專利名稱：包括減壓/增壓的使用的電穿孔方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種使用包括減壓或增壓的電穿孔將所需核酸轉移到細胞或組織(包括植物組織)中，從而產生核酸-轉移物質(包括轉化體)的方法。
背景技術：
人類的種族主要依賴于供他們生存的主要谷類食品，如小麥、大麥、稻、玉米、大豆等。為推進食品生產以與全世界人口的增長相對應，必須開發(fā)具有比傳統(tǒng)農作物產量更高的農作物。重組DNA技術已經作為培育具有更高產量的變種的方法而用于研制轉化農作物。
蔬菜，例如，大白菜、番茄、黃瓜等是豐富我們的食物以及營養(yǎng)必需的農作物。然而，這些蔬菜易感染各種疾病或受到病原體損害。如果重組基因工程技術可用于產生對疾病或病原體損害的抗性，則可獲得穩(wěn)定的產量。為了滿足這種需要，已經研究出了用于分離有效基因以及使用基因轉化的方法。
為了轉化植物，通常有兩種方法直接的基因轉移方法，其中將基因直接轉移到植物中；以及間接的基因轉移方法，其中將基因間接轉移到植物中。
迄今為止，已經廣泛使用利用農桿菌(Agrobacterium)的間接基因轉移方法。例如，培養(yǎng)稻的成熟種子，三周后，用農桿菌感染所得愈傷組織(Hiei等人，Plant Journal，6271-282，1994)；或在發(fā)芽后第4-5天用農桿菌感染種子，從而快速獲得轉化體(Tanaka等人，日本專利號3141084)。
直接的基因轉移方法的例子包括基因槍方法(Christou P.等人，Bio/Technology，9957-962，1991)、聚乙二醇方法(Datta S.K.等人，Bio/Technology，8736-740，1990)、電穿孔方法(Shimamoto K.等人，Nature，338274-276，1989)等。這些技術用于生產轉化體。電穿孔是一種基因轉移方法，其中將細胞(例如，植物細胞)放在含有所需基因(例如，DNA)的溶液中，并通過電刺激將基因引入到細胞中。
與間接的基因轉移方法相比，直接的基因轉移方法具有無需組織培養(yǎng)和農桿菌制備等的優(yōu)點。然而，基因槍方法，其是一種直接的基因轉移方法，具有轉化體(例如，轉化的全株植物)從轉化組織的再生效率普遍較低的缺點(Hagio，JARQ，32(4)239-247，1998)。電穿孔方法具有可用的細胞及組織有限的缺點。因此，直接的基因轉移方法具有有限的應用。
傳統(tǒng)的電穿孔方法只能用于先天沒有細胞壁的細胞以及細胞壁已經人工除去的細胞(例如，原生質體)。相反，相信電穿孔不能用于具有細胞壁的細胞(例如，植物(包括休眠組織，如種子等))。事實上，還沒有關于通過電穿孔將核酸轉移到種子中的方法。因此，為了使用傳統(tǒng)的電穿孔方法獲得核酸轉移物質(特別是，全株轉化植物)，在核酸已經轉移到組織，如原生質體等中后，不可避免地需要原生質體培養(yǎng)、組織培養(yǎng)(例如，為了再分化)或其它步驟。因此，電穿孔并非必然是一種容易的方法，而且需要成本、時間、和勞動。
為了將基因轉移到小麥中，已經使用了未成熟的胚(Weeks J.T.等人，Plant.Physiol.，1021077-1084，1993)。然而，植物需要在田間或溫室生長，以便獲得未成熟的胚。在田間，需要花費6-7個月。在溫室，需要花費3-5個月。
因此，還沒有可行的、簡單且快速的核酸轉移方法(特別是，轉化方法)，其中無需農桿菌的培養(yǎng)和制備等，且很容易制備向其中轉移核酸的樣品，且核酸-轉移物質(特別是，轉化體)很容易在核酸轉移之后獲得。
考慮到上述還沒有建立簡單且快速的核酸轉移方法(特別是，植物轉化方法)的情況，本發(fā)明目的是提供一種簡單且快速的核酸轉移方法(特別是，一種植物轉化方法)，它具有下列特征(i)無需農桿菌等的培養(yǎng)和制備；(ii)向其中轉移核酸的樣品的制備較為簡單；且(iii)核酸轉移-物質很容易在核酸轉移后獲得。
本發(fā)明簡單且快速的方法可迅速獲得大量核酸轉移物質(特別是，全株轉化植物)。因此，本發(fā)明可用于需要植物轉化體的工業(yè)領域以及使用植物很容易進行大規(guī)模處理和大規(guī)模分析的研究和開發(fā)中。此外，本發(fā)明可引起研究的顯著進步，潛在導致創(chuàng)新重組體的開發(fā)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的上述目的是通過用于將核酸轉移到細胞中的方法實現的，該方法包括下列步驟a)將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
在其中一個實施方案中，本發(fā)明的方法是通過下列步驟進行的1)將植物組織保持在不同于大氣壓的壓力下；并2)使用電穿孔將所需基因轉移到植物中。
具體而言，在這里本發(fā)明人已經試驗過各種用于處理細胞，從而使核酸很容易被引入到細胞中的方法，從而在植物中實現成功的電穿孔。通常，相信(i)應用農桿菌的核酸轉移方法，其中將植物放在真空中，對于除擬南芥屬(Arabidopsis)之外的植物無效；且(ii)無需將植物保持在真空中，以便使用農桿菌轉移核酸(Bent，PlantPhysiology，1241540-1547，2000年12月)。相反，如下面實施例所示，本發(fā)明人發(fā)現通過電穿孔進行植物核酸轉移是通過增加將植物組織保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟而優(yōu)化的。本發(fā)明的方法可應用于除植物細胞之外的任何其它細胞，其中通過電穿孔進行的核酸轉移的效率明顯提高。
本發(fā)明的方法非常簡單。此外，本發(fā)明的方法無需培養(yǎng)，而這種培養(yǎng)通常是核酸轉移后所必需的。因此，本發(fā)明具有核酸轉化物質沒有體細胞克隆變異的優(yōu)點。已知體細胞克隆變異不可避免地出現在常規(guī)核酸轉移后所需的培養(yǎng)中。正如本領域那些技術人員通常所了解的那樣，體細胞克隆變異是指在培養(yǎng)物中出現的基因突變，即培養(yǎng)物中核酸序列中出現的任何序列改變(例如，置換、缺失、插入、易位、倒位、重復等)，所述核酸序列是指最初由向其中轉移核酸的細胞所具有的核酸序列和/或轉移的核酸序列。無意的體細胞克隆變異常常為核酸轉移物質帶來不希望得到的特性。因此，因為所需的核酸轉移物質可在不發(fā)生體細胞克隆變異的條件下獲得，所以本發(fā)明的方法十分有用。
本發(fā)明進一步提供允許植物物種轉化的優(yōu)點，這些植物物種不能或很難通過傳統(tǒng)的基因轉移技術轉化。具體而言，Norin 61(小麥變種)，其用于下列實施例中，在日本是小麥的其中一種主要變種。不能通過組織培養(yǎng)使這種變種再生為全株植物，即，很難通過傳統(tǒng)技術獲得轉化體(Machii等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，5367-74，1998)。此外，例如，對于實施例4中所用的大豆，還沒有很好地建立再分化技術。很難獲得大豆的轉化體。然而，如下面實施例所述，本發(fā)明可轉化通常不能或很難被制成轉化體的植物物種。本發(fā)明的方法可用于通常不能或很難被制成轉化體的任何其它物種。
因此，本發(fā)明提供下列內容。
1.一種用于將核酸轉移到細胞中的方法，包括下列步驟a)細胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
2.根據項1所述的方法，其中將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是使細胞經過減壓的步驟。
3.根據項1所述的方法，其中將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是使細胞經過增壓的步驟。
4.根據項1所述的方法，其中將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是在將細胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下的步驟之前進行的。
5.根據項2所述的方法，其中減壓步驟是在比大氣壓低約0.096MPa的壓力下進行的。
6.根據項1所述的方法，其中步驟b)包括在至少兩個方向上向細胞及核酸施加高壓脈沖。
7.根據項1所述的方法，其中所述細胞是植物細胞。
8.根據項7所述的方法，其中所述植物細胞是休眠植物組織的細胞。
9.根據項8所述的方法，其中所述休眠植物組織是種子。
10.根據項7所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。
11.根據項10所述的方法，其中所述單子葉植物是禾本科(Gramineae)植物。
12.根據項11所述的方法，其中所述禾本科植物是小麥(Triticumaestivum L.)。
13.根據項11所述的方法，其中所述禾本科植物是稻(Oryza sativaL.)。
14.根據項11所述的方法，其中所述禾本科植物是玉米(Zea mays L.)。
15.根據項7所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
16.根據項15所述的方法，其中所述雙子葉植物是十字花科(Cruciferae)植物。
17.根據項16所述的方法，其中所述十字花科植物是大白菜(Brassicarapa L.)。
18.根據項16所述的方法，其中所述十字花科植物是油菜(Brassicanapus L.)。
19.根據項15所述的方法，其中所述雙子葉植物是豆科(Leguminosae)植物。
20.根據項19所述的方法，其中所述豆科植物是大豆(Glycine maxMerr)。
21.根據項15所述的方法，其中所述雙子葉植物是茄科(Solanaceae)植物。
22.根據項21所述的方法，其中所述茄科植物是番茄(Lycopersicumesculentum Mill)。
23.根據項15所述的方法，其中所述雙子葉植物是葫蘆科(Cucurbitaceae)植物。
24.根據項23所述的方法，其中所述葫蘆科植物是日本香瓜(Cucumismelo L.)。
25.根據項15所述的方法，其中所述雙子葉植物是旋花科(Convolvulaceae)植物。
26.根據項25所述的方法，其中所述旋花科植物是牽牛花(Pharbitis nilChoisy)。
27.一種用于產生植物的方法，其中核酸被轉移到植物細胞中，包括下列步驟a)細胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
28.根據項27所述的方法，還包括使細胞分化、生長、和/或增殖的步驟。
29.根據項27或28所述的方法，其中步驟a)包括將含有細胞的種子保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟，且步驟b)包括將含有細胞及核酸的種子置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下的步驟。
30.根據項29所述的方法，其中所述種子是單子葉植物的種子。
31.根據項30所述的方法，其中所述單子葉植物的種子是禾本科的種子。
32.根據項31所述的方法，其中所述禾本科的種子是小麥(Triticumaestivum L.)的種子。
33.根據項31所述的方法，其中所述禾本科的種子是稻(Oryza sativaL.)的種子。
34.根據項31所述的方法，其中所述禾本科的種子是玉米(Zea maysL.)的種子。
35.根據項29所述的方法，其中所述種子是雙子葉植物的種子。
36.根據項35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是十字花科的種子。
37.根據項36所述的方法，其中所述十字花科的種子是大白菜(Brassicarapa L.)的種子。
38.根據項36所述的方法，其中所述十字花科的種子是油菜(Brassicanapas L.)種子。
39.根據項35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是豆科的種子。
40.根據項39所述的方法，其中所述豆科的種子是大豆(Glycine maxMerr)的種子。
41.根據項35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是茄科的種子。
42.根據項41所述的方法，其中所述茄科的種子是番茄(Lycopersicumesculentum Mill)的種子。
43.根據項35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是葫蘆科的種子。
44.根據項43所述的方法，其中所述葫蘆科的種子是日本香瓜(Cucumismelo L.)的種子。
45.根據項35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是旋花科的種子。
46.根據項45所述的方法，其中所述旋花科的種子是牽?；?Pharbitisnil Choisy)的種子。
47.一種通過項27-46任何一項所述的方法生產的植物。
48.根據項47所述的植物，其不含體細胞克隆變異。
49.一種用于將核酸轉移到細胞中的裝置，包括a)用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分；和b)用于電穿孔的部分。
50.根據項49所述的裝置，其中用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分具有維持壓力低于大氣壓的能力。
51.根據項49所述的裝置，其中所述細胞是植物細胞。
52.根據項49所述的方法，其中b)的電穿孔部分包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間距離的長度足以容納植物種子。
53.根據項52所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離為至少約5mm。
54.根據項52所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離長于約1cm。
55.根據項52所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
56.根據項49所述的裝置，其中b)的電穿孔部分包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可被容納于第一和第二電極之間。
57.根據項56所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
58.一種用于將核酸轉移到細胞中，并將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的電穿孔裝置，該裝置包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間距離的長度足以容納植物種子。
59.根據項58所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離為至少約5mm。
60.根據項58所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離長于約1cm。
61.根據項58所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
62.一種用于將核酸轉移到細胞中，并將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的電穿孔裝置，該裝置包括
起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可被容納于第一和第二電極之間。
63.根據項62所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
64.一種能抵抗不同于大氣壓的壓力并具有足以容納植物種子大小的電穿孔室。
65.根據項64所述的電穿孔室，其中與電穿孔室內壁上的至少3個點相切的最大內切圓直徑為至少約5mm。
66.根據項64所述的電穿孔室，其中與電穿孔室內壁上的至少3個點相切的最大內切圓直徑長于約1cm。
67.根據項64所述的電穿孔室，其中該室具有四邊形的橫截面，且室的內部尺寸是約1cm×2cm×2cm。
