專利名稱：半胱氨酸天冬氨酸酶9的激活及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣義上涉及分子醫(yī)學(xué)和藥物篩選試驗(yàn)，并且更具體地涉及有關(guān)程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)中的相互作用以及鑒定改變這種相互作用的藥物的方法。
背景技術(shù)：
在從C.elegans到人的多細(xì)胞機(jī)體中，細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡是細(xì)胞生命周期的關(guān)鍵性判定點(diǎn)。在正常的胚胎形成和發(fā)育、體內(nèi)平衡維護(hù)、和免疫系統(tǒng)功能中，它是一個(gè)重要的生命歷程。細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)和啟動(dòng)是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)過(guò)程，這與該功能的多樣性相一致。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，死亡區(qū)域超家族是傳導(dǎo)死亡信號(hào)所需的相互作用的主要介體。該超家族由死亡區(qū)域(DD)、死亡效應(yīng)區(qū)域(DED)和半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)募集區(qū)域(CARD)家族組成。這些家族中的每一個(gè)成員均通過(guò)形成專有的CARD-CARD、DD-DD和DED-DED連接的同型互作方式而與其它蛋白相互作用。
半胱氨酸天冬氨酸酶，和效應(yīng)物半胱氨酸天冬氨酸酶切割必需蛋白例如聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、和活化核酸內(nèi)切酶例如CAD(由抑制劑ICAD裂解)一起，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者。上游半胱氨酸天冬氨酸酶，例如半胱氨酸天冬氨酸酶8和9，分別被諸如死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)和細(xì)胞凋亡物(apoptosome)的信號(hào)復(fù)合物激活。半胱氨酸天冬氨酸酶通過(guò)CARD或DED區(qū)域結(jié)合到特異性銜接分子，導(dǎo)致半胱氨酸天冬氨酸酶自動(dòng)激活。例如，由Apaf-1、半胱氨酸天冬氨酸酶9和細(xì)胞色素C組成細(xì)胞凋亡物，在該結(jié)構(gòu)內(nèi)，Apaf-1通過(guò)CARD-CARD互作而與半胱氨酸天冬氨酸酶9前體(procaspase 9)相互作用。結(jié)合于Apaf-1的細(xì)胞色素C激活該復(fù)合物，從而使半胱氨酸天冬氨酸酶9前體得到募集和自動(dòng)激活。可能該復(fù)合物含有多個(gè)Apaf-1和半胱氨酸天冬氨酸酶9前體，因?yàn)樵摷せ顝?fù)合物具有700kDa的分子量。
細(xì)胞凋亡物(apoptosome)，還有Fas DISC和含有Pelle的復(fù)合物均是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的大型調(diào)節(jié)復(fù)合物的實(shí)例。這些復(fù)合物中的蛋白由多個(gè)區(qū)域組成，例如蛋白-蛋白相互作用基元、激酶區(qū)域、蛋白分解區(qū)域、配體結(jié)合區(qū)域和膜結(jié)合區(qū)域。死亡區(qū)域總是提供分子內(nèi)通訊手段中的一種。見C.H.Weber和C.Vincenz的綜述，“The death domain superfamilya tale of two interfaces？”Trendsin Biochemical Sciences，Vol.26 No.8，2001。
半胱氨酸天冬氨酸酶9是蛋白酶中的天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶(ASCP)家族的一員，其包括，例如，ICE，CPP32，Nedd2/Ich-1，Mch2，Mch3，Mch4，Mch5，TX(ICH-2，ICErel-II)，和ICErel-III。
半胱氨酸天冬氨酸酶9與幾種ASCPs氨基酸序列同源，但是其催化部位QACGG與其它已知ACSPs中的相對(duì)保守的催化部位相比，在第四個(gè)殘基處有所不同。美國(guó)專利號(hào)6,271,361，其公開了半胱氨酸天冬氨酸酶9的DNA和氨基酸序列，在此全文引入以供參考。
象許多ASCP一樣，半胱氨酸天冬氨酸酶9以酶原的形式被合成，其能被諸如CPP32或粒酶B進(jìn)行蛋白切割。切割后的半胱氨酸天冬氨酸酶9產(chǎn)生兩個(gè)亞基，一個(gè)大亞基和一個(gè)小亞基，兩者聯(lián)合形成一個(gè)活性異二聚體復(fù)合物。具體的，CPP32可以把半胱氨酸天冬氨酸酶9前體切割為一個(gè)具有約37kDa(p37)分子量的大亞基和一個(gè)約10kDa(p10)分子量的小亞基。類似地，粒酶B可以把半胱氨酸天冬氨酸酶9前體切割為一個(gè)具有約35kDa(p35)分子量的大亞基和一個(gè)約12kDa(p12)分子量的小亞基。此外，該細(xì)胞凋亡途徑的其它成份能把半胱氨酸天冬氨酸酶9加工為一個(gè)較大切割產(chǎn)物和一個(gè)較小切割產(chǎn)物。相應(yīng)地，術(shù)語(yǔ)“大亞基”和“小亞基”分別指任何較大蛋白切割產(chǎn)物，例如p37或p35，和任何較小切割產(chǎn)物，例如p10或p12，這是很容易理解的。
象其它ASCP一樣，該活性半胱氨酸天冬氨酸酶9復(fù)合物能夠充當(dāng)?shù)鞍酌?，并且需要在該底物結(jié)合部位的P1位置有一個(gè)Asp殘基，和在P1′位置有一個(gè)小的優(yōu)選為疏水的殘基。
