果。
在本發(fā)明中，抑制FPP生物合成甾醇的抑制劑被加入培養(yǎng)基中。相應(yīng)地，抑制劑的濃度應(yīng)根據(jù)抑制劑和用于生產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物的種類而改變，比如，濃度范圍使得在類胡蘿卜素生產(chǎn)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)的減少小于50％。更優(yōu)選的抑制劑濃度可以是在使細(xì)胞生長(zhǎng)的減少小于30％濃度范圍內(nèi)。
在本發(fā)明中，抑制FPP生物合成甾醇的抑制劑可以在培養(yǎng)的任何階段被加入培養(yǎng)基中。
按照本發(fā)明的方法通過培養(yǎng)類胡蘿卜素源微生物所生產(chǎn)的類胡蘿卜素，可以在被分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的情況下從培養(yǎng)基中將其分離出來，或者可以從微生物細(xì)胞中分離出來，并且如果想要一種特定的類胡蘿卜素在需要時(shí)也可將其與其它的類胡蘿卜素分開，分離方法是本領(lǐng)域所公知的[例如，Carotenoids VolIAIsolation and Analysis，Britton等，BirkhuserVerlag，Basel(1995)]。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的類胡蘿卜素可用于加工生產(chǎn)食品或飼料。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)此類方法都很熟悉。某些復(fù)合食品或飼料還可包括一些一般用于某種目的且為本領(lǐng)域所公知的添加劑或成分。
下述實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，但并不因此而限定了本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例所用的角鯊烯合酶抑制劑是[3-(3-烯丙基-聯(lián)苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，屬于苯氧丙胺型抑制劑系列中的一種。該化合物的合成是根據(jù)Brown等(supra)公開的方法將聯(lián)苯-4-酚(產(chǎn)品代碼H7751，Sigma，USA)與烯丙基溴和碳酸鉀在丁烷-2-酮中通過熱重排反應(yīng)來生產(chǎn)3-烯丙基-聯(lián)苯-4-酚。3-烯丙基-聯(lián)苯-4-醇與1，3-二溴丙烷和碳酸鉀在丁烷-2-酮中進(jìn)行反應(yīng)，隨后與異丙胺在2-丙醇中反應(yīng)得到[3-(3-烯丙基-聯(lián)苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺。
實(shí)施例1加入角鯊烯合酶抑制劑對(duì)法夫紅酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響將法夫紅酵母ATCC96594接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上(DIFCO，Detroit，U.S.A.，在試管中有10mL)，在20℃下?lián)u動(dòng)試管培養(yǎng)2天。將0.5mL的培養(yǎng)物接種到新鮮的YPD培養(yǎng)基上(在試管中有10mL)，培養(yǎng)基含有30g/L的葡萄糖和各自0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μg/mL的[3-(3-烯丙基-聯(lián)苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，在20℃下?lián)u動(dòng)試管培養(yǎng)5天。
不時(shí)地通過取回等量樣品的培養(yǎng)物，通過使用UV-1200光度計(jì)(ShimadzuCorp.，Kyoto，Japan)測(cè)量660nm下的光密度，來分析細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)果見表1。
當(dāng)角鯊烯合酶抑制劑的濃度不高于2.0μg/mL時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)不受影響。在第2天抑制劑5.0μg/mL條件下觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)約23％受到抑制。
實(shí)施例2加入角鯊烯抑制劑對(duì)法夫紅酵母生產(chǎn)蝦青素的影響如實(shí)施例1在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)法夫紅酵母ATCC96594，20℃下?lián)u瓶培養(yǎng)2天。將2.5mL的培養(yǎng)物接種到新鮮的YPD培養(yǎng)基上(在燒瓶中有50mL)，培養(yǎng)基含有22g/L的葡萄糖和各自0、0.5、1.0、2.0和5.0μg/mL的[3-(3-烯丙基-聯(lián)苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，在20℃下?lián)u瓶培養(yǎng)7天。培養(yǎng)的第2天，在培養(yǎng)基中加入50g/L的葡萄糖。也試驗(yàn)了在培養(yǎng)的中期加入抑制劑。培養(yǎng)的第4天和第7天取回等量樣品的培養(yǎng)物，測(cè)定在660nm下的光密度(按照和實(shí)施例1所述的相同方法)和培養(yǎng)物中蝦青素的含量。
為了分析蝦青素的含量，將取回的培養(yǎng)液和溶劑混合物(乙醇、己烷和乙酸乙酯)混合，通過用玻璃珠劇烈搖瓶以從法夫紅酵母中提取類胡蘿卜素。提取后，破裂的細(xì)胞和玻璃珠經(jīng)離心除去，所得上清液用HPLC分析蝦青素含量。所用的HPLC條件如下HPLC柱Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)溫度室溫洗脫液丙酮/己烷(18/82)加1ml/L的水到洗脫液上樣量10μl流速2.0ml/minute檢測(cè)UV在450nm下蝦青素的對(duì)照品得自Hoffmann La-Roche(Basel，Switzer-land)。結(jié)果見表2。