68.根據項64所述的電穿孔室，其中該室具有圓形的橫截面，且室的內部尺寸是約1cm×4cm。
69.一種能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的電穿孔室，其中該室的大小可被改變，從而使植物種子可被容納于室中。
70.一種用于自動進行電穿孔的裝置，包括a)用于放置含核酸及細胞的混合物的容器；b)用于在容器a)中放置核酸的部分；c)用于在容器a)中放置細胞的部分；d)用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的容器，該容器能夠抵抗不同于大氣壓的壓力；e)用于在容器d)中放置細胞的部分；f)用于將容器d)的內部區(qū)域維持在不同于大氣壓的壓力下的部分；g)用于向含核酸及細胞的混合物施加高壓脈沖的容器；h)用于在容器g)中放置含核酸及細胞的混合物的部分；i)用于向容器g)中的含核酸及細胞的混合物施加高壓脈沖的部分；和j)用于自動運行部分b)、c)、e)、f)、h)、和i)的部分，其中部分b)和部分c)彼此相同或不同；部分e)和部分h)彼此相同或不同；且容器a)、容器d)、和容器g)彼此相同或不同。
附圖簡述

圖1是pWI-H5K的限制性酶切圖。
圖2表示在下列條件下經過電穿孔的小麥種子(Norin 61)的結果脈沖寬度為50μsec、脈沖次數為50、壓力是低于大氣壓0.096MPa(減壓)、施加的電壓是100V(A)、50V(B)、20V(C)、或0V(D)。
圖3表示1經過減壓和電穿孔的小麥種子；2只經過電穿孔的小麥種子；和3對照小麥種子的GUS染色結果。
圖4表示用2000ppm遺傳霉素篩選轉化小麥種子的結果，其中A具有質粒的樣品，B沒有質粒的對照。
圖5表示轉化小麥植株DNA的PCR分析結果。第1-8泳道轉化小麥植物的DNA樣品；M標記；P陽性對照，N陰性對照。右面的箭頭表示目標產物的位置(約0.75kb)。
圖6表示轉化小麥植株DNA的DNA印跡分析結果。第1-8泳道轉化小麥植株的DNA樣品；P1陽性對照，P2陽性對照，N陰性對照。右面從上面開始的箭頭表示約4.0kb、約2.0kb、約1.5kb、和約1.0kb。
圖7表示具有種子生育力的小麥轉化體的照片。照片中的植株與在圖6的DNA印跡分析中呈陽性的第1和2泳道的植株相對應。
圖8表示轉化小麥植株的下一代個體(T1)DNA的PCR分析結果。第1-6泳道轉化小麥植株的下一代個體(T1)的DNA樣品，M標記，P陽性對照，N陰性對照。右面的箭頭表示目標產物的位置(約0.75kb)。
圖9表示在下列條件下經過電穿孔的稻種子(日本產)的結果脈沖寬度為50μsec、脈沖次數為99、壓力是低于大氣壓0.096MPa(減壓)、施加的電壓是50V(A)、20V(B)、10V(C)、或0V(D)。
圖10表示1經過減壓和電穿孔的日本產稻種子；2只經過電穿孔的日本產稻種子；和3對照的日本產稻種子的GUS染色結果。
圖11表示用200ppm遺傳霉素篩選轉化的日本產稻種子的結果，其中A具有質粒的樣品，B沒有質粒的對照。
圖12表示轉化的日本產稻植株DNA的DNA印跡分析結果。第1-6泳道轉化的日本產稻植株的DNA樣品，P陽性對照(相當于約5個拷貝)，N陰性對照。右面的箭頭表示目標產物的位置(約0.8kb)。
圖13表示具有種子生育力的日本產稻轉化體的照片。照片中的植株與在圖12的DNA印跡分析中呈陽性的第5泳道植株相對應。
圖14表示轉化的日本產稻植株下一代個體(T1)的DNA的PCR分析結果。第1-8泳道轉化的日本產稻植株下一代個體(T1)的DNA樣品，M標記，P陽性對照，N陰性對照。右面的箭頭表示目標產物的位置(約0.75kb)。
圖15表示A經過減壓和電穿孔的印度產稻種子；B只經過電穿孔的印度產稻種子；和C對照的印度產稻種子的GUS染色結果。
圖16表示1經過減壓和電穿孔的大豆種子；和2對照大豆種子的GUS染色結果。
圖17表示A經過減壓和電穿孔的大白菜種子；和B對照大白菜種子的GUS染色結果。
圖18表示A經過減壓和電穿孔的番茄種子；B只經過電穿孔的番茄種子；和C對照番茄種子的GUS染色結果。
圖19表示A經過減壓和電穿孔的牽?；ǚN子；和B對照牽牛花種子的GUS染色結果。
圖20表示經過電穿孔的小麥種子的結果，其中電壓是100V，脈沖寬度是50μsec，脈沖次數是50，且A低于大氣壓0.096MPa壓力，B低于大氣壓0.06MPa壓力，C沒有減壓，或D對照(沒有DNA和減壓)。
圖21表示經過電穿孔的日本產稻種子的結果，其中電壓是50V，脈沖寬度是50μsec，脈沖次數是99，A低于大氣壓0.096MPa壓力，B低于大氣壓0.06MPa壓力，C沒有減壓，或D對照(沒有DNA和減壓)。
圖22表示本發(fā)明電穿孔裝置的實施方案。
圖23表示本發(fā)明電穿孔裝置的另一實施方案。
圖24表示本發(fā)明電穿孔裝置的另一實施方案。
圖25表示本發(fā)明直角平行六面體形電穿孔室的實施方案。
圖26表示本發(fā)明微管形電穿孔室的實施方案。
圖27表示與本發(fā)明舉例性電穿孔室內壁上的至少3個點相切的最大內切圓的例子。
圖28表示本發(fā)明自動電穿孔裝置的圖解說明。
圖29表示本發(fā)明自動電穿孔裝置的實施方案。
進行本發(fā)明的最佳方式以下，將參考附圖通過用于說明的實施例描述本發(fā)明。
應當理解，在本說明書中，除非另有說明，單數形式的冠詞包括它們復數的概念。還應當理解，除非另有說明，這里所用的術語具有本領域通常所用的定義。
本公開內容中所用的下列術語具有下面歸于它們的含義。
這里所用術語“核酸轉移”是指以人工方式將核酸轉移到細胞或組織中。已經通過“核酸轉移”向其中轉移了核酸的細胞或組織的表型可以改變或不改變。這里所用術語“基因轉移”是指以人工方式將含有基因的核酸轉移到細胞或組織中，該基團是決定遺傳性狀的因子。已經通過“基因轉移”向其中轉移了含基因的核酸的細胞或組織的表型可以改變或不改變。這里所用術語“轉化”是指通過將含基因的核酸引入到細胞或組織中而改變細胞或組織的表型。值得注意的是，在特定情況下，術語“核酸轉移”、“基因轉移”、和“轉化”可在這里互換使用。在本說明書的上下文中，本領域那些技術人員可很清楚理解這些術語各自的含義。
術語“核酸轉移物質”、“基因轉移物質”、和“轉化體”是指從分別經過核酸轉移、基因轉移、以及轉化的細胞或組織產生的生物的全部或一部分。應注意的是，在特定情況下，術語“核酸轉移物質”、“基因轉移物質”、和“轉化體”可在這里互換使用。在本說明書的上下文中，本領域那些技術人員可很清楚地理解這些術語各自的含義。核酸轉移物質、基因轉移物質、和轉化體可以是任何生物，包括，例如，從原核生物細胞及真核生物細胞(例如，植物細胞等)或組織產生的生物。轉化體還被稱作轉化細胞、轉化組織、轉化宿主等，這取決于所轉化的是什么。這里所用術語“轉化體”包括所有這些形式，而且可指特定環(huán)境中的特定形式。它們可用于術語“核酸轉移物質”及“基因轉移物質”。
術語“細胞”是指來源于任何生物(例如，任何類型的多細胞生物(例如，動物(例如，脊椎動物、無脊椎動物)、植物(例如，單子葉植物、雙子葉植物等))、單細胞生物(例如，細菌等))的細胞。優(yōu)選，本發(fā)明所用的細胞是具有細胞壁的細胞，特別優(yōu)選植物細胞。
這里所用術語“組織”是指多細胞生物中，具有基本相同功能和/或形式的細胞聚集體。組織通常是相同來源的細胞聚集體，或如果細胞具有基本相同的功能和/或形式，可以是不同來源的細胞聚集體。通常，組織是器官的一部分。在植物中，組織可以各種方式被粗略分類，例如，可被分為分生組織和永久組織，這取決于成分細胞的發(fā)育狀態(tài)；或被分為簡單組織和復雜組織，這取決于成分細胞的類型。動物組織被分為上皮組織、結締組織、肌肉組織、神經組織等，這取決于形式、功能或遺傳基礎。
這里所用術語“組織”是指來源于任何生物(例如，任何類型的多細胞生物(例如，動物(例如，脊椎動物、無脊椎動物)、植物(例如，單子葉植物、雙子葉植物等)、真菌等)的任何組織。優(yōu)選，本發(fā)明所用的組織是具有細胞壁的組織，特別優(yōu)選植物組織。植物組織的例子包括，但不限于，休眠組織、種質、生長點、和花芽。休眠組織的優(yōu)選例子包括，但不限于，成熟種子、未成熟種子、冬芽、和塊莖。特別優(yōu)選的休眠組織是成熟種子，但不限于此。
這里所用術語“器官”是指一種結構，其是個體生物的特殊部分，其中個體生物的某些功能就是在此局部進行的，而且其是形態(tài)學獨立的。通常，在多細胞生物(例如，動物、植物、真菌)中，器官是由若干組織以特定的空間排列構成的，組織是由許多細胞構成的。植物器官的例子包括，但不限于，根、葉、莖、花等。動物器官的例子包括，但不限于，皮膚、心臟、血管、角膜、視網膜、腎、肝、胰、腸、胎盤、臍帶、肺、腦、神經、末肢等。
這里所用術語“篩選”是指通過抗生素-抗性試驗和/或基因工程技術(例如，PCR、DNA印跡、RNA印跡等)將核酸轉移物質與非-核酸轉移物質區(qū)別開來。具體而言，術語“篩選”是指在有藥物存在的條件下，通過培養(yǎng)和/或使這些生物生長而將具有引入的藥物抗性基因的轉化生物與未轉化生物區(qū)別開來的步驟，其中轉化生物對所述藥物具有抗性。
這里所用術語“電穿孔”是指將核酸(例如，含基因的核酸)轉移到細胞(例如，植物細胞)中的技術，其中將DC高壓脈沖施加于細胞上，從而將孔打開，使核酸進入細胞。進行電穿孔的條件可由本領域那些技術人員根據所用的物種、組織、細胞等適當選擇。進行電穿孔所用的一般電壓是10V/cm-200V/cm、優(yōu)選20V/cm-150V/cm、更優(yōu)選30V/cm-120V/cm、甚至更優(yōu)選40V/cm-100V/cm、最優(yōu)選50V/cm-100V/cm，但不限于這些值。進行電穿孔的一般脈沖寬度是lμsec-90μsec、優(yōu)選10μsec-90μsec、更優(yōu)選20μsec-80μsec、更優(yōu)選30μsec-80μsec、甚至更優(yōu)選40μsec-70μsec、最優(yōu)選50μsec-60μsec，但不限于這些值。進行電穿孔的一般脈沖次數是1-200、優(yōu)選10-150、更優(yōu)選20-120、甚至更優(yōu)選30-110、最優(yōu)選40-100、但不限于這些值。
這里所用短語“將細胞(或組織)及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下”是指將細胞(或組織)及核酸置于具有引發(fā)電穿孔(即，核酸向細胞(或組織)中轉移)所需的所有條件(電壓、脈沖寬度、脈沖次數、細胞(或組織)與核酸之間的位置關系、電穿孔的運行時間等)的狀態(tài)下。進行電穿孔所需的條件對于本領域那些技術人員而言是很清楚的，可由本領域那些技術人員適當確定。
在本發(fā)明中，電穿孔優(yōu)選是通過以至少兩個方向，向細胞(或組織)及核酸施加高壓脈沖而進行的。這項技術可通過向細胞(或組織)及核酸施加一段預定時間的高壓脈沖，之后交換陽極和陰極的位置，并再次施加高壓脈沖而最簡單地實現。這項技術還可使用排列于電穿孔室中不同位置上的電極對實現。通過以至少兩個方向施加高壓脈沖，核酸的轉移效率可顯著提高。例如，本發(fā)明人發(fā)現當以兩個方向將高壓脈沖施加于十字花科植物的種子及核酸上時，與僅以一個方向施加高壓脈沖比，核酸向種子中轉移的效率提高了約2倍或更多。
本發(fā)明進行電穿孔時所用的電穿孔室可具有任何尺寸，只要該室可容納經過核酸轉移的細胞和/或組織。特別優(yōu)選電穿孔室的大小可容納植物組織(例如，植物種子)。本發(fā)明的電穿孔室可以是任何形狀。這種形狀的例子包括，但不限于，立方體、直角平行六面體、圓柱體、管形(例如，體具有均勻或不均勻的橫截面，且該體可以或不向底部漸細)等。為使本發(fā)明的電穿孔室容納植物種子，與本發(fā)明室內壁上至少3個點相切的最大內切圓直徑可以是，例如至少約5mm或更多、優(yōu)選至少約6mm或更多、優(yōu)選至少約7mm或更多、優(yōu)選至少約8mm或更多、優(yōu)選至少約9mm或更多、優(yōu)選至少約1cm或更多、優(yōu)選至少約2cm或更多、優(yōu)選至少約3cm或更多、優(yōu)選至少約4cm或更多、優(yōu)選至少約5cm或更多、優(yōu)選至少約6cm或更多、優(yōu)選至少約7cm或更多、優(yōu)選至少約8cm或更多、優(yōu)選至少約9cm或更多、優(yōu)選至少約10cm或更多、優(yōu)選至少約15cm或更多、優(yōu)選至少約20cm或更多。與本發(fā)明電穿孔室內壁上至少3個點相切的最大內切圓直徑的上限可以是，但不限于，例如，約25cm、約20cm、約15cm、約10cm、約9cm、約8cm、約7cm、約6cm、約5cm、約4cm、約3cm、約2cm、約1cm、約9mm、約8mm、約7mm、或約6mm。長度可以是這些確切描述值間的中間值(如1.5cm等)。這里所用術語“內切圓”是指與室容器內壁上至少3個任意點相切的任何圓。這里，室中提供的電極也被看作是容器的一部分。因此，室容器的內壁包括電極的表面。通常，電極的厚度是可以忽略不計(例如，0.1mm等)。
按照本發(fā)明一個方面，本發(fā)明的電穿孔室具有四邊形的橫截面和內部尺寸，1cm×2cm×2cm(例如，長×寬×高)。按照本發(fā)明另一方面，電穿孔具有圓形的橫截面和內部尺寸，1cm×4cm(例如，直徑×高)。由電極占據的區(qū)不包括在室的尺寸中。通常，電極的厚度可以忽略不計。這里所用術語“橫截面”是指與室的縱向垂直的橫截面。這里所用術語“內部尺寸”是指室容器內壁上兩個任意點之間的距離。當室具有四邊形的橫截面時，內部尺寸是指橫截面的長或寬，或高。當室具有圓形的橫截面時，內部尺寸是指橫截面的直徑，或高。
在其中一個實施方案中，本發(fā)明的電穿孔室可被改變成使該室可容納植物種子的大小。室的大小可通過任何方式改變。例如，室的大小可利用螺釘等來調節(jié)至適宜的尺寸。
本發(fā)明的電穿孔室可由任何材料制成。電穿孔室的材料可以是形成固體的任何材料。這種材料的例子包括，但不限于，玻璃、硅石、硅、陶瓷、二氧化硅、塑料、金屬(包括合金)、天然及合成的聚合物(例如，聚苯乙烯、纖維素、脫乙酰殼聚糖、葡聚糖、和尼龍等)等。該室可由不同材料制成的層構成。例如，可使用無機絕緣材料，如玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍寶石、鎂橄欖石、氧化硅、碳化硅、氮化硅等?？墒褂糜袡C材料，如聚酰胺、聚碳酸酯、(變性)聚苯醚、聚對苯二甲酸丁二醇酯、增強的聚對苯二甲酸乙二酯、聚醚砜、聚苯硫醚、多芳基化合物、聚醚酰亞胺、聚醚醚酮、聚酰亞胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、不飽和聚酯、氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏1，1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸類樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、酚樹脂、尿素樹脂、環(huán)氧樹脂、三聚氰胺樹脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、有機硅樹脂、聚砜等。此外，優(yōu)選，本發(fā)明的電穿孔室能夠抵抗不同于大氣壓的壓力(例如，甚至在將不同于大氣壓的壓力施加于該室時，該室不會破碎、斷裂、或變形)。特別優(yōu)選，該室能夠抵抗減壓。特別優(yōu)選，本發(fā)明的電穿孔室是由聚丙烯、有機硅樹脂、和玻璃制成的，且提供有鉑或不銹鋼制成的電極。
優(yōu)選，本發(fā)明的電穿孔室提供有溫度控制部分。例如，溫度控制部分可使用傳感器檢測溫度的變化，并可人工或自動控制室的溫度。溫度控制部分通常是用于降低室溫度的冷卻部分。冷卻部分可以是利用，例如，冰、冷卻凝膠等的任何裝置。
本發(fā)明的電穿孔室提供有至少一對(兩個)電極。因此，在特定實施方案中，本發(fā)明的室可提供有多于一對(兩個)的電極(例如，兩對(四個)電極、三對(六個)電極、四對(八個)電極、五對(十個)電極、或多于五對電極)。例如，在室具有四邊形橫截面的情況下，如果電極是沿著每個相對的內側壁提供的，則可將兩對(四個)電極與該室連接。此外，在室具有六邊形橫截面的情況下，如果電極是沿著每個相對的內側壁提供的，則可將三對(六個)電極與該室連接。因此，本發(fā)明的室中可提供任意對數的電極。且，電極具有任意的空間位置關系。
