專利名稱：檢測微生物的寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測微生物的寡核苷酸，檢測微生物的方法以及實(shí)施所述方法的試劑盒。
迄今對微生物的檢測主要通過血清或顯微鏡的方法來實(shí)施。該方法對于少量微生物的直接檢測不夠敏感。因此，迄今在檢測之前是對微生物進(jìn)行繁殖的培養(yǎng)步驟。這種方法的一個不足之處是，一些微生物在可利用的營養(yǎng)物培養(yǎng)基上根本就不生長，因而不能被檢測出。各種環(huán)境樣品的分析表明，可培養(yǎng)的細(xì)菌僅為全部細(xì)菌的0.1-14％。尤其是，已經(jīng)證明依賴于培養(yǎng)的過程對于復(fù)合生物群落組分的分析是不適合的。這是因?yàn)?，依賴于所選擇的培養(yǎng)條件，只有能很好適應(yīng)于這些培養(yǎng)條件的那些微生物的增殖才得到了促進(jìn)，其結(jié)果是起始樣品中占優(yōu)勢的種群比例嚴(yán)重失真。由于這些種群的變化，對微生物的定量分析是完全不可能的。這種方法的另一不足之處是，一些已知的培養(yǎng)過程是非常費(fèi)力的，并且結(jié)果通常是不明確的。這可導(dǎo)致假陽性和假陰性的分析結(jié)果。
鑒于所述培養(yǎng)的不足之處，現(xiàn)代微生物檢測方法都具有一個共同的目標(biāo)通過去除對培養(yǎng)的需求，從而尋求避免培養(yǎng)的不足之處。
用于檢測微生物的現(xiàn)代方法的實(shí)例有基于DNA或基于RNA的雜交或擴(kuò)增方法(DNA＝脫氧核糖核酸，RNA＝核糖核酸)。對雜交特別的理解為形成兩條單鏈互補(bǔ)寡或多核苷酸的雙螺旋。雜交可尤其發(fā)生在兩個DNA或兩個RNA分子之間及DNA和RNA分子之間。各種分子只有當(dāng)靶序列與另一序列足夠互補(bǔ)時才會發(fā)生雜交。
也可對用于檢測的互補(bǔ)靶序列進(jìn)行固定，如所謂的DNA芯片通常所采用的。德國實(shí)用新型專利201 10 013要求了用于口腔疾病，尤其是牙周炎診斷和治療的這樣一種載體(DNA芯片)的權(quán)利。與口腔菌群中某些細(xì)菌或病毒的已知參照序列互補(bǔ)的寡核苷酸固定于該載體上。由于互補(bǔ)性，施用于該基因芯片的寡核苷酸在特定條件下能與對應(yīng)的參照序列雜交。該載體的不足之處是，要么必須通過培養(yǎng)繁殖微生物，要么雜交前必須對所提供樣品的遺傳信息在芯片上進(jìn)行擴(kuò)增。因此，初始存在于樣品中的微生物也不能定量。
已知的擴(kuò)增方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在PCR中，采用特異性引物對特定微生物基因組的特征片段進(jìn)行擴(kuò)增。如果引物發(fā)現(xiàn)其靶位點(diǎn)，則可對遺傳物質(zhì)片段進(jìn)行百萬倍的擴(kuò)增。隨后的分析中可進(jìn)行定性評估，例如采用分離DNA片段的瓊脂糖凝膠。在最簡單的情況下，這提供的信息是所采用引物的靶位點(diǎn)存在于分析樣品中。無任何其他信息可提供。這些靶位點(diǎn)既可源于活細(xì)菌也可源于死細(xì)菌或裸DNA。此處不可能發(fā)生分化。另外，分析樣品中存在的各種物質(zhì)可誘導(dǎo)對DNA擴(kuò)增酶，taq聚合酶的抑制。這是假陰性結(jié)果的普遍原因。PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展是定量PCR，所述定量PCR目的在于在微生物的存在量和擴(kuò)增DNA的量之間建立一種關(guān)聯(lián)。PCR的優(yōu)點(diǎn)包括其高特異性及所需時間較短。主要不足之處是其對污染的高度敏感性及所致的假陽性結(jié)果，上面提及的不能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞或裸DNA，并且，最后，由于存在抑制性物質(zhì)而所致的假陰性結(jié)果。
上世紀(jì)九十年代初，開發(fā)出了采用熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行原位雜交方法，并且已成功用于許多環(huán)境樣品中(Amann等，(1990)，J.Bacteriol.172，762)。該方法被命名為“FISH”(熒光原位雜交)，并且利用了每一細(xì)胞中存在的核糖體核糖核酸既帶有高度保守的又帶有高度可變的，即屬甚或種特異性序列。以這些序列結(jié)構(gòu)域可產(chǎn)生出互補(bǔ)寡核苷酸，并且用可檢測的標(biāo)記物也可另外提供互補(bǔ)寡核苷酸。采用這些所謂的核酸探針，可直接以高特異性鑒定出樣品中的微生物種、屬或群，并且如果必要，甚至可肉眼觀察到或可定量。該方法是提供了生物群落實(shí)際原位狀況的不失真表述的唯一方法。甚至可鑒定從未培養(yǎng)因而也從未描述過的微生物。
在FISH中，探針滲入存在于分析樣品中的細(xì)胞。如果分析樣品中存在開發(fā)探針?biāo)梅N、屬或群的微生物，則微生物細(xì)胞內(nèi)的探針結(jié)合至其靶序列，并且通過探針標(biāo)記可檢測出細(xì)胞。
FISH技術(shù)優(yōu)于上面另外描述的微生物鑒定技術(shù)(培養(yǎng)，PCR)的優(yōu)點(diǎn)是多方面并且是多樣化的。
首先，許多以常規(guī)培養(yǎng)不能檢測的微生物可用探針檢測。通過培養(yǎng)至多只有15％的樣品細(xì)菌菌群可見，而FISH技術(shù)則使得許多樣品中高達(dá)100％的總細(xì)菌菌群可被檢測。其次，通過FISH技術(shù)對微生物的檢測可比通過培養(yǎng)快得多。通過培養(yǎng)進(jìn)行的微生物鑒定通常要花好幾天，而采用FISH技術(shù)，即使在種的水平，取樣和微生物鑒定之間也只需花費(fèi)幾個小時。第三，與培養(yǎng)基相比較，對探針的特異性幾乎可進(jìn)行自由選擇。采用探針可檢測單個種，及至整個屬或微生物菌群。第四，可對樣品本身中的微生物種或整個微生物菌群進(jìn)行精確定量。第五，可對樣品中各種微生物的群叢進(jìn)行肉眼觀察。
與PCR相比較，F(xiàn)ISH只能可靠地檢測活微生物。采用PCR得到的裸DNA或死微生物的假陽性結(jié)果不會發(fā)生于FISH中。另外，與可歸因于污染的假陽性結(jié)果差不多，由于抑制性物質(zhì)存在而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果也被排除。
因此，F(xiàn)ISH技術(shù)對于快速和高特異性地直接檢測樣品中的微生物是一種出色手段。與培養(yǎng)方法相比，它是直接的并且甚至能使樣品中存在的微生物得以定量。
例如面積為約2m2的人體肌膚，是微生物寄居的最大人體器官之一。在進(jìn)化過程中，宿主與其微生物寄居者之間形成了緊密的關(guān)系。由肌膚通過各種腺體提供的營養(yǎng)物被微生物代謝。由此導(dǎo)致的肌膚表面的酸化防止了肌膚被病原微生物所寄居。
然而，微生物的代謝活性也可產(chǎn)生有害效果。例如，肌膚氣味和頭皮屑的產(chǎn)生以及各種肌膚疾病的發(fā)生均可歸因于微生物的活性。
例如，酵母樣鱗斑霉屬(yeast Malassezia)被懷疑特別地與諸如頭皮的肌膚磷屑有關(guān)。此外，這種微生物也被認(rèn)為是皮膚病變色糠疹(Pityriasis versicolor)的根源。
痤瘡丙酸桿菌存在的增加也是痤瘡發(fā)生的信號，即使是在早期。
原則上，所有的微生物均屬于可從肌膚分離的肌膚菌群。根據(jù)Price的觀點(diǎn)，有兩個不同的菌群(Price，P.B.正常肌膚的細(xì)菌學(xué)用于研究細(xì)菌菌群和機(jī)械去污的消毒活性的新定量試驗(yàn)(The bacteriology ofthe normal skinA new quantitative test applied to a study of the bacterialflora and the disinfectant action of mechanical cleansing.)J.Infect.Dis.，63301-318，1938)。
a)常住菌能夠在人體肌膚上增殖的微生物，或者在肌膚樣品分析中，發(fā)現(xiàn)能規(guī)則地大量或高百分比存在的微生物。需要聲明的是，上述屬性可歸因于這些常住微生物對肌膚的堅固錨定(附著)。
b)過渡菌不能在人體肌膚上增殖的微生物，或者分析中僅發(fā)現(xiàn)不規(guī)則地且以少量/百分比存在的微生物。理論上，這些微生物是游離的，即不能粘附于肌膚成分上。
鑒于尋求新藥用或化妝品用活性組分所需，對肌膚常住菌的更全面認(rèn)識是尤為重要的。另外，各種微生物之間的相互作用可開啟對健康肌膚和肌膚疾病之間關(guān)系的更廣闊理解，并促進(jìn)更好的有效成分、治療劑或藥物的開發(fā)。諸如除臭劑、乳膏等化妝產(chǎn)品對相關(guān)肌膚微生物的選擇性影響，也可推測出對肌膚微生態(tài)體系結(jié)構(gòu)和功能的全面認(rèn)識。
因此，目前需要適合作為其它更廣泛微生物的核酸探針的寡核苷酸，從而可以開新的應(yīng)用領(lǐng)域。尤其是，目前需要用于檢測與人和/或動物接觸的微生物，例如食品中，廢水中，環(huán)境樣品中或者來自皮膚表面微生物的探針。
因此，本發(fā)明致力于解決的問題是提供檢測微生物或者微生物群的寡核苷酸，其能對樣品中的這些微生物進(jìn)行快速及任選定量的確定，并且，盡管同時存在其他微生物，仍能安全地檢測出單個微生物種或微生物種群。
這個問題已經(jīng)通過提供用于檢測微生物的寡核苷酸以及通過使用這些寡核苷酸的方法以及實(shí)施所述方法的試劑盒得以解決，所述寡核苷酸選自i)帶有SEQ ID NO.01至30中所示序列的寡核苷酸，以及ii)與i)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，其核苷酸對應(yīng)比率至少為80％，優(yōu)選為至少84％，更優(yōu)選為至少90％，最優(yōu)選為95％，以及iii)衍生自所提及的i)和ii)的寡核苷酸之一的寡核苷酸，序列被刪除或延長了一個或多個核苷酸，以及iv)在嚴(yán)格條件下，能和與所提及的i)、ii)或iii)寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸。
在本發(fā)明上下文中，對術(shù)語“微生物群”的理解是包含了至少兩個微生物種，所述微生物種可屬于同一屬，或者具有非常類似的rRNA。例如，根據(jù)本發(fā)明的微生物群也可包含某一屬的所有種。
除了帶有SEQ ID NO.01至18中所示序列的寡核苷酸，以及與其核苷酸對應(yīng)比率至少為80％，優(yōu)選為至少84％，更優(yōu)選為至少90％，最優(yōu)選為95％的寡核苷酸之外，本發(fā)明還包含衍生自所提及寡核苷酸，被延長或刪除了一個或多個核苷酸的寡核苷酸。