細(xì)胞凋亡在眾多病理狀況中扮演著重要角色，有的是抑制了程序性細(xì)胞死亡，從而增加了細(xì)胞存活時(shí)間，有的是促進(jìn)了程序性細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失。由細(xì)胞存活時(shí)間增加引起的病理狀況實(shí)例包括癌癥，例如淋巴瘤、惡性腫瘤和激素依賴性腫瘤。這種激素依賴性腫瘤包括，例如，乳癌，前列腺癌和卵巢癌。細(xì)胞存活增加時(shí)間或細(xì)胞凋亡抑制還可導(dǎo)致自身免疫疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫介導(dǎo)的腎小球腎炎，以及病毒感染諸如皰疹病毒、痘病毒和腺病毒。被確定的與細(xì)胞死亡途徑有關(guān)的第一個(gè)基因，bcl-2基因，在癌細(xì)胞中被鑒定，并且顯示其通過(guò)降低表達(dá)該基因的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡的發(fā)生概率來(lái)起作用。
相反，細(xì)胞凋亡疾病，其中促進(jìn)了程序性細(xì)胞死亡是一個(gè)普遍病因，一般包括，例如，衰退紊亂諸如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病，肌萎縮性側(cè)索硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、小腦衰退，和與獲得性免疫缺損病(AIDS)有關(guān)的腦病。由于成年人的神經(jīng)細(xì)胞一般不分裂，故無(wú)法得到新細(xì)胞來(lái)替換垂死細(xì)胞，這種疾病中發(fā)生的神經(jīng)細(xì)胞死亡導(dǎo)致遭受該疾病的病人狀態(tài)逐漸惡化。與促進(jìn)了細(xì)胞凋亡有關(guān)的其它疾病包括，例如，脊髓發(fā)育不良綜合征，諸如再生障礙性貧血和局部缺血性損傷，包括心肌梗死，中風(fēng)和再灌注損傷。
半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制劑包括那些抑制蛋白酶活性的試劑以及抑制半胱氨酸天冬氨酸酶9與其它多肽結(jié)合的化合物。此類化合物作為藥物用于治療或預(yù)防具有細(xì)胞凋亡特征的疾病。當(dāng)在本發(fā)明中應(yīng)用時(shí)，半胱氨酸天冬氨酸酶9多肽可用來(lái)篩選那些激活或作為半胱氨酸天冬氨酸酶9激動(dòng)劑的化合物，激活方式如通過(guò)誘導(dǎo)酶原切割為活性亞基。此類化合物同樣能夠用作藥物來(lái)治療或預(yù)防具有細(xì)胞凋亡缺失特征的疾病。
發(fā)明概述本申請(qǐng)涉及鑒定能夠調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬氨酸酶9活性的化合物的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A顯示在pH7.2時(shí)半胱氨酸天冬氨酸酶1對(duì)底物DEVD(SEQ ID NO1)、IETD(SEQ ID NO2)、LEED(SEQ ID NO3)、WEHD(SEQ ID NO4)、LEHD(SEQ ID NO5)和VEID(SEQ ID NO6)中的特異性。圖1B顯示pH7.2時(shí)半胱氨酸天冬氨酸酶2的底物特異性。圖1C顯示pH7.2時(shí)半胱氨酸天冬氨酸酶3的底物特異性。圖1D顯示pH7.2時(shí)半胱氨酸天冬氨酸酶6的底物特異性。圖1E顯示pH7.2時(shí)半胱氨酸天冬氨酸酶7的底物特異性。圖1F顯示pH7.2時(shí)半胱氨酸天冬氨酸酶8的底物特異性。圖1G顯示pH7.2時(shí)半胱氨酸天冬氨酸酶9的底物特異性。圖1H顯示pH7.2時(shí)半胱氨酸天冬氨酸酶10的底物特異性。
圖2顯示相對(duì)于半胱氨酸天冬氨酸酶各種類型，AFC的釋放速率。
圖3顯示在含有Hofmeister系列Na鹽的緩沖液中，LEHD(SEQ ID NO5)被半胱氨酸天冬氨酸酶9裂解的相對(duì)速率。
圖4A到4C顯示Hofmeister鹽對(duì)于半胱氨酸天冬氨酸酶家庭成員的選擇性。圖4A顯示在不同量的硫酸銨中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。圖4B顯示在不同量的硫酸銨中半胱氨酸天冬氨酸酶3的活性。
圖4C顯示在不同量的磷酸鈉中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。
圖5A顯示30U酶、100uM Ac-LEHD-AFC(SEQ ID NO5)中，在不同濃度的檸檬酸鈉鹽中，半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。圖5B顯示30U酶、100uM Ac-LEHD-AFC(SEQ ID NO5)中，在不同磷酸鈉鹽和鉀鹽溶液中，半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。圖5C顯示在不同濃度的CsCl和LiCl中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。圖5D顯示在不同濃度的Mg(SO4)、Ca(SO4)、MgCl2和CaCl2中，半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。
發(fā)明詳述半胱氨酸天冬氨酸酶9是一種由多組分裝配而成的具有蛋白分解活性的細(xì)胞凋亡物(Renatus等，(2001)Dimer formation drives the activation of the deathprotease Caspase9，PNAS98，14250-14255)。該復(fù)合物調(diào)控發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)的組織體系，并且調(diào)控那些被環(huán)境應(yīng)力或配體-受體激活損傷而無(wú)法恢復(fù)的細(xì)胞的去除。象半胱氨酸天冬氨酸酶家族的其它成員一樣，半胱氨酸天冬氨酸酶9在細(xì)胞中處于潛伏形態(tài)，但是有一點(diǎn)不同于其它成員，簡(jiǎn)單的蛋白分解過(guò)程不足以使之激活。對(duì)于這樣一種1百萬(wàn)道爾頓的復(fù)合物，為了完全使之轉(zhuǎn)化為催化形式，需要其與激活形式的APAF-1的結(jié)合。純化復(fù)合物的每個(gè)成員以及在體外將它們裝配起來(lái)是非常困難的，這導(dǎo)致很難獲得對(duì)半胱氨酸天冬氨酸酶9活化機(jī)制在結(jié)構(gòu)上的了解，或設(shè)計(jì)出該種蛋白酶，使之用于篩選發(fā)現(xiàn)特異性調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明通過(guò)提供一種簡(jiǎn)單而方面的在體外增強(qiáng)半胱氨酸天冬氨酸酶9活性的方法，而使特異性調(diào)節(jié)劑的篩選，包括高通量篩選成為可能。