本發(fā)明電穿孔室中所提供電極之間的距離可具有任何長度，而且可根據進行核酸轉移的細胞和/或組織的大小而改變。特別優(yōu)選，電極之間的距離足以容納植物組織(例如，植物種子)。電極之間足以容納植物種子的距離可以是，例如，至少約5mm或更多，優(yōu)選至少約6mm或更多，優(yōu)選至少約7mm或更多，優(yōu)選至少約8mm或更多，優(yōu)選至少約9mm或更多，優(yōu)選至少約1cm或更多，優(yōu)選至少約2cm或更多，優(yōu)選至少約3cm或更多，優(yōu)選至少約4cm或更多，優(yōu)選至少約5cm或更多，優(yōu)選至少約6cm或更多，優(yōu)選至少約7cm或更多，優(yōu)選至少約8cm或更多，優(yōu)選至少約9cm或更多，優(yōu)選至少約10cm或更多，優(yōu)選至少約15cm或更多，優(yōu)選至少約20cm或更多。電極之間距離的上限可以是，但不限于，例如，約25cm、約20cm、約15cm、約10cm、約9cm、約8cm、約7cm、約6cm、約5cm、約4cm、約3cm、約2cm、約1cm、約9mm、約8mm、約7mm、或約6mm。長度可以是這些確切描述值間的中間值(例如，1.5cm等)。
在其中一個實施方案中，電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可容納于電極之間。電極之間的距離可通過任何方式改變。例如，可利用螺釘等將電極之間的距離調節(jié)至適宜距離。
電極可由任何材料制成，只要該材料具有導電的能力。電極材料的例子包括，但不限于，例如，鉑金、金、不銹鋼、碳、和導電聚合物。特別優(yōu)選電極是由鉑制成的。
舉例性的電穿孔室是長1cm×寬2cm×高2cm的直角平行六面體形，并提供有鉑電極，其中鉑電極之間的距離是約1cm。該電穿孔室特別用于具有中間大小(約5-15mm)的植物種子(例如，小麥、稻、玉米等)。使用該室，可同時處理許多(例如，約10-30粒)中間大小的植物種子。
另一舉例性電穿孔室為內徑1cm×高4cm的微管形，并提供有不銹鋼電極，其中不銹鋼電極之間的距離是約1cm。這種微管形室可很容易通過使用粘合劑等將不銹鋼箔(例如，約5×40mm(厚度約0.1mm))與商業(yè)購得的微管連接而生產。該微管形室可經受離心，從而使細胞、組織和/或種子沉淀在室底部。因此，很容易進行溶液的更換。當處理較小(約0.1-5mm時)的植物種子(例如，擬南芥(Arabidopsis thaliana)等)時，這種微管形室特別有用。使用該室，可同時處理很多較小的植物種子。
這里所用的“將細胞/組織(包括植物組織)保持在不同于大氣壓的壓力下”是指將細胞/組織(包括植物組織)保持在較之大氣壓(通常，1個大氣壓＝101.325kPa＝約0.1MPa)更高(增壓)或更低(減壓)的壓力下的步驟。
盡管不希望受到任何理論的束縛，但認為通過將細胞/組織(包括植物組織)保持在不同于大氣壓的壓力下，可改變施加于細胞/組織上的周圍氣壓，從而使含有核酸，如DNA等的緩沖溶液滲透到組織或細胞之間的腔內；且因此，它可通過電穿孔經過核酸轉移/轉化，進入到具有細胞壁的細胞和組織(特別是，植物細胞和植物組織)中，而這通常被認為是不可能的。
這里所用術語“減壓”是指將細胞/組織(包括植物組織(例如，種子))保持在低于大氣壓的壓力下進行核酸轉移/轉化的步驟。在本發(fā)明中，可以，但不限于，在比大氣壓低0.02MPa的壓力下，優(yōu)選在比大氣壓低0.04MPa的壓力下，更優(yōu)選在比大氣壓低0.06MPa的壓力下，更優(yōu)選在比大氣壓低0.08MPa的壓力下，最優(yōu)選在比大氣壓低0.096MPa的壓力下進行減壓。減壓的運行時間是，但不限于，1分鐘-120分鐘，優(yōu)選10分鐘-100分鐘，更優(yōu)選15分鐘-90分鐘，更優(yōu)選30-70分鐘，最優(yōu)選約60分鐘。
這里所用術語“增壓”是指將細胞/組織(包括植物組織(例如，種子))保持在比大氣壓更高的壓力下進行核酸轉移/轉化的步驟。
按照本發(fā)明其中一個方面，提供一種電穿孔裝置。本發(fā)明的電穿孔裝置可以明顯較高的效率將核酸轉移到任何細胞或組織中，且特別用于將核酸轉移到具有細胞壁的細胞或組織(例如，植物細胞或植物組織)中，而這通常是利用電穿孔進行核酸轉移所不能進行的。在其中一個實施方案中，本發(fā)明的電穿孔裝置包括a)用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分和b)電穿孔部分。
用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分可以是能夠進行減壓和/或增壓的任何裝置。還可利用商業(yè)購得的減壓裝置(例如，真空干燥器等)和/或增壓裝置。任何電穿孔裝置都可使用?？衫蒙虡I(yè)購得的電穿孔裝置(例如，CUY21EDIT基因轉移裝置，Nepagene，Ichikawa-shi，Chiba-ken，日本)。優(yōu)選如上所述，電穿孔部分中提供的兩個電極(第一電極和第二電極)之間的距離足以容納植物種子。
在本發(fā)明另一實施方案中，提供一種包括兩個電極的電穿孔裝置，其中兩個電極之間的距離足以容納植物種子。電穿孔裝置可與將細胞/組織保持在不同于大氣壓的壓力下的裝置結合使用。在本實施方案中，電穿孔裝置和將細胞/組織保持在不同于大氣壓的壓力下的裝置并非必需存在與同一室內。
常規(guī)的電穿孔裝置目的在于將高壓脈沖施加于非常小的細胞上。因此，室的內壁和電極之間的距離需要被盡可能地減到最小。因此，室的內部尺寸和常規(guī)電穿孔裝置中電極之間的距離通常為約1mm或2mm，或至多4mm。因此，這里提出的、包括具有足以容納植物種子的空間的室和其間距離足以容納植物種子的電極的電穿孔裝置迄今為止還是未知的。
此外，本發(fā)明的電穿孔裝置還可以是自動運轉的。在本發(fā)明的自動電穿孔裝置中，緩沖溶液等的注入和/或更換可由自動分液機進行。作為自動分液機，例如，可使用商業(yè)購得的epMotion5070工作站(Eppendorf Co.，Ltd.，Higashi-Kanda 3，Chiyoda-ku，Tokyo，日本)等。自動分液機不限于此。特別是，自動分液機可被有利用作容器中放置核酸和/或細胞的部分，該容器用于放置含有核酸及細胞的混合物。
用于放置含核酸及細胞的混合物的第一容器、用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的第二容器、以及用于向含核酸及細胞的混合物施加高壓脈沖的第三容器可以是任何容器。這些容器彼此可以相同或不同。這些容器的材料可以是能夠形成固體的任何材料。這種材料的例子包括，但不限于，玻璃、硅石、硅、陶瓷、二氧化硅、塑料、金屬(包括合金)、天然及合成的聚合物(例如，聚苯乙烯、纖維素、脫乙酰殼聚糖、葡聚糖、和尼龍等)等。該容器可由不同材料制成的層構成。例如，可使用無機絕緣材料，如玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍寶石、鎂橄欖石、氧化硅、碳化硅、氮化硅等。可使用有機材料，如聚酰胺、聚碳酸酯、(變性)聚苯醚、聚對苯二甲酸丁二醇酯、增強的聚對苯二甲酸乙二酯、聚醚砜、聚苯硫醚、多芳基化合物、聚醚酰亞胺、聚醚醚酮、聚酰亞胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、不飽和聚酯、氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏1，1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸類樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、酚樹脂、尿素樹脂、環(huán)氧樹脂、三聚氰胺樹脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、有機硅樹脂、聚砜等。
優(yōu)選，本發(fā)明的第一容器是由高度透明且有利于觀察樣品的材料(例如，聚苯乙烯)生產的。優(yōu)選，本發(fā)明的第二容器是由能夠抵抗不同于大氣壓的壓力(特別是，減壓)的材料(例如，聚酰胺、聚碳酸酯、(變性)聚苯醚、聚對苯二甲酸丁二醇酯、增強的聚對苯二甲酸乙二酯、聚醚砜、聚苯硫醚、多芳基化合物、聚醚酰亞胺、聚醚醚酮、聚酰亞胺、和環(huán)氧樹脂)生產的，且更優(yōu)選是由高度透明且有利于觀察樣品的材料(如丙烯酸類樹脂)生產的。優(yōu)選，本發(fā)明的第三容器是由對細胞具有親和性的材料(例如，聚丙烯、有機硅樹脂、和玻璃)生產的，并提供有鉑、金、不銹鋼、碳、或導電聚合物制成的電極。這些材料還可用任何適宜的材料覆蓋，從而提供所需性質(例如，容器的絕緣，提高電極的導電性等)。
此外，優(yōu)選，本發(fā)明的第一和第二容器能夠抵抗不同于大氣壓的壓力。特別優(yōu)選，本發(fā)明的第一和第二容器能夠抵抗減壓。例如，第一容器可安裝在第二和/或第三容器中?？蛇x擇性地，含有核酸及細胞的混合物是從第一容器注入到第二容器(或安裝在其中的另一容器)和/或第三容器(或安裝在其中的另一容器)中的。
作為將細胞放在第二容器中的部分以及將含有核酸及細胞的混合物放在第三容器中的部分，可有利地使用皮帶運輸機。本發(fā)明不限于此。可使用任何裝置。在第一容器、第二容器、和第三容器中放置的液體可通過利用自動泵等吸出/排出而除去。
本發(fā)明的自動電穿孔裝置包括用于使各種操作裝置自動化的控制裝置。本發(fā)明的電穿孔裝置包括電源裝置?？刂蒲b置和電源裝置可安裝在包括電穿孔裝置的同一室內，或可與電穿孔裝置隔開而且可與電穿孔裝置相連。
當種子進行電穿孔時，優(yōu)選在減壓或增壓前將種子浸在水(例如，自來水)中。處理前將種子浸在水中的時間為，但不限于，6h-48h，優(yōu)選12h-36h，更優(yōu)選18h-30h，甚至更優(yōu)選20h-26h，最優(yōu)選24h。
本發(fā)明用于核酸轉移的舉例性條件如下所述。將種子浸在自來水中，25℃過夜。第二天，將種子放在真空裝置中，接著在比大氣壓低0.096MPa的壓力下進行減壓。之后，將高壓脈沖(100V、50μsec、電極之間的距離1cm)施加于通過減壓進行電穿孔處理，即，核酸轉移/基因轉移的種子上約50次。電壓和脈沖的次數可根據農作物而改變。進行電穿孔的條件可由本領域那些技術人員根據需要適當選擇。之后，在含有抗生素的培養(yǎng)基中篩選細胞或組織，接著，裝入盆中(在盆中栽培)，由此可獲得標準的全株植物。
這里所用術語“植物”是包括屬于植物界的生物的通稱，其特征在于含有葉綠體、具有剛性細胞壁、永久產生豐富的胚組織，且沒有移動的能力。例如，在“Genshoku Makino Shokubutsu Daizukan[Unabridged Makino′s Original Color Illustrated Reference Book ofPlants]，Hokuryukan(1982)，日本)等中將植物分類。其中所述的所有植物都可用于本發(fā)明。代表性地，植物是指形成細胞壁并通過葉綠體進行合成代謝的開花植物。“植物”包括任何單子葉和雙子葉植物。單子葉植物的例子包括禾本科植物。優(yōu)選的單子葉植物的例子包括，但不限于，玉米、小麥、稻、燕麥、大麥、高梁、黑麥、和小米，更優(yōu)選玉米、小麥和稻。小麥的例子包括小麥變種Norin 61，其很難通過常規(guī)方法轉化。雙子葉植物的例子包括，但不限于十字花科、豆科、茄科、葫蘆科和旋花科的植物。十字花科植物的例子包括，但不限于，大白菜、油菜、卷心菜、和花椰菜。優(yōu)選的十字花科植物是大白菜和油菜。特別優(yōu)選的十字花科植物是油菜。豆科植物的例子包括，但不限于，大豆、紅豆、菜豆、和豇豆。優(yōu)選的豆科植物是大豆。茄科植物的例子包括，但不限于，番茄、茄子、和馬鈴薯。優(yōu)選的茄科植物是番茄。葫蘆科植物的例子包括，但不限于，日本香瓜、黃瓜、甜瓜和西瓜。優(yōu)選的葫蘆科植物是日本香瓜。旋花科植物的例子包括，但不限于，牽?；ā⒏适?、和bellbind。優(yōu)選的旋花科植物是牽?；ā３翘貏e說明，植物是指任何全株植物、植物器官、植物組織、植物細胞和種子。植物器官的例子包括根、葉、莖、花等。植物細胞的例子包括愈傷組織及培養(yǎng)細胞的懸浮液。在特定實施方案中，植物是指全株植物。
在本發(fā)明另一實施方案中，例如，可使用茄科、禾本科、十字花科、薔薇科(Rosaceae)、豆科、葫蘆科、唇形科(Lamiacea)、百合科(Liliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、傘形科(Umbelliferae)、旋花科、菊科(Compositae)等的植物。本發(fā)明所用植物物種的例子包括任何樹種，果樹物種、?？?Moraceae)植物(例如，橡樹)、和錦葵科(Malvaceae)植物(例如，棉花)。
在本發(fā)明的簡單方法中，植物組織(包括休眠組織(包括成熟種子、未成熟種子、冬芽、和塊莖)、種質、生長點、和花芽)進行電穿孔。在最簡單的方法中，種子進行電穿孔。通過將已經用本發(fā)明的電穿孔方法將核酸轉移到其中的種子直接種在土壤中進行種植，該種子可很容易發(fā)育成核酸轉移物質/轉化體。種子通常是由3部分組成的，即，胚、胚乳、和種皮(Yakichi Noguchi and Shinichiro Kawata，supervisors，Nogaku-Daijiten[Unabridged Dictionary ofAgriculture]，Yokendo(1987)，p.896(由Hideo Chizaka準備的相應部分))。胚包括植物的所有基因信息，并生長成全株植物。所有單子葉植物和所有雙子葉植物都有胚。當通過本發(fā)明的電穿孔方法進行核酸轉移時，經證實所引入的核酸在胚中表達。因此，本發(fā)明的最簡單方法可用于在任何具有包括胚的種子的植物中很容易獲得核酸轉移的全株植物/轉化體。
十字花科植物的例子包括蘿卜屬(Raphanus)、芥屬(Brassica)、擬南芥屬、Wasabia、和薺屬(Capsella)的植物。具體的例子包括日本白蘿卜、油菜籽、擬南芥、日本辣根、和薺菜。
禾本科植物的例子包括稻屬(Oryza)、小麥屬(Triticum)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、甘蔗屬(Saccharum)、高粱屬(Sorghum)和玉米屬(Zea)的植物。具體的例子包括稻、大麥、黑麥、甘蔗、高粱、和玉米。
這里所用的術語“動物”共同指動物界(Aminalia)的生物，它們需要氧氣和有機食品，而且在移動能力方面不同于植物和礦物。動物分為脊椎動物和無脊椎動物。作為脊椎動物，可使用盲鰻目(Myxiniformes)、七鰓鰻目(Petromyzontiformes)、軟骨魚綱(Chondrichthyes)、硬骨魚綱(Osteichthyes)、兩棲動物、爬行動物、鳥類、哺乳動物等。更優(yōu)選，可使用哺乳動物(例如，單孔目(Monotremate)、有袋目(Marsupialia)、貧齒目(Edentata)、皮翼目(Dermoptera)、翼手目(Chiroptera)、食肉目(Carnivore)、食蟲目(Insectivore)、長鼻目(Proboscidea)、奇蹄目(Perissodactyla)、偶蹄目(Artiodactyla)、管齒目(Tubulidentata)、鱗甲目(Pholidota)、海牛目(Sirenia)、鯨目(Cetacean)、靈長目(Primates)、嚙齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)等)。甚至更優(yōu)選使用靈長目(例如，黑猩猩、日本獼猴、人)。最優(yōu)選，使用來源于人的細胞或器官。作為無脊椎動物，可使用甲殼綱(Crustacea)、倍足綱(Diplopoda)、燭蛺綱(Pauropoda)、唇足綱(Chilopoda)、綜合綱(Symphyla)、昆蟲綱(Insecta)等。更優(yōu)選，使用昆蟲(例如，鱗翅目(Lepidoptera)，包括蠶(Bombyx mori Linnaeus)等)。
這里所用術語“轉基因生物”是指其中摻入特定基因的生物；術語“轉基因植物”是指其中摻入特定基因的植物；術語“轉基因動物”是指其中摻入特定基因的動物。
