專利名稱：Serrs活性微粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提供SERRS活性聚合物珠子和它們用于檢測靶分子的生產(chǎn)方法，以及檢測靶分子的方法。
現(xiàn)代分子生物學(xué)中最近的發(fā)展突出了對同時原位識別大量生物分析物的需要。有該需求的領(lǐng)域包括DNA檢測、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞和抗體識別，和藥物發(fā)現(xiàn)。
包括微粒和使用不同于SERRS的檢測技術(shù)的相關(guān)技術(shù)包括使用“量子點(quantum dot)”和使用表面等離子體共振的變化，表面等離子體共振可通過結(jié)合金顆粒實現(xiàn)。量子點由硫化/硒化鎘的納米級微粒組成，硫化/硒化鎘是一種熟知的顏料，其可以被修飾從而可以附著生物分析物。該技術(shù)的優(yōu)點是與單個分子相比單個微粒給出強(qiáng)烈發(fā)射，并且這些微粒的性質(zhì)使得通過改變硫化物與硒化物的比例實現(xiàn)寬范圍發(fā)射頻率。
在表面等離子體共振方法中，如在Storhoff，J.J.，Elghanian，R.，Mucic，R.C.，Mirkin，C.A.，Letsinger，R.L.，J.Am.Chem.Soc 1998，120，1959-1964中描述的，使用用特定寡核苷酸在表面修飾的兩種金納米微粒(nanoparticle)。兩種微粒都識別并雜交DNA的特定鏈，其是生物分析物。這使得金微粒緊密接近，并檢測表面等離子體共振的頻率變化。然而，這種技術(shù)不提供所期望的組合多用、穩(wěn)定性和簡單性。
SERRS可獨特地提供選擇性標(biāo)記化學(xué)以開發(fā)所需要的新類型測定法。其具有與熒光相等或更好的靈敏性，但是主要優(yōu)點是用作標(biāo)記的每種SERRS染料給出獨特的指紋，其可以在染料混合物中被識別而不用分離染料混合物?，F(xiàn)在有約50種為SERRS特別設(shè)計的染料，每種染料給出唯一光譜。盡管控制該潛力的有效方法是已知的，但是其開發(fā)受到兩個問題的限制。首先，染料包被的銀微粒和它們標(biāo)記的分析試劑或其他試劑之間有反應(yīng)的可能性，其次，為了得到穩(wěn)定的強(qiáng)SERRS，優(yōu)選保持和復(fù)制銀微粒間特定程度的聚集-該步驟在分析過程中容易被擾亂。
本發(fā)明目的之一是消除和/或減輕至少一種上面提到的缺點。
一般說來，本發(fā)明基于本發(fā)明人的觀察，即SERRS活性染料可被包封在聚合物涂層中，賦予染料的穩(wěn)定性，保護(hù)SERRS活性染料免受環(huán)境的影響并允許一種以上的染料被包封從而可以檢測一種以上的SERRS信號。
從而，第一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定靶分子的SERRS活性珠子，其中SERRS活性珠子含有聚集的金屬膠體和至少一種SERRS活性染料，其被包被在聚合物殼中。
SERRS指表面增強(qiáng)共振拉曼散射(surface enhanced resonanceRaman scattering)。SERRS以前已經(jīng)被描述過，見例如Rodger，C.H.，Smith，W.E.，Dent，G.，Edmonson，M.，J.Chem.Soc.Dalton Trans.，1996，5，791和其中的參考文獻(xiàn)，讀者通過這些參考文獻(xiàn)可得到背景信息。令人驚奇地，在銀表面有一種普遍的熒光淬滅機(jī)制。這意味著幾乎所有染料都給出SERRS，使得能夠使用比通過熒光可能得到的更廣泛和更簡單的衍生化學(xué)(derivatisation chemistry)。此外，SERRS活性微粒提供的染料的特異增強(qiáng)對于允許從一般從含有靶分析物的生物和工業(yè)樣品觀察到的背景信號鑒定染料綽綽有余。這消除了成功地鑒定分析物前許多技術(shù)所需要的復(fù)雜而費時的分離步驟。
應(yīng)該明白此處所用的術(shù)語SERRS不應(yīng)被理解為限制性的并且本發(fā)明也可以應(yīng)用于表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)，但是優(yōu)選SERRS。
令人驚奇地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將SERRS活性金屬納米微粒和SERRS活性染料包封在聚合物涂層中不會妨礙SERRS信號被容易地檢測。此外，可以在某些情況下距離珠子高達(dá)10米地方檢測SERRS信號。
聚合物殼可以從各種單體和交聯(lián)劑形成，這些單體通過鏈增長機(jī)制和逐步增長機(jī)制聚合，這些機(jī)制能夠形成包封聚合膠體和SERRS活性染料的珠子。可以理解一部分聚集的膠體也可以附著和/或包埋在珠子的表面。聚合物殼可以含有不止一層。例如，可以形成在表面上含有一些聚集的膠體的珠子。然后可以將這些珠子返回到珠子生產(chǎn)步驟，加入金屬膠體。這樣產(chǎn)生額外的聚合物蓋或?qū)樱湓谥樽颖砻嫔喜缓薪饘倌z體微粒。不過，在某些情況中，可能希望珠子的表面上有金屬并且這可以使用金屬膠體或者通過金屬涂層或者平版沉積金屬于珠子表面來實現(xiàn)。在它們的表面上含有金屬的珠子的另一個優(yōu)點是SERRS感測也可以在被另外內(nèi)部標(biāo)記的珠子的表面進(jìn)行。
單體和特定單體的優(yōu)選種類包括，但不限于，下面的種類和其衍生物丙烯酸和衍生物(例如，2-溴丙烯酸、丙烯酰氯、N-丙烯酰酪氨酸、N-丙烯酰吡咯烷酮(pyrrolidinone))、丙烯酸酯類(例如，丙烯酸烷基酯、丙烯酸烯丙酯、丙烯酸羥丙酯)、甲基丙烯酸和衍生物(例如，衣康酸、2-(三氟甲基)丙烯酸)、甲基丙烯酸酯(例如，甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、3-硫代丙基甲基丙烯酸鈉鹽)、苯乙烯類(例如，(2，3和4)-氨基苯乙烯、苯乙烯-4-磺酸、3-硝基苯乙烯)、乙烯基類(例如，氯甲酸乙烯基酯、4-乙烯基芐酸、4-乙烯基苯甲醛、乙?；溥?、4-乙烯基苯酚、4-乙烯胺、丙烯醛)、乙烯基吡啶類(例如，(2，3和4)-乙烯基吡啶、3-丁烯1，2-二醇)、硼酸(例如，4-乙烯基硼酸)、磺酸(例如，4-乙烯基磺酸)、金屬螯合劑(例如，苯乙烯亞氨基二乙酸)、丙烯酰胺和衍生物(例如，N-甲基丙烯酰胺)、甲基丙烯酰胺和衍生物(例如，N，N-二甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺)、烯烴(例如，4-戊烯酸、3-氯-1-苯基-1-丙烯)(甲)丙烯酸酐和衍生物(例如，甲基丙烯酸酐)、含硅單體(例如，(3-甲基丙烯氧丙基)三甲氧基硅烷、四甲基二硅氧烷)、多烯(例如，異戊二烯、3-羥基-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯)、疊氮化物(例如，4-疊氮-2，3，5，6-四氟芐酸)、硫醇(例如，烯丙硫醇)。丙烯酸封尾(terminated)的或者其他不飽和尿烷、碳酸鹽和環(huán)氧化物也可以用于本發(fā)明中，如基于硅的單體可以用于本發(fā)明中。使主題聚合化合物具有剛性的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且包括，但不限于，二-、三-、四-和五-官能的丙烯酸鹽(酯)、甲基丙烯酸鹽(酯)、丙烯酰胺、乙烯樹脂、烯丙基樹脂和苯乙烯。