另外，除了帶有SEQ ID NO.19至30中所示序列的寡核苷酸，以及與其核苷酸對應(yīng)比率至少為77％，優(yōu)選為至少83％，更優(yōu)選為至少88％，最優(yōu)選為94％的寡核苷酸外，本發(fā)明還包含衍生自所提及寡核苷酸，被延長或刪除了一個或多個核苷酸的寡核苷酸。
更特別地，還可將1-40個，優(yōu)選為1-25個，更特別地為1-15個核苷酸連接至所提及寡核苷酸的3’末端和或5’末端。
根據(jù)本發(fā)明，也可采用衍生自所提及寡核苷酸的寡核苷酸，所述衍生方法為從序列中刪去1-7個，優(yōu)選為1-5個，更優(yōu)選為1-3個核苷酸，例如1個或2個核苷酸。
在一個特別的實(shí)施方案中，待選擇的微生物選自葡萄球菌屬、消化鏈球菌屬、棒狀桿菌屬、丙酸桿菌屬、榮氏球菌屬、鱗斑霉菌屬和/或Sporomusa類。
迄今，僅通過已知培養(yǎng)方法調(diào)查研究過肌膚微生物群落。由于此類方法的上述缺陷，僅有可培養(yǎng)的細(xì)菌或真菌可被檢測出。這些種的實(shí)例包括金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，科氏葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，頭狀葡萄球菌，沃氏葡萄球菌，松鼠葡萄球菌，施氏葡萄球菌，中間葡萄球菌，Veillonella spec.，痤瘡丙酸桿菌，Malassezia sloffiae，厚皮鱗斑霉菌，秕糠鱗斑霉菌，微小棒狀桿菌，無枝菌酸棒狀桿菌，紋狀棒狀桿菌及結(jié)膜干燥棒狀桿菌。
采用本發(fā)明的寡核苷酸，可方便地檢測出這些和其他所提及屬的種，不僅僅是定性，還能定量。這些定量信息可用于，首要的是用于試驗(yàn)有效成分或者肌膚疾病的早期診斷。此外，上述的微生物屬也可以存在于其它樣品中，例如食品中，臨床檢驗(yàn)材料或者環(huán)境樣品中。
在本發(fā)明上下文中，對“肌膚”的理解是人體肌膚和/或動物肌膚或粘膜以及肌膚附屬物(毛發(fā)、毛囊、指甲、腺體)。
在一個特定實(shí)施方案中，寡核苷酸帶有可檢測的標(biāo)記(優(yōu)選為熒光標(biāo)記物)，所述標(biāo)記物優(yōu)選為共價結(jié)合至寡核苷酸。寡核苷酸與靶序列所完成的雜交的可檢測性對于鑒定以及任選的微生物定量是必要的。尤其是，這通常通過將可檢測標(biāo)記物共價結(jié)合至寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)。所使用的可檢測標(biāo)記物通常是熒光基團(tuán)，例如Cy-2，Cy-3或Cy-5(Amersham Life Sciences，Inc.，Arlington Heights，USA)，F(xiàn)ITC(熒光素異硫氰酸酯)，CT(5，(6)-羧基四甲基若丹明-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Molecular Probes Inc.，Eugene，USA))，TRITC(四甲基若丹明-5，6-異硫氰酸酯(Molecular Probes Inc.，見上)或FLUOS(5，(6)-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)?；蛘撸刹捎没瘜W(xué)發(fā)光基團(tuán)或放射性標(biāo)記物，例如35S，32P，33P，125J。然而，通過將寡核苷酸偶聯(lián)至酶活性分子也可獲得可檢測性，所述酶活性分子例如為堿性磷酸酶，酸性磷酸酶，過氧化物酶，辣根過氧化物酶，β-D-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。這些酶各自都有許多已知的生色團(tuán)，所述生色團(tuán)代替天然底物與酶反應(yīng)，并產(chǎn)生帶顏色或熒光的產(chǎn)物。這種生色團(tuán)的實(shí)例列于如下表1中。
表1酶 生色團(tuán)堿性磷酸酶及酸性磷酸酶 4-甲基傘形基-磷酸鹽(*)雙(4-甲基傘形基磷酸鹽)， (*)3-O-甲基熒光素，黃酮-3-二磷酸三銨鹽(*)，對-硝基苯基磷酸二鈉鹽過氧化物酶 鹽酸酪胺(*)，3-(對-羥基苯基)-丙酸(*)，對-羥基苯乙基醇(*)，2，2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS)，鄰-亞苯基二胺二鹽酸化物，鄰-聯(lián)茴香胺，5-氨基水楊酸，p-ucresol(*)，3，3’-二甲氧基聯(lián)苯胺，3-甲基-2-苯并噻唑啉腙，四甲基聯(lián)苯胺辣根過氧化物酶 H2O2+二銨聯(lián)苯胺H2O2+四甲基聯(lián)苯胺β-D-半乳糖苷酶 鄰-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷4-甲基傘形基-β-D-半乳糖苷葡萄糖氧化酶 ABTS，葡萄糖和噻唑基藍(lán)*發(fā)熒光最后，寡核苷酸可以設(shè)計為適合于雜交的另一核酸序列位于其5’或3’末端。該核酸序列同樣含有約15-1,000個核苷酸，優(yōu)選15-50個核苷酸。該二級核酸區(qū)域可通過上面述及的手段檢測的寡核苷酸依次識別。
另一可能性是將可檢測的寡核苷酸偶聯(lián)至半抗原，所述半抗原隨后可與識別半抗原的抗體相接觸。地高辛配基可以作為這種半抗原的實(shí)例。除那些已提及的外，其他實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
更特別地，酶標(biāo)記物選自過氧化物酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，以及磷酸酶，優(yōu)選為堿性磷酸酶。
本發(fā)明也涉及用于檢測微生物的組合寡核苷酸，含有至少一種并且優(yōu)選地兩種或者多種上述的寡核苷酸。
在本發(fā)明的上下文中，組合寡核苷酸被理解為含有以諸如溶液(例如緩沖溶液)或混合物(例如凍干狀態(tài))形式存在的至少一種或多種寡核苷酸。另外，該寡核苷酸也可與另一寡核苷酸(例如在芯片上或者在試劑盒中)一同存在，但是相互分開(例如在不同的容器中)。
在一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合寡核苷酸含有i)至少一種用于特異性檢測葡萄球菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.01至03中所示序列的寡核苷酸以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或ii)至少一種用于特異性檢測消化鏈球菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.04至06及27至29所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)苛條件下，能和與a)，b)或c)寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或iii)至少一種用于特異性檢測棒狀桿菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.07至12及19至26所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或iv)至少一種用于特異性檢測韋榮氏球菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.13至15所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或v)至少一種用于特異性檢測痤瘡丙酸桿菌種細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.16及17所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或vi)至少一種用于特異性檢測鱗斑霉菌屬真菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自
a)帶有SEQ ID NO.18所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或vii)至少一種用于特異性檢測源自Sporomusa類微生物的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.30所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所提及，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)苛條件下，能和與a)，b)或c)寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸。
本發(fā)明的寡核苷酸特別適合于葡萄球菌屬、消化鏈球菌屬、棒狀桿菌屬、丙酸桿菌屬、榮氏球菌屬、鱗斑霉菌屬和/或Sporomusa類微生物的特異性檢測。
因此，從組i)至組vii)的一種或多種寡核苷酸的如下組合是可能的。這是指，例如，從組i)，ii)，iii)，iv)，v)，vi)或vii)之一選擇一種或多種寡核苷酸。
組i)的一種或多種寡核苷酸與組ii)的一種或多種寡核苷酸的組合，以及類似地，組i)與組iii)，組i)與組iv)，組i)與組v)，組i)與組vi)，組i)與組vii)，組ii)與組iii)，組ii)與組iv)，組ii)與組v)，組ii)與組vi)，組ii)與組vii)，組iii)與組iv)，組iii)與組v)，組iii)與組vi)，組iii)與組vii)，組iv)與組v)，組iv)與組vi)，組iv)與組vii)，組v)與組vi)，組v)與組vii)，以及組vi)與組vii)寡核苷酸的組合是本發(fā)明所含范圍。
根據(jù)本發(fā)明，組i)，ii)和iii)的一種或多種寡核苷酸的組合，以及類似地，組i)與ii)和iv)；組i)與ii)和v)；組i)與ii)和vi)；組i)與ii)和vii)，組i)與iii)和iv)；組i)與iii)和v)；組i)與iii)和vi)，組i)與iii)和vii)；組i)與iv)和v)；組i)與iv)和vi)；組i)與iv)和vii)，組i)與v)和vi)，組i)與v)和vii)；組ii)與iii)和iv)；組ii)與iii)和v)；組ii)與iii)和vi)；組ii)與iii)和vii)；組ii)與iv)和v)；組ii)與iv)和vi)，組ii)與iv)和vii)；組ii)與v)和vi)，組ii)與v)和vii)；組iii)與iv)和v)；組iii)與iv)和vi)，組iii)與iv)和vii)；組iii)與v)和vi)，組iii)與v)和vii)以及組iv)與v)和vi)，組iv)與v)和vii)，組iv)與vi)和vii)，組v)與vi)和vii)寡核苷酸的組合也是可以的。