已經通過本發(fā)明方法經過核酸轉移/轉化的細胞和組織可利用本領域任何已知的方法分化、生長、和/或增殖。在植物物種中，使細胞或組織分化、生長、和/或增殖的步驟可通過，例如，培養(yǎng)植物細胞或植物組織或包括細胞或組織的全株植物而實現。植物在這里可通過本領域任何已知的方法培育。培育植物的方法在，例如“Moderu shokubutsuno Jikken Purotokoru，Ine ShiroinunazunaSaibo kogaku BessatsuShokubutsu Saibo Kogaku Sirizu 4；Ine no Saibaiho[ExperimentalProtocol for Model Plants For Rice and Arabidopsis thalianaCellularEngineering，Special Issue，Plant Cellular Engineering Series 4；RiceCultivating Methods]”(Kazutoshi Okuno)pp.28-32，和“Shiroinunazuna no saibaiho[Cultivating Methods forArabidopsis]”(Yasuo Niwa)pp.33-40(Supervised by Ko Shimamotoand Kiyotaka Okada)中舉例說明，且本領域那些技術人員可很容易地進行。因此，這些方法沒有在這里詳細描述。例如，擬南芥可通過土壤培養(yǎng)、巖棉(rockwol)培養(yǎng)、或水培法培養(yǎng)來培育。當撒播擬南芥的種子并在連續(xù)光照條件(冷白色熒光管(約6000lux))下培育時，第一朵花在播種后約4周長出，種子在開花后約16天成熟。一個種子罐包含約40-50個種子。在播種后約2-3個月植物死亡前，可獲得大約10,000個種子。在小麥的培育中，例如，已知除非小麥種子暴露于低溫下并在播種后接受短日照處理，否則植物不會抽穗和開花。因此，例如，當在人工環(huán)境(例如，溫室或生長室)下培育小麥時，必需使小麥植株在早期發(fā)育階段經過低溫和短日照處理(例如，光照期20℃，8小時(約2000lux)，黑暗期8℃，16小時等)。這種處理被稱作春化。每種植物所需的培育條件通常是本領域已知的，因此，無需在這里詳細描述。
在除了植物之外的物種(例如，動物物種)中，通過本發(fā)明方法經過核酸轉移/轉化的細胞和組織可利用本領域任何已知的方法分化、生長、和/或增殖(見，例如，Yoshiharu Izumi等人，eds.，“SeibutsuKagaku Jikken no Tebiki 4.Dobutsu Soshiki Jikkenho[Guidelines for Biochemical Experiments 4.Experimental Protocol forAnimal Tissue]，Kagaku Dojin，1987，等)。例如，已經通過電穿孔向其中轉移核酸的細胞和/或組織可在室溫(約25℃)下用商業(yè)購得的飼料使其生長。
如這里所用的，所轉移的基因是多核苷酸形成的。
這里所用術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”及“核酸”具有相同的含義，是指任何長度的核苷酸的聚合物。這些術語還包括“衍生的寡核苷酸”或“衍生的多核苷酸”。術語“衍生的寡核苷酸”和“衍生的多核苷酸”可互換用于指含有核苷酸衍生物或核苷酸之間所具有的鍵不同于正常鍵的寡核苷酸或多核苷酸。具體而言，這種寡核苷酸的例子包括2′-O-甲基-核糖核苷酸、其中的磷酸二酯鍵轉化成硫代磷酸酯鍵的衍生寡核苷酸、其中的磷酸二酯鍵轉化成N3′-P5′氨基磷酸酯鍵的衍生寡核苷酸、其中的核糖及磷酸二酯鍵轉化成肽核酸鍵的衍生寡核苷酸、其中的尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的胞嘧啶被吩噁嗪修飾的胞嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的核糖被2′-O-丙基核糖取代的衍生寡核苷酸、和其中的核糖被2′-甲氧基乙氧基核糖取代的衍生寡核苷酸。除非另有說明，特定的核酸序列還暗含包括其保守修飾的變體(例如，簡并密碼子置換)及其互補序列，以及明確指出的序列。具體而言，簡并密碼子置換可通過產生其中一個或多個所選(或全部)密碼子的第三個位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列而實現(Batzer等人，Nucleic Acid Res.，195081，1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，2602605-2608，1985；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，891-98，1994)。在這里術語“核酸”與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”、和“多核苷酸”互換使用。具體的核酸序列還暗含包括“剪接變體”。類似地，由核酸編碼的特定蛋白暗含包括由該核酸剪接變體編碼的任何蛋白?！凹艚幼凅w”，就像它名稱所暗示的那樣，是基因的選擇性剪接產物。轉錄后，原始的核酸轉錄物可被剪接，這樣不同(可變)的核酸剪接產物編碼不同的多肽。用于生產剪接變體的機理可改變，但包括外顯子的可變剪接。通過連讀轉錄從同一核酸衍生的可變多肽也包括在該定義內。剪接反應的任何產物，包括剪接產物的重組形式也包括在該定義中。
這里所用“基因”是指確定遺傳性狀的因子。基因通常以預定的順序排列在染色體上。確定蛋白一級結構的基因被稱作結構基因?？刂平Y構基因表達的基因被稱作調節(jié)基因。這里所用“基因”還指“多核苷酸”、“寡核苷酸”、及“核酸”。這里所用的基因“同源性”是指兩個或多個基因序列之間的同一性程度。因此，兩個基因之間的同源性越大，它們序列之間的同一性或相似性就越大。兩個基因是否具有同源性是通過直接比較它們的序列或在核酸的情況下，通過嚴格條件下的雜交方法而確定的。當直接互相比較兩個基因序列時，如果基因的DNA序列彼此通常具有至少50％、優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，則基因具有同源性。
堿基序列之間同一性的比較和堿基序列之間同源性的計算在這里是使用具有缺省參數的序列分析工具BLAST計算的。
這里所用的基因、多核苷酸、多肽等的“表達”表示基因等在體內經過某些作用并轉化成其它形式。優(yōu)選，基因、多核苷酸等經過轉錄并翻譯成多肽形式，然而，mRNA通過轉錄的產生可以是表達的體現。更優(yōu)選，這種多肽的形式可通過翻譯后的加工獲得。
這里所用“核苷酸”可天然存在或非天然存在?！把苌塑账帷被颉昂塑账犷愃莆铩笔侵覆煌谔烊淮嬖诘暮塑账?，但具有與天然存在的核苷酸相似的功能的核苷酸。這種衍生核苷酸及核苷酸類似物是本領域熟知的。這種衍生核苷酸及核苷酸類似物的例子包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基-膦酸酯、手性甲基-膦酸酯、2-O-甲基-核糖核苷酸、及肽核酸(PNA)。
這里所用術語“片段”是指相對于全長多肽或多核苷酸(其長度為n)而言具有1-n-1序列長度的多肽或多核苷酸.根據目的不同，可適當改變片段的長度。例如，多肽長度的下限是，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50和更多氨基酸。其沒有在這里明確舉例說明的整數(例如，11等)也可適當作為下限。多核苷酸的下限是，例如，5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100和更多核苷酸。其沒有在這里明確舉例說明的整數(例如，11等)也可適當作為下限。
本發(fā)明中所用的一般分子生物學技術可通過參考Ausubel F.A.等人，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，New York，NY，1988；Sambrook J.等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1987等，由本領域那些技術人員很容易地進行。
在這里討論基因時，“載體”是指能夠將目標多核苷酸序列引入到靶細胞中的載體。這種載體包括能夠在宿主細胞，如原核生物細胞、酵母細胞、動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、個體動物和植物，優(yōu)選植物細胞中自我復制，或被摻入到其染色體中，并具有位于適合本發(fā)明多核苷酸轉錄的位點處的啟動子的載體。
這里所用術語“表達載體”是指含有結構基因和用于調節(jié)其表達的啟動子的核酸序列，以及此外處于允許它們在宿主細胞內活動的狀態(tài)的各種調節(jié)元件。調節(jié)元件可優(yōu)選包括終止子、選擇標記如藥物-抗性基因、和增強子。本領域那些技術人員熟知生物(例如，植物)表達載體的類型和調節(jié)元件的類型可根據宿主細胞而改變。用于篩選的選擇標記的例子包括，但不限于，藥物-抗性基因，如編碼產生對抗生素卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶的neo基因(Beck等，Gene，19327，1982)；編碼產生對抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶的hyg基因(Gritz和Davies，Gene，25179，1983)；和編碼產生對除草劑膦絲菌素抗性的膦絲菌素乙?；D移酶的基因(EP 242236)；編碼鏈霉素磷酸轉移酶的spt基因；鏈霉素抗性基因；和壯觀霉素抗性基因(例如，H.S.Chawla，Introduction to Plant Biotechnology 2nd363，SciencePublishers，Inc.，hard cover，2002)；和選擇標記基因，如編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的GUS基因(Jefferson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，63901，1986)、螢光素酶基因(Ow等人，Science，234856，1986)、和GFP(綠色熒光蛋白)編碼基因(例如，從Funakoshi Co.，Ltd.，Hongo，Bunkyo-ku，Tokyo，日本購得)。
用于本發(fā)明篩選的制劑的例子包括，但不限于，卡那霉素、潮霉素、遺傳霉素、慶大霉素、鏈霉素和壯觀霉素。
“重組載體”是指可將目標多核苷酸序列轉移到靶細胞的載體。這種載體的例子包括能夠自我復制或能夠被摻入到宿主細胞(例如，植物細胞和全株植物)內的染色體中的載體，并包括位于適合本發(fā)明多核苷酸轉錄位點的啟動子。
植物細胞“重組載體”的例子包括Ti質粒、煙草花葉病病毒(tobaccomosaic virus)載體、和雙生病毒(Gemini virus)載體。
“終止子”是位于基因的蛋白-編碼區(qū)下游，并在DNA被轉錄到mRNA中時，參與轉錄終止以及聚腺苷酸序列加成的序列。已知終止子有助于mRNA的穩(wěn)定性，并對基因表達量產生影響。這種終止子的例子包括，但不限于，CaMV35S終止子、胭脂氨酸合酶基因的終止子(Tnos)、和煙草PR1a基因的終止子。這里所用的“啟動子”是確定基因轉錄起始位點的堿基序列，且是直接調節(jié)轉錄頻率的DNA區(qū)。轉錄是由與啟動子結合的RNA聚合酶啟動的。啟動子區(qū)通常位于推定蛋白編碼區(qū)的第一個外顯子上游約2kbp內。因此，可通過使用DNA分析軟件預測基因組堿基序列中的蛋白編碼區(qū)而估計啟動子區(qū)。推定啟動子區(qū)通常位于結構基因的上游。優(yōu)選，推定啟動子區(qū)位于第一個外顯子的翻譯起始位點上游的約2kbp內。
當在本說明書中提到基因表達時，“位點特異性”通常是指基因相對于生物(例如，植物)內位點(例如，在植物的情況下；根、莖、干、葉、花、種子、胚芽、胚、果實等)的表達特異性?！皶r間特異性”是指基因相對于生物(例如，植物)發(fā)育階段(例如，在植物的情況下，生長階段，和發(fā)芽后的天數)的表達特異性。這種特異性可使用適當選擇的啟動子被引入到所需生物中。
這里相對于本發(fā)明啟動子表達所用的術語“組成型”是指啟動子的特征，即啟動子以基本恒定的量在生物的所有組織中表達，而不管生物的生長階段是幼年階段還是成熟階段。具體而言，當在與本說明書實施例中描述的那些相同的條件下進行RNA印跡分析時，按照本發(fā)明的定義，例如，如果在任何時間(例如，兩個或多個時間點(例如，第5天和第15天))的相同或相應位點觀察到基本相同量的表達，則表達被認為是組成型的。組成型啟動子被認為在正常生長環(huán)境中維持生物的內環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮作用。這里相對于啟動子表達所用的啟動子表達的“應激反應”是指啟動子的特征，即當生物經過至少一次應激時，啟動子的表達量發(fā)生改變。特別是，增加表達量的特征被稱作“應激誘導型”。減少表達量的特征被稱作“應激抑制型”?！皯ひ种菩汀北磉_是以在正常情況下觀察表達作為前提的。因此，這個概念與“組成型”表達重疊。這些特征可通過提取生物任何部分的RNA并通過RNA印跡分析RNA表達量或通過蛋白質印跡測定表達蛋白的量而測定。當用含有應激誘導型啟動子及編碼目標多肽的核酸的載體轉化植物或其一部分(特別是細胞/組織等)時，具有誘導啟動子活性的刺激物可用于引起特定的基因在預定條件下表達。
這里所用術語“增強子”是指用于提高目標基因表達效率的序列。作為用于植物中的增強子，含有在CaMV35S啟動子內上游序列的增強子區(qū)是優(yōu)選的?？墒褂靡粋€或多個增強子，或不使用增強子。
這里所用術語“可操縱連接”表示所需序列位于其表達(操縱)處于轉錄和翻譯調節(jié)序列(例如，啟動子、增強子等)控制下的位置。為了使啟動子與基因可操縱連接，通常，啟動子直接位于基因的上游。然而，間插序列可存在于啟動子和結構基因之間，因此啟動子無需與結構基因鄰接。
引入基因的存在可通過DNA印跡或PCR加以證實。引入基因的轉錄還可通過RNA印跡或PCR檢測。如果需要，蛋白，其是基因產物，的表達可通過，例如，蛋白質印跡加以證實。
在下文中，將通過實施例描述本發(fā)明。下面的實施例僅用于舉例說明的目的。因此，本發(fā)明的范圍不限于上述說明或下面的實施例，除了通過附加的權利要求來限定之外。
實施例(方法和材料)(1)轉移基因在本發(fā)明中，主要使用含有抗生素抗性基因和/或GUS基因的質粒DNA。本發(fā)明不限于此。在下面的實施例中，使用下列3種質粒。pBI221(Clontech)含有花椰菜花葉病毒(Cauflower mosaic virus)(CMV)的35S啟動子，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，和胭脂氨酸合酶基因(NOS)的終止子。該質粒主要以GUS活性為基礎用于監(jiān)控基因的轉移。pWI-H5K(其限制性酶切圖在圖1中表示)是通過除去pWI-GUS中的GUS基因(Masashi Ugaki等，Nucleic Acids Res.，19371-377，1991)并向其中插入NPT II基因而構造的。pWI-H5K含有hpt(潮霉素抗性基因)，CMV的終止子，NPT II(卡那霉素和慶大霉素抗性基因)，和CMV的35S啟動子和終止子。pBC1已經由CornelUniversity(美國)的Fromm博士(現在，Fromm博士屬于Monsanto公司)研究。pBC1含玉米乙醇脫氫酶基因的啟動子和內含子的一部分，GUS基因，NOS的終止子，CMV的35S啟動子，和hpt(潮霉素抗性基因)，NOS的終止子(Hagio等，Plant Cell Rep.，14329-334，1995)。作為質粒DNA，可使用pWI-GUS質粒中的GUS基因被GFP(綠色熒光蛋白)基因取代的質粒，pigA3GFP質粒(Tamura，Journal ofSericultural Science of Japan，691-12，2000)等。
(2)種子的預處理(第1天)實施例中所用的種于是由本發(fā)明人生產的或從種子和幼苗公司購買的。通過目測(大小不同)選擇約10-30粒適宜的成熟種子，并浸在自來水中25℃過夜，使種子吸水。優(yōu)選，吸水所用的自來水含有用于防止各種細菌增殖的次氯酸鈉水溶液(調節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。在生產小麥轉化體目的的實驗中，優(yōu)選吸水是在10℃下進行2個晚上。
