專利名稱：在植物中獲得病原體抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在植物中通過(guò)降低NADPH氧化酶表達(dá)、活性或功能用于產(chǎn)生或增強(qiáng)病原體抗性的方法。
植物生物技術(shù)工作的目標(biāo)是產(chǎn)生具有有益新特性的植物，例如用于增強(qiáng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力。植物對(duì)病原體的天然防御機(jī)制常常是不足的。單真菌病每年導(dǎo)致數(shù)十億美圓的損失。自植物、動(dòng)物或微生物來(lái)源導(dǎo)入外源基因可增強(qiáng)防御性。實(shí)例為通過(guò)表達(dá)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)內(nèi)毒素保護(hù)免受對(duì)通過(guò)昆蟲(chóng)攝食的損害(Vaeck等人(1987)Nature 32833-37)或通過(guò)表達(dá)大豆幾丁質(zhì)酶保護(hù)免受真菌感染(Broglie等人，(1991)Science2541194-1197)。然而，大部分描述的方法只對(duì)單一病原體或狹窄范圍的病原體提供抗性。
只存在幾種使植物對(duì)較廣譜病原體具有抗性的方法。系統(tǒng)性獲得抗性(SAR)-在多種植物病原體相互作用中的防御機(jī)制—可通過(guò)應(yīng)用內(nèi)源性信號(hào)物質(zhì)如茉莉酸(JA)或水楊酸(SA)進(jìn)行提供(Ward等人，(1991)Plant Cell 31085-1094；Uknes等人(1992)Plant Cell 4(6)645-656)。通過(guò)合成化合物如2，6-二氯異煙酸(INA)或S-甲基苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸酯(BTH；Bion)可達(dá)到相似作用(Friedrich等人(1996)Plant J 10(1)61-70；Lawton等人(1996)Plant J.1071-82)。在SAR的情況下具有正調(diào)節(jié)作用的發(fā)病機(jī)理相關(guān)(PR)蛋白質(zhì)的表達(dá)在一些情況下也可引起病原體抗性。
在大麥中，Mlo基因座描述為對(duì)病原體防御的負(fù)調(diào)節(jié)物。Mlo基因的缺失引起對(duì)大多數(shù)霉病物種的抗性增加，并尤其是為種非特異抗性(Büschges R等人(1997)Cell 88695-705；Jorgensen JH(1977)Euphytica2655-62；Lyngkjaer MF等人，(1995)Plant Pathol 44786-790)。通過(guò)常規(guī)育種獲得的Mlo缺陷大麥變種在農(nóng)業(yè)中已正在進(jìn)行應(yīng)用。盡管精耕細(xì)作，可能由于隱性的事實(shí)，已證實(shí)抗性是持久的。對(duì)在其它植物中，特別是谷類物種中的Mlo樣抗性沒(méi)有進(jìn)行描述。已對(duì)來(lái)自其它谷類物種中的Mlo基因及多種同源物(homolog)進(jìn)行鑒定并克隆(Büschges R等人(1997)Cell 88695-705；WO98/04586；Schulze-Lefert P；Vogel J(2000)Trends Plant Sci.5343-348)。已對(duì)用這些基因用于獲得病原體抗性的多種方法進(jìn)行了描述(WO98/04586；WO00/01722；WO99/47552)。缺點(diǎn)是Mlo介導(dǎo)的防御機(jī)制包含葉細(xì)胞的自發(fā)相繼死亡(Wolter M等人(1993)Mol Gen Genet 239122-128)。另一個(gè)缺點(diǎn)是Mlo缺陷基因型顯示對(duì)半活體營(yíng)養(yǎng)(hemibiotrophic)病原體如(稻瘟病菌(Magnaporte grisea；M.grisea))及禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus(蠕孢菌(Bipolarissorokiniana))的超敏反應(yīng)(Jarosch B等人(1999)Mol Plant MicrobeInteract 12508-514；Kumar J等人(2001)Phytopathology 91127-133)。
將活性氧類(ROS；例如過(guò)氧化物(O2-)、羥基自由基及H2O2)的釋放歸于對(duì)植物病原體的反應(yīng)中有重要的保護(hù)功能(Wojtaszek P(1997)Biochem J 322681-692)。細(xì)胞如何產(chǎn)生ROS的多種途徑是已知的。在哺乳動(dòng)物的巨噬細(xì)胞中，必需提及的特別是可轉(zhuǎn)移電子到分子氧的酶NADPH氧化酶。在植物中，也已對(duì)其同源酶進(jìn)行了鑒定(Lamb & Dixon(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48251)。
已顯示在擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)NADPH氧化酶的催化亞單位中的突變顯示活性氧中間體(ROI)的積累降低。對(duì)于超敏反應(yīng)(HR)，結(jié)果是不同的用無(wú)毒力及細(xì)菌丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)顯示在雙重突變體中HR降低，而毒力卵菌寄生霜霉菌(Peronosporaparasitica)顯示HR升高。然而，與野生型植物相比，毒力及無(wú)毒力丁香假單胞菌菌株的生長(zhǎng)均未發(fā)生變化(Torres MA等人(2002)Proc Natl AcadSci USA 99517-522)。同樣，通過(guò)用生理相關(guān)濃度的抑制劑氯化二亞苯基碘(DPI)抑制NADPH氧化酶對(duì)病原體性真菌的發(fā)育無(wú)作用(Hückelhoven R & Kogel KH(1998)Mol Plant Microbe Interact 11292-300)。吞噬細(xì)胞的大麥NADPH氧化酶(pNAox，吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶的大亞單位gp91phox的同源物)的cDNA片段在基因庫(kù)登錄號(hào)AJ251717)下進(jìn)行了描述。
本發(fā)明的目的是提供用于在植物中防御病原體的新化合物，所述化合物在許多盡可能的不同植物物種，優(yōu)選在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用的農(nóng)作物植物中引起對(duì)盡可能廣泛病原體譜的有效防御。我們已發(fā)現(xiàn)通過(guò)本發(fā)明方法已達(dá)到本目。
本發(fā)明的第一個(gè)方面包括用于在植物中對(duì)至少一種病原體產(chǎn)生或增強(qiáng)抗性的方法，所述方法包括以下操作步驟a)降低在植物或其組織、器官、部分或細(xì)胞中NADPH氧化酶的蛋白質(zhì)量、活性或功能，及b)與起始植物相反或相比，選擇其中對(duì)至少有一種病原體存在抗性或抗性增強(qiáng)的植物。
令人驚訝的是，通過(guò)用雙鏈pNAox-dsRNA(“基因沉默”)序列特異RNA干擾方法降低大麥NADPH氧化酶(pNAox)在表皮細(xì)胞中的表達(dá)，顯示Bgh感染后疾病水平顯著降低(參考Haustoria的公式進(jìn)行測(cè)定)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)特別令人驚訝，因?yàn)榕cNADPH氧化酶相關(guān)的活性氧類(“氧化進(jìn)發(fā)”)的釋放一般歸于保護(hù)性功能。
與Mlo相似，NADPH氧化酶表達(dá)的降低介導(dǎo)對(duì)多種禾谷類白粉菌大麥?；?Blumeria graminis f.sp.hordei)分離株的廣泛抗性。在瞬時(shí)基因沉默實(shí)驗(yàn)中，Bgh(吸器發(fā)育)的穿透率顯著降低35％以上—其強(qiáng)度作用與通過(guò)Mlo-dsRNA獲得的作用相對(duì)應(yīng)(Schweizer P等人(2000)PlantJ 24895-903)。在野生型大麥變種Pallas中，大約40％真菌穿透導(dǎo)致吸器的發(fā)育，通過(guò)導(dǎo)入NADPH氧化酶的雙鏈RNA(pNAox-dsRNA)在NADPA氧化酶表達(dá)降低的情況下穿透率只達(dá)到大約25％。甚至在病原體敏感野生型變種如Pallas中，只可觀察到大約40至50％的穿透率的事實(shí)，可歸因于一直存在的基礎(chǔ)抗性。由于這些發(fā)現(xiàn)，可認(rèn)為酶NADPH氧化酶是用于病原體如Bgh成功穿透入植物細(xì)胞的主要元件。此外，此方法優(yōu)于所有一般通過(guò)抗性介導(dǎo)蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的病原體抗性表型的那些方法?？蓪⒒蜻M(jìn)行關(guān)閉使(外源)蛋白質(zhì)不表達(dá)。在理想情況下，只將內(nèi)源性基因進(jìn)行了滅活。這對(duì)于消費(fèi)者的認(rèn)可及接受有值得考慮的優(yōu)點(diǎn)，所述消費(fèi)者經(jīng)常對(duì)具有外源蛋白質(zhì)的植物不相信。本文中的非常特別的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子用于降低NADPH氧化酶量、活性或功能，例如，在病原體-可誘導(dǎo)啟動(dòng)子情況下，只在需要(即病原體攻擊)時(shí)使表達(dá)成為可能。