銀、金或銅膠體表面，特別是銀，尤其優(yōu)選用于本發(fā)明中。然而，也可以使用金屬合金。
表面可以是裸露的金屬或者可以在金屬表面上含有金屬氧化層。其可包括有機(jī)涂層如檸檬酸或適當(dāng)?shù)木酆衔?，如聚賴氨酸或多酚的涂層，以增加其吸附容量。其可包括共價連接到聚合物的染料。
膠體微粒優(yōu)選地以受控方式聚集以便是統(tǒng)一和期望的大小和形狀并且盡可能穩(wěn)定以抵抗自聚集。制備這些不聚集的膠體的方法已經(jīng)是公知的。它們包括，例如，用還原劑如檸檬酸鹽還原金屬鹽(例如，硝酸銀)，以形成穩(wěn)定的微晶懸浮液(見P.C.Lee&D.Meisel，J.Phys，Chem.(1982)，86，p.3.391)該“儲備”懸浮液然后在剛使用前聚集。適當(dāng)?shù)木奂瘎┌ㄋ?例如HNO3或抗壞血酸)、聚胺(例如，聚賴氨酸、精胺、亞精胺、1，4-二氨基哌嗪、二亞乙基三胺、氨基乙基-1，3-丙烷二胺、三亞乙基四胺和四亞乙基五胺)和無機(jī)活化離子如Cl-、I-、Na+或Mg2+。為了增加對該過程的控制，所用的所有設(shè)備應(yīng)該被嚴(yán)格清潔，并且試劑應(yīng)該是高級別的。
膠體微?？梢允侨魏未笮?，只要它們產(chǎn)生SERRS效果-通常它們的橫截面為約4-50nm，優(yōu)選25-36nm，盡管這將依賴于金屬的類型。
本發(fā)明的珠子特別小，典型地直徑小于1μm。優(yōu)選地，珠子的橫截面為約10nm到1mm，更優(yōu)選地橫截面約10nm到1μm，但是顯然不小于它們所包封的染料涂布的膠體微粒。
本發(fā)明的珠子可含有許多SERRS活性納米微粒(含有聚集的金屬膠體和吸附的一種或多種SERR活性染料)，它們的每一種可以被相同標(biāo)記或者不同標(biāo)記以便增加多用(multiplexing)能力。即，單個珠子可含有一種或多種SERRS活性染料。如果不止一種染料被摻入珠子中，獲得的SERRS信號將是從各種所用的染料得到的SERRS信號的組合，并且通過改變珠子中染料和/或染料的相對水平，可以形成具有可辨別的SERRS信號的珠子“文庫”。
珠子形成中銀納米微粒與聚合物的作用是減小珠子的大小。這提供了對珠子化學(xué)的額外控制并意味著可以形成寬范圍的大小。從而，一旦聚合物形成，SERRS珠子排列被鎖定在適當(dāng)位置從而所選聚集的狀態(tài)被保存。此外，聚合物保護(hù)銀納米微粒免受環(huán)境的影響。
這些珠子中所用的聚合物還可含有官能團(tuán)(例如，羧酸、羧酸的活性酯、醇、胺、環(huán)氧衍生物、氯甲基苯乙烯基基團(tuán)、乙烯基基團(tuán)、硫醇基團(tuán)、馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺)或者可通過一種或多種連接基團(tuán)進(jìn)一步衍生化，從而靶分子可以反應(yīng)并結(jié)合到微粒的表面。這些基團(tuán)的優(yōu)點是它們可以作為與共價或非共價連接的點以提供特異捕獲或分析。術(shù)語連接基團(tuán)指促進(jìn)一個或多個靶分子和一個或多個SERRS活性微粒間粘附的基團(tuán)。粘附可包括任何類型的鍵，包括但不限于共價、離子、氫鍵、范德華力或機(jī)械結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明提供了制備SERRS活性珠子的方法，包括步驟1)形成聚集的金屬膠體，其含有被其吸收的SERRS活性染料；2)在適當(dāng)?shù)娜軇┲袑⒕奂慕饘倌z體與單體混合；和3)實現(xiàn)單體的聚合從而形成包封聚集的金屬膠體的聚合物珠子。
備選地，可以首先制備珠子，其不含有吸附到其中的SERRS活性染料的聚集膠體。然后可以加熱珠子(例如到80℃)以便使得它們多孔并能夠吸收所述含有被吸收到其中的SERRS活性染料的聚集的膠體。冷卻珠子捕獲珠子中的膠體微粒。通過升高溫度并將珠子浸泡在適當(dāng)?shù)木彌_液中除去染料/膠體。
聚合物珠子還可以進(jìn)一步反應(yīng)以將官能團(tuán)或連接基團(tuán)加到珠子的外表面從而允許分子粘附的該珠子。
適當(dāng)?shù)陌蟹肿拥膶嵗ǎ怂?、蛋白質(zhì)如抗體、醛、硫醇、胺、炸藥、濫用藥物、治療劑、代謝物和環(huán)境污染物。然而，珠子，由于它們的極小的尺寸，還可以僅僅應(yīng)用，例如作為安全標(biāo)記物。因此珠子可通過包含在例如氣溶膠噴霧、顏料、墨水等中而應(yīng)用于表面。珠子通常對于裸眼是不可見的，但是將負(fù)荷特定SERRS活性染料或者染料組合從而可以檢測特定SERRS信號。這尤其可用于防止/最小化假冒。
將適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)如DNA序列附著到聚合物表面進(jìn)行分析/或標(biāo)記步驟。這樣，分析過程和SERRS過程是分開的并且兩者都可優(yōu)化。
本發(fā)明的珠子可以作為標(biāo)記技術(shù)而具有更廣泛的應(yīng)用。它們可以用于例如蛋白質(zhì)和抗體檢測。對于蛋白質(zhì)，最簡單的實例是將一對蛋白質(zhì)之一附著到SERRS活性表面并將熒光標(biāo)記附著到另一個蛋白質(zhì)。當(dāng)這一對復(fù)合時，珠子將顯示出熒光和拉曼散射，當(dāng)該對分開時，將僅僅在珠子上檢測到拉曼光譜。存在一種分光光度計，其可適于同時提供熒光和拉曼散射。
此外，這些珠子可以進(jìn)一步改良以例如在使用時幫助它們的分離。通過將珠子的表面用例如識別靶并且含有生物素基團(tuán)的DNA分子衍生，可以將珠子特異地附著到表面，并且珠子可以在鏈霉抗生物素蛋白表面上除下。備選地/額外地，例如通過在通過加入材料增重的珠子的里面和/或表面上摻入磁性物質(zhì)可以磁化珠子，所加入的材料將使得微粒基于它們的重量分離。然后通過使用小磁體將磁性珠子分離以例如，在分光光度計的光線中濃縮微粒。