各自選自四組的一種或多種寡核苷酸的組合，即組i)與ii)，iii)和iv)；組i)與ii)，iii)和v)；組i)與ii)，iii)和vi)；組i)與ii)，iii)和vii)；組i)與ii)，iv)和v)；組i)與ii)，iv)和vi)；組i)與ii)，iv)和vii)；組i)與ii)，v)和vi)；組i)與ii)，v)和vii)；組i)與ii)，vi)和vii)；組i)與iii)，iv)和v)；組i)與iii)，iv)和vi)；組i)與iii)，iv)和vii)；組i)與iii)，v)和vi)；組i)與iii)，v)和vii)；組i)與iv)，v)和vi)；組i)與iv)，v)和vii)；組i)與iv)，vi)和vii)；組ii)與iii)，iv)和v)；組ii)與iii)，iv)和vi)；組ii)與iii)，iv)和vii)；組ii)與iii)，v)和vi)；組ii)與iii)，v)和vii)或者組iii)與iv)，v)和vi)；組iii)與iv)，v)和vii)；組iii)與iv)，vi)和vii)的組合也可采用。
來自五組的一種或多種寡核苷酸的組合，即組i)與ii)，iii)，iv)和v)；組i)與ii)，iii)，iv)和vi)；組i)與ii)，iii)，iv)和vii)；組i)與ii)，iii)，v)和vi)；組i)與ii)，iii)，v)和vii)；組i)與iii)，iv)，v)和vi)；組i)與iii)，iv)，v)和vii)；組i)與ii)，iv)，v)和vi)；組i)與ii)，iv)，v)和vii)；組i)與ii)，iv)，vi)和vii)，；組ii)與iii)，iv)，v)和vi)；組ii)與iii)，iv)，v)和vii)的組合也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
來自六組的一種或多種寡核苷酸的組合，即組i)與ii)，iii)，iv)，v)和vi)；組i)與ii)，iii)，iv)，v)和vii)；組i)與iii)，iv)，v)，vi)和vii)；組ii)與iii)，iv)，v)，vi)和vii)，以及選自全部七組的一種或多種寡核苷酸的組合也是本發(fā)明的范圍。
因此，本發(fā)明的組合寡核苷酸適合于檢測微生物種或微生物群。為此目的，選擇組i)的一種或多種寡核苷酸，例如可用于檢測葡萄球菌屬的某幾個種。
另外，然而，通過組合寡核苷酸的合適組分(根據(jù)所提及的可能組合)，可同時和/或彼此并列地、方便地實(shí)施對所提及各種屬的微生物種和/或群的檢測。
例如，采用合適的組合寡核苷酸，可同時實(shí)施對葡萄球菌屬微生物(通過選擇一種或多種組i)的寡核苷酸)和/或與棒狀桿菌屬微生物的同時檢測，一道(通過選擇一種或多種組iii)寡核苷酸)。通過各種組合可個別地適合于滿足特定需求。
迄今考慮到用于檢測微生物的寡核苷酸的選擇，在待檢測的微生物中存在合適的互補(bǔ)序列是尤為重要的。滿足如下條件的序列認(rèn)為合適的一方面，該序列對待檢測微生物具有特異性，另一方面，可實(shí)際接受插入的寡核苷酸，即不會被核糖體蛋白質(zhì)或rRNA二級結(jié)構(gòu)所掩蔽。即使Fuchs等人(B.M.Fuchs，G.Wallner，W.Besiker，I.Schwippi，W.Ludwig and R.AmannFlow cytometric analysis of the in situaccessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeledoligonucleotide probes.Appl.Environ Microbiol.1998，64(12)4973-4982)顯示以初級序列數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)開發(fā)的大量寡核苷酸如果存在的話，只可以用于限制范圍的原位雜交。rRNA次級結(jié)構(gòu)域或者核糖體蛋白覆蓋的可能寡核苷酸結(jié)合位點(diǎn)被引用作為上述寡核苷酸不能令人滿意的結(jié)合。這種不能結(jié)合的區(qū)域?qū)γ糠N生物而言是不同的并且每種生物都必須重新去發(fā)現(xiàn)。因此，具有良好結(jié)合特性的寡核苷酸的序列不能從rRNA的初級序列被揭示，即使是專業(yè)人員，因此也不能源于這種程序的共有序列。
通過選擇本發(fā)明的特定序列，則可能檢測出微生物種，微生物屬或微生物群。對于15個核苷酸的寡核苷酸而言，序列存在的互補(bǔ)性應(yīng)在100％之上。對于含15個以上核苷酸的寡核苷酸，允許有一至數(shù)個錯配位點(diǎn)。
尤其是，本發(fā)明提供了含有用于葡萄球菌屬微生物特異性檢測的寡核苷酸，所述寡核苷酸與rRNA互補(bǔ)，并選自帶有SEQ ID NO.01至03中所示序列的寡核苷酸。
每一種所提及的寡核苷酸檢測葡萄球菌屬的至少一種如下種金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，解糖葡萄球菌，山羊葡萄球菌，頭狀葡萄球菌，沃氏葡萄球菌，巴斯德葡萄球菌，阿爾萊特葡萄球菌，雞葡萄球菌，科氏葡萄球菌，S.succinus，克氏葡萄球菌，腐生葡萄球菌，馬胃葡萄球菌，木糖葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，S.lugdunesis，產(chǎn)色葡萄球菌，耳葡萄球菌，施氏葡萄球菌，松鼠葡萄球菌，緩慢葡萄球菌，S.vitulus，S.pulveri，S.felis，豬葡萄球菌，S.piscifermentans，肉葡萄球菌，模仿葡萄球菌，中間葡萄球菌，S.delphini，S.muscae和S.condimenti。
具有類似的rRNA序列，但不屬于葡萄球菌屬的微生物，不會被這些探針方便地檢測出來多粘類芽孢桿菌，豆形桿菌，蠟樣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，炭疽芽孢桿菌，普通變形菌，洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)，單形擬桿菌，Pediococcus damnosus。這是一特別的優(yōu)點(diǎn)，顯示出探針的高特異性。
帶有SEQ ID NO.02所示序列的寡核苷酸適合于葡萄球菌屬微生物的檢測，尤其適用于中間葡萄球菌，S.delphini，S.muscae，S.condimenti，S.piscifermentans，肉葡萄球菌，施氏葡萄球菌，S.felis和模仿葡萄球菌，優(yōu)選為中間葡萄球菌和施氏葡萄球菌。
本發(fā)明帶有SEQ ID NO.01至02中所示序列的寡核苷酸的組合是特別優(yōu)選的。這種組合可檢測出葡萄球菌屬的至少如下種金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，山羊葡萄球菌，頭狀葡萄球菌，沃氏葡萄球菌，巴斯德葡萄球菌，阿爾萊特葡萄球菌，雞葡萄球菌，科氏葡萄球菌，S.succinus，克氏葡萄球菌，腐生葡萄球菌，馬胃葡萄球菌，木糖葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，S.lugdunesis，產(chǎn)色葡萄球菌，耳葡萄球菌，施氏葡萄球菌，松鼠葡萄球菌，緩慢葡萄球菌，S.vitulus，S.pulveri，中間葡萄球菌，S.delphini，S.felis，S.muscae，S.condimenti，S.piscifermentans，肉葡萄球菌和模仿葡萄球菌。
更特別地，本發(fā)明也提供了用于消化鏈球菌屬微生物特異性檢測的寡核苷酸，所述寡核苷酸與rRNA互補(bǔ)，并選自帶有SEQ ID NO.04至06和27至29中所示序列的寡核苷酸。
根據(jù)最新知識，屬名為消化鏈球菌的已知細(xì)菌可歸為各個亞群，尤其是Anaerococcus，Peptoniphilus和Finegoldia屬。
每一種所提及的寡核苷酸可檢測出合稱為“消化鏈球菌”的Anaerococcus，Peptoniphilus和Finegoldia屬的至少一種如下種P.assaccharolyticus，P.lacrimalis，P.hareii，F(xiàn).magnus，A.tetradius，A.hydrogenalis，A.lactolyticus，A.octavius和A.vaginalis。
帶有SEQ ID NO.04至06序列的寡核苷酸是特別優(yōu)選的。這些寡核苷酸各自可檢測出消化鏈球菌屬，尤其是Anaerococcus屬的至少如下種Anaerococcus hydrogenalis，A.lactolyticus，A.octavius，A.prevotii，A.tetratidius和A.vaginalis。
如下所提及消化鏈球菌屬的種，以及具有相似rRNA序列但不屬于消化鏈球菌屬，尤其是Anaerococcus屬的其他微生物，不會被方便地檢測出Peptoniphilus lacrimalis，厭氧消化鏈球菌，F(xiàn)inegoldia magnus和Ruminococcus productus，表皮短桿菌，Abiotropha elegans和矛形梭菌。
在一個特別優(yōu)選實(shí)施方案中，帶有SEQ ID NO.04中所示序列的寡核苷酸尤其優(yōu)選。該寡核苷酸可檢測出屬名為“消化鏈球菌”的微生物的至少如下種Anaerococcus hydrogenalis，A.lactolyticus，A.octavius，A.prevotii和A.vaginalis。
尤其是，本發(fā)明還提供了用于消化鏈球菌屬微生物特異性檢測的寡核苷酸，所述寡核苷酸與rRNA互補(bǔ)，并選自帶有SEQ ID NO.27至29中所示序列的寡核苷酸。
如下所提及消化鏈球菌屬的種，以及具有相似rRNA序列但不屬于消化鏈球菌屬的其他微生物，不會被方便地檢測出Micromonasmicros，Helcococcus kunzii，Helcococcus ovis。
帶有SEQ ID NO.27和28中所示序列的寡核苷酸尤其優(yōu)選。這些寡核苷酸可檢測出Peptoniphilus屬的至少如下種Peptoniphilusassaccharolyticus，P.hareii，P.indolicus(更特別為菌株ATCC29427和緊密相關(guān)菌株，即具有極相似rRNA的菌株)和P.lacrimalis。
具有相似rRNA的如下種不被這些寡核苷酸檢測出嗜糖假單胞桿菌，Variovorax paradoxus，F(xiàn)inegoldia magna，表皮葡萄球菌，痤瘡丙酸桿菌，Micromonas micros，Gallicola baranese，Atopobiumparvulum，殊異韋榮氏菌，惡臭假單胞菌，以及Anaerococcus和棒狀桿菌屬的種。
帶有SEQ ID NO.28中所示序列的寡核苷酸可特別地檢測出Peptoniphilus lacrimalis種的微生物。