(3)電穿孔裝置本發(fā)明所用的電穿孔裝置可以是商業(yè)購得的電穿孔裝置(例如，CUY21EDIT基因轉移裝置，Nepagene Co.，Ltd.，Ichikawa-shi，Chiba-ken，日本)。
在本實施例中，用于進行電穿孔的電穿孔室可以是具有任何大小的電穿孔室，這樣它就可容納被轉化的植物組織。優(yōu)選是能夠被冷卻的室。在本實施例中，使用具有鉑電極和長1cm×寬2cm×高2cm尺寸的電穿孔室。
(4)緩沖溶液的制備(第2天)在每個實驗中，使用1.5ml或更少的緩沖溶液和150μg的質粒DNA。所述緩沖溶液是由250mM氯化鈣、12.5mM亞精胺、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、和0.3％Tween 20組成的。
(5)減壓將緩沖溶液和已經開始發(fā)芽的種子放在直徑35mm×深10mm的培養(yǎng)皿中，接著使用低于大氣壓0.096MPa或0.06MPa的壓力減壓1小時。
(6)電穿孔減壓后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中，室依次在冰上維持1分鐘。之后，將具有50μsec脈沖寬度的100V或50V脈沖電壓(即，矩形電波，其中施加電壓50μsec，然后停止施加電壓75μsec，重復該循環(huán))施加于電極之間，電極之間的距離為1cm。脈沖次數是50或99。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，除去緩沖溶液，并將種子放回到原始培養(yǎng)皿中。將2ml 0.5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液傾注在包含種子的培養(yǎng)皿中。所述PVP水溶液含有次氯酸鈉水溶液，其被調節(jié)至約0.01％的有效氯濃度，用于防止各種細菌增殖。
將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，并在25℃維持過夜。
(7)種子的后處理(第3天)在接下來的一天，除去緩沖溶液，并向培養(yǎng)皿中加入2ml新的具有相同組成的緩沖溶液。使培養(yǎng)皿在25℃下維持過夜。
(8)GUS分析(第4天)在接下來的一天，除去緩沖溶液，向培養(yǎng)皿中加入2ml X-Gluc溶液(100mM磷酸緩沖溶液，pH7.0，0.05％X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸環(huán)己基銨鹽)、0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM亞鐵氰化鉀、0.3％Triton X-100、20％甲醇)。使培養(yǎng)皿在25℃維持過夜。GUS基因的表達是在第5天和之后通過染色加以證實的。
(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選(第4天和之后)種子是如下生長的，沒有進行GUS分析。
a)將種子轉移到9cm×15mm的培養(yǎng)皿中，其中已經鋪了一片濾紙。
b)將10ml含有抗生素的蒸餾水溶液加入到培養(yǎng)皿中。當用遺傳霉素篩選小麥種子時，其濃度為2000rpm或1200ppm。當用遺傳霉素篩選稻的種子時，其濃度為200ppm。
c)種子是下列條件下，在培養(yǎng)室中生長的(光照期25℃，16h，約2000lux；黑暗期25℃，8h)或(光照期20℃，8h，約2000lux；黑暗期8℃，16h)。
(10)轉化體的生長(第11天和之后)用含抗生素的培養(yǎng)基篩選后，將植物種在直徑8.5cm×高5.5cm、含有園藝土的罐(花盆)中(New Magic Soil；Sakata Seed Corporation，Tsuzuki-ku，Yokohama-shi，日本)，它們在單獨的生長室中生長，條件如下(光照期15℃，8h，約5000lux(鈉燈)；黑暗期15℃，16h)或(光照期20℃，8h，約2000lux；黑暗期8℃，16h)。
(11)DNA提取基因轉移是使用如下PCR加以證實的。收集轉化植物的葉和莖，并提取葉和莖的DNA。DNA提取可通過任何熟知的技術進行。一般的DNA提取技術是CTAB技術(Hirofumi Uchimiya，“ShokubutsuIdenshi Sosa Manyuaru Toransugenikku Shokubutsu noTsukurikata[Manual of Plant Genetic Engineering；How To ProduceTransgenic Plants]”，Kodansha Scientific，pp.71-74，hardcover，1989)。
(12)PCR分析電穿孔后，在第14天提取各植物葉子的DNA。在PCR中使用一對引物(5’-ctgcgtgcaatccatcttg-3’(SEQ ID NO.1)，5’-actcgtcaagaaggcgatagaag-3’(SEQ ID NO.2))檢測NPT II基因。還可使用另一對引物(5’-catgattgaacaagatggattgcacgcaggttctc-3’(SEQ IDNO.3)，5’-cagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgat-3’(SEQ ID NO.4))。這種引物對可更優(yōu)選以更特異的方式用于檢測NPT II基因。作為聚合酶，按照制造商的說明(Perkin Elmer Japan Co.，Ltd.(Nishi-ku，Yokohama-shi，日本)使用AmpliTaqGold(注冊商標)。用于擴增的熱循環(huán)是在下列設置下使用的
(a)95℃10分鐘(循環(huán)1次)；(b)95℃1分鐘，64℃2分鐘和72℃2分鐘(循環(huán)50次)；(c)72℃7分鐘(循環(huán)1次)；和(d)在4℃下保存。
(13)DNA印跡分析電穿孔后，對來源于各植物的DNA進行DNA印跡分析，所述植物已經通過(12)中的PCR分析被證實具有引入基因。DNA印跡是本領域熟知的，因此其條件可由本領域那些技術人員根據需要適當選擇。在DNA印跡分析中，使用對引入的NPT II基因特異的序列(如序列表中SEQ ID NO.5所示)作為探針。
(14)遺傳分析通過DNA印跡分析證實具有引入基因的植物進一步生長，接著自花授粉。結果，獲得很多成熟的種子。在這些種子之中，隨機選擇約10粒種子，并在含土壤的罐中培育。提取幼株葉子的DNA。將所述DNA用作模板在(12)所述的條件下進行PCR。
(實施例1)(小麥的轉化)對小麥(變種Norin 61)的成熟種子進行實驗。使種子吸水，在25℃下過夜。將2ml包含30粒已經開始發(fā)芽的種子以及pWI-GUS(用于GUS分析)或pWI-H5K(用于生長)的質粒DNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。在低于大氣壓0.096MPa的壓力下減壓1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜?；虮磉_水平是使用GUS活性作為指數測定的。結果在下面表1中表示。
表1

按照上述結果，可了解到當施加100V電壓時，可進行具有最高效率的轉化(注意電極之間的距離為1cm)。
類似的結果在圖2中表示。圖2表示在下列條件下進行電穿孔的結果脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50，壓力為低于大氣壓0.096MPa(減壓)，且所施加的電壓為100V(A)、50V(B)、20V(C)、或0V(D)。當所施加的電壓為100V時，轉化效率最高。
圖3表示1在(電壓100V，脈沖寬度50μsec，脈沖次數50；壓力低于大氣壓0.096MPa(減壓))的條件下經過轉化的小麥種子；2在(電壓100V，脈沖寬度50μsec，脈沖次數50；沒有減壓)的條件下只經過電穿孔的小麥種子；和3對照小麥種子的照片。從圖3可以看出，只有當減壓與電穿孔結合時，才能獲得轉化。
用于生長的種子沒有經過GUS活性實驗，且減壓后，使種子在含有2000ppm遺傳霉素的蒸餾水中生長(如(7)種子的后處理，(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，和(10)轉化體的生長中所述)。結果在圖4中表示。提取幼苗中的DNA，接著進行PCR，以便證實引入基因的存在(如(11)DNA提取，和(12)PCR分析所述)。
SEQ ID NO.1和2用于進行PCR。結果，證實了NPT II基因被引入到全株植物中。
上述實驗的再現性是通過以基本相同的方式重復實驗而研究的。結果，獲得基本相同的結果。該重復實驗具體過程的詳述在下面描述。開始，將一片7cm直徑的濾紙放在90×15mm的培養(yǎng)皿中。將150粒小麥Norin 61的種子放在濾紙上。將10ml水加入到培養(yǎng)皿中，其依次被放置在黑暗的地方，10℃下共2天，使種子吸水。所加入的水含有用于防止各種細菌增殖的次氯酸鈉溶液(調節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。在第2天，幼根和幼芽頂破種皮。因此，證實了種子已經開始發(fā)芽。在此第2天，用自來水充分洗滌種子。洗滌之后立即進行本發(fā)明的核酸轉移處理。將2ml含有30粒小麥種子和pWI-H5KDNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中，其依次在冰上維持1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離為1cm；脈沖寬度為50μsec；脈沖次數為50。將該室在冰上再維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。在4℃下保存培養(yǎng)皿約1小時，并在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液，并將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。該過程總共進行5次，這樣總共150個小麥種子經過本發(fā)明的核酸轉移處理。
接下來，將10ml 0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液作為防止變成褐色的試劑放在90×15-mm培養(yǎng)皿中。將經過核酸轉移處理的小麥種子放在培養(yǎng)皿中。所述PVP水溶液含有用于防止各種細菌增殖的次氯酸鈉溶液(調節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。將培養(yǎng)皿放在黑暗的地方，10℃下共2天。2天后，將10ml含有1200ppm遺傳霉素的水溶液放在新的90×15mm培養(yǎng)皿中，并將上述小麥種子轉移到該培養(yǎng)皿中。所述遺傳霉素水溶液含有用于防止各種細菌增殖的次氯酸鈉溶液(調節(jié)至約0.02％的有效氯濃度)。接下來，使培養(yǎng)皿中的種子在春化的條件下，在培養(yǎng)室中生長2周(光照期20℃、8h、約2000lux；和黑暗期8℃，16h)。
此外，將在上述使用遺傳霉素抗生素的篩選過程中發(fā)芽的存活小麥植株移植到含土壤的罐中，并生長約3-4個月。這種生長是在與上述相同的培養(yǎng)室中進行的，條件為(光照期20℃、8h、約2000lux；和黑暗期8℃，16h)。裝入罐中后約1個月，收集已生長的小麥植株的葉子。提取所收集葉子的DNA。將提取的DNA用作模板進行PCR。結果，證實了引入基因的存在。該PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴增條件進行的。結果在圖5表示。
約5,000粒小麥種子經過相似處理。結果，獲得205株具有遺傳霉素抗性的個體植株。在它們之中，87株個體在PCR分析中顯示引入基因的存在。使在PCR中顯示引入基因存在的87株個體生長，之后，經過DNA印跡分析。從87株個體中隨機選擇8株個體。提取8株個體的DNA，并經過DNA印跡分析。結果，引入的NPT II基因的存在在所有8株個體中均被證實。結果在圖6表示。
在DNA印跡分析中顯示引入基因存在的這8株個體進一步生長。結果，發(fā)現所有8株個體都具有種子生育力。這些具有種子生育力的小麥轉化體的照片在圖7中表示。將從這些小麥轉化體(第一代T0代)中獲得的種子(第二代T1代)播撒在土壤中。種子生長為幼株。提取6株幼株葉子的DNA，經過PCR分析。結果，引入基因的存在在6株幼株中均得以證實。該PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴增條件進行的。結果在圖8中表示。從圖8可以看出，證實了所有6株幼株都顯示出引入的NPT II基因的存在。因此，證實了本發(fā)明的核酸轉移方法可將目標外源性基因以適宜的方式摻入到基因組中，且所引入的外源性基因可被傳遞到下一代中。
(實施例2)將日本產稻(變種Koshihikari)的成熟種子用作原料。
使種子吸水，25℃下過夜。將2ml包含30粒已經開始發(fā)芽的種子和pWI-GUS或pWI-H5K的質粒DNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。在低于大氣壓0.096MPa的壓力下減壓1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離為1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為99。使該室進一步在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。4℃下保存培養(yǎng)皿約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。向培養(yǎng)皿中加入2ml蒸餾水，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜?；虮磉_水平是使用GUS活性作為指數測定的。結果在下面表2表示。
表2

根據上述結果，可了解到當施加50V的電壓時，可進行具有最高效率的轉化(注意電極之間的距離為1cm)。
相似的結果在圖9中表示。圖9表示在下列條件下進行電穿孔的結果脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為99，壓力為低于大氣壓0.096MPa(減壓)，且所施加的電壓為50V(A)、20V(B)、10V(C)、或0V(D)。當所施加的電壓為50V時，轉化效率最高。
圖10表示1在(電壓50V，脈沖寬度50μsec，脈沖次數99；壓力低于大氣壓0.096MPa(減壓))的條件下經過轉化的稻種子；2在(電壓50V，脈沖寬度50μsec，脈沖次數99；沒有減壓)的條件下只經過電穿孔的稻種子；和3對照稻種子的照片。從圖10可以看出，只有當減壓與電穿孔結合時，才能獲得轉化。
用于生長的種子沒有經過GUS活性實驗，且減壓后，使種子在含有200ppm遺傳霉素的蒸餾水中生長(如(7)種子的后處理，(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，和(10)轉化體的生長中所述)。結果在圖11中表示。
上述實驗的再現性是通過以基本相同的方式重復實驗而研究的。結果，獲得基本相同的結果。該重復實驗具體過程的詳述在下面描述。開始，將一片7cm直徑的濾紙放在90×15mm的培養(yǎng)皿中。將100粒稻(糙米)的種子放在濾紙上。將10ml水加入到培養(yǎng)皿中，其依次被放置在25℃下、光照期16h、共1天，使種子吸水。所加入的水含有用于防止各種細菌增殖的次氨酸鈉溶液(調節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。在接下來的一天，用自來水充分洗滌種子。洗滌后立即進行本發(fā)明的核酸轉移處理。將1ml包含20粒稻種子和pWI-H5KDNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。在低于大氣壓0.096MPa的壓力下減壓1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中，其依次在冰上維持1分鐘。之后，在下列條件下通過電穿孔施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離為1cm；脈沖寬度為50μsec；脈沖次數為99。將該室在冰上再維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。在4℃下保存培養(yǎng)皿約1小時，并在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液，并將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。該過程總共進行5次，這樣共100粒稻種子經過本發(fā)明的核酸轉移處理。