原則上，根據(jù)本發(fā)明所述的方法可應(yīng)用于所有植物物種，優(yōu)選應(yīng)用于NADPH氧化酶或其功能性等同物天然表達(dá)的植物。
對(duì)于本發(fā)明，“植物”表示植物界高等及低等植物的所有屬和種。在這個(gè)表述中包括成熟植物、種子、枝條及幼苗，及部分、繁殖材料、植物器官、組織、原生質(zhì)體、愈傷組織及其它培養(yǎng)物，例如來(lái)自它們的細(xì)胞培養(yǎng)物，及所有給予植物細(xì)胞功能性或結(jié)構(gòu)單位的其它型組。成熟植物是指除幼苗外在任何發(fā)育階段的植物。幼苗表示在早期發(fā)育階段的幼小、未成熟植物?！爸参铩卑幸荒晟岸嗄晟鷨巫尤~及雙子葉植物并以舉例的方式但不受限制，包括南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、核桃屬(Juglans)、草霉屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食豆屬(Onobrychis)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼佗羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)，太陽(yáng)花屬(Solarium)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、馬郁蘭屬(Majorana)、菊苣屬(Cichorium)，向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵屬(Pelargonium)、稷屬(Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)，毛莨屬(Ranunculus)，千里光屬(Senecio)、喇叭舌屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)，Browaalia、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(Oryza)、玉米屬(Zea)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、小麥屬(Triticum)、高粱屬(Sorghum)、云杉屬(Picea)及楊屬(Populus)。
術(shù)語(yǔ)“植物”優(yōu)選包含單子葉農(nóng)作物植物，例如谷類物種如小麥、大麥、谷子、黑麥、黑小麥(triticale)、玉米、稻、高粱或燕麥及甘蔗。
術(shù)語(yǔ)進(jìn)一步包含雙子葉農(nóng)作物植物例如，-蕓苔科(Brassicaceae)如油菜、蕓苔、水芹、擬南芥菜、卷心菜或蕓苔，豆科(Leguminosae)如大豆、苜蓿、豌豆或花生。
-茄科(Solanaceae)如馬鈴薯、煙草、番茄、茄子或紅辣椒，菊科(Asteraceae)如向日葵、萬(wàn)壽菊、萵苣或金盞草，-葫蘆科(Cucurbitaceae)如瓜、南瓜/西葫蘆或胡瓜，及亞麻子、棉花、大麻、三葉草、菠菜、亞麻、辣椒、胡蘿卜、甜菜根、蘿卜、甜菜、甘薯、黃瓜、花椰菜、綠花椰菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、塊根芹菜、草莓、懸鉤子、黑霉、菠蘿及多種樹(shù)、灌木、堅(jiān)果及藤蔓物種。樹(shù)種優(yōu)選包含李樹(shù)、櫻桃樹(shù)、桃樹(shù)、油桃、杏樹(shù)、香蕉樹(shù)、paw paw、芒果樹(shù)、蘋果樹(shù)、梨樹(shù)、溫柏。
進(jìn)一步包含的為觀賞植物，有用或觀賞樹(shù)、花、切花、灌木或草坪，以舉例的方式但不限于薔薇科(Rosaceae)如玫瑰，杜鵑花科(Ericaceae)如杜鵑花及azaleas，大戟屬(Euphorbiaceae)如猩猩木及巴豆，石竹科(Caryophyllaceae)如康乃馨，茄科(Solanaceae)如牽?；?，苦苣臺(tái)科(Gesneriaceae)如非洲堇、鳳仙花科(Balsaminaceae)如勿碰我，蘭科(Orchidaceae)如蘭花，鳶尾科(Iridaceae)如洋蔥(gladioli)、鳶尾、小蒼蘭及番紅花，菊科(Compositae)如金盞草、牻牛兒苗科(Geraniaceae)如天竺葵，百合科(Liliaceae)如龍血樹(shù)，?？?Moraceae)如無(wú)花果，天南星科(Araceae)如喜林芋屬(philodendron)等等。
優(yōu)選達(dá)到本發(fā)明目的的為作為食物或飼料進(jìn)行利用的植物，非常特別優(yōu)選單子葉屬或種，如以上描述的谷類物種。
方法非常特別優(yōu)選應(yīng)用于單子葉植物，最優(yōu)選具有農(nóng)業(yè)上重要性的植物如小麥、燕麥、谷子、大麥、黑麥、玉米、稻子、蕎麥、高粱、黑小麥、斯佩爾特小麥(spelt)、亞麻子或甘蔗。
“病原體抗性”表示在病原體感染后，植物的疾病癥狀降低或減弱。癥狀可為多方面，但優(yōu)選包含直接或間接對(duì)植物的品質(zhì)、產(chǎn)量、用作飼料或糧食的適合性有副作用或使農(nóng)作物播種、種植、收獲或加工變的困難。
“賦予”、“存在”、“產(chǎn)生”或“增強(qiáng)”病原體抗性表示在其它方面相同條件下(例如，氣候條件、生長(zhǎng)條件、病原體物種等等)，與沒(méi)有應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明方法的野生型植物(“原初植物”)相比，由于應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明所述的方法，特定植物種或變種的防御機(jī)制對(duì)一種或多種病原體的抗性增強(qiáng)?？剐栽鰪?qiáng)證明它自身優(yōu)選疾病癥狀表現(xiàn)降低，除上述的不利作用外，疾病癥狀也包括，例如，病原體進(jìn)入植物或植物細(xì)胞的穿透率或在同一植物或植物細(xì)胞上的繁殖率。在本文中，疾病癥狀優(yōu)選降低至少10％或至少20％，特別優(yōu)選至少40％或60％，非常特別優(yōu)選至少70％或80％并最優(yōu)選至少90％或95％。
與原初植物相反或進(jìn)行比較，對(duì)至少一種病原體存在或增強(qiáng)抗性的植物而言“選擇”表示所有適于識(shí)別病原體抗性存在或增強(qiáng)的那些方法。這些可為病原體感染癥狀(例如，在真菌感染情況下吸器的發(fā)育)，但也包括與植物品質(zhì)、產(chǎn)量、用于作為飼料或糧食等的適合性相關(guān)的上述癥狀。
本發(fā)明范圍內(nèi)的“病原體”以舉例的方式但不局限于指病毒或類病毒、細(xì)菌、真菌、動(dòng)物害蟲(chóng)例如昆蟲(chóng)或線蟲(chóng)。特別優(yōu)選的為真菌，如霉菌。然而，可以推定NADPH氧化酶的表達(dá)、它的活性或它的功能也引起對(duì)其它病原體的抗性。以下病原體可以舉例的方式但不受限制進(jìn)行闡述1.真菌病原體及真菌樣病原體真菌病原體及真菌樣病原體(例如管毛生物界(Chromista))優(yōu)選來(lái)自包含根腫菌門(Plasmodiophoramycota)、卵菌門(Oomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、壺菌(Chytridiomycetes)、接合菌(Zygomycetes)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)及半知菌(Deuteromycetes)。在表1和2中提及的病原體及與它們相關(guān)的疾病可以舉例而非限制的方式提及。
表1真菌植物疾病
表2霜霉病
以下是特別優(yōu)選的-根腫菌門如蕓苔根腫菌(Plasmodiophora brassicae)(十字花科植物的甘藍(lán)根腫病)、馬鈴薯粉痂菌(Spongospora subterranea)(洋芋的白痂病)、多粘霉(Polymyxa graminis)(谷類及草的根病)，
-卵菌門如萵苣盤梗霉(Bremia lactucae)(萵苣霜霉病)、在金魚草(金魚草霜霉(P.antirrhini))、洋蔥(P.destructor)、菠菜(散展霜霉(P.effusa))、大豆(東北霜霉(P.manchurica))、煙草(“青霉”；P.tabacina)、苜蓿及三葉草(車軸草霜霉(P.trifolium))中的霜霉屬(Peronospora)(霜霉病)、律草假霜霉(Pseudoperonosporahumuli)(蛇麻花霜霉病)、單軸霉(Plasmopara)(葡萄樹(shù)霜霉病)(葡萄生單軸霉(P.viticola))及向日葵(霍爾斯單軸霉(P.halstedii))、大孢指疫霉(谷物及草的霜霉病)、腐霉(所有類型植物的種子腐病、幼苗猝倒及根腐病，例如德巴利腐霉(P.debaryanum)引起的甜菜猝倒病)，致病疫霉(Phytophthora infestans)(馬鈴薯枯萎病、番茄褐腐病等等)、白銹屬(Albugo spec)(十字花科植物的白銹病)。