以下的Hofmeister系列是根據(jù)它們沉淀母雞蛋清蛋白混合物的能力而排列的各種離子等級(jí)。
陰離子SCN-＞NO3-＞Cl-＞檸檬酸鹽＞醋酸根-＞磷酸鹽＞SO42-陽(yáng)離子Ca2+＞Mg2+＞Na+＝K+＞NH4+＞N(CH3)4+已經(jīng)表明，Hofmeister系列鹽具有非常廣泛的用途，包括在生物大分子的構(gòu)建或變性上顯示出的分級(jí)能力。近年來(lái)，通常使用Hofmeister系列在離子方面的能力，用之穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)。在凍干酶的鹽誘導(dǎo)激活研究中發(fā)現(xiàn)了類似的能力(Ru等人，On the salt-induced activation of lyophilized enzymes in organicsolventsEffect of salt kosmotropicity on enzyme activity，J.Am.Chem.Soc.，122(2000)1565-1571)。陰離子和陽(yáng)離子的離子強(qiáng)度與它們的水合強(qiáng)度呈相反關(guān)系。
該系列中的相關(guān)位置(主要相應(yīng)于水合強(qiáng)度)應(yīng)被認(rèn)為僅作預(yù)示，因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)、pH和溫度不同，呈現(xiàn)明確陽(yáng)離子特異效果的醋酸根離子會(huì)有變化。離子破壞水天然的氫鍵合網(wǎng)，具有與增加溫度或壓強(qiáng)相似的效果；例如粘度降低。用等效滲透壓力已經(jīng)成功估算出離子的這種效果。具有最大該效果的離子(同水自身相比，與水之間呈現(xiàn)較弱的相互作用)被稱為結(jié)構(gòu)破壞劑(structure-breakers)或chaotropes，而具有相反效果的離子被稱為結(jié)構(gòu)形成劑(structure-makers)或kosmotropes(與水分子呈現(xiàn)強(qiáng)相互作用)。
當(dāng)在硫酸銨中制備半胱氨酸天冬氨酸酶9樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)底物蛋白迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樾‰?，這表明該溶液中蛋白酶解作用顯著增強(qiáng)。本申請(qǐng)?jiān)诓幌拗破毡闄C(jī)制，也不限制組成和方法的情況下，發(fā)明人假定，硫酸銨的溶解增強(qiáng)了水溶液極性，從而導(dǎo)致由于低聚或構(gòu)象變化引起半胱氨酸天冬氨酸酶9的結(jié)構(gòu)改變，這種改變伴隨著酶的激活。已知許多病毒蛋白酶是被水構(gòu)成的Hofmeister系列陰離子(Kosmotropic試劑)所活化(Cacace，M.，Landau，E.和Ramsden，J.(1997)，The Hofmeister seriessalt and solvent effects on interfacial phenomena，Quart.Rev.of Biophysics30，241-277)。例如，負(fù)責(zé)病毒衣殼成熟的單純皰疹病毒1蛋白酶顯示，在1M檸檬酸鈉中活性增加了860倍(Hall，D.和Darke，P.(1995)，Activation of the Herpes Simplex virus type 1 protease，JBC270，22697-22700)。用該鹽進(jìn)行處理被認(rèn)為是模擬了活性蛋白的天然微環(huán)境，在細(xì)胞核中，該酶可能處于高濃度聚陰離子環(huán)境中。
通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶所處的溶劑狀態(tài)來(lái)模擬細(xì)胞凋亡物半胱氨酸天冬氨酸酶9的激活過(guò)程，從而產(chǎn)生了一種簡(jiǎn)單的體外篩選發(fā)現(xiàn)該酶抑制劑的方法。
用kosmotropic試劑激活半胱氨酸天冬氨酸酶9是令人驚訝的，這不僅體現(xiàn)在激活程度方面，而且體現(xiàn)在半胱氨酸天冬氨酸酶9被完全活化的事實(shí)方面。在本發(fā)明之前，沒理由相信kosmotropic鹽會(huì)活化半胱氨酸天冬氨酸酶9。用kosmotropic鹽活化其它半胱氨酸天冬氨酸酶的失敗，如實(shí)施例4中描寫的半胱氨酸天冬氨酸酶3，更加說(shuō)明了上述事實(shí)。
半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制劑可用于治療或減弱具有程序性細(xì)胞死亡增強(qiáng)特征的疾病的嚴(yán)重度。利用此處所描述的半胱氨酸天冬氨酸酶9激活試驗(yàn)，可以對(duì)多種化合物進(jìn)行篩選，從中發(fā)現(xiàn)那些抑制或增強(qiáng)半胱氨酸天冬氨酸酶9蛋白酶活性表達(dá)的化合物。此類篩選方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。此類抑制分子可以是那些合成的或天然產(chǎn)生的化合物庫(kù)中的分子。