接下來，將10ml 0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液作為防止變成褐色的試劑放在90×15-mm培養(yǎng)皿中。將經過核酸轉移處理的稻種子放在培養(yǎng)皿中。所述PVP水溶液含有用于防止各種細菌增殖的次氯酸鈉溶液(調節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。將培養(yǎng)皿放置在25℃下，光照期16h，共2天。2天后，將10ml含有200ppm遺傳霉素的水溶液放在新的90×15-mm培養(yǎng)皿中，并將上述稻種子轉移到該培養(yǎng)皿中。所述遺傳霉素水溶液含有用于防止各種細菌增殖的次氯酸鈉溶液(調節(jié)至約0.02％的有效氯濃度)。接下來，使培養(yǎng)皿中的種子在25℃下生長2周，光照期16h。
此外，將在上述使用遺傳霉素抗生素的篩選過程中發(fā)芽的存活稻植株移植到含土壤的罐中，并生長約3-4個月。這種生長是在一般的培育條件下，在密閉的溫室中，在25℃下進行的。裝入罐中后約1個月，收集已生長的稻植株的葉子。提取所收集葉子的DNA。將提取的DNA用作模板進行PCR。結果，證實了引入基因的存在。該PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴增條件進行的。PCR分析證實了NPT II基因的存在。
約2,000粒稻種子經過相似處理。結果，獲得55株具有遺傳霉素抗性的個體植株。在它們之中，33株個體在PCR分析中顯示引入基因的存在。使在PCR中顯示引入基因存在的33株個體生長，之后，經過DNA印跡分析。從33株個體中隨機選擇6株個體。提取6株個體的DNA，經過DNA印跡分析。結果，引入的NPT II基因的存在在2株個體中被證實。結果在圖12中表示。
在DNA印跡分析中顯示引入基因存在的稻個體進一步生長。結果，發(fā)現稻個體具有種子生育力。這些具有種子生育力的稻轉化體的照片在圖13中表示。將從這些稻轉化體(第一代T0代)中獲得的種子(第二代T1代)播撒在土壤中。種子生長為幼株。提取8株幼株葉子的DNA，經過PCR分析。結果，確定了引入基因的存在。該PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴增條件進行的。結果在圖14中表示。從圖14可以看出，證實了所有8株幼株都顯示出引入的NPT II基因的存在。因此，證實了本發(fā)明的核酸轉移方法可將目標外源性基因以適宜的方式摻入到基因組中，且所引入的外源性基因可被傳遞到下一代中。
(實施例3)將印度產稻(變種IR24)的成熟種子用作原料。
使種子吸水，25℃下過夜。將2ml包含30粒已經開始發(fā)芽的種子和pWI-GUS的質粒DNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為99。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。結果在圖15中表示。從圖15可看出，只有當減壓與電穿孔結合時，才能獲得轉化。
減壓后，使用含有200ppm遺傳霉素的蒸餾水篩選種子。
(實施例4)將大豆(變種Oosuzu)的成熟種子用作原料。使種子吸水，25℃過夜。
將2ml包含10粒已經開始發(fā)芽的種子和pBC1或pWI-GUS的質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。轉化成功的結果在圖16中表示。
(實施例5)將玉米(變種Petercorn)的成熟種子用作原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含3粒已經開始發(fā)芽的種子和質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。
(實施例6)使用大白菜(變種Muso)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經開始發(fā)芽的種子和質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。轉化成功的結果在圖17中表示。
用于生長的種子沒有經過GUS活性實驗，且減壓后，使種子在含有適量遺傳霉素的蒸餾水中生長(如(7)種子的后處理，(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，和(10)轉化體的生長中所述)。提取幼苗的DNA，接著進行PCR，從而證實引入基因的存在(如(11)DNA提取，和(12)PCR分析中所述)。在PCR中顯示引入基因存在的個體進一步生長，之后，經過DNA印跡。從隨機選擇的某些已經生長的個體中提取DNA，接著進行DNA印跡分析。
(實施例7)使用番茄(變種Minicarol)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經開始發(fā)芽的種子和質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。轉化成功的結果在圖18表示。
(實施例8)將日本香瓜(變種Kinsho甜瓜)的成熟種子用作原料。使種子吸水，25℃過夜。種子開始發(fā)芽。
將2ml包含40粒種子和質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。
進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。
將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。
(實施例9)使用牽?；?變種“Sun Smile”和“Youzirotairin”)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含10粒已經開始發(fā)芽的種子和質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。轉化成功的結果在圖19中表示。
(實施例10)使用擬南芥(變種Col-0)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含1000粒已經開始發(fā)芽的種子和質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到微管形室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。
用于生長的種子沒有經過GUS活性實驗，且減壓后，使種子在含有適量遺傳霉素的蒸餾水中生長(如(7)種子的后處理，(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，和(10)轉化體的生長中所述)。提取幼苗的DNA，接著進行PCR，從而證實引入基因的存在(如(11)DNA提取，和(12)PCR分析中所述)。在PCR中顯示引入基因存在的個體進一步生長，之后，經過DNA印跡。從隨機選擇的某些已經生長的個體中提取DNA，接著進行DNA印跡分析。
在DNA印跡分析中顯示引入基因存在的擬南芥?zhèn)€體進一步生長，產生具有種子生育力的擬南芥?zhèn)€體。將從這些擬南芥轉化體(第一代T0代)中獲得的種子(第二代T1代)播撒在土壤中。種子長成幼株。提取幼株葉子的DNA，經過PCR分析。結果，確定了引入基因的存在。該PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴增條件進行的。
(實施例11)使用日本香瓜(變種Kinsho甜瓜)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經開始發(fā)芽的種子和質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。使種子進行沒有減壓，在低于大氣壓0.06MPa下減壓1小時，在低于大氣壓0.096MPa下減壓1小時的處理。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。結果在表3中表示。
表3

1-對于經過核酸轉移的種子而言，X-Gluc染色均未被證實。
2+對于30粒經過核酸轉移的種子中的15?；蚋喾N子而言，X-Gluc染色被證實。
在表3中，基因表達水平是以用X-Gluc溶液染色的程度為基礎評價的。正如從表3結果所看到的那樣，大約0.096MPa減壓對于日本香瓜是優(yōu)選的。
接下來，研究對于日本香瓜轉化而言優(yōu)選的電壓。使日本香瓜在與上述相同的條件(0.096MPa減壓)下經過核酸轉移，區(qū)別在于下列電壓條件。結果在下面的表4中表示。
表4

1-對于經過核酸轉移的種子而言，X-Gluc染色均未被證實。
2±對于30粒經過核酸轉移的種子中的1-14粒種子而言，X-Gluc染色的微弱水平被證實。
3+對于30粒經過核酸轉移的種子中的15粒或更多種子而言，X-Gluc染色被證實。
按照上述結果，證實了當施加約100V的電壓時，其中電極之間的距離是約1cm，轉化可最有效地進行。
(實施例12)對小麥(變種Norin 61)的成熟種子進行實驗，其中比較減壓條件。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經開始發(fā)芽的種子和質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。將放在2ml不含質粒DNA的電穿孔緩沖溶液中的發(fā)芽種子用作對照。使種子進行沒有減壓，在低于大氣壓0.06MPa下減壓1小時，或在低于大氣壓0.096MPa下減壓1小時的處理(注意對照種子沒有經過減壓)。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為50。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。結果在圖20中表示?；虮磉_水平是通過用X-Gluc溶液染色的程度作為指數確定的。從圖20可以看出，在小麥中，優(yōu)選在低于大氣壓約0.096MPa下減壓。且，在低于大氣壓約0.06MPa下減壓的情況中，對于小麥種子證實了X-Gluc染色。
(實施例13)對日本產稻(變種Koshihikari)的成熟種子進行實驗，其中比較減壓條件。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經開始發(fā)芽的種子和質粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。將放在2ml不含質粒DNA的電穿孔緩沖溶液中的發(fā)芽種子用作對照。使種子進行沒有減壓，在低于大氣壓0.06MPa下減壓1小時，或在低于大氣壓0.096MPa下減壓1小時的處理(注意對照種子沒有經過減壓)。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為99。進一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。結果在圖21中表示。基因表達水平是通過用X-Gluc溶液染色的程度作為指數確定的。從圖21可以看出，對于稻而言，優(yōu)選在低于大氣壓約0.096MPa下減壓。且，在低于大氣壓約0.06MPa下減壓的情況中，對于稻種子證實了X-Gluc染色。
(實施例14)(蠶的轉化)使用蠶(節(jié)肢動物門(Arthropoda)的家蠶)卵。將2ml含有50個蠶卵和質粒DNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中，其中所述蠶卵是從在冰箱中保存的休眠卵中任意選擇的或是從產卵后0-10天之間的非-休眠卵中任意選擇的。作為質粒DNA，使用pWI-GUS質粒中的GUS基因被GFP(綠色熒光蛋白)編碼基因取代的質粒?？蛇x擇性地，使用pigA3GFP質粒(Tamura，Journal of SericulturalScience of Japan，691-12，2000)。使用GFP(綠色熒光蛋白)編碼基因(例如，從Funakoshi Co.，Ltd.，Hongo，Bunkyo-ku，Tokyo，日本購得)。減壓在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行5分鐘。之后，將卵和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓是50V，其中電極之間的距離為1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數為5。進一步使該室在冰上維持2分鐘。
之后，僅僅將已經過電穿孔的卵轉移到具有濾紙的培養(yǎng)皿中。使卵在25℃下生長2-3周。作為飼料，使用商業(yè)購得的人造飼料(KatakuraKogyo，K.K.，Okufu，Sayama-shi，Saitama，日本)等。用紫外線或藍光照射孵出的幼蟲，從而證實從核酸轉移物質發(fā)射出的綠色熒光。
使已經被證實發(fā)出綠色熒光的幼蟲進一步生長為成蟲。使成蟲與其中已經轉移了相同核酸的個體等配對。用紫外線或藍光照射下一代個體，從而通過從其發(fā)射出的綠色熒光的存在證實引入核酸的遺傳。
(實施例15)(大腸桿菌(E.coli)的轉化)使用大腸桿菌(原核生物)。將2ml含有大腸桿菌(約106-108個細胞/ml)和pBC1質粒DNA(10ng/ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進行1分鐘。之后，將大腸桿菌和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓是200V，其中電極之間的距離為1cm，脈沖寬度為2μsec，且脈沖次數為1。使該室進一步在冰上維持2分鐘。
之后，將已經過電穿孔的大腸桿菌轉移到補充了100ppm氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，接著在37℃培養(yǎng)過夜(見，商業(yè)購得的實驗指南，如Molecular Cloning，ver.2，LB瓊脂培養(yǎng)基)。提取大腸桿菌中的質粒DNA和基因組DNA。氨芐青霉素抗性基因的存在是通過PCR等加以證實的。
(實施例16)電穿孔裝置和室在下文中，將參考附圖描述本發(fā)明的電穿孔裝置和電穿孔室。這里解釋所用的附圖僅用于舉例說明。本發(fā)明的范圍不受這些附圖的限制。
圖22表示本發(fā)明實施方案的電穿孔室。該裝置包括用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分和電穿孔部分。在容器(106)中提供有至少一對彼此互相面對的電極(104，105)。值得注意的是，雖然在圖22中描述了一對(兩個)電極(104，105)，但是在容器(106)中可提供不止一對電極。任選地，該容器(106)提供有溫度控制部分(128)。要進行核酸轉移的細胞(109)以及所轉移的核酸分子(110)，任選連同緩沖溶液(111)被放置在容器(106)中。在其中一個實施方案中，容器(106)被放置在另一容器(108)內。它可在容器(108)中維持不同于大氣壓的壓力。容器(108)的內部壓力可通過使用維持不同于大氣壓的壓力的部分(126)，利用氣孔(107)將空氣引入到容器(108)中(增壓)，或從容器(108)中排出(減壓)而改變。如果容器(106)還包括能夠被密封的蓋子和具有用于維持不同于大氣壓的壓力的部分的氣孔，則容器(106)和容器(108)可以相同(即，容器(106)可替換容器(108))。所述裝置還包括用于產生高壓脈沖的部分(101)。所述高壓脈沖產生部分(101)分別經由兩根電線(102，103)與一對電極(104，105)相連。當高壓脈沖產生部分(101)被打開產生高壓脈沖時，與其相連的電極(104)和電極(105)可分別起陽極和陰極，或陰極和陽極的作用。優(yōu)選，高壓脈沖產生部分(101)包括用于顛倒電流方向的極性轉換部分(127)，雖然它可能并不是必需的。通過打開/關閉極性轉換部分(127)，可以兩個方向將高壓脈沖施加于細胞(109)及核酸(110)。