適當(dāng)?shù)拇判晕镔|(zhì)可以是摻入到珠子中的磁性納米微粒的形式。這些磁性納米微?？梢园ㄈ魏舞F磁材料納米微粒形式，包括鐵、磁鐵礦、鐵酸鹽和其他金屬如鎳和鈷的化合物。
通過將含有所述磁性納米微粒的溶液與膠體/染料混合物組合并且之后形成SERRS活性珠子而實現(xiàn)磁性納米微粒的摻入。所形成的珠子其后可以官能化，如前述。
對于抗體，可以開發(fā)一種非常簡單的測定法，其消除了競爭性和替換測定法中的某些不確定性，因為用熒光團(tuán)標(biāo)記的抗原可被加到固定在SERRS活性珠子上的抗體。當(dāng)珠子通過離心或磁場從溶液除去時，可以考察具有熒光團(tuán)的那些珠子并且讀出拉曼碼以確定那些標(biāo)記已經(jīng)被替換。備選地，珠子可以用作三明治測定法中的特異標(biāo)記，在該測定法中抗原被捕獲在表面(如板或者磁珠)上的抗體，并且SERRS標(biāo)記的抗體包被的微粒將通過附著到被捕獲的抗原而粘附到該表面上?？乖€可以最初由標(biāo)記微粒上的抗體捕獲。通過將珠子附著到兩種蛋白質(zhì)的每一種或者通過將珠子附著到一種蛋白質(zhì)和將另一種標(biāo)記如熒光團(tuán)附著到另一種蛋白質(zhì)類似的探測蛋白質(zhì)識別。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，分子印記方法可用于通過模板方法(見例如WO 00/41723)將特異分子識別性質(zhì)賦予聚合物殼。該一般性方法原則上可應(yīng)用于將親和性賦予各種分析物的聚合物殼，這些分析物包括臨床、飲食、法醫(yī)和環(huán)境相關(guān)的分析物。
得到SERRS光譜的方法可以是常規(guī)的。然而，可以將下面的方法應(yīng)用于光譜測量典型地，本發(fā)明的方法將使用激光的入射光進(jìn)行，該入射光具有可見光譜的頻率，即380nm-780nm，尤其為400nm-650nm(所選的確切頻率將通常依賴于每種情況所用的染料-可見光譜紅色區(qū)中的頻率總體上傾向于產(chǎn)生更好的表面增強(qiáng)效果)。然而，可以展望以下情形，其中可以使用其他頻率，例如紫外(即200nm-400nm)或近紅外范圍(700nm-1100nm)的頻率。從而可以在約200nm到1100nm進(jìn)行SERRS檢測。
具有適當(dāng)頻率和功率的適當(dāng)光源的選擇和(如果必要)調(diào)節(jié)將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)的，尤其是參考可得到的SERRS文獻(xiàn)之后。為了實現(xiàn)高靈敏檢測，使用SERRS，需要頻率為或者接近染料的吸收最大值的相干光源。如果需要較低靈敏性，光源可以不必是相干的或者高強(qiáng)度，因此可以將燈與單色器光柵或棱鏡組合使用以選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)頻率。
一些設(shè)備適于收集SERRS信號，包括波長選擇鏡、用于散射光檢測的全息光學(xué)元件和纖維-光學(xué)導(dǎo)波管?？梢允褂美珉姾神詈掀骷?CCD)、硅光電二極管或者單個或者串連排列的用于信號的級聯(lián)放大的光電倍增管測量SERRS信號的強(qiáng)度。光子計數(shù)電子儀器可用于靈敏度檢測。檢測器的選擇將很大程度上依賴于進(jìn)行具體測定法所需要的檢測靈敏性。
注意到本發(fā)明的方法可以包括得到橫跨一定波長范圍的完整SERRS光譜，或者選擇峰值并僅僅在該峰的波長掃描(即，拉曼“成像”)。還可以僅僅使用用以除去反射光、Raleigh散射等的濾光器和檢測器如光電二極管檢測所有拉曼散射。
用于得到和/或分析SERRS光譜的儀器將幾乎確定地包括一些形式的數(shù)據(jù)處理器如計算機(jī)。
拉曼信號由一系列不定強(qiáng)度的離散光譜線組成。這些線的頻率和相對強(qiáng)度對于所檢測的SERRS活性染料是特異的，因此拉曼信號是該染料的“指紋”。如果SERRS分析器被選擇性用于檢測染料混合物，那么為了鑒定必須檢測“指紋”光譜。
一旦SERRS信號已經(jīng)被適當(dāng)?shù)臋z測器捕獲，其頻率和強(qiáng)度數(shù)據(jù)通常將被傳遞給計算機(jī)用于分析。指紋拉曼光譜將與參照光譜比較以鑒定所檢測的拉曼活性化合物或者所測量頻率的信號強(qiáng)度將被用于計算所檢測的拉曼活性化合物的量。
總之，描述了用于分析物的多重標(biāo)記的含有SERRS活性微粒的聚合物微粒的開發(fā)。膠體微粒被染料標(biāo)記，預(yù)聚集并被鎖定到聚合物中從而SEERS效果被永久接通并且通過例如將所要檢測的分子共價連接到聚合物表面單獨地進(jìn)行分析事件。主要優(yōu)點是這些微粒給出非常強(qiáng)烈、穩(wěn)定的SERRS。對于特定微粒的簡單、靈敏的鑒定，懸浮液中有巨大的多重標(biāo)記能力，其是任何其他技術(shù)不可匹敵的，并且SERRS活性納米聚集物受到保護(hù)而不受環(huán)境的影響。反過來，這使得可以原位鑒定和定量復(fù)雜混合物中超低濃度的特異靶分析物如DNA序列或肽。
另一方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中靶分子的方法，該方法包括步驟a)提供根據(jù)本發(fā)明的一種或幾種SERRS活性珠子，其中該珠子已經(jīng)被產(chǎn)生從而具有特異的可識別的SERRS信號并且珠子的表面已經(jīng)被修飾從而使能夠結(jié)合所述靶分子的部分附著其上；b)將所述一種或幾種珠子與樣品接觸以允許樣品中的所述任何靶分子結(jié)合所述一種或幾種珠子；和c)通過檢測從結(jié)合所述靶分子的一種或幾種珠子得到的可特異識別的SERRS信號來檢測所述靶分子。