-子囊菌門如白小羊蹄菌(Microdochium nivale)(黑麥及小麥的雪霉病)、禾本科鐮孢、大刀鐮孢(主要在小麥中的部分穗不育)、尖鐮孢(番茄的鐮孢枯萎)、禾谷類白粉菌(大麥(大麥?；?及小麥(小麥專化型)的白粉病)、豌豆白粉菌(Erysiphe pisi)(豌豆的白粉病)、Nectriagalligena(果樹(shù)的Nectria canker)、葡萄鉤絲殼(Uncinula necator)(葡萄樹(shù)白粉病)、維管束假盤菌(Pseudopeziza tracheiphila)(葡萄樹(shù)紅熱病)、麥角菌(Claviceps purpurea)(例如，黑麥及草的麥角癥)、禾頂囊殼(小麥、黑麥及其它草的全蝕斑病(Take-All))、稻瘟病菌(稻瘟病)、麥類核腔菌(Pyrenophora graminea)(大麥葉條紋)、圓核腔菌(Pyrenophora teres)(大麥網(wǎng)斑病)、假麥草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)(小麥葉枯病)、蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)(蘋果斑點(diǎn)病)、核盤菌(Sclerotinia sclerotium)(莖斷、莖腐)、苜蓿假盤菌(Pseudopeziza medicaginis)(苜蓿、白三葉草及紅三葉草的葉斑病)。
-擔(dān)子菌如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)(大麥、黑麥、小麥的核瑚菌病)、玉蜀黍黑粉菌(玉米的黑粉病)、裸黑粉菌(Ustilago nuda)(大麥散黑穗病)、小麥散黑粉菌(Ustilago tritici)(小麥、斯佩爾特小麥的散黑穗病)、燕麥散黑粉菌(Ustilago avenae)(燕麥散黑穗病)、立枯絲核菌(馬鈴薯的立枯絲核菌根腐病)、軸黑粉菌屬中的某些種(Sphacelotheca spp.)(高粱的絲黑穗病)、亞麻柵銹菌(Melampsoralini)(亞麻銹病)、禾柄銹菌(小麥、大麥、黑麥、燕麥的莖銹病)、隱匿柄銹菌(小麥葉銹病)、Puccinia dispersa(黑麥褐銹病)、大麥柄銹菌(Puccinia hordei)(大麥葉銹病)、禾冠柄銹菌(Pucciniacoronata)(燕麥頂銹病)、條形柄銹菌(小麥、大麥、黑麥及許多草的黃銹病)、疣頂單胞銹菌(Uromyces appendiculatus)(大豆的褐銹病)、齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)(許多植物的根及莖腐病)。
-半知菌如小麥(小麥殼針孢)的穎枯殼針孢(穎斑枯病)、小麥基腐病假尾孢(小麥、大麥、黑麥的眼斑病)、黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)(黑麥及大麥的葉斑病)、茄鏈格孢(Alternaria solani)(馬鈴薯、番茄的早疫病)、甜菜莖點(diǎn)霉(Phoma betae)(甜菜上的黑點(diǎn))、甜菜生尾孢(Cercospora beticola)(甜菜的葉斑)、蕓苔鏈格孢(Alternariabrassicae)(油菜、卷心菜及其它十字花科植物的黑斑病)、大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)(黃萎病)、豆刺盤孢(Colletotrichumlindemuthianum)(大豆炭疽病)、黑脛莖點(diǎn)霉(Phoma lingam)(卷心菜及油菜的黑點(diǎn))、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(葡萄藤、草莓、番茄、蛇麻花等等的灰霉)。
最優(yōu)選的為致病疫霉(馬鈴薯枯萎病、番茄等等的褐腐病)、雪腐微結(jié)節(jié)菌(Microdochium nivale)(以前稱為雪腐鐮孢(Fusarium nivale)；黑麥及小麥的雪霉病)、禾本科鐮孢、大刀鐮孢(小麥部分穗不育)、尖鐮孢(番茄的鐮孢枯萎)、禾谷類白粉菌(大麥(大麥?；?及小麥(小麥專化型))的白粉病)、稻瘟病菌(稻瘟病)、核盤菌(莖斷、莖腐)、穎枯殼針孢及小麥殼針孢(小麥穎孢斑點(diǎn))、蕓苔鏈格孢(油菜、卷心菜及其它十字花科的黑斑病)、黑脛莖點(diǎn)霉(卷心菜及油菜的黑點(diǎn))。
2.細(xì)菌病原體在表3中闡述的與它們相關(guān)的所有病原體及疾病，可以舉例的方式但不受限制進(jìn)行闡述。
表3細(xì)菌疾病
非常特別優(yōu)選的為以下病原性細(xì)菌馬鈴薯壞腐棒狀桿菌(Corynebacterium sepedonicum)(馬鈴薯細(xì)菌性環(huán)腐病)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(馬鈴薯細(xì)菌性軟腐)、解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)(對(duì)梨、蘋果、quince引起火疫病)、瘡痂病鏈霉菌(Streptomyces scabies)(馬鈴薯瘡痂病)、丁香假單胞菌煙草致病變種(煙草黑熱)、丁香假單胞菌菜豆致病變種(菜豆油點(diǎn))、丁香假單胞菌番茄致病變種(番茄細(xì)菌性斑)、野油菜黃單胞菌棉花致病變種(Xanthomonascampestris pv.malvacearum)(棉花細(xì)菌性枯萎)及野油菜黃胞菌稻致病變種(水稻及其它草的細(xì)菌性葉枯病)。
3.病毒病原體“病毒病原體”包括所有植物病毒例如煙草或黃瓜花葉病毒、環(huán)斑病毒、壞死病毒、玉米矮縮花葉病毒等等。
與它們相關(guān)的病原體及疾病在表4中可以舉例而非限制性的方式提及。
表4病毒性疾病
4.動(dòng)物害蟲(chóng)4.1昆蟲(chóng)病原體昆蟲(chóng)例如甲蟲(chóng)，毛蟲(chóng)虱或螨可以舉例的方式但不受限制進(jìn)行闡述。優(yōu)選為鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等等屬的昆蟲(chóng)。特別優(yōu)選的為鞘翅目及鱗翅目昆蟲(chóng)例如歐洲玉米螟(ECB)、Diabrotica barberi(“北方玉米切根蟲(chóng)”)、Diabrotica undecimpunctata(“南方玉米切根蟲(chóng)”)、Diabrotica virgifera(“西方玉米切根蟲(chóng)”)、Agrotis ipsilon(“黑切根蟲(chóng)”)、Crymodes devastator(“玻璃狀切根蟲(chóng)”)、Feltia ducens(“微黑切根蟲(chóng)”)，Agrotis gladiaria(“粘土狀后背的(claybacked)切根蟲(chóng)”)、梳狀叩頭蟲(chóng)(Melanotus spp.)、Aeolus mellillus(“金針蟲(chóng)”)、Aeolus mancus(“小麥金針蟲(chóng)”)、Horistonotus uhlerii(“砂地金針蟲(chóng)”)、Sphenophorusmaidis(“玉米長(zhǎng)喙象”)、Sphenophorus zeae(“牛草長(zhǎng)喙象”)、Sphenophorusparvulus(“牧草長(zhǎng)喙象”)、Sphenophorus callosus(“南方玉米長(zhǎng)喙象”)、食葉鰓金龜屬中的種(Phyllogphaga spp.)(“白蠐螬”)、Anuraphismaidiradicis(“谷物根蚜”)、Delia platura(“灰地種蠅”)、Colaspis brunnea(“葡萄肖葉甲”)、Stenolophus lecontei(“玉米深褐步甲”)和Cliviniaimpressifrons(“玉米籽細(xì)步甲”)。
其它可提及的昆蟲(chóng)為甲角負(fù)泥蟲(chóng)(Oulema melanopus)、歐洲麥稈蠅(Oscinella frit)、金針蟲(chóng)(Agrotis lineatus)及蚜蟲(chóng)(例如燕麥粒蚜蟲(chóng)Rhopalosiphum padi、黑莓蚜蟲(chóng)Sitobion avenae)。
4.2線蟲(chóng)與它們相關(guān)的病原體及疾病在表6中以舉例而非限制的方式提及。
表6寄生線蟲(chóng)
非常特別優(yōu)選的為馬鈴薯金線蟲(chóng)(Globodera rostochiensis)及馬鈴薯白線蟲(chóng)(G.pallida)(馬鈴薯、番茄及其它茄科的胞囊線蟲(chóng))、甜菜胞囊線蟲(chóng)(Heterodera schachtii)(糖甜菜及飼用甜菜、油菜籽、卷心菜等的甜菜線蟲(chóng))、燕麥胞囊線蟲(chóng)(燕麥及其它谷類物種的谷類胞囊線蟲(chóng))、鱗球莖莖線蟲(chóng)(莖或球莖線蟲(chóng)，黑麥、燕麥、玉米、三葉草、煙草、甜菜的莖線蟲(chóng))、Anguina tritici(小麥粒線蟲(chóng)(斯佩爾特小麥、黑麥)、北方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne hapla)(胡蘿卜、黃瓜、萵苣、番茄、馬鈴薯、甜菜、苜蓿的根結(jié)線蟲(chóng))。
真菌或病毒病原體的優(yōu)選單個(gè)變種的實(shí)例以下1.大麥真菌、細(xì)菌及病毒病原體禾柄銹菌大麥?；?大麥莖銹病)、禾谷類白粉菌大麥?；?大麥白粉病)、大麥黃化矮病毒(BYDV)、病原性昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)Ostrinia nubilalis(歐洲玉米螟)、Agrotis ipsilon(黑切根蟲(chóng))；Schizaphis graminum(麥二岔蚜)；Blissus leucopterusleucopterus(麥長(zhǎng)蝽)；Acrosternum hilare(喜綠蝽)；Euschistus servus(扁盾蝽)；Deliaplatura(玉米種蠅)；Mayetiola destructor(小麥癭蚊)；Petrobia latens(麥巖螨)。