圖23表示本發(fā)明另一實施方案的電穿孔裝置。本裝置包括用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分和電穿孔部分，它們分開安裝在單一的容器(212)內。在該裝置中，用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分包括容器(206-a)。要進行核酸轉移的細胞(209)被放在容器(206-a)中。除細胞(209)之外，被轉移的核酸和/或緩沖液被任選放在容器(206-a)中。在其中一個實施方案中，容器(206-a)放在另一容器(208)內。容器(208)內部可維持在不同于大氣壓的壓力下。容器(208)的內部壓力可通過使用維持不同于大氣壓的壓力的部分(226)，利用氣孔(207)將空氣引入到容器(208)中(增壓)，或從容器(208)中排出(減壓)而改變。如果容器(206-a)還包括能夠被密封的蓋子和具有用于維持不同于大氣壓的壓力的部分的氣孔，則容器(206-a)和容器(208)可以相同(即，容器(206-a)可替換容器(208))。
已經通過上述部分經過減壓和/或增壓的細胞依次被電穿孔部分處理。所述電穿孔部分包括容器(206-b)。容器(206-b)可與容器(206-a)相同或不同。換句話說，用于減壓和/或增壓的容器(206-a)可被用作容器(206-b)。任選，容器(206-a，206-b)提供有溫度控制部分(228-a/228-b)。容器(206-b)內提供有至少一對互相面對的電極(204，205)。值得注意的是，雖然在圖23中描述了一對(兩個)電極(204，205)，但是容器(206-b)中可提供不止一對電極。經過核酸轉移的細胞(209)以及所轉移的核酸分子(210)，任選連同緩沖溶液(211)被放在容器(206-b)中。所述裝置還包括用于產生高壓脈沖的部分(201)。所述高壓脈沖產生部分(201)分別經由兩根電線(202，203)與一對電極(204，205)相連。當打開高壓脈沖產生部分(201)產生高壓脈沖時，與其相連的電極(204)和電極(205)可分別起陽極和陰極，或陰極和陽極的作用。優(yōu)選，高壓脈沖產生部分(201)包括用于顛倒電流方向的極性轉換部分(227)，雖然它可能并不是必需的。通過打開/關閉極性轉換部分(227)，可以兩個方向將高壓脈沖施加于細胞(209)及核酸(210)上。
圖24表示本發(fā)明另一實施方案的電穿孔裝置。本裝置僅包括用于將核酸轉移到細胞中的電穿孔部分。該裝置結合用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下。該裝置包括容器(306)。容器(306)內提供有至少一對電極(304，305)。值得注意的是，雖然圖24中描述了一對(兩個)電極(304，305)，但是在容器(306)中可提供不止一對電極。任選，容器(306)提供有溫度控制部分(328)。要進行核酸轉移的細胞(309)以及所轉移的核酸分子(310)，任選連同緩沖溶液(311)被放在容器(306)中。細胞(309)已經通過任何其它裝置經過了減壓和/或增壓。所述裝置還包括用于產生高壓脈沖的部分(301)。所述高壓脈沖產生部分(301)分別經由兩根電線(302，303)與一對電極(304，305)相連。當打開高壓脈沖產生部分(301)產生高壓脈沖時，與其相連的電極(304)和電極(305)可分別起陽極和陰極，或陰極和陽極的作用。優(yōu)選，高壓脈沖產生部分(301)包括用于顛倒電流方向的極性轉換部分(327)，雖然它可能并不是必需的。通過打開/關閉極性轉化部分(327)，可以兩個方向將高壓脈沖施加于細胞(309)及核酸(310)上。在所述裝置中，電極(304)和電極(305)之間的距離(α)足以容納植物種子。該距離是按照上述定義的。
圖25表示本發(fā)明其中一個實施方案的直角平行六面體的電穿孔室。該室是由能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的材料(例如，聚丙烯等)制成的。在電穿孔室(406)內提供有至少一對互相面對的電極(413，414)，這樣電極與室內壁緊密連接。值得注意的是，雖然在圖25中描述了一對(兩個)電極(413，414)，但是在容器(406)中可提供不止一對電極。電極(413，414)優(yōu)選是沿著彼此面對的兩個內壁放置的平板形式。線(404)和線(405)，它們是由與電極(413，414)相同或不同的金屬制成的，任選從電極(413)和電極(414)伸展。線(404)和線(405)與分別與和高壓脈沖產生部分(401)連接的電線(402)和電線(403)相連?？梢圆惶峁┚€(404)和線(405)。如果不提供，則與高壓脈沖產生部分(401)相連的電線(402)和電線(403)可直接與電極(413)和電極(414)連接。當打開高壓脈沖產生部分(401)產生高壓脈沖時，所連接的電極(413)和電極(414)可分別起陽極和陰極或陰極和陽極的作用。該室具有足夠容納植物種子的大小。室的大小可由內部尺寸，即其橫截面的長(a)×寬(b)×高(c)表示?？扇菁{植物種子的大小是按照上面所定義的。優(yōu)選，能夠容納植物種子的室的大小是長1cm×寬2cm×高2cm。要進行核酸轉移的細胞和被轉移的核酸分子，任選連同緩沖溶液被放在容器(406)中。任選，容器(406)提供有溫度控制部分(428)。
圖26表示本發(fā)明其中一個實施方案的微管形電穿孔室。該室(506-a)是由能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的材料(例如，聚丙烯等)制成的。在室(506-a)內提供有至少一對互相面對的電極(504，505)，這樣電極與室內壁緊密連接。值得注意的是，雖然在圖26中描述了一對(兩個)電極(504，505)，但是在容器(506-a)中可提供不止一對電極。電極(504，505)優(yōu)選是通過使用粘合劑將不銹鋼箔(約5×40mm(厚度約0.1mm))粘在微管內壁上制成的。在特定的實施方案中，每個電極(504，505)的末端從微管(506-a)中伸出。電極(504)和電極(505)的末端分別與和高壓脈沖產生部分(501)連接的電線(502)和電線(503)相連。當打開高壓脈沖產生部分(501)產生高壓脈沖時，所連接的電極(504)和電極(505)可分別起陽極和陰極或陰極和陽極的作用。該室具有足夠容納植物種子的大小。室的大小可由內部尺寸，即其橫截面的直徑(e)×高(d)表示?？扇菁{植物種子的大小是按照上面所定義的。優(yōu)選，能夠容納植物種子的室的大小是直徑1cm×高4cm。要進行核酸轉移的細胞和被轉移的核酸分子，任選連同緩沖溶液被放在容器(506-a)中。微管(506-a)任選包含用于密封關閉微管的蓋子(515)。任選，容器(506-a)提供有溫度控制部分(528)。
在上述實施例中，如圖26所示，微管(506-a)的體具有均勻的橫截面，然后向底部漸細。本發(fā)明的微管形電穿孔室可以是任何其它形式。例如，微管室的體可具有不均勻的橫截面和向底部漸細的形狀(506-b)。在另一實施方案中，該室的體具有從頂部到底部的均勻橫截面(506-c)。在另一實施方案中，該室的體具有506-d中所示的不均勻橫截面。
本發(fā)明的室可以是任何形狀，只要它的大小可使它容納植物種子。該室的大小是否能夠容納植物種子可通過測量與室內壁相切的內切圓直徑加以證實。該內切圓與室內壁上的至少3個任意點相切。例如，如圖27所示，當室為三棱柱的形狀(606)時，與圖27所示三個點相切的最大內切圓(616)直徑(f)是可容納植物種子的大小。例如，如圖27所示，在三棱柱室中提供了至少一對電極(604-a，605-a)。值得注意的是，雖然在圖27的三棱柱室中描述了一對(兩個)電極(604-a，605-a)，但是容器(606)中可提供不止一對電極。同樣，如圖27所示，當室的形狀為五棱柱的形狀(607)時，與圖27所示5個點相切的最大內切圓(617)直徑(g)是可容納植物種子的大小。例如，圖27所示五棱柱室中提供了至少一對電極(604-b，605-b)。值得注意的是，雖然在圖27的五棱柱室中描述了一對(兩個)電極(604-b，605-b)，但容器(607)中可提供不止一對電極。在室具有其它形狀的情況下，最大內切圓的大小(直徑)是使該室容納植物種子的大小。
圖28是表示本發(fā)明自動電穿孔裝置的示意圖。該裝置包括a)用于放置含核酸分子及細胞的混合物的容器(706-a)；b)用于在容器a)中放置核酸分子的部分(724)；c)用于在容器a)中放置細胞的部分(725)；d)用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的容器(708)，所述容器能夠抵抗不同于大氣壓的壓力；e)用于在容器d)中放置細胞的部分(718-a)；f)用于將容器d)維持在不同于大氣壓的壓力下部分(726)；g)用于向含核酸分子及細胞的混合物施加高壓脈沖的容器(720)；h)用于在容器g)中放置含核酸分子及細胞的混合物的部分(718-b)；i)用于向容器g)中含核酸分子及細胞的混合物施加高壓脈沖的部分(701)；和j)用于自動操縱部分b)、c)、e)、f)、h)、和i)的部分(719)。
開始，制備容器(706-a)。將細胞從部分(725)注射到容器(706-a)中。任選，可在細胞注入之前、基本同時、或之后，將核酸分子從部分(724)注射到同一容器(706-a)中。細胞(和，任選地，核酸分子)或含有注射入細胞的容器(706-a)可通過部分(718-a)的作用被放在容器(708)中。容器(708)是由能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的材料(例如，聚丙烯等)制成的。將具有注射入細胞(和，任選地，核酸分子)的容器(706-b)安裝在容器(708)中。在某些情況下，容器(708)和容器(706-b)可以是同一容器。在細胞已經被放在容器(708)中后，可啟動部分(726)。使用部分(726)，將容器(708)的內部維持在不同于大氣壓的壓力下。因此，放在容器(708)中的細胞(和，任選地，核酸分子)經過減壓和/或增壓。已經過減壓和/或增壓的細胞，或含細胞的容器是通過放置部分(718-b)從容器(708)轉移到容器(720)的(含有放在容器(720)中的細胞的容器被表示為706-c(這里，容器(720)和容器(706-c)可以是同一容器))。當核酸分子不包含在容器(706-b/706-c)中時，核酸分子是在放置部分(718-b)啟動之前或之后，從部分(724)注射到容器(706-b/706-c)中的。任選，緩沖溶液可與核酸分子同時或依次注射到容器(706-b/706-c)中。當含細胞及核酸分子的混合物已經被放在容器(720)中時，啟動部分(701)。使用部分(701)，將高壓脈沖施加于容器(720)中含細胞及核酸分子的混合物上。結果，在細胞與核酸分子之間發(fā)生電穿孔。本發(fā)明的電穿孔裝置還包括用于自動控制上述部分(724、725、718-a、726、718-b、和701)的控制部分(719)。如圖28所示，控制部分(719)經由電線(721-a、721-b、721-c、721-d、721-e、和721-f)與部分(724、725、718-a、726、718-b、和701)相連?？刂菩盘柺峭ㄟ^這些電線傳輸的。在本發(fā)明的自動電穿孔裝置中，部分(724)和部分(725)可彼此相同或不同。部分(718-a)和部分(718-b)可彼此相同或不同。容器(706-a)、容器(706-b)、和容器(706-c)可彼此相同或不同。此外，在本發(fā)明的電穿孔裝置中，容器(708)中的減壓和/或增壓以及容器(720)中的電穿孔可以任何順序進行。優(yōu)選，容器(720)中的電穿孔可在容器(708)中的減壓和/或增壓之后進行。
圖29表示本發(fā)明自動電穿孔裝置的更具體的實施方案。在圖29的實施方案中，細胞開始從部分(825)被放到容器(806-a)中。任選，在注射入細胞時，核酸分子可從部分(824)被放到容器(806-a)中。任選，容器(806-a)包括電極(804-a，805-a)。含有注射入細胞(和，任選地，核酸分子)的容器(806-a)是通過部分(818-a)，如皮帶運輸機等，經過容器(808)的入口(822-a)轉移到容器(808)中的。含有注射入細胞(和，任選地，核酸分子)的容器，其被放在容器(808)中，是由806-b(且，在容器(806-b)中提供的電極由804-b，805-b表示)表示的。當把細胞放在容器(808)中時，容器(808)的入口(822-a)和出口(822-b)是閉合的，這樣容器(808)可密閉。在密閉容器(808)中，啟動部分(826)，將容器(808)的內部維持在不同于大氣壓的壓力下。不同于大氣壓的壓力可通過部分(826)的作用，經由氣孔(807)將空氣引入到容器(808)中(增壓)，或從容器(808)中排出(減壓)而產生。包含已經如上所述經過減壓和/或增壓的細胞(和，任選地，核酸分子)的容器(806-b)是通過部分(818-b)，如皮帶運輸機等，經由容器(808)的出口(822-b)向容器(820)轉移的。如果在此時，容器(806-b/806-c)不含核酸分子，則在此轉移步驟內將核酸分子注射到容器(806-b/806-c)中。含有注射入細胞及核酸分子的容器，其已被放在容器(820)中，是由806-c(容器(806-c)中提供的電極是由804-c，805-c表示的)表示的。在細胞及核酸分子已經被放在容器(820)中后，優(yōu)選閉合容器(820)的入口(823-a)和出口(823-b)。容器(820)包括用于產生高壓脈沖的部分(801)。所述高壓脈沖產生部分(801)經由兩根電線(802，803)分別與電極(804-c)和電極(805-c)相連。當打開高壓脈沖產生部分(801)產生高壓脈沖時，所連接的電極(804-c)和電極(805-c)可起陽極和陰極或陰極和陽極的作用。優(yōu)選，高壓脈沖產生部分(801)包括用于顛倒電流的極性轉換部分(827)，雖然它可能并不是必需的。通過打開/關閉極性轉換部分(827)，可以兩個方向將高壓脈沖施加于細胞(809)及核酸分子(810)上。此外，本發(fā)明的自動電穿孔裝置包括用于自動控制上述部分(824、825、818-a、826、818-b、801)的控制部分(819)。如圖29所示，控制部分(819)經由各電線(821-a、821-b、821-c、821-d、821-e、821-f)與部分(824、825、818-a、826、818-b、801)相連?？刂菩盘柺峭ㄟ^電線傳輸的。值得注意的是，在圖29中，用于在容器(806-a)中放置核酸分子的部分(824)和用于在容器(806-a)中放置細胞的部分(825)是作為獨立部分描述的，雖然部分(824，825)可以是同一部分(即，用于在容器(806-a)中放置細胞及核酸的單個部分)。值得注意的是，雖然在圖29中描述了一對(兩個)電極(804-a、805-a；804-b、805-b；804-c、805-c)，但是在容器(分別是806-a；806-b；806-c)中可提供不止一對電極。此外，在圖29中，放置部分(818-a、818-b)被描述為單一的皮帶運輸機，雖然放置部分(818-a、818-b)可以是分開的部分。此外，用于改變壓力的容器(808)和/或用于進行電穿孔的容器(820)可以與含有核酸分子和/或細胞的容器(806-a、806-b、806-c)同時在皮帶運輸機上移動，或代替后者移動?？蛇x擇性地，放置部分可使用沒有皮帶運輸機等的自動泵，通過吸出/排出而將放在容器(806-a)、容器(806-b)、和容器(806-c)中的材料/懸浮液轉移。容器(806-a)、容器(806-b)、和容器(806-c)彼此可以相同或不同。當它們是不同的容器時，內含物(即，細胞和/或核酸分子)在每個容器之間轉移，如從容器(806-a)轉移到容器(806-b)和/或從容器(806-b)轉移到容器(806-c)等。轉移可通過，例如，簡單地傾斜容器，或使用自動分液器/自動移液管/自動泵等吸出/排出而進行。任選，容器(806-a、806-b、806-c)提供有溫度控制部分(828-a、828-b、828-c)。