典型地，靶分子可以是抗體或抗原，在這種情況下SERRS活性珠被修飾以分別具有粘附到珠子表面的相應(yīng)抗原或抗體?？梢允褂贸Ｒ?guī)三明治測定法，其中第一抗體附著到表面，用于結(jié)合樣品中可能存在的的特異蛋白。珠子可以被衍生以包括第二抗體，其也對所述蛋白質(zhì)特異。如果該蛋白質(zhì)存在于樣品中，那么其有效地成為兩種抗體間的三明治并且這可通過在附著到第二抗體的珠子上進(jìn)行的SERRS檢測。也可以檢測天然結(jié)合的其他分子如受體/配體復(fù)合體，所述復(fù)合體之一固定在珠子表面上。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法用于檢測樣品中特定核酸序列。在該情況下，珠子可被修飾以具有能夠特異雜交含有特定核酸序列的分子，該分子附著到珠子的表面。能夠特異雜交的該分子可以有足夠長度而可以發(fā)生簡單雜交和隨后的檢測。備選地，能夠特異雜交靶核酸分子的分子可以是相對短的分子，比如少于50個核苷酸，例如，長度少于25個核苷酸，該分子被設(shè)計作為引物以允許與所述核酸分子的雜交和從該核酸分子的鏈延伸。這樣，附著到珠子表面的分子將通常通過其5’末端粘附從而3’末端能夠結(jié)合并引發(fā)鏈延伸。典型地，也可以利用另一種引物，其被設(shè)計以在距離結(jié)合珠子的引物例如100個核苷酸到2000個核苷酸的地方結(jié)合靶核酸分子。這可允許使用適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶和必需的dNTPs(脫氧核苷酸三磷酸)產(chǎn)生雙鏈分子，其摻入靶核酸序列，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
實際上可以進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(例如PCR)以便有效增加將要檢測的靶核酸的量。另一引物也可以通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄐ揎椧园軌蚪Y(jié)合特定表面的部分。例如，該引物在其5’末端可含有生物素分子以便使任何擴(kuò)增的產(chǎn)物都能夠結(jié)合涂有鏈霉抗生物素蛋白的表面。如此產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，其可通過擴(kuò)增產(chǎn)物的一端結(jié)合表面，而游離末端摻入可容易被檢測的SERRS活性珠。
由于能夠產(chǎn)生具有特異不同SERRS信號的SERRS活性珠，可以使用許多不同標(biāo)記的珠子進(jìn)行本領(lǐng)域中所謂的多重反應(yīng)，這些珠子每一種都具有不同的固定結(jié)合部分，例如寡核苷酸。對于寡核苷酸，可以設(shè)計每種寡核苷酸以鑒定例如核酸分子中的特定多態(tài)性，該設(shè)計可通過在3’末端插入特定序列來實現(xiàn)，當(dāng)3’末端發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合時該特定序列將僅允許發(fā)生鏈延伸。即，當(dāng)3’末端的核苷酸不與靶雜交時，其不能發(fā)生鏈延伸。通過使用被設(shè)計以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的另一種引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可能容易地檢測靶核酸分子中存在哪種多態(tài)性。
如果進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，染料，如Sybr Green可用作最初指示劑，指示已經(jīng)得到擴(kuò)增產(chǎn)物。該產(chǎn)物之后可通過進(jìn)行SERRS檢測鑒定?？墒褂迷搩?yōu)選步驟從而僅僅被鑒定為產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)之后被通過SERRS檢測進(jìn)行分析。
總之，本發(fā)明的關(guān)鍵優(yōu)點是1)靈敏性每個珠子是一個單獨的敏感元件(sensing unit)，能夠容納數(shù)百萬SERRS活性染料標(biāo)記物。整個可利用的銀表面可緊密地用染料標(biāo)記物充滿。分子內(nèi)淬滅機(jī)制防止具有例如熒光的兩個標(biāo)記物緊密接近，但是該機(jī)制不適用于SERRS。從而，對于一個珠子，該信號非常強(qiáng)并且可容易且快速地在低濃度檢測到。
2)穩(wěn)定性聚集過程在珠子的形成過程中進(jìn)行，該聚集過程對于從SERRS得到最大信號是必需的。從而，其是預(yù)置的并且受到聚合物的保護(hù)而不受環(huán)境影響，使得信號持續(xù)、恒定并且不受任何生物學(xué)事件的影響。此外，用于發(fā)現(xiàn)特定分析物的傳感物質(zhì)共價附著到聚合物表面。
3)多重檢測可以生產(chǎn)珠子使得其含有許多“寫”的編碼，這可通過在許多膠體懸浮液的每一種中使用不同染料混合物并通過將來自一種以上的懸浮液的聚集膠體和染料加到特定珠子而實現(xiàn)。然后SERRS峰的尖銳性質(zhì)使得可以識別沒有任何分離的珠子混合物中的每種珠子類型。由于可以使用強(qiáng)烈粘附到SERRS活性表面的所有生色團(tuán)，比用熒光更簡單且更廣泛的染料化學(xué)是可能的。例如，來自染料如偶氮的SERRS信號的模式對生色團(tuán)周圍的替換非常敏感，使得比用熒光產(chǎn)生多個標(biāo)記容易地多。這極大地增加了使用相對簡單的染料的編碼潛能。
此外，因為珠子含有金屬，所以為珠子提供了顯著的質(zhì)量。該重量也可用于使用這些珠子的檢測和/或分離技術(shù)。例如，如在圖2中識別的DNA條帶可以被捕獲在石英微量天平的鏈霉抗生物素蛋白包被的板的表面上并檢測質(zhì)量變化。珠子的沉重性質(zhì)將使得該質(zhì)量改變易于檢測，與DNA條帶的常規(guī)捕獲相比增加了石英天平的靈敏性。檢測重量改變后，可以通過重量變化檢測導(dǎo)致該變化的特定微粒。
本發(fā)明現(xiàn)在將通過實施例和參考下面的圖進(jìn)一步描述，這些圖顯示了

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的SERRS活性珠子的示意性表示。
圖2示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的SERRS活性珠的潛在用途。
圖3顯示了實施例2中對照珠子的拉曼光譜和空白珠子的SERRS。
圖4顯示了染料包被的珠子樣品中染料的SERRS。
圖5顯示了染料包被的珠子的SEM圖像，測量條長度為10μm，所示珠子的平均直徑約為0.8μm。
圖6顯示了ABT DMOPA、8HQPK和兩種染料的1∶10比例混合的SERRS光譜。
圖7顯示了8HQPK、苯并三唑羅丹明B和兩種染料的3∶1混合物的SERRS光譜。
圖8顯示了使用擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)本發(fā)明的SERRS活性珠如何用于鑒定特定核酸序列的示意性表示。