帶有SEQ ID NO.29中所示序列的寡核苷酸也尤其優(yōu)選。這種寡核苷酸可從屬名為“消化鏈球菌”的已知微生物中，檢測出至少Finegoldia magna種及rRNA序列與該種非常相似的其他微生物，而如下微生物則不能被同時檢測出Anaerococcus hydrogenalis，厭氧消化鏈球菌，Peptoniphilus lacrimalis，表皮葡萄球菌，Halocellacellulosilytica，痤瘡丙酸桿菌，Micromonas micros，殊異韋榮氏菌，惡臭假單胞菌，以及Anaerococcus，棒狀桿菌屬和Peptoniphilus屬的其他種。
尤其是，本發(fā)明的提供了用于棒狀桿菌屬微生物特異性檢測的寡核苷酸，所述寡核苷酸與rRNA互補(bǔ)，并選自帶有SEQ ID NO.07至12中所示序列的寡核苷酸。
所提及的寡核苷酸各自可檢測棒狀桿菌屬的至少一種如下種谷氨酸棒狀桿菌，Corynebacterium lipophiloflavum，C.glucuronolyticum，麥?zhǔn)习魻顥U菌，擁擠棒狀桿菌，C.fastidiosum，C.segmentosum，嗜氨棒狀桿菌，極小棒狀桿菌，C.flavescens，C.coyleiae，非發(fā)酵棒狀桿菌，C.pseudogenitalium，C.genitalium，C.mucofaciens，耳棒狀桿菌，C.mycetoides，膀胱炎棒狀桿菌，多毛棒狀桿菌，假結(jié)核棒狀桿菌，潰瘍棒狀桿菌，白喉棒狀桿菌，C.vitarumen，庫氏棒狀桿菌，C.genitalium，C.argentoratens，C.callunae，牛棒狀桿菌，C.variabilis，無枝菌酸棒狀桿菌，C.tuberculostearicum，結(jié)膜干燥棒狀桿菌，C.matruchotii，杰氏棒狀桿菌，C.efficiens，C.thomsenii，黑色棒狀桿菌，C.auriscanis，C.mooreparkense，干酪棒狀桿菌，C.camporealensis，C.sundsvallense，C.mastidis，C.imitans，C.riegelii，C.asperum，C.freneyi，紋帶棒狀桿菌，C.coyleiae和模仿棒狀桿菌。
具有相似rRNA序列，但不屬于棒狀桿菌屬的微生物，不會被這些寡核苷酸方便地檢測出丙酮丁醇梭桿菌，Eubacterium moniliforme和核粒梭桿菌。屬于肌膚微生物群落的如下細(xì)菌也不會被檢測出藤黃微球菌、變異微球菌、Micrococcus lyae、醋酸鈣不動桿菌和化膿性鏈球菌。這是一特別優(yōu)點(diǎn)，顯示出探針的高特異性。
帶有SEQ ID NO.10中所示序列的寡核苷酸特別優(yōu)選用于紋帶棒狀桿菌和/或結(jié)膜干燥棒狀桿菌種的棒狀桿菌的檢測。
另外，帶有SEQ ID NO.11中所示序列的寡核苷酸用于杰氏棒狀桿菌種的棒狀桿菌檢測。
帶有SEQ ID NO.07，08，10和11中所示序列的寡核苷酸的組合尤其優(yōu)選。這種組合可檢測棒狀桿菌屬的至少如下種谷氨酸棒狀桿菌，Corynebacterium lipophiloflavum，C.glucuronolyticum，麥?zhǔn)习魻顥U菌，擁擠棒狀桿菌，C.fastidiosum，C.segmentosum，嗜氨棒狀桿菌，極小棒狀桿菌，C.flavescens，C.coyleiae，非發(fā)酵棒狀桿菌，C.pseudogenitalium，C.“genitalium”，C.mucofaciens，耳棒狀桿菌，C.mycetoides，膀胱炎棒狀桿菌，多毛棒狀桿菌，假結(jié)核棒狀桿菌，潰瘍棒狀桿菌，白喉棒狀桿菌(C.diphteriae)，C.camporealensis，C.vitarumen，庫氏棒狀桿菌，C.argentoratens，C.callunae，牛棒狀桿菌，牛腎盂炎棒狀桿菌，C.riegelii，變異棒狀桿菌，無枝菌酸棒狀桿菌，C.“tuberculostearicum”，結(jié)膜干燥棒狀桿菌，C.matruchotii，杰氏棒狀桿菌。
在一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于棒狀桿菌屬微生物特異性檢測的寡核苷酸，所述寡核苷酸與rRNA互補(bǔ)，并選自帶有SEQ IDNO.19至26中所示序列的寡核苷酸。
所提及的每一種寡核苷酸可檢測棒狀桿菌屬的至少如下種之一C.coyleiae，非發(fā)酵棒狀桿菌，C.“genitalium”，C.mucifaciens，無枝菌酸棒狀桿菌，C.“tuberculostearicum”和C.riegelii。這些寡核苷酸適合用于棒狀桿菌屬的一個或多個非常緊密相關(guān)種群的特異性檢測。
具有相似rRNA序列的如下微生物不會被這些寡核苷酸方便地檢測出丙酮丁醇梭桿菌，Eubacterium yurii和核粒梭桿菌。屬于肌膚微生物群落的如下細(xì)菌也不會被檢測出藤黃微球菌、變異微球菌、Micrococcus lyae、醋酸鈣不動桿菌和化膿性鏈球菌。這是一特別優(yōu)點(diǎn)，并且顯示出探針的高特異性。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶有SEQ ID NO.19中所示序列的寡核苷酸用于檢測如下微生物源于棒狀桿菌屬、由C.“tuberculostearicum”(更特別為ATCC 35692)形成的微生物群，或者名為CDC G5840(存取號X80498)菌株的周圍群，以及帶有非常相似的rRNA的微生物，即與所提及微生物極緊密相關(guān)的微生物，或者其rRNA同一性程度很高，和/或在與所提及寡核苷酸雜交的區(qū)域，與所提及微生物的rRNA完全或幾乎完全對應(yīng)(即帶有一個或多個偏差，優(yōu)選為一至三個核苷酸偏差)的微生物。
這種探針可方便檢測出C.“tuberculostearicum”和帶有極相似rRNA的棒狀桿菌屬種，而不會檢測出如下棒狀桿菌屬的更不相關(guān)種極小棒狀桿菌，白喉棒狀桿菌，紋帶棒狀桿菌，結(jié)膜干燥棒狀桿菌，C.“fastidiosum”，C.camporealensis，擁擠棒狀桿菌以及C.“pseudogenitalium”，核非發(fā)酵棒狀桿菌，杰氏棒狀桿菌，C.durum，C.mucifaciens，牛腎盂炎棒狀桿菌，C.riegelii，谷氨酸棒狀桿菌，C.lipophilofiavum，C.glucuronolyticum，嗜氨棒狀桿菌，C.coyleiae，假結(jié)核棒狀桿菌，庫氏棒狀桿菌，C.callunae和解脲棒狀桿菌。
帶有SEQ ID NO.20中所示序列的探針尤其優(yōu)選用于無枝菌酸棒狀桿菌和緊密相關(guān)種的特異性檢測。這種探針可方便地檢測無枝菌酸棒狀桿菌和帶有非常相似的rRNA，且在與所提及寡核苷酸雜交的rRNA部分僅有少數(shù)錯配，優(yōu)選為沒有錯配的棒狀桿菌屬的種，而不會檢測出如下棒狀桿菌屬的更不相關(guān)種C.“asperum”，杰氏棒狀桿菌，牛棒狀桿菌，C.freneyi，非發(fā)酵棒狀桿菌，C.durum，C.matruchotii，C.mucifaciens，牛腎盂炎棒狀桿菌，谷氨酸棒狀桿菌和結(jié)膜干燥棒狀桿菌，以及C.lipophiloflavum，C.glucuronolyticum，極小棒狀桿菌，嗜氨棒狀桿菌，C.camporealensis，C.coyleiae，假結(jié)核棒狀桿菌，C.riegelii，庫氏棒狀桿菌，C.callunae和解脲棒桿菌。
帶有SEQ ID NO.21中所示序列的探針尤其優(yōu)選地用于某些種的微生物的檢測，更特別地用于棒狀桿菌屬的檢測，所述棒狀桿菌屬與SEQ ID NO.31中所示16S rRNA的部分序列的核苷酸對應(yīng)至少為60％，優(yōu)選為至少70％，更優(yōu)選為至少80％，最優(yōu)選為至少90％，例如至少95％。
這種探針可方便地檢測出棒狀桿菌屬的上述種，而不會檢測出如下棒狀桿菌屬的更不相關(guān)種C.“genitalium”，C.mucifaciens，C.coyleiae，C.glucuronolyticum，非發(fā)酵棒狀桿菌，C.pseudogenitalium，C.lipophiloflavum，以及無枝菌酸棒狀桿菌，杰氏棒狀桿菌，C.durum，牛腎盂炎棒狀桿菌，紋帶棒狀桿菌，谷氨酸棒狀桿菌，擁擠棒狀桿菌，結(jié)膜干燥棒狀桿菌，極小棒狀桿菌，C.camporealensis，C.coyleiae，假結(jié)核棒狀桿菌，庫氏棒狀桿菌，C.callunae和解脲棒狀桿菌。
帶有SEQ ID NO.23中所示序列的探針特別優(yōu)選地用于非發(fā)酵棒狀桿菌種的棒狀桿菌檢測。
這種探針可方便地檢測出非發(fā)酵棒狀桿菌，以及帶有非常相似的rRNA的棒狀桿菌屬的種，而不會檢測出如下棒狀桿菌屬的更不相關(guān)種C.“genitalium”，C.mucifaciens，嗜氨棒狀桿菌，C.coyleiae，C.glucuronolyticum，C.riegelii，C.thomssenii，C.pseudogenitalium和C.lipophiloflavum，以及無枝菌酸棒狀桿菌，杰氏棒狀桿菌，C.durum，牛腎盂炎棒狀桿菌，紋帶棒狀桿菌，谷氨酸棒狀桿菌，擁擠棒狀桿菌，結(jié)膜干燥棒狀桿菌，極小棒狀桿菌，C.camporealensis，C.coyleiae，假結(jié)核棒狀桿菌，庫氏棒狀桿菌，C.callunae和解脲棒狀桿菌。
帶有SEQ ID NO.25中所示序列的探針尤其優(yōu)選地用于非發(fā)酵棒狀桿菌，C.mucifaciens，C.coyleiae和/或“C.genitalium”種的棒狀桿菌檢測。
這種探針可方便地檢測出非發(fā)酵棒狀桿菌，C.mucifaciens，C.coyleiae和/或“C.genitalium”和具有非常相似的rRNA的棒狀桿菌屬的種，而不會檢測出如下棒狀桿菌屬的更不相關(guān)種結(jié)膜干燥棒狀桿菌，杰氏棒狀桿菌，解脲棒狀桿菌，無枝菌酸棒狀桿菌，谷氨酸棒狀桿菌，紋帶棒狀桿菌，擁擠棒狀桿菌，牛腎盂炎棒狀桿菌，嗜氨棒狀桿菌，庫氏棒狀桿菌，以及C.glucuronolyticum，C.camporealensis，假結(jié)核棒狀桿菌，C.durum，極小棒狀桿菌，C.lipophiloflavum，C.callunae和C.thomssenii。
另外，這種寡核苷酸也不會檢測出雖然不屬于棒狀桿菌屬，但具有非常相似的rRNA的如下微生物Nanomurea fastidiosa，棘孢小單孢菌，Abiotropha elegans和化膿隱秘桿菌。
帶有SEQ ID NO.26中所示序列的探針尤其優(yōu)選用于C.riegelli的特異性檢測。
在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于韋榮氏球菌屬微生物特異性檢測的寡核苷酸，所述探針與rRNA互補(bǔ)，并選自帶有SEQ IDNO.13至15中所示序列的寡核苷酸。
每一種所提及的寡核苷酸可檢測韋榮氏球菌屬的的至少一個如下種殊異韋榮菌，小韋榮菌和非典型韋榮菌。由于韋榮氏球菌屬在系統(tǒng)進(jìn)化樹中被大量隔離，非靶標(biāo)微生物不會方便地被檢測出。