半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制劑包括，例如，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)型或非競(jìng)爭(zhēng)性型機(jī)理結(jié)合并鈍化半胱氨酸天冬氨酸酶9蛋白酶活性的小分子和有機(jī)化合物，抑制將無(wú)活性的半胱氨酸天冬氨酸酶9前體轉(zhuǎn)化為活性半胱氨酸天冬氨酸酶9蛋白酶的抑制劑，或其它間接抑制半胱氨酸天冬氨酸酶9途徑的分子。此類半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制劑可包括，例如，自殺抑制劑，抗半胱氨酸天冬氨酸酶9抗體和蛋白，小肽類蛋白酶抑制劑，或小的非肽類有機(jī)分子抑制劑。此類抑制劑的具體實(shí)例包括底物類似物，如四肽DEVD-CHO(SEQ ID NO1)(Asp-Glu-Val-Asp-乙醛)，熒光標(biāo)記的四肽如DEVD-AMC(SEQ ID NO1)(Asp-Glu-Val-Asp-氨甲基香豆素)，YVAD-AMC(SEQ ID NO7)(Tyr-Val-Ala-Asp-氨甲基香豆素)，ZEVD-AMC(芐氧羰基-Glu-Val-Asp-氨甲基香豆素)和牛痘病毒蛋白交叉反應(yīng)物質(zhì)A。另一個(gè)具體實(shí)例包括噬菌體展示肽庫(kù)，其中大于108的肽序列可在單輪淘選中進(jìn)行篩選(美國(guó)專利號(hào)6,121,416)。將半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制劑配制到培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基能夠?qū)⒁种苿┮氲筋A(yù)定細(xì)胞類型中，或者可將半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制劑附于目標(biāo)配體，通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和其它受體介導(dǎo)的作用，將其引入。
半胱氨酸天冬氨酸酶9底物拮抗劑可用于治療或減弱由程序性細(xì)胞死亡增強(qiáng)引起的疾病的嚴(yán)重度。此類底物拮抗劑能夠結(jié)合半胱氨酸天冬氨酸酶9并抑制半胱氨酸天冬氨酸酶9的切割能力。底物切割的抑制阻止了程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵過(guò)程。底物拮抗劑包括，例如，配體和小分子化合物。
半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制劑還可用本發(fā)明的半胱氨酸天冬氨酸酶9編碼核酸和半胱氨酸天冬氨酸酶9多肽進(jìn)行鑒定，例如，通過(guò)結(jié)合試驗(yàn)，諸如ELISA或RIA，或者通過(guò)使用四肽底物的酶試驗(yàn)，諸如香豆素標(biāo)記的DEVD-AMC(SEQID NO1)和YVAD-AMC(SEQ ID NO7)。DEVD-AMC(SEQ ID NO1)和YVAD-AMC(SEQ ID NO7)分別代表聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和IL-1βP1-P4底物四肽的切割位點(diǎn)(Nicholson等，Nature 37637-43(1995))。
用于此類試驗(yàn)的半胱氨酸天冬氨酸酶9多肽可以通過(guò)，例如，體外翻譯、重組表達(dá)或生化過(guò)程，來(lái)獲得。此類方法和其它方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，通過(guò)將半胱氨酸天冬氨酸酶9cDNA克隆到諸如pET21b的細(xì)菌表達(dá)載體里，可以表達(dá)重組半胱氨酸天冬氨酸酶9(Novagen Inc.，Madison，Wis.)。接著，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的常規(guī)分子生物學(xué)方法表達(dá)和純化半胱氨酸天冬氨酸酶9。使用連續(xù)的熒光試驗(yàn)，純化的重組半胱氨酸天冬氨酸酶9蛋白可用于測(cè)量諸如DEVD-AMC(SEQ ID NO1)和YVAD-AMC(SEQ ID NO7)等各種底物的水解速率。
測(cè)量半胱氨酸天冬氨酸酶活性的眾多方法是本領(lǐng)域中已知的，包括用半胱氨酸天冬氨酸酶的熒光底物、酶活性試驗(yàn)、免疫印跡法和親和標(biāo)記，如在CurrentProtocols in Cell Biology，第18章中所描述的，該章節(jié)在此全文引入以供參考。在本發(fā)明之前，這些方法不能用于半胱氨酸天冬氨酸酶9，因?yàn)樵隗w外它的活性水平很低。
一旦用此處公開的方法激活了半胱氨酸天冬氨酸酶9，其活性可以用熒光試驗(yàn)來(lái)定量。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了7-氨基-三氟甲基香豆素(AFC)。當(dāng)AFC從諸如Ac-LEHD-AFC(SEQ ID NO5)的肽上被切割下來(lái)時(shí)，由于它不再被乙酰基(Ac)保護(hù)基團(tuán)抑制，AFC會(huì)發(fā)出熒光。AFC激發(fā)波長(zhǎng)是400nm，其熒光波長(zhǎng)是505nm。當(dāng)肽完整時(shí)，該熒光被肽氨基末端所存在的Ac(乙?；?保護(hù)基團(tuán)所抑制，因?yàn)檫@兩個(gè)基團(tuán)在距離上非常接近。半胱氨酸天冬氨酸酶9在D(天冬氨酸)后進(jìn)行切割，并且釋放出AFC基團(tuán)，之后AFC基團(tuán)就不再被保護(hù)基團(tuán)所抑制了。