2.大豆真菌、細(xì)菌或病毒病原體大雄疫霉威氏大豆變種(Phytophthoramegasperma fsp.Glycinea)、菜豆殼球孢、立枯絲核菌、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖鐮孢、菜豆間座殼大豆變種(Diaporthephaseolorum var.sojae)(大豆擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis sojae))、菜豆間座殼caulivora變種(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)、齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、大豆尾孢(Cercospora sojina)、東北霜霉、束狀刺盤孢(Colletotrichumdematium)(平頭刺盤孢(Colletotrichum truncatum))、山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)、大豆殼針孢(Septoria glycines)、大豆生葉點(diǎn)霉(Phyllosticta sojicola)鏈格孢、丁香假單胞菌威氏大豆變種、野油菜黃單胞菌菜豆致病變種、Microsphaera diffussa、半裸鐮孢(Fusarium semitectum)、Phialophora gregata、大豆花葉病毒、大豆小叢殼(Glomerella glycines)、煙草環(huán)斑病病毒、煙草線條病毒、Phakopsorapachyrhizi、瓜果腐霉、終極腐霉(Pythium ultimum)、德巴利腐霉、番茄斑萎病毒、大豆胞囊線蟲(chóng)(Heterodera glycines)、腐皮鐮孢(Fusarium solani)。
病原性昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)Pseudoplusia includens(大豆尺夜蛾)；Anticarsiagemmatalis(黎豆夜蛾)；Plathypena scabra(苜蓿綠夜蛾)；Ostrinianubilalis(歐洲玉米螟)；Agrotis ipsilon(黑切根蟲(chóng))；Spodoptera exigua(甜菜夜蛾)；Heliothis virescens(棉卷葉蛾)；Helicoverpa zea(美洲棉鈴蟲(chóng))；Epilachna varivestis(墨西哥豆甲)；Myzus persicae(桃赤蚜)；Empoasca fabae(馬鈴薯小葉蟬)；Acrosternum hilare(喜綠蝽)；Melanoplus femurrubrum(赤腿蚱蜢)；Melanoplus differentialis(長(zhǎng)額負(fù)蝗)；Hylemya platura(玉米種蠅)；Sericothrips variabilis(大豆薊馬)；Thrips tabaci(洋蔥薊馬)；Tetranychus turkestani(土耳其斯坦葉螨)；Tetranychus urticae(二斑葉螨).
3.蕓苔真菌、細(xì)菌或病毒病原體白銹菌(Albugo candida)、蕓苔鏈格孢(Alternaria brassicae)、Leptosphaeria maculans、立枯絲核菌、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、蕓苔生球腔菌(Mycosphaerellabrassiccola)、終極腐霉(Pythium ultimum)、寄生霜霉、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、鏈格孢。
4.苜蓿真菌、細(xì)菌或病毒病原體密執(zhí)安棍狀桿菌詭譎亞種(Clavibactermichiganense subsp.Insidiosum)、終極腐霉、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、華麗腐霉(Pythium splendens)、德巴利腐霉、瓜果腐霉、大雄疫霉、車軸草霜霉、Phoma medicaginis var.medicaginis、苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)、苜蓿假盤菌(Pseudopezizamedicaginis)、Leptotrochila medicaginis、鐮孢、野油菜黃單胞菌苜蓿致病變種、根腐絲囊霉(Aphanomyces euteiches)、Stemphyliumherbarum、Stemphylium alfalfae。
5.小麥真菌、細(xì)菌或病毒病原體丁香假單胞菌atrofaciens變種、冰草條黑粉菌(Urocystis agropyri)、野油菜黃單胞菌大麥致病變種、丁香假單胞菌丁香致病變種、鏈格孢、多主枝孢(Cladosporium herbarum)、禾本科鐮孢、燕麥鐮孢、大刀鐮孢、小麥散黑粉菌(Ustilago tritici)、小麥殼二孢(Ascochyta tritici)、禾生頭孢(Cephalosporiumgramineum)、禾生刺盤孢(Collotetrichum graminicola)、小麥禾白粉菌、小麥禾柄銹菌(Puccinia graminis)、小麥隱匿柄銹菌、條形柄銹菌、偃麥草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)、穎枯殼針孢、小麥殼針孢、燕麥殼針孢(Septoria avenae)、小麥基腐病假尾孢、立枯絲核菌、谷類絲核菌(Rhizoctonia cerealis)、禾頂囊殼小麥變種、瓜果腐霉、終極腐霉、蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)、大麥黃矮病毒、雀麥草花葉病毒、土傳小麥花葉病毒、小麥線條花葉病毒、小麥梭斑病毒、美洲小麥條點(diǎn)花葉病毒、麥角菌(Claviceps purpurea)、小麥腥黑粉菌(Tilletia tritici)、光滑黑粉菌(Tilletia laevis)、小麥黑粉菌(Ustilago tritici)、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、立枯絲核菌、Pythium arrhenomannes、禾生腐霉(Pythium gramicola)、瓜果腐霉、高原病毒(High Plains Virus)、歐洲小麥線條病毒、小麥禾柄銹菌(小麥莖銹病)、禾谷類白粉菌小麥?；?小麥白粉病)。
病原性昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)Pseudaletia unipunctata(行軍蟲(chóng))；Spodopterafrugiperda(秋夜蛾)；Elasmopalpus lignosellus(小玉米秸蛀心蟲(chóng))；Agrotis orthogonia(西部切根蟲(chóng))；Elasmopalpus Zignosellus(小玉米秸蛀心蟲(chóng))；Oulema melanopus(橙足負(fù)泥蟲(chóng))；Hypera punctata(車軸草葉象甲)；Diabrotica undecimpunctata howardi(南方玉米切根蟲(chóng))；俄小麥蚜；Schizaphis graminum(麥二岔蚜)；Macrosiphum avenae(英谷物蚜)；Melanoplus femurrubrum(赤腿蚱蜢)；Melanoplusdifferentialis(長(zhǎng)額負(fù)蝗)；Melanoplus sanguinipes(遷徒蚱蜢)；Mayetiola destructor(小麥癭蚊)；Sitodiplosis mosellana(麥紅吸漿蟲(chóng))；Meromyza americana(小麥稈蠅)；Hylemya coarctata(小麥鱗莖蚊)；Frankliniella fusca(煙草薊馬)；Cephus cinctus(小麥稈葉蜂)；Aceriatulipae(郁金香瘤癭螨).
6.向日葵真菌、細(xì)菌或病毒病原體Plasmophora halstedii、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、翠菊黃萎病菌(Aster Yellows)、向日葵殼針孢(Septoriahelianthi)、向日葵擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis helianthi)、向日葵鏈格孢(Alternaria helianthi)、百日草鏈格孢(Alternaria zinniae)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、Phoma macdonaldii、菜豆殼球孢、二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、稻根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉、匍枝根酶(Rhizopus stolonifer)、向日葵柄銹菌(Pucciniahelianthi)、大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)、胡蘿卜軟腐病歐文氏菌Carotovora致病變種、頂頭孢(Cephalosporium acremonium)、隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)、婆羅門參白銹(Albugotragopogonis)。
病原性昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)Suleima helianthana(向日葵芽小卷葉蛾)；Homoeosoma electellum(向日葵卷葉蛾)；zygogramma exclamationis(向日葵甲蟲(chóng))；Bothyrus gibbosus(胡蘿卜金龜)；Neolasiopteramurtfeldtiana(向日葵籽癭蚊).