帶有SEQ ID NO.13至14中所示序列的寡核苷酸的組合。這種組合可檢測韋榮氏球菌屬的至少如下種殊異韋榮菌，小韋榮菌和非典型韋榮菌。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于痤瘡丙酸桿菌種微生物的特異性檢測的寡核苷酸，所述探針與rRNA互補(bǔ)，并選自帶有SEQ ID NO.16至17中所示序列的寡核苷酸。
每一種所提及的寡核苷酸可特異性地檢測痤瘡丙酸桿菌種。
特別優(yōu)選的是帶有SEQ ID NO.16中所示序列的寡核苷酸。
具有非常相似的rRNA序列，但不屬于痤瘡丙酸桿菌種的下列微生物，不會被方便地檢測出P.propionicus，顆粒丙酸桿菌，親合丙酸桿菌，孚羅伊登氏丙酸桿菌，滕里氏丙酸桿菌，嗜淋巴丙酸桿菌，極小丙酸桿菌，Sacchromonospora viridis，Nocardiodes spec.，Propioniferax innocua，Gordonia sputi和隱秘桿菌。
在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于鱗斑霉菌屬微生物的特異性檢測的寡核苷酸，所述寡核苷酸與rRNA互補(bǔ)，并帶有SEQ IDNO.18中所示序列。
所提及的寡核苷酸可檢測鱗斑霉菌屬的至少一個如下種M.sloffiae，厚皮鱗斑酶菌和秕糠狀鱗斑酶菌。
帶有相似的rRNA，但不屬于鱗斑霉菌屬的微生物，不會被方便地檢測出白色念珠菌和Candida krucei。
帶有SEQ ID NO.30中所示序列的寡核苷酸特別優(yōu)選地用于Sporomusa類的某些微生物的檢測，優(yōu)選為形成Sporomusa類亞群的Phascolarctobacterium和氨基酸球菌屬微生物，以及與所提及微生物的rRNA非常相似的微生物。
所提及的寡核苷酸至少可檢測Acidaminococcus fermentans，Phascolarctobacterium faecium種，以及帶有極相似rRNA的緊密相關(guān)的微生物，但下列微生物除外Veillonella spec.，Halobacillushalophilus，Sporomusa paucivorans，Macrococcus caseolyticus，Anaeromusa acidaminophila，Halocella cellulosilytica，厭氧消化鏈球菌，Succiniclasticum ruminis和Succinispira mobilis。
在一個特定優(yōu)選實(shí)施方案中，未標(biāo)記的寡核苷酸可與標(biāo)記的寡核苷酸一起使用。培育同時含未標(biāo)記和標(biāo)記的寡核苷酸的樣品，優(yōu)選地以增加探針的特異性。例如，在選定條件下，通過采用用于與待檢測種緊密相關(guān)的不被檢測的微生物種的寡核苷酸，所述寡核苷酸與不被檢測的微生物的rRNA的靶序列雜交好于標(biāo)記探針，從而可區(qū)分出緊密相關(guān)的微生物種。由于未標(biāo)記探針與不被檢測的微生物的rRNA雜交好于標(biāo)記探針與不被檢測的微生物的rRNA的結(jié)合，因而，通過采用未標(biāo)記的寡核苷酸(競爭體)可防止假陽性結(jié)果。由此使某些微生物種或微生物群的特異性檢測成為可能，首要的甚至在帶有極相似rRNA序列的緊密相關(guān)種存在情況下。
例如，根據(jù)本發(fā)明，采用SEQ ID NO.22的寡核苷酸連同SEQ IDNO.21的寡核苷酸是合適的。在此情況下，優(yōu)選地標(biāo)記SEQ ID NO.21中所示寡核苷酸，而SEQ ID NO.22中所示寡核苷酸則不標(biāo)記。由此可毫不費(fèi)勁地檢測出16S rRNA序列含有SEQ ID NO.31中所示序列的微生物種，而不會同時檢測出非發(fā)酵棒狀桿菌(比較實(shí)施例中的分析結(jié)果)。
根據(jù)本發(fā)明，采用SEQ ID NO.23和24結(jié)合的寡核苷酸也是較合適的。鑒于帶有SEQ ID NO.23的寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記作為檢測非發(fā)酵棒狀桿菌的探針，SEQ ID NO.24的寡核苷酸則掩蓋其中16S rRNA序列包括SEQ ID NO.31中所示序列的微生物種的極相似的靶序列。
另外，SEQ ID NO.26的寡核苷酸可與根據(jù)SEQ ID NO.25的寡核苷酸一起用作為未標(biāo)記的競爭體。這樣，系統(tǒng)進(jìn)化樹中彼此緊鄰的棒狀桿菌屬的如下種可被檢測出來非發(fā)酵棒狀桿菌，C.genitalium，C.mucifaciens，C.coyleiae，帶有極類似rRNA序列的C.riegelii棒狀桿菌種則不能被同時檢測出。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO.19至30的一種或者多種組合寡核苷酸含有一種或多種其他寡核苷酸，以用于檢測葡萄球菌屬，韋榮氏球菌屬，鱗斑霉菌屬和/或丙酸桿菌屬的種。一份樣品中可同時或并行地方便檢測出各種肌膚相關(guān)微生物，更尤其是在單個過程中。另外，此處公開的寡核苷酸，尤其是根據(jù)SEQ ID NO.1至18的寡核苷酸尤其適合。
序列協(xié)議(sequence protocol)的序列如以下表2中所示。
表2
根據(jù)本發(fā)明的方法包含如下步驟
a)采集肌膚樣品，b)對存在于所采集肌膚樣品中的微生物進(jìn)行固定，c)與至少一種寡核苷酸培育固定的微生物，以誘導(dǎo)雜交，d)去除未雜交的寡核苷酸，以及e)檢測與寡核苷酸雜交的微生物，并任選地進(jìn)行定量。
在本發(fā)明的上下文中，微生物的“固定”應(yīng)理解為對微生物的處理，使其細(xì)胞壁可被寡核苷酸穿透。通常采用乙醇用于固定。如果這些措施后細(xì)胞壁不能被寡核苷酸穿透，則專業(yè)人員所熟知的其他措施可達(dá)到同樣的結(jié)果。這些措施包括，例如甲醇，醇類混合物，低百分比的低聚甲醛溶液或稀釋的甲醛溶液等等。
根據(jù)本發(fā)明，特別地采用熒光標(biāo)記的寡核苷酸對固定細(xì)胞進(jìn)行培育，以用于“雜交”。這些標(biāo)記的寡核苷酸能夠?qū)⑵渥陨斫Y(jié)合至與寡核苷酸對應(yīng)的靶序列，任選地是在穿透細(xì)胞壁之后。結(jié)合應(yīng)理解為互補(bǔ)核酸片段之間的氫橋的形成。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，以合適的雜交溶液使用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸。這種溶液的合適組成是專業(yè)人員所熟知的。對應(yīng)的溶液含有，例如濃度為0％至80％的甲酰胺，優(yōu)選濃度為0％至45％，特別優(yōu)選為20％至40％，以及例如鹽濃度(優(yōu)選的鹽是NaCl)為0.1mol/l至1.5mol/l，優(yōu)選濃度為0.5mol/l至1.0mol/l，更優(yōu)選為0.9mol/l。另外，通常存在濃度為0.001％至2％的去垢劑(通常為SDS)，優(yōu)選濃度為0.005％至0.1％，更特別為0.01％。存在合適的緩沖物質(zhì)(例如Tris-HCl，檸檬酸鈉，HEPES，PIPES等)以對溶液起緩沖作用，典型的濃度為0.01mol/l至0.1mol/l，優(yōu)選濃度為0.01mol/l至0.05mol/l，更特別濃度為0.02mol/l。雜交溶液的pH通常在6.0至9.0之間，優(yōu)選為7.0至8.0之間，更特別為約8.0。
其他可使用的添加劑包括，例如成片段的鮭精DNA，或用于預(yù)防雜交反應(yīng)中非特異性結(jié)合的阻斷劑，或用于加快雜交反應(yīng)的均一聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，或葡聚糖硫酸酯。另外，也可加入物質(zhì)，使對樣品中存在的所有活和/或...微生物的DNA著色(例如DAPI，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸化物)。對應(yīng)的添加劑都是專業(yè)人員所熟知的，并可以已知和典型的濃度加入。
雜交溶液中寡核苷酸的濃度的確定方法為通過其標(biāo)記的性質(zhì)及通過靶結(jié)構(gòu)的數(shù)量進(jìn)行。為了提供快速和有效的雜交，寡核苷酸數(shù)量應(yīng)超出靶結(jié)構(gòu)數(shù)量幾個數(shù)量級。然而，重要的是要記住過量的熒光標(biāo)記寡核苷酸會導(dǎo)致背景熒光增加。相應(yīng)地，寡核苷酸的濃度范圍應(yīng)該為0.5至500ng/ml。用于根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選濃度是每μl雜交溶液使用1至10ng的每種寡核苷酸。所使用雜交溶液的體積應(yīng)是8μl至100ml之間；在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中是10μl至1000μl之間，在特別優(yōu)選實(shí)施方案中是20μl至40μl之間。
雜交的持續(xù)時間通常是10分鐘至12小時之間，優(yōu)選為約1.5小時。雜交溫度優(yōu)選地為44℃至48℃之間，更特別為46℃?？梢蕾囉诠押塑账?，尤其是其長度及與待檢測細(xì)胞內(nèi)靶序列的互補(bǔ)程度，而對雜交溫度參數(shù)以及雜交溶液中鹽和去垢劑濃度進(jìn)行優(yōu)化。在這點(diǎn)上，專業(yè)人員對關(guān)聯(lián)性的計算是熟悉的。
雜交完成后，應(yīng)除去或洗掉未雜交和多余的寡核苷酸，通常采用常規(guī)洗滌溶液來完成。如果需要，這種洗滌溶液可含有0.001-0.1％的去垢劑，例如SDS，優(yōu)選濃度為0.01％，以及濃度為0.001-0.1mol/l的Tris-HCl或其他合適的緩沖物質(zhì)，優(yōu)選為0.02mol/l，pH范圍為6.0-9.0，優(yōu)選為約8.0。可存在去垢劑，但不是絕對必需。另外，洗滌溶液通常含有濃度為根據(jù)所需嚴(yán)格性，0.003mol/l至0.9mol/l的NaCl，優(yōu)選濃度為0.01mol/l至0.9mol/l。NaCl濃度為0.07mol/l為特別優(yōu)選。NaCl濃度為0.05mol/l至0.22mol/l特別適合于雜交，雜交中可采用根據(jù)SEQID NO.19至30的寡核苷酸實(shí)施特異性檢測。另外，洗滌溶液可含有優(yōu)選濃度為0.005mol/l的EDTA。洗滌溶液還可含有專業(yè)人員熟知的合適量的防腐劑。
未結(jié)合的寡核苷酸通常在44℃至52℃之間的溫度下洗去，優(yōu)選溫度為44℃至50℃，更特別地為44℃至48℃的溫度，洗滌時間為10至40分鐘，優(yōu)選時間為15分鐘。
依賴于所使用寡核苷酸標(biāo)記的性質(zhì)，可采用光學(xué)顯微鏡、落謝熒光顯微鏡、化學(xué)發(fā)光檢測儀、熒光計的實(shí)施最終評價。