實施例部分實施例1膠體制備根據(jù)Lee和Meisel(Rodger，C.，Smith，W.E.，Dent，G.，Edmonson，M.，J.Chem.Soc，Dalton Trans.，1996，5，716；Munro，C.H.，Smith，W.E.，Garner，M.，Clarkson，J.和White，P.C.，Languir，1995，11，3712)的方法制備檸檬酸還原的膠體。所有玻璃器具使用王水(3∶1 HCl∶HNO3)徹底清潔然后用水然后用蒸餾水徹底沖洗。硝酸銀(90mg)溶于40℃蒸餾水(500ml)中。然后使用本生燈將溶液快速加熱到98℃的溫度。此時加入10ml 1％檸檬酸三鈉溶液。然后小心控制溫度，保持溫度恒定在98℃90分鐘。恒溫期間后，將膠體懸浮液冷卻并測量其紫外吸收光譜。最大紫外吸收在403-410nm范圍內(nèi)的膠體用于下面詳述的實驗中。
通過將12管含有12ml檸檬酸還原的膠體(λmax為406nm)以3000r.p.m離心20分鐘制備用于聚合中的銀沉淀。除去每管的上清液并將剩余的銀濃縮到1個管中。然后使用超聲破碎將濃縮的沉淀重懸于乙腈中，然后將其在3000r.p.m離心40分鐘。再次除去上清液，使用超聲破碎將所得沉淀重懸于乙腈(5ml)中并將懸浮液摻入到聚合中。
用和上面完全相同的方法制備負(fù)荷染料的樣品，但是在含有檸檬酸鹽還原的膠體的12支管中加入150μl ABTDMOPA[4(5′-偶氮苯并三唑基)-3，5-二甲氧基苯胺]的1×10-6M溶液。
珠子合成下面的對照聚合物不含有膠體而空白聚合物含有膠體但無染料。負(fù)荷染料的聚合物含有膠體和染料。
在3個單獨的50ml厚壁玻璃管中進(jìn)行聚合(對照、空白和負(fù)荷染料的)。對照聚合物的反應(yīng)容器裝有乙腈(25ml)、二乙烯基苯80(0.5g)和偶氮二異丁腈(AIBN)(0.005g)，空白聚合物的反應(yīng)容器裝有乙腈(20ml)、溶于乙腈的膠體的無染料懸浮液(5ml)、二乙烯基苯80(0.5g)和AIBN(0.005g)，負(fù)荷染料的聚合物的反應(yīng)容器裝有乙腈(20ml)、溶于乙腈的負(fù)荷染料的膠體的懸浮液(5ml)、二乙烯基苯80(0.5g)和AIBN(0.005g)。搖動反應(yīng)容器以溶解單體和AIBN，在冰水浴上冷卻10分鐘然后用無氧氮氣噴射以除去溶解的氧。然后將管包封并通過在低側(cè)面滾筒(low-profile roller)上以60℃加熱24小時實現(xiàn)聚合。聚合后，通過在薄膜濾器(0.2μm)上過濾分離聚合物珠子，用幾體積新鮮乙腈洗滌然后40℃真空干燥。
珠子修飾將25ml 0.1M MES緩沖液(pH4.5)中的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)(500mg)加到聚合物珠子并在25℃孵育2小時以形成胺表面活性物質(zhì)。圖1顯示了如上描述制備的珠子(1)的簡圖。珠子(1)由包封聚集膠體的聚合物殼(3)和SERRS活性染料珠子(5)形成。聚合物殼(3)的表面已經(jīng)被官能化從而具有氨基表面活性物質(zhì)(7)，其能夠與DNA反應(yīng)。將25ml磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中的3μg oligo/g珠子加入活化的珠子并在25℃過夜反應(yīng)。通過離心從溶液除去珠子并重懸于磷酸緩沖液(pH7.2)中備用。
在如上描述制備的珠子(1)的用途的一個簡單實例(見圖2)中，寡核苷酸(12)被設(shè)計以識別DNA的特異序列。當(dāng)靶序列(14)存在于DNA提取物中時，其將與寡核苷酸(12)雜交從而被珠子(10)捕獲。含有例如生物素基團(tuán)(18)的第二寡核苷酸(16)也被雜交并且該系統(tǒng)被帶到鏈霉抗生物素蛋白的板或珠子(20)上。該測定法特異識別靶序列(14)，其與微粒(10)和生物素化的序列(16)都雜交。備選地，如果磁性微粒被加到珠子，其和雜交的靶可被帶到適當(dāng)?shù)谋砻嫔隙鵁o生物素步驟。在兩種方法中，可使用各種方法除去未摻入的探針。在第一種方法中，如果額外的生物素被加到鏈霉抗生物素蛋白板，沒有標(biāo)記物提供，因此，其是不必嚴(yán)格除去的干擾物。然而，用標(biāo)記物產(chǎn)生的復(fù)合物的大小使得容易分離并且在任一方法中未摻入探針的除去可使用流式細(xì)胞系統(tǒng)或者短層析步驟實現(xiàn)。備選地，使用磁性包被的鏈霉抗生物素蛋白珠子從溶液吸引復(fù)合物可以實現(xiàn)磁性分離。
實施例2然后使用12個離心管制備另一組銀沉淀。每管空白珠子含有9.6ml膠體和2.4ml水。每管染料包被的珠子含有2.4ml染料(1×10-6M)和9.6ml膠體。
所有管在加入染料后放置過夜并離心40分鐘。沉淀重懸于10ml乙腈中并再次離心40分鐘(無超聲破碎)。
沉淀然后重懸于另一5ml乙腈中并超聲破碎2分鐘后加入聚合物反應(yīng)混合物中。
然后將0.5g二乙苯和0.005g AIBN溶于總體積25ml的乙腈(包括5ml膠體)中。樣品用N2脫氣10分鐘。然后將樣品置于37℃滾柱(roller)上，加熱到60℃并聚合24小時。
然后樣品經(jīng)0.2mm孔大小的濾紙過濾，用乙腈洗滌并在真空烘箱中干燥。
然后將少量珠子(即對照、空白和含有染料的珠子)重懸于約1ml乙腈中，超聲破碎，滴在顯微鏡載波片上干燥。圖3和4中顯示的光譜記錄在系統(tǒng)100 Renishaw微探針拉曼分光計上，20倍物鏡，100％功率約8mW)ls，la。
圖3顯示了被鑒定為(a)的對照珠子的拉曼和被鑒定為(b)的空白珠子的SERRS。
圖4顯示了含有染料的珠子樣品中染料的SERRS。
SEM圖像然后使用超聲破碎將少量珠子懸浮于PVA溶液中。然后將珠子干燥到小玻璃盤中，在真空中干燥并保存后分析。圖5中的SEM圖像然后記錄在Cameca SX100電子微探針微分析器上，使用5kV電子束。大珠子為約1.5μm，小珠子為約0.5μm。
PVA中的染料混合物圖6和7是PVA穩(wěn)定感光底層中的兩種混合物的兩個樣品的拉曼光譜。
圖6顯示了(a)ABT DMOPA(GM19)、(b)8HQPK和兩種染料的1∶10比例混合物的SERRS光譜。在Renishaw顯微鏡系統(tǒng)，514，5s，1a，100％功率(約3mW)，X5物鏡上記錄光譜。
圖6中，兩種染料(a)ABT DMOPA和(b)8HQPK的每一種的主峰可以在混合物(c)中的光譜中清楚地鑒定。標(biāo)記的峰(i-v)、(vii)和(viii)都來自8HQPK染料(即1-[4-(-羥基-喹啉-5-基偶氮)-苯基]-乙酮)，而標(biāo)記峰(ix)來自ABT DMOPA染料?；旌衔锕庾V(c)中約1360cm-1處的峰是在該位置來自兩種染料的峰的組合。該峰的強(qiáng)度相對于光譜中的其他峰增加了。