7.玉米真菌、細(xì)菌或病毒病原體串珠鐮孢亞粘團(tuán)變種、斯氏歐文氏菌、串珠鐮孢、玉米赤霉(禾本科鐮孢)、Stenocarpella maydi(玉米色二孢)、畸雌腐霉、德巴利腐霉、禾生腐霉(Pythium graminicola)、華麗腐霉、終極腐霉、瓜果腐霉、黃曲霉、玉米蠕孢菌0，T(Cochliobolusheterostrophus)、炭色長(zhǎng)蠕孢I，II & III(Cochliobolus carbonum)、大斑凸臍蠕孢(Exserohilum turcicum)I，II & III、小梗長(zhǎng)蠕孢(Helminthosporium pedicellatum)、玉蜀黍節(jié)壺菌、玉蜀黍葉點(diǎn)霉(Phyllosticta maydis)、玉蜀黍球梗孢(Kabatiella maydis)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、玉蜀黍黑粉菌、高粱柄銹菌、多堆柄銹菌、菜豆殼球孢、草酸青霉菌、稻黑孢(Nigrospora oryzae)、多主枝孢(Cladosporium herbarum)、彎孢(Curvularia lunata)、不等彎孢、蒼白彎孢、密執(zhí)安棒狀桿菌內(nèi)布拉斯加亞種、綠色木霉(Trichoderma viride)、玉米矮花葉病毒A&B、小麥線條花葉病毒、玉米褪綠矮縮病毒、高粱麥角(Claviceps sorghi)、燕麥假單胞菌(Pseudonomas avenae)、菊歐文氏菌玉米致病變種、胡蘿卜軟腐病歐文氏菌、Cornstunt spiroplasma、大孢色二孢(Diplodiamacrospora)、大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)、高粱指霜霉(Peronosclerospora sorghi)、菲律賓指霜霉(Peronosclerosporaphilippinesis)、玉蜀黍指霜霉(Peronosclerospora maydis)、甘蔗指霜霉(Peronosclerospora sacchari)、Spacelotheca reiliana、玉蜀黍殼銹菌(Physopella zeae)、玉蜀黍頭孢、頂頭孢(Caphalosporiumacremonium)、玉米褪綠斑點(diǎn)病毒、高原病毒、玉米花葉病毒、玉米雷亞朵非納病毒、玉米線條病毒(MSV)、玉米條紋葉枯病毒、玉米粗矮病毒。
病原性昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)Ostrinia nubilalis(歐洲玉米螟)；Agrotis ipsilon(黑切根蟲(chóng))；美洲棉鈴蟲(chóng)；Spodoptera frugiperda(秋夜蛾)；Diatraeagrandiosella(西南玉米螟)；Elasmopalpus lignosellus(小玉米秸蛀心蟲(chóng))；Diatraea saccharalis(蔗螟)；Diabrotica virgifera(西部玉米根蟲(chóng))；Diabrotica longicornis barberi(北部玉米根蟲(chóng))；Diabroticaundecimpunctata howardi(南部玉米根蟲(chóng))；梳爪叩頭蟲(chóng)屬的種(金針蟲(chóng))；Cyclocephala borealis(北部臭金龜子；蠐螬)；Cyclocephalaimmaculata(南部臭金龜子；蠐螬)；Popillia japonica(日本甲蟲(chóng))；Chaetocnema pulicaria(玉米跳甲)；Sphenophorus maidis(玉米谷象)；Rhopalosiphum maidis(玉米葉蚜)；Anuraphis maidiradicis(玉米根蚜)；Blissus leucopterus leucopterus(麥長(zhǎng)蝽)；Melanoplusfemurrubrum(赤腿蚱蜢)；Melanoplus sanguinipes(遷徒蚱蜢)；Hylemva platura(玉米種蠅)；Agromyza parvicornis(玉米斑潛蠅)；Anaphothrips obscrurus(美洲錐尾薊馬)；Solenopsis milesta(竊蟻)；Tetranychus urticae(二斑葉螨)。
8.高粱真菌、細(xì)菌或病毒病原體大斑凸臍蠕孢、禾生刺盤孢(Glomerellagraminicola)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、高粱膠尾孢、高梁殼二孢(Ascochyta sorghina)、丁香假單胞菌丁香致病變種、野油菜黃單胞菌絨毛草致病變種、須芒草假單胞菌(Pseudomonasandropogonis)、紫病銹菌(Puccinia purpurea)、菜豆殼球孢、Perconiacircinata、串珠鐮孢、鏈格孢、高梁蠕孢菌(Bipolaris sorghicola)、高粱生長(zhǎng)孺孢(Helminthosporium sorghicola)、彎孢、Phoma insidiosa、燕麥假單胞菌(Pseudomonas alboprecipitans)、高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)、高粱生座枝孢(Ramulispora sorghicola)、甘蔗黑痣菌(Phyllachara sacchari)、Sporisorium reilianum(絲軸黑粉菌)、高粱軸黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)、Sporisorium sorghi、甘蔗花葉H、玉米矮花葉病毒A&B、高粱麥角(Claviceps sorghi)、立枯絲核菌、局限枝頂孢霉、大孢指疫霉、高粱指霜霉、菲律賓指霜霉、禾生指梗霉、禾本科鐮孢、尖鐮孢、Pythium arrhenomanes、禾生腐霉。
病原性昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)Chilo partellus(高梁蛀蟲(chóng))；Spodoptera frugiperda(秋夜蛾)；美洲棉鈴蟲(chóng)；Elasmopalpus lignosellus(小玉米秸蛀心蟲(chóng))；Feltia subterranea(粗膚地老慮)；Phyllophaga crinita(蠐螬)；擬步甲屬(Eleodes)、Conoderus屬和天牛屬(Aeolus)中的種(金針蟲(chóng))；Oulemamelanopus(橙足負(fù)泥蟲(chóng))；Chaetocnema pulicaria(玉米跳甲)；Sphenophorus maidis(玉米谷象)；Rhopalosiphum maidis(玉米葉蚜)；Sipha flava(蔗黃偽毛蚜)；Blissus leucopterus leucopterus(麥長(zhǎng)蝽)；Contarinia sorghicola(高梁癭蚊)；Tetranychus cinnabarinus(朱砂葉螨)；Tetranychus urticae(二斑葉螨).
9.棉花病原性昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)棉卷葉蛾；美洲棉鈴蟲(chóng)；Spodoptera exigua(甜菜夜蛾)；Pectinophora gossypiella(棉紅鈴蟲(chóng))；Anthonomus grandisgrandis(棉鈴象蟲(chóng)甲)；Aphis gossypii(蝗蚜)；Pseudatomoscelis seriatus(棉跳盲蝽)；Trialeurodes abutilonea(結(jié)翅粉虱)；Lygus lineolaris(牧草盲蝽)；Melanoplus femurrubrum(赤腿蚱蜢)；Melanoplusdifferentialis(長(zhǎng)額負(fù)蝗)；Thrips tabaci(洋蔥薊馬)；Franklinkiellafusca(煙草薊馬)；Tetranychus cinnabarinus(朱砂葉螨)；Tetranychusurticae(二斑葉螨).