本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是多種的且多樣化的。
特別的優(yōu)點(diǎn)是這種檢測方法的速度。常規(guī)的培養(yǎng)需要高達(dá)7天以用于檢測，而應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法后，可在3小時內(nèi)獲得結(jié)果。這就首先提供了所應(yīng)用處理的效果和不期望效果的隨附診斷對照。這點(diǎn)上的另一有利之處是，根據(jù)本發(fā)明的方法使所有提及的微生物都能被同時檢測，這是另一時間優(yōu)勢，因?yàn)閺娜拥皆u價的所有步驟只需實(shí)施一次。
另一優(yōu)點(diǎn)是微生物檢測可以定量。
另一優(yōu)點(diǎn)是通過常規(guī)檢測方法可能檢測不出的肌膚微生物群落的微生物，而今在此方法中采用本發(fā)明寡核苷酸可第一次檢測出。
根據(jù)寡核苷酸或者所采用寡核苷酸的特異性，可檢測微生物的各種群。一方面，大的微生物群以及另一方面，相對較小的緊密相關(guān)群以及甚至單個種，可與其他甚至是緊密相關(guān)的微生物種一道被特異性檢測出。
另外，在陽性信號情況下，通過本發(fā)明的方法，可引入系統(tǒng)進(jìn)化樹中的未知微生物種，或者通過與特異性探針的雜交，在生物化學(xué)檢測的基礎(chǔ)上確認(rèn)所采用的分組。
另一優(yōu)點(diǎn)是所述寡核苷酸的高特異性。因此，微生物的某些屬或者群可被特異性檢測出而屬的單個種可以高特異性的檢測得出。
在本發(fā)明所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在所述方法步驟a)中從下列來源采集樣品vii) 皮膚表面，viii) 食品，ix)環(huán)境，尤其是水，土壤或者空氣，x) 從廢水或者從生物膜，xi)從臨床檢驗(yàn)材料或者xii) 從藥品或者化妝品。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品從皮膚表面通過從待試驗(yàn)的區(qū)域在去垢劑的幫助下去除皮膚菌落的微生物。
另一主要優(yōu)點(diǎn)是，肌膚微生物群落的這些藥物和化妝品相關(guān)微生物第一次可被同時檢測出。由此，通過采用用于寡核苷酸的不同標(biāo)記物，可并行檢測出所有、一些或個別微生物群或種，并可清晰地相互區(qū)分開來。另外，這些微生物群或種的種群比例(population ratios)以及其之間的相互作用由此可首次分析出來。這就第一次開啟了以醫(yī)藥和/或化妝品方式明確診斷和選擇性治療相關(guān)肌膚問題的可能性。現(xiàn)在第一次可以確定藥物治療或化妝品治療對于肌膚總微生物群落的效果。由此可盡早識別出某一治療的可能效果和有害效果，并且在進(jìn)一步治療中擴(kuò)大或受到抑制。
本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是，可對被檢測的微生物進(jìn)行定量。由此可首次獲得上述肌膚微生物群落的微生物的絕對與相對量比值的知識。這就能給出藥物或化妝品治療的結(jié)果，以及在治療前、治療過程中及治療后監(jiān)控全部效果。關(guān)于這一點(diǎn)的另一優(yōu)點(diǎn)是，根據(jù)本發(fā)明的方法只能檢測活微生物。
為了從志愿者采集肌膚樣品，將肌膚與去垢劑溶液接觸，所述去垢劑用以促進(jìn)微生物從肌膚表面的去除。優(yōu)選采用的生理安全的去垢劑為，例如濃度為ca.0.01-1重量％的Tween或Triton。pH為5至10，尤其為7至9的范圍，例如8，證明是較有利的。
為了達(dá)到微生物更好的移除，將肌膚表面用刮擦儀器進(jìn)行摩擦。合適的刮擦儀器有直徑可變的各種材料制成的小棒，所述直徑例如從0.05至1.5cm，所述材料例如為玻璃、金屬或塑料。同樣材料的圓形刮刀也是較合適的。優(yōu)選采用直徑介于0.4至0.8cm之間的玻璃小棒或塑料刮刀。也可優(yōu)選采用玻璃吸液管的管嘴，例如5ml的玻璃吸液管。已經(jīng)證明它對于擦掉肌膚上的相對粗糙表面特別適合，從而促進(jìn)微生物的去除。
帶有粗糙表面的塑料刮刀，例如玻璃纖維加固的聚酰胺(Merck，Art.No.231J2412，雙刮刀，長度180mm)制成的取樣刮刀是特別合適的。用藥簽進(jìn)行摩擦，并通過用相對粘性介質(zhì)輕敷進(jìn)行取樣，或者甚至用粘性薄膜(例如可市售的家用膠帶)進(jìn)行肌膚取樣，也適合于本發(fā)明目的。以這些方法可獲得微生物，例如通過用合適的緩沖溶液洗滌。甚至可直接在膠帶上實(shí)施其他方法。
本發(fā)明的方法也優(yōu)選用于食品控制。食品樣品尤其是從牛奶或者乳制品(酸奶，奶酪，乳清，黃油，酪乳)，飲用水，飲料(碳酸飲料，啤酒，果汁)，糖果或者肉類從采集的。
此外，例如環(huán)境樣品也可被用于利用本發(fā)明的方法檢驗(yàn)。這些樣品也可以從空氣，水或者從土壤中采集。
本發(fā)明的方法也可用于臨床樣品的分析。其適合于檢驗(yàn)組織樣品，例如生物活體解剖材料，來自肺，腫瘤或者感染組織，來自分泌物，諸如汗液，唾液，精液和來自鼻，尿道或者陰道的排泄物以及尿液和大便樣品。
本發(fā)明方法的另一應(yīng)用是廢水分析，例如活性淤泥，降解淤泥或者厭氧淤泥。此外，適合于分析工廠中的生物膜以及天然形成的生物膜或者廢水處理中形成的生物膜。
本發(fā)明的方法也可用于分析藥品個化妝品的分析，例如油膏，乳膏，酊劑，漿糊等，例如被微生物污染。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過如下試劑進(jìn)行固定i)優(yōu)選自乙醇、丙酮和乙醇/乙酸混合物的變性劑，ii)優(yōu)選自甲醛、低聚甲醛和戊二醛的交聯(lián)劑，或iii)加熱固定。
在一個特定實(shí)施方案中，微生物可于固定后固定于載體上。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物的固定細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟c)之間可進(jìn)行滲透化。
在本發(fā)明的上下文中，“滲透”應(yīng)理解為細(xì)胞的酶處理。這種處理使得真菌和革蘭氏陽性細(xì)菌對寡核苷酸可滲透。適合用于這種處理的酶，酶的合適濃度及合適的溶劑是專業(yè)人員所熟知的。本發(fā)明的方法顯然也適合于革蘭氏陰性細(xì)菌的分析；這樣可對用于滲透化的酶處理進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，或者甚至可以完全略去。
雜交之前對細(xì)胞的滲透化具有的優(yōu)點(diǎn)是，雖然寡核苷酸可穿透進(jìn)入細(xì)胞，但核糖體以及rRNA不能從細(xì)胞逃逸。這種全細(xì)胞雜交技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是，細(xì)菌的形態(tài)仍保持完整，并且這些完整的細(xì)菌可被原位檢測出，即處于其天然環(huán)境中。相應(yīng)地，不僅可對細(xì)菌進(jìn)行定量，各個細(xì)菌群之間可能的關(guān)聯(lián)也可被檢測出。
在最優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過采用細(xì)胞壁溶解酶進(jìn)行部分降解，從而實(shí)施滲透化，所述細(xì)胞壁溶解酶優(yōu)選自溶菌酶、溶葡球菌酶、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶和變?nèi)芫亍?br> 另外，在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了適合作為陽性對照的寡核苷酸。這種寡核苷酸的特征在于，它可檢測分析樣品中存在的許多，任選的所有細(xì)菌或真核生物。例如，Amann等(1990)所描述的寡核苷酸EUB338(細(xì)菌)或者寡核苷酸EUK(真核生物)適合用于此目的。諸如這樣的陽性對照可用于監(jiān)視所應(yīng)用的方法是否被準(zhǔn)確的實(shí)施。然而最重要的是，它能夠在作為整體的待確定的細(xì)菌群落中，特異性地檢測出一部分微生物。
本發(fā)明還提供了實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。所述試劑盒含有作為重要組分(尤其是用于原位雜交過程)的特定雜交溶液，所述雜交溶液含有待檢測微生物的特異性寡核苷酸。另外，試劑盒可含有不帶寡核苷酸的相應(yīng)雜交溶液，以及相應(yīng)的洗液或相應(yīng)洗液的濃縮物。另外，試劑盒可任選地含有酶溶液，固定液及任選的包埋溶液?？扇芜x地提供用于同時實(shí)施陽性對照和陰性對照(例如不帶有或帶有非雜交的寡核苷酸)的雜交溶液。
在特別的實(shí)施方案中，所述試劑盒用于檢測皮膚菌群的微生物。由此，該試劑盒在尋找活性物質(zhì)，分析肌膚微生物群落及含活性物質(zhì)的化妝品的活力測試中是較有利的。采用本發(fā)明的試劑盒，可有效實(shí)施人體肌膚和動物肌膚的直接分析或從中采集的樣品進(jìn)行分析，甚至能抵抗高背景的其他微生物。
含有幾種寡核苷酸或者組合寡核苷酸的試劑盒尤其適合。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，能夠檢測較大群待測微生物的寡核苷酸或者組合寡核苷酸被用于含有能夠只檢測屬于所述群的一種或者幾種的一種或者多種寡核苷酸的試劑盒中。例如，可以首先采用一種或多種探針鑒定含有棒狀桿菌屬微生物的樣品，然后研究棒狀桿菌屬內(nèi)的單個微生物種或群特異性的陽性樣品。優(yōu)選采用的，尤其是組合使用的，用于檢測棒狀桿菌屬多個不同種，優(yōu)選用于檢測棒狀桿菌屬的肌膚相關(guān)種的優(yōu)選寡核苷酸，是帶有SEQ ID NO.7至12中所示序列，更優(yōu)選為帶有SEQ ID NO.7，8，10和11中序列的寡核苷酸，尤其是如果同時采用SEQ ID NO.7，8，10和11的寡核苷酸的話。為達(dá)此目的，依賴于目標(biāo)棒狀桿菌屬的微生物種，可于試劑盒中加入一種或多種所提及的SEQ ID NO.19至26的寡核苷酸。
如下實(shí)施例旨在例述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例肌膚微生物群落的微生物檢測取樣通過去垢劑洗滌方法實(shí)施取樣((P.Williamson，A.M.Kligman(1965)，J.Invest.Derm.，Vol.45，No.6).步驟1.將兩端開口的塑料圓桶用完好末端壓至待檢查的肌膚上，并裝入1.5ml的去垢劑溶液(生理Tween緩沖液，pH8.0，含0.523g/l的KH2PO4，16.73g/l的K2HPO4，8.50g/l的NaCl，10.00g/l的Tween80和1.00g/l的胰蛋白胨)。