圖7顯示了(a)8HQPK、(b)苯并三唑羅丹明B和(c)兩種染料的3∶1混合物的SERRS光譜。其在Renishaw顯微鏡系統(tǒng)上，以514nm，5s，3a，100％功率(約3mW)，5倍物鏡收集。圖7中，兩種染料(a)8HQPK和(b)BTRB的每一種的主峰可在混合物(c)的光譜中清楚的鑒定。標(biāo)記峰(i-viii)都來自8HQPK染料(即苯并三唑羅丹明B-9-{4-[苯并三唑-5-基氨磺酰]-2-甲基-苯基}-6-二乙基氨基-呫噸-3-亞基)-二乙基-銨)，而標(biāo)記峰(ix)來自BTRB染料。
實施例3-磁珠的用途珠子制備將50ml磁性納米微粒溶液加入50ml用如實施例1中的染料混合物處理的銀膠體中。然后離心納米微?；旌衔锊⑷鐚嵤├?中進(jìn)行珠子處理。然后如實施例1用寡核苷酸官能化珠子。
方法(a)該方法結(jié)合使用微粒的磁性性質(zhì)的分離和純化。
使用意欲用于實施例2中的測定法的PCR產(chǎn)物樣品，其中生物素帶和一個珠子已經(jīng)雜交到靶DNA，將電磁鐵的小平頭電極放入含有PCR產(chǎn)物的微量滴定板的孔中。接通磁鐵并收集所有磁珠。然后從溶液除去磁鐵，浸入第二孔中并將其洗滌然后進(jìn)入第三個孔中，該孔具有如實施例2中鏈霉抗生物素蛋白包被的區(qū)域。在第三孔切斷電磁鐵并釋放珠子。讓珠子在2分鐘內(nèi)附著到鏈霉抗生物素蛋白區(qū)，之后再次接通磁鐵。這除去了所有未附著的珠子。
這樣，所有未摻入的生物素引物保留在第一孔中，所有未附著到靶帶的珠子在第一步中除去，未附著到靶帶的生物素標(biāo)記的DNA在第二步中除去。如實施例2研究第二步后保留在孔底的珠子，SERRS碼用于鑒定珠子和靶DNA。
方法(b)該方法闡明了使用僅含有磁性微粒而無標(biāo)記的銀微粒的衍生珠子的選擇性優(yōu)點。也可以使用商業(yè)化衍生珠子。
如實施例1所描述的制備一批珠子，但是不加入銀納米微粒并使用識別特異靶DNA的特異寡核苷酸序列衍生化。還摻入PCR混合物中的是具有摻入的珠子中的銀標(biāo)記和珠子和無磁性微粒。它們含有另一寡核苷酸序列，其被設(shè)計用以識別相同靶DNA的不同區(qū)。PCR后，將電磁鐵加入孔中并接通。僅具有磁珠的樣品被吸引到電極。然后在拉曼微探針下研究電極。僅觀察到含有被標(biāo)記珠子的電極。該方法是有效的，因為其將所有珠子濃縮于顯微鏡研究體積中。這增加了靈敏性。該方法是可靠且具有選擇性的，因為其包括雙雜交事件。
方法(c)該方法闡明了拉曼和熒光與磁珠的組合使用。
使用來自實施例4的PCR混合物，其中Sybr green被加入DNA，將電磁鐵滴入PCR混合物。接通電磁鐵并除去磁珠。直接在拉曼顯微鏡下研究混合物。選擇頻率使得熒光和拉曼信號在CCD監(jiān)測器的分開部分中檢測。該方法是有效的，因為通過在小區(qū)域收集珠子用于即刻檢測所產(chǎn)生的靈敏性。來自Sybr green的熒光甚至在常規(guī)PCR儀上也檢測到雜交從而可以從一個陣列選擇單個孔用于快速一步鑒定分析。
實施例4 SERRS珠子用于DNA檢測在該實施例中，SERRS珠子可用作檢測特異DNA序列的標(biāo)記。該形式基于PCR測定法以闡明SERRS珠子的高靈敏性和關(guān)于多用增加的能力。最初熒光屏可指示已經(jīng)產(chǎn)生反應(yīng)的管或孔。這些“熱”孔可通過SERRS檢查并確定已經(jīng)雜交的一個或多個實際的DNA序列。
可根據(jù)實施例1制備修飾的珠子，其中珠子的外表面已經(jīng)被修飾以允許寡核苷酸的固定，該寡核苷酸的3’末端被指向遠(yuǎn)離珠子的外表面。這可通過例如在寡核苷酸合成過程中將基團(tuán)附著到其5’末端并修飾珠子的表面從而5’末端的基團(tuán)附著到珠子的表面而容易地實現(xiàn)。
圖8a顯示了這種珠子50的示意性表示，該珠子由于珠子50內(nèi)發(fā)現(xiàn)的染料標(biāo)記的膠體微粒52而具有特異SERRS特征，許多鑒定的寡核苷酸54附著到珠子50的表面。
靶的PCR擴(kuò)增PCR用于從樣品擴(kuò)增特定種類的雙鏈DNA。這通過使用用于基因分型(genetyping)的等位基因特異寡核苷酸的PCR現(xiàn)有的特異性。最初，可選擇引物序列檢測特定疾病中發(fā)現(xiàn)的最通常突變的突變狀態(tài)。為了分析樣品DNA的基因型，兩種前導(dǎo)引物可以與一種反向引物一起用于多重擴(kuò)增阻抗突變系統(tǒng)(ARMS)中。正向引物通過5’-末端接頭固定于不同SERRS珠子上，這些珠子作為特異引物的標(biāo)記。反向引物的5’末端用生物素標(biāo)記。隨著PCR的進(jìn)行，產(chǎn)物將在SERRS珠子上積累，生物素?fù)饺脒h(yuǎn)離SERRS珠子的擴(kuò)增子的末端。備選地，當(dāng)在SERRS珠子上進(jìn)行PCR存在問題時，可以進(jìn)行靶的常規(guī)PCR，然后導(dǎo)入SERRS珠子。
對于例如5重反應(yīng)，5種不同的引物可以固定于五種不同SERRS珠子上并且用與樣品混合的所有珠子進(jìn)行PCR反應(yīng)。
圖8b示意性顯示了標(biāo)記的產(chǎn)物60，其在PCR反應(yīng)后得到。使用附著到SERRS珠子的引物(見圖8a)和生物素化引物62的擴(kuò)增導(dǎo)致生物素化產(chǎn)物的產(chǎn)生，其也摻入SERRS活性珠。
PCR的初始篩選[任選的]可通過由于雙鏈DNA量的增加例如Sybr Green(64，見圖8c)熒光的增加測量PCR的成功。使用PCR結(jié)束時的解離曲線將證實PCR產(chǎn)物而不是引物二聚體的存在。從而，如果存在擴(kuò)增，那么熒光將顯示該擴(kuò)增。可能使用QPCR儀器測量PCR過程中熒光的增加，然后PCR后也可使用常規(guī)板讀出器快速分析試管。認(rèn)為合適時可以使用無模板對照物的對照管和具有無義DNA的珠子。
SERRS珠子在表面的固定一旦熒光增加的管已經(jīng)被任選地鑒定為含有PCR產(chǎn)物，其內(nèi)含物可以點到鏈霉抗生物素蛋白包被的載波片(66，見圖8d)上。這將具有SERRS珠子的生物素化PCR產(chǎn)物固定到載波片的表面。生物素化引物也將被固定(但是將不具有特異地可檢測的SERRS信號)但是任何其他可以在一系列洗滌中洗掉。(這將包括添入的Sybr Green，其可以發(fā)熒光并干擾SERRS信號)。從從而，一系列SERRS珠子現(xiàn)在將被固定在載波片的表面等待通過SERRS研究。
固定化珠子的SERRS分析從被固定的SERRS珠子可以得到SERRS光譜以鑒定已經(jīng)被用于產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的實際的引物序列。SERRS鑒定沒有分離的混合物組分的能力可以用于可能通過眼從多重，例如五重的特定管中鑒定SERRS珠子，盡管也可以使用統(tǒng)計學(xué)為非專業(yè)人員證實這一點，目的是增加復(fù)合程度。