如上所述，此前已經使用優(yōu)選實施方案舉例說明了本發(fā)明。應了解本發(fā)明的范圍只受權利要求的限定。本說明書中引證的所有專利、專利申請、和公開出版物整體引入此處作為參考，其程度與這里詳細描述的相同。
工業(yè)實用性提供一種簡單且快速的核酸轉移方法。
本發(fā)明的簡單且快速的核酸轉移方法可用于本領域的研究和發(fā)展，從而很容易進行大規(guī)模的處理和大規(guī)模的分析。此外，本發(fā)明可引起研究的顯著進步，潛在導致創(chuàng)新重組體的開發(fā)。
序列表<110>National Institute of Agrobiological Sciences<120>包括減壓/增壓的使用的電穿孔方法<130>AR034PCT<150>JP P2002-207611<151>2002-07-16<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>1ctgcgtgcaa tccatcttg 19<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2actcgtcaag aaggcgatag aag 23<210>3<211>35<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctc 35<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgat 35<210>5<211>882<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探針<400>5tctagaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct60tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 120gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 180ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcccggctat cgtggctggc cacgacgggc 240gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 300ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 360atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 420caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 480
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc540aaggcgcgca tgcccgacgg cgacgatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg600aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg660gcggaccgct atcatgacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc720gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc780gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg840accaagcgac gatgaattcg gcggccgcgg ggatcctcta ga 88權利要求
1.一種用于將核酸轉移到細胞中的方法，包括下列步驟a)將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
2.根據權利要求1所述的方法，其中將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是使細胞經過減壓的步驟。
3.根據權利要求1所述的方法，其中將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是使細胞經過增壓的步驟。
4.根據權利要求1所述的方法，其中將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是在將細胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下的步驟之前進行的。
5.根據權利要求2所述的方法，其中減壓步驟是在比大氣壓低約0.096MPa的壓力下進行的。
6.根據權利要求1所述的方法，其中步驟b)包括在至少兩個方向上向細胞及核酸施加高壓脈沖。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞是植物細胞。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述植物細胞是休眠植物組織的細胞。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述休眠植物組織是種子。
10.根據權利要求7所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述單子葉植物是禾本科植物。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述禾本科植物是小麥(Triticum aestivum L.)。
13.根據權利要求11所述的方法，其中所述禾本科植物是稻(Oryzasativa L.)。
14.根據權利要求11所述的方法，其中所述禾本科植物是玉米(Zeamays L.)。
15.根據權利要求7所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述雙子葉植物是十字花科植物。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述十字花科植物是大白菜(Brassica rapa L.)。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述十字花科植物是油菜(Brassica napus L.)。
19.根據權利要求15所述的方法，其中所述雙于葉植物是豆科植物。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述豆科植物是大豆(Glycine max Merr)。
21.根據權利要求15所述的方法，其中所述雙子葉植物是茄科植物。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述茄科植物是番茄(Lycopersicum esculentum Mill)。
23.根據權利要求15所述的方法，其中所述雙子葉植物是葫蘆科植物。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述葫蘆科植物是日本香瓜(Cucumis melo L.)。
25.根據權利要求15所述的方法，其中所述雙子葉植物是旋花科植物。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述旋花科植物是牽?；?Pharbitis nil Choisy)。
27.一種用于產生植物的方法，其中核酸被轉移到植物細胞中，包括下列步驟a)將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
28.根據權利要求27所述的方法，還包括使細胞分化、生長、和/或增殖的步驟。
29.根據權利要求27或28所述的方法，其中步驟a)包括將含有細胞的種子保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟，且步驟b)包括將含有細胞及核酸的種子置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下的步驟。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述種子是單子葉植物的種子。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述單子葉植物的種子是禾本科的種子。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述禾本科的種子是小麥(Triticum aestivum L.)種子。
33.根據權利要求31所述的方法，其中所述禾本科的種子是稻(Oryza sativa L.)的種子。
34.根據權利要求31所述的方法，其中所述禾本科的種子是玉米(Zea mays L.)種子。
35.根據權利要求29所述的方法，其中所述種子是雙子葉植物的種子。
36.根據權利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是十字花科種子。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述十字花科的種子是大白菜(Brassica rapa L.)的種子。
38.根據權利要求36所述的方法，其中所述十字花科的種子是油菜(Brassica napus L.)的種子。
39.根據權利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是豆科的種子。
40.根據權利要求39所述的方法，其中所述豆科的種子是大豆(Glycine max Merr)的種子。
41.根據權利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是茄科的種子。
42.根據權利要求41所述的方法，其中所述茄科的種子是番茄(Lycopersicum esculentum Mill)的種子。
43.根據權利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是葫蘆科的種子。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述葫蘆科的種子是日本香瓜(Cucumis melo L.)的種子。
45.根據權利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是旋花科的種子。
46.根據權利要求45所述的方法，其中所述旋花科的種子是牽?；?Pharbitis nil Choisy)的種子。
47.一種通過權利要求27-46任何一項所述的方法生產的植物。
48.根據權利要求47所述的植物，其不含體細胞克隆變異。
49.一種用于將核酸轉移到細胞中的裝置，包括a)用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分；和b)用于電穿孔的部分。
50.根據權利要求49所述的裝置，其中用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分具有維持壓力低于大氣壓的能力。
51.根據權利要求49所述的裝置，其中所述細胞是植物細胞。
52.根據權利要求49所述的方法，其中b)的電穿孔部分包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間距離的長度足以容納植物種子。
53.根據權利要求52所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離為至少約5mm。
54.根據權利要求52所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離長于約1cm。
55.根據權利要求52所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
56.根據權利要求49所述的裝置，其中b)的電穿孔部分包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可被容納于第一和第二電極之間。
57.根據權利要求56所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
58.一種用于將核酸轉移到細胞中，并將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的電穿孔裝置，該裝置包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間距離的長度足以容納植物種子。
59.根據權利要求58所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離為至少約5mm。
60.根據權利要求58所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離長于約1cm。
61.根據權利要求58所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
62.一種用于將核酸轉移到細胞中，并將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的電穿孔裝置，該裝置包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可被容納于第一和第二電極之間。
63.根據權利要求62所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
64.一種能抵抗不同于大氣壓的壓力并具有足以容納植物種子大小的電穿孔室。
65.根據權利要求64所述的電穿孔室，其中與電穿孔室內壁上的至少3個點相切的最大內切圓直徑為至少約5mm。
66.根據權利要求64所述的電穿孔室，其中與電穿孔室內壁上的至少3個點相切的最大內切圓直徑長于約1cm。
67.根據權利要求64所述的電穿孔室，其中該室具有四邊形的橫截面，且室的內部尺寸是約1cm×2cm×2cm。
68.根據權利要求64所述的電穿孔室，其中該室具有圓形的橫截面，且室的內部尺寸是約1cm×4cm。
69.一種能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的電穿孔室，其中該室的大小可被改變，從而使植物種子可被容納于室中。
70.一種用于自動進行電穿孔的裝置，包括a)用于放置含核酸及細胞的混合物的容器；b)用于在容器a)中放置核酸的部分；c)用于在容器a)中放置細胞的部分；d)用于將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下的容器，該容器能夠抵抗不同于大氣壓的壓力；e)用于在容器d)中放置細胞的部分；f)用于將容器d)的內部區(qū)域維持在不同于大氣壓的壓力下的部分；g)用于向含核酸及細胞的混合物施加高壓脈沖的容器；h)用于在容器g)中放置含核酸及細胞的混合物的部分；i)用于向容器g)中含核酸及細胞的混合物施加高壓脈沖的部分；和j)用于自動運行部分b)、c)、e)、f)、h)、和i)的部分，其中部分b)和部分c)彼此相同或不同；部分e)和部分h)彼此相同或不同；且容器a)、容器d)、和容器g)彼此相同或不同。
全文摘要
本發(fā)明的目的是建立一種比常規(guī)技術更簡單且更快速的轉化方法。該目的可通過以下方法解決，該方法包括下列步驟a)將細胞保持在不同于大氣壓的壓力下，并且b)將細胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。本發(fā)明取消了基因轉移后通常所需的培養(yǎng)的必要性。因此，本發(fā)明可獲得不能或很難通過常規(guī)技術轉化的物種的轉化體。本發(fā)明的簡單轉化方法可很容易進行大規(guī)模的處理和大規(guī)模的分析，用于本領域的研究和發(fā)展。此外，本發(fā)明可引起研究的顯著進步，潛在導致創(chuàng)新重組體的開發(fā)。
文檔編號C12M1/42GK1668752SQ03816759
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月14日 優(yōu)先權日2002年7月16日
發(fā)明者萩尾高志, 田部井豐 申請人:獨立行政法人農業(yè)生物資源研究所