2.采用一種上述的刮擦儀器，在6×水平和6×垂直光壓下對待處理的表面進(jìn)行摩擦。
3.抽吸移除液體后，重復(fù)上述步驟。
將兩份液體合并。兩份合并液體的樣品的一部分用于隨后的寡核苷酸檢測；另一部分通過對存在于樣品中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，用于作為對照的并行檢測。
應(yīng)采用無菌水(例如millipore水)來制備去垢劑溶液。
固定然后，將一個體積的無水乙醇加入所采集的樣品，隨后進(jìn)行離心(室溫，8,000r.p.m.，5分鐘)。棄去上清液，用一個體積的1×PBS溶液洗滌沉積顆粒。最后，將沉積顆粒重懸浮于1/10體積的固定液(50％乙醇)種，并在-20℃下儲存待用。
將一個等分的細(xì)胞懸浮液施用于顯微鏡玻片上并干燥(46℃，30分鐘，或直至完全干燥)。然后通過應(yīng)用另一固定液(無水乙醇)將細(xì)胞完全脫水并干燥(46℃，3分鐘，或直至完全干燥)。
滲透化然后，施用合適體積的合適酶溶液，并培育樣品(室溫，15分鐘)。任選地以其他的合適酶溶液重復(fù)該步驟。
用蒸餾水除去滲透化溶液，再次將樣品完全干燥(46℃下培育直至完全干燥)。然后通過應(yīng)用固定液(無水乙醇)對細(xì)胞進(jìn)行再次的完全脫水，并干燥(46℃，3分鐘，或直至完全干燥)。
雜交然后，將含有對待檢測微生物具有特異性的上述寡核苷酸的雜交溶液施用于固定的，完全被消化和脫水的細(xì)胞。然后，將玻片置于以雜交溶液濕潤的腔室內(nèi)(雜交溶液不含核苷酸，46℃下持續(xù)90分鐘)。
洗滌然后，將顯微鏡玻片置于充滿洗滌溶液的腔室內(nèi)，并進(jìn)行培育(46℃，15分鐘)。
然后，將玻片短暫浸入充滿蒸餾水的腔室內(nèi)，并在側(cè)面進(jìn)行風(fēng)干(46℃，30分鐘，或直至完全干燥)。
檢測然后，將樣品支持物包埋入合適的包埋介質(zhì)中。然后采用熒光顯微鏡分析樣品。
分析結(jié)果1.采用上述取樣方法，從混合型肌膚(通過化裝師來分類，并通過皮脂測定儀測量來確定)的女性志愿者前額采集微生物樣品。
通過計算熒光信號并將結(jié)果與總細(xì)胞計數(shù)對比，確定出極高百分比的丙酸菌(＞90％)。發(fā)現(xiàn)低百分比的葡萄球菌(＜10％)。未發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌。
2.通過上述取樣方法，從另一女性志愿者肌膚上采集微生物樣品。
從樣品的一部分分離到某一微生物的16S rRNA。隨后的序列測定表明，雖然該微生物可歸為棒狀桿菌屬，但該序列是一個新序列。這一序列如序列表SEQ ID NO.31所示，在這一序列的基礎(chǔ)上開發(fā)出能檢測出這一微生物的相應(yīng)探針(根據(jù)SEQ ID NO.21)。
另一部分樣品與前述的細(xì)菌特異性探針EUB及探針混合物(SEQID NO.07至11)雜交，用于檢測肌膚相關(guān)的棒狀桿菌。
通過計算熒光信號并將結(jié)果與總細(xì)胞計數(shù)對比，確定出高百分比的棒狀桿菌(ca.73％)，所述總細(xì)胞計數(shù)由細(xì)菌特異性探針來確定。
這一樣品的低百分比(ca.5％)的棒狀桿菌與根據(jù)SEQ ID NO.21的標(biāo)記寡核苷酸雜交，這是通過計算熒光信號并將結(jié)果與前面檢測的棒狀桿菌計數(shù)對比確定的，根據(jù)SEQ ID NO.22的未標(biāo)記寡核苷酸被同時用作為競爭體。
序列表<110>漢高兩合股份公司(Henkel KGaA)<120>檢測微生物的寡核苷酸(Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen)<130>SCT045178-47<150>DE 102 32 776.9；DE 103 07 732.4<151>2002-07-18；2003-02-14<160>31<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>寡核苷酸<400>6tacactctct caagccgg 18<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>寡核苷酸<400>21ccatccaaaa tgcggtcc18<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>22ccatccaaaa tgtggtcc18<210>23
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>23caccatccaa aatgtggtc19<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>24caccatccaa aatgcggtc19<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>25ctgcagtccc gcagtta 17
<210>26<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>26ctgcagtccc acagtta17<210>27<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>27gcatttccgc ctgcgaac 18<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸
<400>28gcattgccgc ctgcgaac18<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>variation<222>(13)..(13)<223>″k″＝G，T；寡核苷酸<400>29cactatatag ctkccctc18<210>30<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>30catctcagcg tcagacac18<210>31<211>1431<212>RNA
<213>棒狀桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1308)..(1308)<223>″n″＝A，C，G，U<400>31gaugaacgcu ggcggcgugc uuaacacaug caagucgaac ggaaaggccu cugcuugcag 60ggguacucga guggcgaacg ggugaguaac acguggguga ucugcccugc acuucgggau 120aagccuggga aacugggucu aauaccggau aggaccgcau uuuggauggu gugguggaaa 180guuuuucggu gugggaugag cucgcggccu aucagcuugu ugguggggua auggccuacc 240aaggcgucga cggguagccg gccugagagg guguacggcc acauugggac ugagauacgg 300cccagacucc uacgggaggc agcagugggg aauauugcac aaugggcgca agccugaugc 360agcgacgccg cgugggggau gacggccuuc ggguuguaaa cuccuuucgc uagggacgaa 420gcguuuuugu gacgguaccu ggagaagaag caccggcuaa cuacgugcca gcagccgcgg 480uaauacguag ggugcgagcg uuguccggaa uuacugggcg uaaagagcuc guaggugguu 540ugucgcgucg uuuguguaag cccgcagcuu aacugcggga cugcaggcga uacgggcaua 600acuugagugc uguaggggag acuggaauuc cugguguagc gguggaaugc gcagauauca 660ggaggaacac cgauggcgaa ggcaggucuc ugggcaguaa cugacgcuga ggagcgaaag 720cauggguagc gaacaggauu agauacccug guaguccaug ccguaaacgg ugggcgcuag 780gugugagucc cuuccacggg guucgugccg uagcuaacgc auuaagcgcc ccgccugggg 840aguacggccg caaggcuaaa acucaaagga auugacgggg gcccgcacaa gcggcggagc 900auguggauua auucgaugca acgcgaagaa ccuuaccugg gcuugacaua caccagaucg 960ccguagagau acgguuuccc uuugugguug guguacaggu ggugcauggu ugucgucagc 1020ucgugucgug agauguuggg uuaagucccg caacgagcgc aacccuuguc uuauguugcc 1080
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1.一種用于檢測微生物的寡核苷酸，選自i)帶有SEQ ID NO.01至30中所示序列的寡核苷酸，以及ii)與i)中寡核苷酸對應(yīng)至少80％，優(yōu)選為至少84％，更優(yōu)選為至少90％，最優(yōu)選為95％的寡核苷酸，以及iii)衍生自上述i)和ii)的寡核苷酸之一的寡核苷酸，其序列被刪除或延長了一個或多個核苷酸，以及iv)在嚴(yán)格條件下，能和與所提及的i)，ii)或iii)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸。
2.權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于所述微生物選自葡萄球菌屬，消化鏈球菌屬，丙酸菌屬，棒狀桿菌屬，韋榮氏球菌屬，鱗斑霉菌屬或Sporomusa類。
3.權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸，其特征在于所述寡核苷酸帶有可檢測的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物尤其是共價連接至寡核苷酸。
4.權(quán)利要求3所述的寡核苷酸，其特征在于可檢測的標(biāo)記物選自a)熒光標(biāo)記物，b)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，c)放射性標(biāo)記物，d)酶活性基團(tuán)，e)半抗原，f)通過雜交可檢測的核酸。