除半胱氨酸天冬氨酸酶9之外的其它半胱氨酸天冬氨酸酶的高流量篩選是本領(lǐng)域中已知的。例如，Smith等人篩選出了半胱氨酸天冬氨酸酶8(Expression，preparation and high-throughput screening of Caspase-8discovery of redox-based andsteroid diacid inhibition，Arch Biochem Biophys，2002年3月15日；399(2)195-205，在此全文引入以作參考)，其中篩選過(guò)程如下構(gòu)建半胱氨酸天冬氨酸酶8的大腸桿菌表達(dá)構(gòu)建體，其中His標(biāo)記序列插入半胱氨酸天冬氨酸酶8的5′端第217個(gè)密碼子。該菌株產(chǎn)生大量可溶的、His標(biāo)記的、31kDa非活性單鏈酶前體。該31kDa蛋白被純化到98％純度。羥基磷灰石柱色譜法將酶分為兩種類型，一種具有正確的31,090相對(duì)質(zhì)量，另一種增加了具有178個(gè)質(zhì)量單元(即，31,268)。后者證實(shí)是因?yàn)樵诖竽c桿菌中發(fā)生了His標(biāo)記的修飾，修飾物是一當(dāng)量的葡糖酸-1，5-內(nèi)酯。在合適的緩沖條件下加入二硫蘇糖醇使已純化的蛋白自動(dòng)分解為適當(dāng)?shù)?9kDa和11kDa的酶，從而活化該純化蛋白。這產(chǎn)生了一個(gè)在25攝氏度(℃)時(shí)、相對(duì)于200uM Ac-IETD-pNA(SEQ ID NO2)比活度為4-5單位/mg(U/mg)的酶。使用完全活化的蛋白用于對(duì)半胱氨酸天冬氨酸酶8抑制劑的高流量篩選。初步粗篩表明，在存在二硫蘇糖醇(DTT)還原劑的情況下，半胱氨酸天冬氨酸酶8因?yàn)檠趸Щ?，但是在存在半胱氨酸的情況下，半胱氨酸天冬氨酸酶8則不會(huì)因氧化而失活。對(duì)失活機(jī)理的研究表明，本應(yīng)建立活性氧氧化還原作用循環(huán)的DTT還原了醌類化合物，其還原產(chǎn)物(可能是H(2)O(2))使該酶失活。低微摩爾范圍內(nèi)具有親合力的半胱氨酸天冬氨酸酶8抑制劑和類固醇衍生的二酸在該篩選過(guò)程中被分離。抑制劑的結(jié)構(gòu)活性研究表明，類固醇模板和酸部分兩者都是活性所必需。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠懂得如何應(yīng)用本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有的此類篩選方法進(jìn)行改進(jìn)，使之適應(yīng)以前無(wú)法用有效途徑篩選的半胱氨酸天冬氨酸酶9。
可以理解的是，基本上不影響本發(fā)明各種實(shí)施方案的活性的任何改進(jìn)均包括在此處提供的本發(fā)明的定義范圍之內(nèi)。相應(yīng)地，下面的實(shí)施例是用來(lái)說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1市售半胱氨酸天冬氨酸酶的底物特異性將一組市售半胱氨酸天冬氨酸酶相對(duì)于一系列底物進(jìn)行測(cè)試以評(píng)估每種蛋白酶的特異性。半胱氨酸天冬氨酸酶9的優(yōu)選底物是四肽，賴氨酸-谷氨酸-組氨酸-天冬氨酸(后面所稱的LEHD(SEQ ID NO5))。另外，在中性緩沖鹽溶液中，半胱氨酸天冬氨酸酶9對(duì)于它的優(yōu)選底物(LEHD(SEQ ID NO5)所具有的活性，其數(shù)量級(jí)要低于其它任何半胱氨酸天冬氨酸酶對(duì)于它們的同源四肽的數(shù)量級(jí)。這些結(jié)果表明，在本發(fā)明前，在本領(lǐng)域中試圖篩選半胱氨酸天冬氨酸酶9調(diào)節(jié)劑時(shí)所需要克服的困難。
用于進(jìn)行特異反應(yīng)的對(duì)照緩沖液如下20mM pH7.2的PIPES、1mM的EDTA、0.1％的CHAPS、10％的蔗糖、10mM的DTT。使用100uM的各種N-乙酰-四肽-7-氨基-三氟甲基香豆素底物用于對(duì)不同的市售半胱氨酸天冬氨酸酶的試驗(yàn)。在二甲亞砜中制備2.5mM濃度的儲(chǔ)備底物，隨后用對(duì)照緩沖液稀釋到200uM。
在上文所列的對(duì)照緩沖液中制備300U的酶儲(chǔ)備液。試驗(yàn)進(jìn)行如下使用96孔黑色Dynex測(cè)微熒光計(jì)單板。試驗(yàn)體積總量為100ul。7-氨基-三氟甲基香豆素(AFC)的激發(fā)波長(zhǎng)為400nm，在505nm處對(duì)所發(fā)射的熒光進(jìn)行動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)，持續(xù)1小時(shí)(h)，期間AFC被從肽上切割下來(lái)。
首先添加50ul 200uM的儲(chǔ)備底物(最終試驗(yàn)濃度為100uM)。然后添加對(duì)照緩沖液40ul。外加10ul 300U的半胱氨酸天冬氨酸酶儲(chǔ)備液(最終試驗(yàn)濃度為30U)開始試驗(yàn)。計(jì)算出整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的線性速率(相對(duì)熒光U/s)，并且用圖表表示出每種酶對(duì)于各種底物的線性速率。
實(shí)施例2比較各種半胱氨酸天冬氨酸酶的切割速率與半胱氨酸天冬氨酸酶3對(duì)它的優(yōu)選四肽DEVD(SEQ ID NO1)的切割速率相比，得出各種半胱氨酸天冬氨酸酶對(duì)它們最佳底物的切割相對(duì)速率。按以上實(shí)施例1所描述的過(guò)程來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。該結(jié)果在圖2中顯示。圖2顯示30U酶和它們最佳底物之間的相對(duì)活性。正如前面所示，在中性緩沖鹽溶液中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它任何半胱氨酸天冬氨酸酶。表1顯示產(chǎn)生圖2數(shù)據(jù)結(jié)果的半胱氨酸天冬氨酸酶的濃度以及每種酶的最佳底物。
表1
實(shí)施例3在含有Hofmeister系列的Na鹽的緩沖液中半胱氨酸天冬氨酸酶9切割LEHD(SEQ ID NO5)的相對(duì)速率將所有鹽的溶解于對(duì)照緩沖液中，濃度達(dá)到0.8M。該緩沖液為20mM pH7.2的PIPES、1mM的EDTA、0.1％的CHAPS、10％的蔗糖、10mM的DTT。底物為100uM N-Ac-LEHD-Afc(SEQ ID NO5)，30U半胱氨酸天冬氨酸酶9/孔(0.72uM)。