10.水稻病原性昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)Diatraea saccharalis(甘蔗蛀心蟲(chóng))；Spodopterafrugiperda(秋夜蛾)；美洲棉鈴蟲(chóng)；Colaspis brunnea(葡萄肖葉甲)；Lissorhoptrus oryzophilus(稻象甲)；Sitophilus oryzae(米象)；Nephotettix nigropictus(黑尾葉蟬)；Blissus leucopterus leucopterus(麥長(zhǎng)蝽)；Acrosternum hilare(喜綠蝽)。
11.油菜籽病原性昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)Brevicoryne brassicae(卷心菜蚜蟲(chóng))；Phyilotretacruciferae(跳甲)。Mamestra conjugrata(披肩粘蟲(chóng))；Plutellaxylostella(菱形斑紋蛾)；Delia ssp.(根蛆)。
在本發(fā)明中，“NADPH氧化酶”表示本質(zhì)特征為通過(guò)單電子轉(zhuǎn)移，能將分子氧(O2)轉(zhuǎn)換為超氧化物(O2-)的所有酶。優(yōu)選通過(guò)EC類E.C.1.23.45.3描述的那些酶。在本文中，NADPH氧化酶可由相同或不同的一種或多種多肽組成。
優(yōu)選的，NADPH氧化酶為黃細(xì)胞色素蛋白質(zhì)并包含作為輔基的細(xì)胞色素b和/或FAD單元。NADPH氧化酶可由α1β1異二聚體組成，β亞單位為黃細(xì)胞色素的功能性亞單位，所述β亞單位作為糖蛋白，可包含電子轉(zhuǎn)運(yùn)組分(包含NADPH及FAD的親水胞質(zhì)C-末端結(jié)構(gòu)域，及包含絡(luò)合兩個(gè)組氨酸的血紅素輔基的推定跨膜α螺旋的4至6個(gè)N末端)。α亞單位可包含能結(jié)合NADPH氧化酶的潛在胞質(zhì)、活化因子的C末端脯氨酸豐富序列。通過(guò)結(jié)合胞質(zhì)phox蛋白質(zhì)(例如p47-phox、p67-phox、p40-phox)及GTP結(jié)合蛋白質(zhì)p21rac發(fā)生活化。
熟練技術(shù)人員對(duì)來(lái)自植物生物體的NADPH氧化酶是熟悉的(TorresMA等人(1998)Plant J 14365-370，等等)。以舉例但不受限的方式提及的序列為以下基因庫(kù)登錄號(hào)AJ251717(大麥(Hordeum vulgare))、AP003560(稻日本變種((Oryza sativa var.japonica))、AJ320505(煙草(Nicotiana tabacum))、AB050660(馬鈴薯(Solanum tuberosum))、AF088276(番茄(Lycopersicon esculentum))、AB008111(擬南芥菜；Atrboh F)、AF055357(擬南芥菜；RbohD)、AJ309006(煙草；rboh)、AP003271(稻日本變種)、AF055355(擬南芥菜；RbohC)、AF055353(擬南芥菜；RbohA)。特別優(yōu)選包含如在SEQ ID2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示序列的NADPH氧化酶。
來(lái)自與本發(fā)明公開(kāi)NADPH氧化酶序列同源的其它植物的序列例如，可通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索或通過(guò)用NADPH氧化酶序列作為搜索序列或探針篩選基因文庫(kù)易于找到。可提及的實(shí)例為有以下基因庫(kù)登錄號(hào)的序列CAC51517.1、AJ251717、T03973、BAB68079.1、AP003560、T02024、CAC87256.1、AJ320505、BAB70750.1、AB050660、AF088276_1、NP_564821.1、NM_105079、T00265 AC007764_16、NP_192862.1、NM_117194、AF147783_1、AAM28891.1、AF506374、CAC84140.1、AJ309006、T51804、NP_199602.1、NM_124165、BAB89740.1、AP003271、AAC39477.1、AF055355、NP_199919.1、NM_124485、AAC39475.1、AF055353、NP_196356.1、NM_120821、NP_194239.1、NM_118641、BAB08369.1、AB015475、AAC39478.1、AF055356、AC069143_9、NP_173357.1、NM_101781、NP_172383.1、NM_100780、AAB70398.1、AC000106、AAC39476.1、AF055354、BAB70751.1、AB050661、BAB63664.1、AP003275、AAD24966.1、AF109150。
NADPH氧化酶的多肽序列特別優(yōu)選包含選自以下序列基序的至少一個(gè)序列基序
i)AL(K/R)GL(K/R)ii)DK(N/D)XDG(R/K)(I/L/V)(T/N)Eiii)LSASANiv)IMEELDPv)K(F/L)NMA(I/L)(I/V)LXPVCRNvi)(E/Q)WHPFSITvii)S(A/S)PXDD(Q/Y)(L/I)S(L/V)H(V/I/L)Rviii)DGPYG(S/A)PAGDYix)L(I/V)GLGIGATPx)FYWVTREQGSFxi)GVFYCG肽序列非常特別優(yōu)選包含選自序列基序i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、vii)、viii)、ix)、x)及xi)的至少2或3個(gè)，非常特別優(yōu)選至少4或5個(gè)，最優(yōu)選所有序列基序。(括號(hào)內(nèi)的字母表示在這個(gè)位置可能的備選氨基酸，例如(V/I)表示在這個(gè)位置可能為纈氨酸或異亮氨酸)。
NADPH氧化酶也意指對(duì)于NADPH氧化酶活性所必需的NADPH氧化酶復(fù)合體的任何其它單位。
“蛋白質(zhì)量”表示NADPH氧化酶多肽在生物體、組織、細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室中的量。蛋白質(zhì)量的“降低”表示—例如通過(guò)以下文中描述的方法之一—在其它方面相同條件下(例如，培養(yǎng)條件、植物年齡等等)，與沒(méi)有應(yīng)用這個(gè)方法的同一屬及種的野生型相比，NADPH氧化酶在生物體、組織、細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室中的量降低。在本文中，降低達(dá)到至少10％，優(yōu)選至少10％或至少20％，特別優(yōu)選至少40％或60％，非常特別優(yōu)選至少70％或80％，最優(yōu)選至少90％或95％。
“活性”表示NADPH氧化酶將分子氧(O2)轉(zhuǎn)換為過(guò)氧化物(O2-)的能力。活性的“降低”表示—例如通過(guò)以下文中描述的方法之一—在其它方面相同條件下(例如，培養(yǎng)條件，植物年齡等等)，與沒(méi)有應(yīng)用這個(gè)方法的同一屬及種的野生型相比，NADPH氧化酶蛋白質(zhì)在生物體、組織、細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室中的總活性降低。在本文中，降低達(dá)到至少10％，優(yōu)選至少10％或至少20％，特別優(yōu)選至少40％或60％，非常特別優(yōu)選至少70％或80％，最優(yōu)選至少90％或95％。
“功能”優(yōu)選表示NADPH氧化酶在生物體、組織、細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室中的底物結(jié)合能力。適當(dāng)?shù)牡孜餅榈头肿恿炕衔锶鏝ADPH或FAD，也為與NADPH氧化酶相互作用的蛋白質(zhì)分子。
功能“降低”表示—例如通過(guò)以下文中描述的方法之一—在其它方面相同條件下(例如，培養(yǎng)條件，植物年齡等等)，與沒(méi)有應(yīng)用這個(gè)方法的同一屬及種的野生型相比，例如，在生物體、組織、細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室中NADPH氧化酶對(duì)于至少一種底物的結(jié)合能力或結(jié)合強(qiáng)度在量上的降低?！敖档汀币怖斫獗硎緸槔纾缤ㄟ^(guò)kcat/Km值表達(dá)的，底物特異性的變化。在本文中，降低達(dá)到至少10％，優(yōu)選至少10％或至少20％，特別優(yōu)選至少40％或60％，非常特別優(yōu)選至少70％或80％，最優(yōu)選至少90％或95％。結(jié)合NADPH氧化酶的結(jié)合分子可例如通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)以熟練技術(shù)人員熟悉的方式進(jìn)行確定。
用于確定蛋白質(zhì)量、NADPH氧化酶活性或底物結(jié)合能力的方法是熟練技術(shù)人員已知的。例如，可測(cè)定NADPH依賴的O2-或H2O2的產(chǎn)生，其中所述產(chǎn)生可被DPI抑制(例如通過(guò)四唑硝基藍(lán)[NBT]或細(xì)胞色素c還原)。蛋白質(zhì)量可例如，用適當(dāng)抗體的免疫學(xué)方法進(jìn)行確定。對(duì)適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行了描述(Yu L等人(1999)Blood 94(7)2497-504；Doke N(1983a)Physiol Plant Pathol 23345-357；Levine A等人(1994)Cell 79583-593；Tenhaken R等人(1995)Proc Nat Acad Sci USA 924158-4163；Sagi M& Fluhr R.(2001)Plant Physiol 126(3)1281-90；Hückelhoven R & KogelKH(1998)Mol Plant Microbe Interact 11292-300；及以上論文引用的參考文獻(xiàn))。