通常，全部設(shè)置將消耗不超過標(biāo)準(zhǔn)QPCR實驗的時間，即如果使用解離曲線為約150分鐘，或者如果在標(biāo)準(zhǔn)PCR循環(huán)儀中使用較少循環(huán)為約60分鐘。PCR設(shè)置可以以這種方式安排珠子上引物的有效濃度和終體積將進(jìn)入總分析表(spread sheet)并且所有其他值自動顯示。這使得設(shè)置PCR非常簡單并減少了計算中的系統(tǒng)誤差。PCR完成后，可能需要將條帶管的內(nèi)含物吸移到微滴定板用于平板讀數(shù)或者與機(jī)器人處理協(xié)調(diào)。備選地，任選直接吸移到鏈霉抗生物素蛋白板上。
可能使用與擴(kuò)增相反的線性延伸將SERRS珠子摻入一個長雙鏈DNA中。熒光檢測不可能檢測該部分但是SERRS珠子將在酶促延伸時報道是否有一個DNA或者上百萬。
實施例5 SERRS珠子DNA結(jié)合測定法，利用生物素-鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合親和性在這里給出了SERRS珠子結(jié)合測定法的一個實例。在該實例中分析了突變的膀胱纖維癥基因的110個堿基長的序列。
SERRS珠子的活性表面(用偶氮染料標(biāo)記)用短寡核苷酸探針衍生化，該探針與突變膀胱纖維狀基因上發(fā)現(xiàn)的DNA序列互補(bǔ)。突變CF鏈與互補(bǔ)探針合成處相反的序列末端的生物素基團(tuán)連接。SERRS-DNA探針被雜交到CF-生物素序列并固定在鏈霉抗生物素蛋白板上。
方法使用前面概述的方法用二乙烯基苯80和甲基丙烯酸合成SERRS珠子。珠子的表面被許多羧酸基團(tuán)覆蓋。這些活性酸性基團(tuán)用于將寡核苷酸和其他分子附著到珠子的表面。
DNA序列使用快速DNA合成儀合成兩種序列。
序列A含有胺接頭X。
序列A
-X-GTATCTATATTCATCATAGGAAACACCATT序列B含有生物素，B序列B-B-GACTTCACTTCTAATGATGATTATGGGAGA(X＝氨基環(huán)己烷(aminohexamethylene)并被加到5’-末端以產(chǎn)生寡核苷酸，該寡核苷酸在固相合成和純化后在碳鏈末端具有伯胺基團(tuán))。
純化序列A(400μl，0.6mg/ml)并使用0.1M PBS(750μl)緩沖液中的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC，37mg)和N-羥基琥珀酰亞胺(24mg)和乙腈(100μl)將序列A偶聯(lián)到SERRS活性珠(70mg)。
將序列B(0.5μM)與其CF互補(bǔ)引物和反向引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)中。產(chǎn)物被純化并加入到具有另外的序列B的oligo衍生的珠子并加入到95℃10分鐘。
之后將100μl分散的溶液點到鏈霉抗生物素蛋白板上并在濕室中靜置3小時。DNA衍生的珠子用作對照。將板用1％SDS溶液、水和乙腈洗滌。干燥珠子并通過拉曼分光光度計(photospectroscopy)檢查。
權(quán)利要求
1.用于鑒定靶分子的SERRS活性珠，其中SERRS活性珠含有包封在聚合物殼中的聚集的金屬膠體和至少一種SERRS活性染料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的SERRS活性珠，其中聚合物殼由各種單體和交聯(lián)劑形成，包括通過鏈增長機(jī)制和逐步增長機(jī)制聚合的單體，這些機(jī)制能夠形成包封聚集的膠體和SERRS活性染料的珠子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的SERRS活性珠，其中所述一種或多種聚合物殼由下面的種類及其衍生物中的任一種形成丙烯酸和衍生物(例如，2-溴丙烯酸、丙烯酰氯、N-丙烯酰酪氨酸、N-丙烯酰吡咯烷酮)、丙烯酸酯類(例如，丙烯酸烷基酯、丙烯酸烯丙酯、丙烯酸羥丙酯)、甲基丙烯酸和衍生物(例如，衣康酸、2-(三氟甲基)丙烯酸)、甲基丙烯酸酯(例如，甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、3-硫代丙基甲基丙烯酸鈉鹽)、苯乙烯類(例如，(2，3和4)-氨基苯乙烯、苯乙烯-4-磺酸、3-硝基苯乙烯)、乙烯基類(例如，氯甲酸乙烯基酯、4-乙烯基芐酸、4-乙烯基苯甲醛、乙?；溥?、4-乙烯基苯酚、4-乙烯胺、丙烯醛)、乙烯基吡啶類(例如，(2，3和4)-乙烯基吡啶、3-丁烯1，2-二醇)、硼酸(例如，4-乙烯基硼酸)、磺酸(例如，4-乙烯基磺酸)、金屬螯合劑(例如，苯乙烯亞氨基二乙酸)、丙烯酰胺和衍生物(例如，N-甲基丙烯酰胺)、甲基丙烯酰胺和衍生物(例如，N，N-二甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺)、烯烴(例如，4-戊烯酸、3-氯-1-苯基-1-丙烯)(甲)丙烯酸酐和衍生物(例如，甲基丙烯酸酐)、含硅單體(例如，(3-甲基丙烯氧丙基)三甲氧基硅烷、四甲基二硅氧烷)、多烯(例如，異戊二烯、3-羥基-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯)、疊氮化物(例如，4-疊氮-2，3，5，6-四氟芐酸)、硫醇(例如，烯丙硫醇)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項的SERRS活性珠，其中所述一種或多種聚合物殼由丙烯酸封尾的或者其他不飽和尿烷、碳酸鹽和環(huán)氧化物或基于硅的單體形成。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中所述一種或多種聚合物殼含有使主題聚合化合物具有剛性的交聯(lián)劑如二-、三-、四-和五-官能的丙烯酸鹽(酯)、甲基丙烯酸鹽(酯)、丙烯酰胺、乙烯樹脂、烯丙基樹脂和苯乙烯。
6.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中聚集的金屬膠體含有銀、金、銅或金屬合金膠體表面。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中聚集的金屬膠體含有裸露的金屬或者金屬表面上的金屬氧化層。
8.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中聚集的金屬膠體含有用于增加其吸收能力的檸檬酸鹽的或者聚賴氨酸或多酚聚合物的有機(jī)涂層。