蛋白分解活性與Hofmeister陰離子水構(gòu)電勢(shì)的升高有關(guān)，其中檸檬酸根＞磷酸根＞硫酸根＞醋酸根。在0.8M檸檬酸鹽中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性比在0.8M溴化物中的相對(duì)活性高10,000倍，溴化物被認(rèn)為是一種不能使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的陰離子(見圖3)。
實(shí)施例4在Hofmeister鹽中半胱氨酸天冬氨酸酶家族成員的活性在不同濃度的硫酸銨中檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸酶1、3、7和9的活性，此外，在不同濃度的磷酸鈉中進(jìn)一步檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。如圖4所示，這些鹽對(duì)半胱氨酸天冬氨酸酶1和7沒有影響，對(duì)半胱氨酸天冬氨酸酶3有極小影響。相反，半胱氨酸天冬氨酸酶9顯示，在從0到1.6M的硫酸鹽濃度范圍內(nèi)，其活性增加了1400倍(圖4A)，在從0到1M的磷酸鹽濃度范圍內(nèi)，增加了2200倍。所使用的緩沖液如實(shí)施例1中所述。在硫酸銨中，用作半胱氨酸天冬氨酸酶9的底物是25uM的Ac-LEHD-Afc(SEQ ID NO5)，用作半胱氨酸天冬氨酸酶3的底物是25uM的Ac-DEVD-Afc(SEQ ID NO1)。在磷酸鈉中，用作半胱氨酸天冬氨酸酶9的底物為100uM的Ac-LEHD-Afc(SEQ ID NO5)。
實(shí)施例5在不同Hofmeister鹽中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性在包括陰離子和陽(yáng)離子的各種Hofmeister鹽中，檢測(cè)了半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。結(jié)果顯示，即使是Hofmeister系列中的較弱的有機(jī)陽(yáng)離子也能增加半胱氨酸天冬氨酸9活性，但是不如陰離子增加得強(qiáng)烈，正如上述以Hofmeister系列為基礎(chǔ)的理論所預(yù)計(jì)的那樣。該結(jié)果在圖5中顯示。所使用的酶為30U(0.72uM)，底物是100uM的Ac-LEHD-AFC(SEQ ID NO5)，緩沖液如實(shí)施例1中所述。
實(shí)施例6用Hofmeister鹽進(jìn)行半胱氨酸天冬氨酸酶9的高流量篩選根據(jù)實(shí)施例3和4所觀測(cè)到的數(shù)據(jù)，建立以下高流量篩選通用方案，即含有0.8M檸檬酸鈉的反應(yīng)緩沖液可以使半胱氨酸天冬氨酸酶9活性獲得令人滿意的增強(qiáng)。該篩選過(guò)程由以下組成將重組半胱氨酸天冬氨酸酶9、它的熒光底物L(fēng)EHD-AFC(SEQ ID NO5)和測(cè)試化合物混合于96孔格式板中的0.8M檸檬酸鹽緩沖液中，緊接著用自動(dòng)化熒光分光計(jì)進(jìn)行酶動(dòng)力研究。所有操作可用機(jī)器人自動(dòng)進(jìn)行。
詳細(xì)方案的一個(gè)實(shí)施例如下將所有試劑在反應(yīng)緩沖液(20mM pH7.2的PIPES、1mM的EDTA、0.1％的CHAPS、10％的蔗糖、0.8M pH7.2的檸檬酸鈉、1mM的半胱氨酸)中稀釋到最終稀釋，稱為緩沖液A。在DMSO中，制備2.5mM的儲(chǔ)備底物L(fēng)EHD-AFC(SEQ ID NO5)(酶系統(tǒng)產(chǎn)物)。在DMSO中，制備10mM的儲(chǔ)備抑制劑肽LEHD-CHO(SEQ ID NO5)(酶系統(tǒng)產(chǎn)物)和測(cè)試化合物。在緩沖液A中制備儲(chǔ)備半胱氨酸天冬氨酸酶9溶液(PharMingen，San Diego，CA)，濃度為300U/100ul。在黑色96孔U型板的100ul體積的單孔中發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)混合物配制如下1.以緩沖液A，按照1∶50的比例將儲(chǔ)備底物稀釋到50uM，這稱為底物混合物，2.以緩沖液A，按照1∶40的比例將儲(chǔ)備化合物稀釋到250uM，該稱為化合物混合物。在單孔中加入50ul底物混合物和40ul化合物混合物準(zhǔn)備反應(yīng)，加入10ul儲(chǔ)備半胱氨酸天冬氨酸酶9開始反應(yīng)。半胱氨酸天冬氨酸酶9、底物和化合物的終濃度分別為10U/100ul、25uM和100uM。在室溫下以熒光單位/秒(U/s)對(duì)蛋白分解活性進(jìn)行動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)，時(shí)間為1小時(shí)以上。每種反應(yīng)一式三份。含有下列組分的孔組成適當(dāng)?shù)膶?duì)照1.單獨(dú)的底物(陰性對(duì)照)；2.底物和酶(陽(yáng)性對(duì)照)；3.底物、酶和肽抑制劑(抑制劑對(duì)照)。這些對(duì)照緊跟在底物、酶和試驗(yàn)化合物之后。任何降低半胱氨酸天冬氨酸酶9活性＝＞50％的化合物記錄為陽(yáng)性采樣。
實(shí)施例7篩選半胱氨酸天冬氨酸酶9變構(gòu)激活作用的抑制劑細(xì)胞中半胱氨酸天冬氨酸酶9的激活依賴于一種由細(xì)胞凋亡物1百萬(wàn)道爾頓蛋白締合物引起的別構(gòu)作用，該1百萬(wàn)道爾頓蛋白締合物含有APAF1、細(xì)胞色素C和半胱氨酸天冬氨酸酶9。將純化的半胱氨酸天冬氨酸酶9引入到含有Hofmeister系列kosmotropic鹽的緩沖液中，以模擬細(xì)胞凋亡物中半胱氨酸天冬氨酸酶9的變構(gòu)激活狀態(tài)。這能夠把那些結(jié)合于半胱氨酸天冬氨酸酶9激活區(qū)域、跟結(jié)合于蛋白酶催化部位的分子有區(qū)別的分子篩選出來(lái)。這通過(guò)初步篩選出那些在0.8M檸檬酸鈉中對(duì)半胱氨酸天冬氨酸酶9特異性切割熒光四肽(LEHD(SEQ ID NO5))有抑制作用的化合物來(lái)完成(見實(shí)施例6)。采集抑制的樣本，抑制原因可能是由于結(jié)合于催化裂解處，或者是由于結(jié)合于遠(yuǎn)處變構(gòu)部位，從而改變了蛋白酶的構(gòu)象使之變?yōu)榉腔钚孕问?。接著通過(guò)同類四肽LEHD(SEQ ID NO5)對(duì)化合物的競(jìng)爭(zhēng)取代進(jìn)行二次篩選，來(lái)區(qū)分該采樣，這些同類四肽僅僅結(jié)合在催化部位。通過(guò)四肽對(duì)抑制性化合物的競(jìng)爭(zhēng)性取代來(lái)解除抑制作用，從而把作用在催化部位的分子從那些作用在變構(gòu)部位的分子中區(qū)分出來(lái)。