5.權(quán)利要求4所述的寡核苷酸，其特征在于酶標(biāo)記物選自過氧化物酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，以及磷酸酶，優(yōu)選為堿性磷酸酶。
6.用于檢測微生物的組合寡核苷酸，其含有至少一種，優(yōu)選地兩種或者多種權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的寡核苷酸。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的組合寡核苷酸，含有i)至少一種用于特異性檢測葡萄球菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.01至03中所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或ii)至少一種用于特異性檢測消化鏈球菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.04至06及27至29所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或iii)至少一種用于特異性檢測棒狀桿菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)有SEQ ID NO.07至12及19至26所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或iv)至少一種用于特異性檢測韋榮氏球菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.13至15所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或v)至少一種用于特異性檢測痤瘡丙酸桿菌種細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.16及17所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或vi)至少一種用于特異性檢測鱗斑霉菌屬真菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.18所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或vii)至少一種用于特異性檢測源自Sporomusa類微生物的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.30所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸。
8.權(quán)利要求7所述的寡核苷酸，含有i)至少一種，尤其是幾種用于特異性檢測葡萄球菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.01至02中所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或ii)至少一種，尤其是幾種用于特異性檢測消化鏈球菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.04及27至29所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或iii)至少一種，尤其是幾種用于特異性檢測棒狀桿菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.07，8，10，11及19至26所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或iv)至少一種，尤其是幾種用于特異性檢測韋榮氏球菌屬細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.13和14所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或v)至少一種，尤其是幾種用于特異性檢測痤瘡丙酸桿菌種細(xì)菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.16所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或vi)至少一種，尤其是幾種用于特異性檢測鱗斑霉菌屬真菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.18所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸，和/或vii)至少一種，尤其是幾種用于特異性檢測源自Sporomusa類微生物的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自a)帶有SEQ ID NO.30所示序列的寡核苷酸，以及b)如權(quán)利要求1 ii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及c)如權(quán)利要求1 iii)中所述，與a)中寡核苷酸相對應(yīng)的寡核苷酸，以及d)在嚴(yán)格條件下，能和與a)，b)或c)的寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列雜交的寡核苷酸。
9.權(quán)利要求6到8任一項(xiàng)所述的組合寡核苷酸，含有一種、幾種或者全部帶有SEQ ID NO.01，02，04，07，08，10，11，13，14，16，18和19至30所示序列的寡核苷酸。
10.一種通過原位雜交檢測微生物的方法，尤其是檢測葡萄球菌屬，消化鏈球菌屬，丙酸菌屬，棒狀桿菌屬，韋榮氏球菌屬，鱗斑霉菌屬和/或Sporomusa類微生物的方法，其特征在于所述方法包含如下步驟a)采集樣品，b)對存在于所采集樣品中的微生物進(jìn)行固定，c)用至少一種權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的寡核苷酸或組合寡核苷酸培育固定的微生物，以誘導(dǎo)雜交，d)去除未雜交的寡核苷酸，以及e)對與寡核苷酸雜交的微生物進(jìn)行檢測以及任選地進(jìn)行定量。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于在步驟a)中，從下述來源采集樣品i)皮膚表面，ii)食品，iii)環(huán)境，尤其是水，土壤或者空氣，iv)廢水或者生物膜，v)臨床檢驗(yàn)材料或者vi)藥品或者化妝品。
12.權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于通過如下試劑和步驟進(jìn)行固定i)優(yōu)選自乙醇、丙酮和乙醇/乙酸混合物的變性劑，ii)優(yōu)選自甲醛、低聚甲醛和戊二醛的交聯(lián)劑，或iii)加熱固定。
13.如權(quán)利要求10至12任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于固定后將微生物固定于載體上。
14.如權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于雜交前對微生物進(jìn)行滲透化。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于通過采用細(xì)胞壁溶解酶進(jìn)行的部分降解而實(shí)施滲透化，所述細(xì)胞壁溶解酶優(yōu)選自溶菌酶、溶葡球菌酶、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶和變?nèi)芫亍?br> 16.如權(quán)利要求10到14任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于未標(biāo)記的寡核苷酸與標(biāo)記的寡核苷酸一起使用。
17.一種實(shí)施權(quán)利要求10到16任一項(xiàng)所述的方法的試劑盒，含有至少一種權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，優(yōu)選地是含有權(quán)利要求6至9任一項(xiàng)所述的組合寡核苷酸。
18.權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒另外含有至少一種沒有寡核苷酸的雜交溶液。
19.權(quán)利要求17或者18所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒另外含有至少一種合適的洗液或洗液的濃縮液。
20.權(quán)利要求17至19任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒另外含有至少一種合適的滲透化溶液。
21.權(quán)利要求17至20任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒另外含有至少一種合適的固定液。
22.權(quán)利要求17至21任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒另外含有至少一種合適的陽性對照溶液。
23.權(quán)利要求17至22任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒另外含有至少一種合適的陰性對照溶液。
24.權(quán)利要求17至23任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒另外含有一種包埋溶液。
25.i)如權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的寡核苷酸或者組合寡核苷酸，ii)如權(quán)利要求10至16任一項(xiàng)所述的方法和/或iii)如權(quán)利要求16至24任一項(xiàng)所述的試劑盒在對微生物進(jìn)行檢測和/或定量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測微生物的寡核苷酸，檢測微生物的方法以及實(shí)施所述方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1668765SQ03817055
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月18日
發(fā)明者安德烈亞·薩特勒, 克勞迪亞·亞紹, 雷吉內(nèi)·斯科爾蒂塞克, 威拉·馬延沙因, 西爾克·尼韋勒, 阿爾布雷克特·韋斯, 卡爾－海因茨·特雷貝修斯, 克勞迪亞·拜姆弗爾, 沃爾夫?qū)ぢ返峦? 理查德·羅伯特·班貝格, 卡爾·海因茨·施萊費(fèi)爾, 斯特凡·米爾納, 克里斯特爾·阿多馬特, 英格里德·貝格邁爾 申請人:漢高兩合股份公司