NADPH氧化酶蛋白質(zhì)的“功能等同物”優(yōu)選表示衍生自包含如在SEQID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示多肽序列的NADPH氧化酶或與上述多肽序列同源并具有相同本質(zhì)特征的NADPH氧化酶的序列。
在本文中，與包含如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示的多肽序列的NADPH氧化酶之一降低時(shí)獲得的值比較，病原體抗性的功效可向上及向下離散。優(yōu)選的功能等同物為，病原體抗性的功效與來(lái)自通過(guò)降低包含如在SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22描述多肽序列的NADPH氧化酶獲得的比較值的差異不多于50％，優(yōu)選25％，特別優(yōu)選10％，所述病原體抗性的功效通過(guò)例如對(duì)病原體(吸器的發(fā)育)穿透功效進(jìn)行測(cè)定。特別優(yōu)選的為這樣的序列，其降低酶活性的結(jié)果使對(duì)病原體抗性的功效在量上超過(guò)比較值大于50％，優(yōu)選100％，特別優(yōu)選500％，非常特別優(yōu)選1000％，所述比較值通過(guò)包含如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中顯示的多肽序列的NAPDH氧化酶之一的降低獲得。
比較優(yōu)選在類似條件下進(jìn)行?！邦愃茥l件”表示欲進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)之間所有構(gòu)架條件如培養(yǎng)或生長(zhǎng)條件、測(cè)定條件(如緩沖液、溫度、底物、病原體濃度等等)保持相同并且只在欲進(jìn)行比較的NAPDH氧化酶序列、它們的來(lái)源生物體及根據(jù)需要為病原體不同。當(dāng)選擇用于比較的病原體時(shí)，考慮到種特異性，用于比較的欲進(jìn)行選擇的病原體為與對(duì)應(yīng)于其它病原體最相似的病原體。
特別地，“功能等同物”是指對(duì)這樣的NAPDH氧化酶進(jìn)行天然或人工突變并來(lái)自繼續(xù)具有本質(zhì)相同特征的其它植物的同源多肽，所述NAPDH氧化酶包含如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中顯示的多肽序列。以上描述的優(yōu)選植物的同源多肽是優(yōu)選的。來(lái)自與本發(fā)明范圍內(nèi)公開(kāi)的NAPDH氧化酶序列同源的來(lái)自其它植物(例如擬南芥菜)的序列例如通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索或用NADPH氧化酶序列作為搜索序列或探針篩選基因文庫(kù)可易于找到。這些序列以舉例的方式與它們的基因庫(kù)登錄號(hào)一起在以上進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明。
突變包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替代、添加、缺失、倒位或插入。因此，本發(fā)明也包含這樣的多肽，所述多肽例如通過(guò)修飾包含如SEQ IDNO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22顯示的多肽序列獲得。
兩個(gè)核酸序列之間的同源性可以理解為是指兩個(gè)核酸序列的同一性，每種情況下全序列長(zhǎng)度通過(guò)借助于程序GAP運(yùn)算法(威斯康辛軟件包10.0版，威斯康辛大學(xué)，遺傳計(jì)算機(jī)組(GCG)，Madison，美國(guó))比較進(jìn)行計(jì)算，所述程序設(shè)置了以下參數(shù)缺口權(quán)重50長(zhǎng)度權(quán)重3平均匹配10平均誤配0例如與序列SEQ ID NO1在核酸水平有至少80％同源性的序列理解為表示用以上參數(shù)組通過(guò)以上程序運(yùn)算法與序列SEQ ID NO1比較，具有至少80％同源性的序列。
兩個(gè)多肽之間的同源性理解為表示兩個(gè)氨基酸序列的同一性，在每種情況下全序列長(zhǎng)度的同一性通過(guò)借助于程序GAP運(yùn)算法(Wisconsin軟件包10.0版，Wisconsin大學(xué)，遺傳計(jì)算機(jī)組(GCG)，Madison，美國(guó)；Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.253389)比較進(jìn)行計(jì)算。所述程序設(shè)置了以下參數(shù)缺口權(quán)重8 長(zhǎng)度權(quán)重2平均匹配2,912 平均誤配-2,003例如與序列SEQ ID NO2在蛋白質(zhì)水平有至少80％同源性的序列理解為表示用以上參數(shù)組通過(guò)以上程序運(yùn)算法與序列SEQ ID NO2比較，具有至少80％同源性的序列。
衍生自包含如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22顯示的多肽序列的NADPH氧化酶的功能等同物通過(guò)替代、插入或缺失與包含如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22顯示的多肽序列的多肽具有至少50％，優(yōu)選至少70％，通過(guò)優(yōu)選至少90％，特別優(yōu)選至少95％，非常特別優(yōu)選至少98％同源性并與上述序列的相同本質(zhì)特征相區(qū)別。
通過(guò)替代、插入或缺失衍生自包含如SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21顯示的核酸序列的NADPH氧化酶的功能等同物與如SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21顯示的根據(jù)本發(fā)明的核酸之一具有至少50％，優(yōu)選至少70％，通過(guò)優(yōu)選至少90％，特別優(yōu)選至少95％，非常特別優(yōu)選至少98％同源性并編碼與包含如SEQID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22顯示序列的多肽有相同本質(zhì)特征。
并且，用在SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21下描述的核酸序列或這些核酸序列中的部分作為探針，篩選其它物種，優(yōu)選植物物種是熟練技術(shù)人員已知的用于在其它物種中鑒定同源物(homologs)的方法，所述植物物種作為用于轉(zhuǎn)化的適當(dāng)宿主的cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)在以下進(jìn)一步進(jìn)行闡述。在本文中，來(lái)自如SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中顯示的核酸序列的探針長(zhǎng)度至少20bp，優(yōu)選至少50bp，特別優(yōu)選至少100bp，非常特別優(yōu)選至少200bp，最優(yōu)選至少400bp。與在SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21下描述的序列互補(bǔ)的DNA鏈也可用于篩選文庫(kù)。
功能等同物包含在標(biāo)準(zhǔn)條件下與在SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21下所述NAPDH氧化酶的核酸序列雜交的DNA序列，與其互補(bǔ)或其一部分互補(bǔ)的核酸序列，并且作為完整的序列編碼與包含如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22顯示序列的多肽有相同本質(zhì)特征的蛋白質(zhì)。
“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”在廣義上進(jìn)行理解并表示嚴(yán)格或低嚴(yán)格雜交條件。此類雜交條件尤其通過(guò)Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T等人，在Molecular Cloning(實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1989，第9.31-9.57頁(yè)一書中或在Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6一書中進(jìn)行了描述。
例如，洗滌步驟期間的條件可選自通過(guò)低嚴(yán)格條件(大約2X SSC于50℃)及高嚴(yán)格條件(大約0.2X SSC于50℃，優(yōu)選于65℃)(20X SSC0.3M檸檬酸鈉，3M NaCl，pH7.0)限定的條件范圍。此外，洗滌步驟期間的溫度可自于室溫，大約22℃的低嚴(yán)格條件升高到于大約65℃的高嚴(yán)格條件。鹽濃度及溫度這兩個(gè)參數(shù)可同時(shí)發(fā)生變化，或兩個(gè)參數(shù)之一可保持不變而只有另一個(gè)發(fā)生變化。也可在雜交期間應(yīng)用變性劑，例如甲酰胺或SDS。在存在50％甲酰胺時(shí)，雜交優(yōu)選于42℃實(shí)施。一些用于雜交及洗滌步驟條件的實(shí)例在以下文中進(jìn)行顯示(1)例如，雜交條件可選自以下條件a)4X SSC于65℃(任選-100μg/ml經(jīng)變性片段化魚精DNA)b)6X SSC于45℃(任選-100μg/ml經(jīng)變性片段化魚精DNA)c)6X SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺于42℃(任選-100μg/ml經(jīng)變性片段化魚精DNA)d)4X SSC，50％甲酰胺于42℃(任選-100μg/ml經(jīng)變性片段化魚精DNA)e)2X或4X SSC于50℃(低嚴(yán)格條件)，f)30至40％甲酰胺，2X或4X SSC于42℃(低嚴(yán)格條件)(2)例如，洗滌步驟可選自以下條件a)0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％ SDS于50℃。