簡(jiǎn)單方案的詳細(xì)說(shuō)明如下收集初篩出來(lái)的所有采樣并且用緩沖液A(實(shí)施例6)稀釋到250uM(1∶40)、25uM(1∶400)和2.5uM(1∶4000)。向96孔板的單孔中加入這些化合物混合物，每孔均為40ul，設(shè)置三個(gè)重復(fù)，接著加入10ul酶儲(chǔ)備液，并在室溫下預(yù)溫10分鐘。此后，添加50ul底物混合物開始反應(yīng)(實(shí)施例6)。每個(gè)反應(yīng)物的終濃度為半胱氨酸天冬氨酸酶930U/100ul，底物25uM，和初篩采樣化合物100uM、10uM、1uM。使用光譜熒光計(jì)監(jiān)測(cè)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1小時(shí)以上。在預(yù)先確定的時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)一個(gè)或多個(gè)化合物濃度用非線性動(dòng)力學(xué)檢測(cè)抑制性化合物的競(jìng)爭(zhēng)性取代。從時(shí)間0點(diǎn)起的線性動(dòng)力學(xué)或者從抑制作用起的非釋放動(dòng)力學(xué)分別預(yù)示著異位抑制或者非競(jìng)爭(zhēng)性類型抑制作用。
所有抑制劑-酶關(guān)系的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)都可使用X-射線晶體圖譜或者溶液核磁共振來(lái)最終確定。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)同，很容易對(duì)本發(fā)明過(guò)程進(jìn)行一些變化，如將二硫蘇糖醇(DTT)替換為其它的化合物或用谷胱甘肽代替半胱氨酸。這些變化與本發(fā)明方案本質(zhì)上是等同的，盡管根據(jù)所使用的特定條件不同，它們?cè)谟猛就痉矫胬硭?dāng)然地存在著一些差異。
高流量篩選的典型反應(yīng)條件包括120％緩沖液中50ul底物+100％緩沖液中40ul酶+50mMHEPES中10ul樣品。
pH7.2的酶緩沖液20mM PIPES[先用NaOH把pH調(diào)為7.2]6048mg100mM NaCl 5844mg1mM EDTA(0.5M儲(chǔ)備液) 2000ul0.1％W/V CHAPS 1000mg10％蔗糖w/v100g適量d H2O 1000ml1mM半胱氨酸所制得的緩沖液可以取出等份試樣無(wú)菌過(guò)濾并且4℃儲(chǔ)藏以供日常使用。
pH7.2的底物120％濃縮緩沖液(所列濃度最終不是120％)20mM PIPES[先用NaOH把pH調(diào)為7.2]7258mg100mM NaCl 7013mg1mM EDTA(0.5M儲(chǔ)存液) 2400ul0.1％W/V CHAPS 1200mg10％蔗糖 w/v 120g適量d H2O 1000ml1mM半胱氨酸LEHD-AFC(SEQ ID NO5)(半胱氨酸天冬氨酸酶9底物)25uM終濃度酶系列產(chǎn)品目錄號(hào)#AFC-138在175ul的100％DMSO中溶解3mg LEHD-AFC(SEQ ID NO5)并且在-20℃冷凍。該儲(chǔ)備液濃度是25mM假定在100ul溶液中，需要終濃度為25uM。假定需要濃縮液體積為50ul，則為了達(dá)到終濃度為25mM，濃縮液的濃度就應(yīng)為50uM?，F(xiàn)在儲(chǔ)備液的濃度為25mM(25000uM)，25000uM/50uM＝500。在每板需要大約5ml的情況下。
50uM＝1∶500稀釋液＝40ul 25mM LEHD-AFC(SEQ ID NO5)/20ml緩沖液重組人半胱氨酸天冬氨酸酶9終濃度為5ng/ml陽(yáng)性對(duì)照PharMingen目錄號(hào) #66281T購(gòu)買的儲(chǔ)備酶是每50ul 10ug。本申請(qǐng)中的酶儲(chǔ)備液是200ng/ul本申請(qǐng)中需要CPP32酶的終濃度是5ng/ml。向底物(50ul)中加入濃縮酶液的體積是40ul，因此為了在100ul溶液中達(dá)到終濃度5ng/ml，則需要濃縮酶液的濃度為(5ng/ml)(100ul)＝(x ng/ml)(40ul)。經(jīng)計(jì)算得出儲(chǔ)備酶液的濃度應(yīng)為12.5ng/ml。當(dāng)儲(chǔ)備酶濃度是200ng/ul＝200ug/ml時(shí)。
(200ug/ml)/0.0125ug/ml＝16,000，因此酶以1∶16,000的比例進(jìn)行稀釋。
終濃度 儲(chǔ)備濃度5ng/ml＝12.5ng/ml＝1∶16,000＝2.5ul CPP32/40ml緩沖液抑制劑肽LEHD-CHO(SEQ ID NO5)酶系列目錄號(hào)#AL-010 5mg MW502
-20℃干燥儲(chǔ)藏，有效期為4個(gè)月(在二甲亞砜中-20℃儲(chǔ)藏時(shí)，有效期為幾天)DMSO中10mM儲(chǔ)備液＝5mg/ml DMSO
序列表序列表<110>WyethWade，EDRIS<120>半胱氨酸天冬氨酸酶9的激活及其應(yīng)用<130>AM101006 PCT<150>10/191,254<151>2002-07-08<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>1Asp Glu Val Asp1<210>2<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>2Ile Glu Thr Asp1