9.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中聚集的金屬膠體為一種或幾種聚集的金屬膠體微粒的形式。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的SERRS活性珠，其中聚集的金屬膠體微粒具有約4-50nm，或者約25-36nm的橫截面。
11.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中SERRS活性珠具有小于1μm的橫截面。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中SERRS活性珠含有許多SERRS活性納米微粒，所述SERRS活性納米微粒含有聚集的金屬膠體和吸附到其上的一種或幾種SERRS活性染料，其中每種所述納米微粒產(chǎn)生一種基本相同的SERRS信號，或者被提供不同染料或染料組合以便產(chǎn)生可區(qū)分的SERRS信號。
13.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中最外面的聚合物殼還含有選自下面任一種的官能團(tuán)羧酸、羧酸的活性酯、醇、胺、環(huán)氧衍生物、氯甲基苯乙烯基基團(tuán)、乙烯基基團(tuán)、硫醇基團(tuán)、馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺，或者還被一種或幾種連接基團(tuán)衍生，從而靶分子可以反應(yīng)并結(jié)合到珠子的表面，或者從而一部分可以反應(yīng)并結(jié)合到珠子的表面，該部分能夠結(jié)合所述靶分子。
14.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中珠子用作蛋白質(zhì)和抗體檢測的標(biāo)記技術(shù)。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其中分子印記方法被用于通過模板方法將特異分子識別性能賦予聚合物殼。
16.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠，其還含有磁性微粒或者包封在聚合物珠子內(nèi)的微粒，用于使SERRS活性珠具有磁性。
17.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的SERRS活性珠的文庫，其中每種珠子含有可辨別的SERRS信號，可辨別的SERRS信號通過改變SERRS活性染料和/或每種珠子內(nèi)染料的相對水平得到。
18.制備SERRS活性珠子的方法，其包括以下步驟1)形成聚集的金屬膠體，其含有被其吸收的SERRS活性染料；2)在適當(dāng)?shù)娜軇┲袑⒕奂慕饘倌z體與單體混合；和3)實現(xiàn)單體的聚合從而形成包封聚集的金屬膠體的聚合物珠子。
19.制備SERRS活性珠子的方法，其包括以下步驟a)在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑峁﹩误w；b)實現(xiàn)單體的聚合從而形成聚合物珠子；c)將聚集的金屬膠體加到含有聚合物珠子的溶液中；和d)加熱溶液從而導(dǎo)致聚集的金屬膠體被吸收并被聚合物珠子包封。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中聚合物珠子進(jìn)一步反應(yīng)以將官能團(tuán)或者連接基團(tuán)加到珠子的外表面從而允許分子附著到該珠子。
21.檢測樣品中靶分子的方法，該方法包括以下步驟a)提供根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項的一種或幾種SERRS活性珠子，其中該珠子已經(jīng)被產(chǎn)生從而具有特異的可識別的SERRS信號并且珠子的表面已經(jīng)被修飾從而使能夠結(jié)合所述靶分子的部分附著其上；b)將所述一種或幾種珠子與樣品接觸以允許樣品中的所述任何靶分子結(jié)合所述一種或幾種珠子；和c)通過檢測從結(jié)合所述靶分子的一種或幾種珠子得到的可特異識別的SERRS信號來檢測所述靶分子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中靶分子是抗體、抗原、受體、配體或核酸分子，如DNA分子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中能夠結(jié)合所述靶分子的部分分別是抗原、抗體、配體、受體或互補(bǔ)核酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求21-23中任一項的方法，其中一種或多種珠子是磁性的，從而在步驟b)后珠子可以容易地分開和/或者濃縮。
25.檢測樣品中特異核酸的方法，其包括以下步驟a)提供根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項的一種或幾種SERRS活性珠子，其中該珠子已經(jīng)被產(chǎn)生從而具有特異可識別的SERRS信號并且珠子的表面已經(jīng)被修飾從而使能夠結(jié)合所述靶分子的部分附著其上，其中該部分是能夠與靶核酸特異雜交的寡核苷酸；b)將所述一種或幾種珠子與樣品接觸以允許樣品中的任何所述靶分子結(jié)合所述一種或幾種珠子；和c)將所述靶結(jié)合的珠子與進(jìn)一步標(biāo)記的核酸接觸并且所述進(jìn)一步標(biāo)記的核酸與珠子特異性雜交；d)任選地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)并進(jìn)一步任選地檢測所述擴(kuò)增反應(yīng)是否成功；e)將所述標(biāo)記的雜交的核酸結(jié)合的珠子與能夠結(jié)合所述標(biāo)記部分的表面接觸；和f)通過檢測從已經(jīng)有效結(jié)合所述底物的所述珠子得到的特異可鑒定SERRS信號，檢測所述靶分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其還包括一個或多個洗滌步驟以從步驟b、c和/或e中去除未結(jié)合的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供SERRS活性聚合物珠子和它們用于檢測靶分子的生產(chǎn)方法，以及檢測靶分子的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1668764SQ03816607
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者W·E·史密斯, D·格雷厄姆, P·科馬克, A·麥凱布 申請人:斯特拉斯克萊德大學(xué)