*相對(duì)值計(jì)算以沒有抑制劑時(shí)第7天的蝦青素含量為100。
**培養(yǎng)開始時(shí)沒有抑制劑，培養(yǎng)第2天加入5.0μg/mL的抑制劑。
在所有試驗(yàn)條件下蝦青素的生產(chǎn)都有提高。當(dāng)培養(yǎng)第2天加入抑制劑時(shí)所獲得的結(jié)果最好，而對(duì)于生產(chǎn)蝦青素來說在培養(yǎng)開始時(shí)加入抑制劑也同樣有效。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)類胡蘿卜素的生物學(xué)方法，其中包括有氧條件下在含水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，在存在抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制劑下，培養(yǎng)一種能生產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物。
2.一種生產(chǎn)類胡蘿卜素的生物學(xué)方法，其中包括在存在抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制劑前提下，培養(yǎng)一種Xanthophyllomyces(Phaffia)屬的微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素，一種用于有氧條件下在含水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生產(chǎn)類胡蘿卜素的底物，以及從所述微生物的細(xì)胞或從培養(yǎng)基中分離出所得到的類胡蘿卜素。
3.權(quán)利要求2的方法，其中的微生物是Xanthophyllomycesdendrorhous(法夫紅酵母)ATCC96594。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中用于抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制劑選自角鯊烯合酶抑制劑類。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中的角鯊烯合酶抑制劑選自銨離子基的角鯊烯合酶抑制劑類。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中銨離子基的角鯊烯合酶抑制劑選自苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑類。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑選自[3-(3-烯丙基-聯(lián)苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-甲基-N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-環(huán)戊基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-環(huán)丁基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(2-烯丙基-4-丁酰胺基苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-氯-苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-丙基苯氧基)丙胺，和N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)-1-甲基丙胺，和其生物學(xué)上可接受的鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑是[3-(3-烯丙基-聯(lián)苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，或其生物學(xué)上可接受的鹽，N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺或N-甲基-N-異丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抑制劑的濃度范圍使得在類胡蘿卜素生產(chǎn)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)的減少小于50％。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述抑制劑的濃度范圍使得在類胡蘿卜素生產(chǎn)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)的減少小于30％。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)pH值的范圍在4到8之間，且溫度范圍在15到26℃之間，培養(yǎng)時(shí)間24到500小時(shí)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)pH值的范圍在5到7之間，且溫度范圍在18到22℃之間，培養(yǎng)時(shí)間48到350小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素的生物學(xué)方法，所用微生物為Xanthophyllomyces(Phaffia)屬微生物，能在抑制劑抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的前提下生產(chǎn)類胡蘿卜素。
文檔編號(hào)C12R1/645GK1662658SQ03813933
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2003年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月21日
發(fā)明者星野達(dá)雄, 益田節(jié)子, 瀨戶口豐 申請(qǐng)人:Dsm Ip資產(chǎn)公司