<210>3<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>3Leu Glu Glu Asp1<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>4Trp Glu His Asp1<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>5Leu Glu His Asp1<210>6<211>4
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>6Val Glu Ile Asp1<210>7<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>7Tyr Val Ala Asp權(quán)利要求
1.一種鑒定能夠調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬氨酸酶9活性的化合物的方法，包括a)將含有半胱氨酸天冬氨酸酶9或者其酶活性片斷的樣品與測(cè)試化合物和Kosmotropic試劑相接觸；并且b)檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸酶9或者其片斷的活性，其中活性變化表明該化合物能夠調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括抑制半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述活性是用結(jié)合試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述活性是通過(guò)測(cè)定底物的周轉(zhuǎn)來(lái)檢測(cè)的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述底物包含能夠被半胱氨酸天冬氨酸酶9切割的位點(diǎn)，其選自多肽、寡肽和肽。
6.(修改)權(quán)利要求5的方法，其中該底物包含選自LEHD(SEQ ID NO5)、WEHD(SEQ ID NO4)、DEVD(SEQ ID NO1)、ZEVD和YVAD(SEQ ID NO7)的多肽。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述底物是熒光底物。
8.(修改)權(quán)利要求7的方法，其中所述熒光底物包含選自LEHD-AMC(SEQ ID NO5)、WEHD-AMC(SEQ ID NO4)、DEVD-AMC(SEQ IDNO1)、ZEVD-AMC、YVAD-AMC(SEQ ID NO7)、LEHD-AFC(SEQIDNO5)、WEHD-AFC(SEQ ID NO4)、DEVD-AFC(SEQ ID NO1)、ZEVD-AFC和YVAD-AFC(SEQ ID NO7)的標(biāo)記肽。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品包含細(xì)胞裂解液。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品包含具有酶活性的半胱氨酸天冬氨酸酶9片斷。
11.權(quán)利要求1的方法，其中試劑是Hofmeister系列離子。
12.權(quán)利要求1的方法，其中試劑是鈉鹽，該鈉鹽選自硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽和檸檬酸鹽。
13.權(quán)利要求1的方法，其中試劑是銨鹽，該銨鹽選自硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽和檸檬酸鹽。
14.權(quán)利要求12的方法，其中試劑是檸檬酸鹽。
15.權(quán)利要求13的方法，其中試劑是檸檬酸鹽。
16.一種鑒定半胱氨酸天冬氨酸酶9加工過(guò)程的抑制劑或增強(qiáng)劑的方法，包括a)將含有半胱氨酸天冬氨酸酶9前體或其含有切割位點(diǎn)的片斷的樣品，與能夠加工半胱氨酸天冬氨酸酶9前體的蛋白和至少一種候選抑制劑或候選增強(qiáng)劑進(jìn)行接觸；并且b)檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸酶9的大和小亞基的存在，并且由此測(cè)定半胱氨酸天冬氨酸酶9前體所加工的水平，其中加工水平降低表明存在半胱氨酸天冬氨酸酶加工過(guò)程抑制劑，而加工水平增高則表明存在半胱氨酸天冬氨酸酶加工過(guò)程增強(qiáng)劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中該能夠加工半胱氨酸天冬氨酸酶9前體的蛋白是CPP32。
18.權(quán)利要求16的方法，其中該能夠加工半胱氨酸天冬氨酸酶9前體的蛋白是粒酶B。
19.權(quán)利要求16的方法，其中半胱氨酸天冬氨酸酶9的大和小亞基是通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)的。
20.權(quán)利要求16的方法，其中該樣品還包含檸檬酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了以某種方式來(lái)激活半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)9的方法，其中使用該激活方式能夠在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸天冬氨酸酶9的調(diào)節(jié)劑。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK1691955SQ03816063
公開日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2003年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月8日
發(fā)明者W·A·埃德里斯 申請(qǐng)人:惠氏公司