b)0.1X SSC于65℃。
c)0.1X SSC，0.5％ SDS于68℃。
d)0.1X SSC，0.5％ SDS，50％甲酰按于42℃。
e)0.2X SSC，0.1％ SDS于42℃。
f)2X SSC于65℃(低嚴(yán)格條件)。
NADPH氧化酶蛋白質(zhì)、NADPH氧化酶活性或NADPH氧化酶功能的降低可以多種方式進(jìn)行。
與NADPH氧化酶，NADPH氧化酶活性或NADPH氧化酶功能相關(guān)的“降低”或“用以降低”在廣義上進(jìn)行解釋并包含在植物或衍生自其部分、組織、器官、細(xì)胞或種子中NAPDH氧化酶的功能性部分或基本上完全阻止或阻斷(由于多種細(xì)胞-生物學(xué)機(jī)制)。用于本發(fā)明目的的降低也包含NADPH氧化酶的量降低到基本上完全不存在NAPDH氧化酶(即缺乏NADPH氧化酶活性或NADPH氧化酶功能的可檢測(cè)性，或缺乏NADPH氧化酶蛋白質(zhì)的免疫學(xué)可檢測(cè)性)。在本文中，可降低NADPH氧化酶的一個(gè)或多個(gè)基本單位。在本文中，在細(xì)胞或生物體中某NADPH氧化酶的表達(dá)或NADPH氧化酶活性或NADPH氧化酶功能可降低優(yōu)選大于50％，特別優(yōu)選大于80％，非常特別優(yōu)選大于90％。
根據(jù)本發(fā)明包含了用于降低NADPH氧化酶蛋白質(zhì)表達(dá)、NADPH氧化酶活性或NADPH氧化酶功能的多種策略。以舉例但不受限的方式提及的策略為a)導(dǎo)入雙鏈NADPH氧化酶RNA核酸序列(NAox-dsRNA)或確保其表達(dá)的表達(dá)盒；b)導(dǎo)入NADPH氧化酶反義核酸序列或確保其表達(dá)的表達(dá)盒。包括直接針對(duì)NADPH氧化酶基因(即，基因組DNA序列)或NADPH氧化酶基因轉(zhuǎn)錄物(即，RNA序列)反義核酸序列的方法。也包含α-異頭核酸序列。
c)導(dǎo)入與核酶組合的NADPH氧化酶反義核酸序列或確保其表達(dá)的表達(dá)盒。
d)導(dǎo)入用于誘導(dǎo)共抑制的NADPH氧化酶有義核酸序列或確保它們表達(dá)的表達(dá)盒。
e)導(dǎo)入針對(duì)NADPH氧化酶基因、RNA或蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合因子或蛋白質(zhì)結(jié)合因子或確保它們表達(dá)的表達(dá)盒。
f)導(dǎo)入病毒核酸序列及引起NADPH氧化酶RNA降解的表達(dá)構(gòu)建體或確保它們表達(dá)的表達(dá)盒。
g)導(dǎo)入用于誘導(dǎo)在內(nèi)源性NADPH氧化酶基因處同源重組的構(gòu)建體，例如用于產(chǎn)生敲除突變體。
h)在內(nèi)源性NADPH氧化酶基因內(nèi)導(dǎo)入突變用于產(chǎn)生功能缺失(例如產(chǎn)生終止密碼，讀框移位等等)。
在這里，每個(gè)及這些方法中的每一個(gè)可在本發(fā)明意義上引起NADPH氧化酶表達(dá)、NADPH氧化酶活性或NADPH氧化酶功能的降低。組合應(yīng)用也是可行的。額外的方法是熟練技術(shù)人員已知的并可包含阻止或阻礙NADPH氧化酶蛋白質(zhì)的加工、NADPH氧化酶蛋白質(zhì)或它的mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制核糖體的附著，抑制RNA剪接，誘導(dǎo)NADPH氧化酶RNA降解酶和/或抑制翻譯延長(zhǎng)或終止。
優(yōu)選的單個(gè)方法在以下文中進(jìn)行簡(jiǎn)要描述a)導(dǎo)入雙鏈NADPH氧化酶RNA核酸序列(NAox-dsRNA)通過(guò)雙鏈RNA調(diào)節(jié)基因的方法(雙鏈RNA干擾；dsRNAi)在動(dòng)物及植物生物體中已進(jìn)行多次描述(例如Matzke MA等人(2000)Plant MolBiol 43401-415；Fire A等人(1998)Nature 391806-811；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)。在以上談及的參考文獻(xiàn)中清楚地描述了其過(guò)程及方法。有效的基因抑制也可在瞬時(shí)表達(dá)情況下或瞬時(shí)表達(dá)后例如，作為生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果進(jìn)行顯示(Schweizer P等人(2000)Plant J 2000 24895-903)。dsRNAi方法是基于同時(shí)導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)錄物的互補(bǔ)鏈及其對(duì)應(yīng)鏈引起所述基因表達(dá)的高效抑制。所產(chǎn)生的表型與相應(yīng)的敲除突變體非常相似(Waterhouse PM等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 9513959-64)。
當(dāng)降低NADPH氧化酶表達(dá)時(shí)，證明dsRNAi方法特別有效及有益。如在WO 99/32619等等中描述的，dsRNAi方法顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的反義方法。
因此，本發(fā)明的又一方面涉及這樣的雙鏈RNA分子(dsRNA分子)，當(dāng)導(dǎo)入到植物(或衍生自植物的細(xì)胞、器官或種子)時(shí)，所述雙鏈RNA分子引起NADPH氧化酶降低。
用于降低NADPH氧化酶蛋白質(zhì)表達(dá)的雙鏈RNA分子包含a)包含至少一個(gè)核苷酸序列的有義RNA鏈，其與至少部分NADPH氧化酶核酸序列基本相同，及
b)反義RNA鏈，所述反義RNA鏈基本優(yōu)選完全與a)的RNA有義鏈互補(bǔ)。
在又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于降低NADPH氧化酶蛋白質(zhì)表達(dá)的雙鏈RNA分子包含a)包含至少一個(gè)核苷酸序列的有義RNA鏈，其與編碼NADPH氧化酶蛋白質(zhì)的核酸序列的有義RNA轉(zhuǎn)錄物至少部分基本相同，及b)反義RNA鏈，所述反義RNA鏈基本優(yōu)選完全與a)的RNA有義鏈互補(bǔ)。
關(guān)于雙鏈RNA分子，NADPH氧化酶核酸序列優(yōu)選表示包含如SEQ IDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中顯示的序列。
“基本相同”表示與NADPH氧化酶靶序列或功能等同的靶序列相比，dsRNA序列也可具有插入、缺失及個(gè)別點(diǎn)突變，但仍引起表達(dá)的有效降低。優(yōu)選地，如以上定義的抑制性dsRNA有義鏈與至少部分編碼NADPH氧化酶或其功能等同物的核酸序列的有義RNA轉(zhuǎn)錄物之間(或編碼NAPDH氧化酶蛋白質(zhì)或其功能等同物的核酸序列互補(bǔ)鏈的反義鏈之間)的同源性達(dá)到至少75％，優(yōu)選至少80％，非常特別優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選100％。
部分節(jié)段的長(zhǎng)度達(dá)到至少10個(gè)堿基，優(yōu)選至少25個(gè)堿基，特別優(yōu)選至少50個(gè)堿基，非常特別優(yōu)選至少100個(gè)堿基，最優(yōu)選至少200個(gè)堿基或至少300個(gè)堿基。
備選地，“基本相同的”dsRNA也可定義為能與部分貯存蛋白基因轉(zhuǎn)錄物雜交的核酸序列(例如在400mM NaCl，40mM PIPES pH6.4，1mMEDTA于50℃或70℃進(jìn)行12至16小時(shí))。
“基本互補(bǔ)”表示與有義RNA鏈互補(bǔ)物相比，反義RNA鏈也可具有插入、缺失及個(gè)別點(diǎn)突變。優(yōu)選的，反義RNA鏈與有義RNA鏈互補(bǔ)物之間的同源性達(dá)到至少80％，優(yōu)選至少90％，非常特別優(yōu)選95％，最優(yōu)選100％。
編碼NADPH氧化酶蛋白質(zhì)或其功能等同物的核酸序列的“部分有義RNA轉(zhuǎn)錄物”表示轉(zhuǎn)錄自編碼NADPH氧化酶蛋白質(zhì)或其功能性等同物的核酸序列的RNA或mRNA片段，優(yōu)選NADPH氧化酶基因的RNA或mRNA片段。在這里，片段優(yōu)選序列長(zhǎng)度具有至少20個(gè)堿基，優(yōu)選至少50個(gè)堿基，特別優(yōu)選至少100個(gè)堿基，非常特別優(yōu)選至少200個(gè)堿基，最優(yōu)選至少500個(gè)堿基。也包含全長(zhǎng)的經(jīng)轉(zhuǎn)錄RNA或mRNA。
也包含本發(fā)明所述的方法中用于在植物中產(chǎn)生病原體抗性的根據(jù)本發(fā)明的dsRNA分子的用途。
dsRNA可由一條或多條聚合的核苷酸鏈組成。此外，可存在對(duì)糖-磷酸骨架及核苷這兩者的修飾。例如，天然RNA的磷酸二酯鍵可以它們包含至少一個(gè)氮或硫雜原子的方式進(jìn)行修飾。堿基可以例如將腺苷脫氨酶的活性進(jìn)行限制的方式進(jìn)行修飾。這些及進(jìn)一步修飾在下文用于穩(wěn)定反義RNA的方法中進(jìn)行描述。
為了達(dá)到相同目的，當(dāng)然，向細(xì)胞或生物體中導(dǎo)入多種dsRNA分子是可能的，所述dsRNA分子每個(gè)包含以上定義的核苷酸序列節(jié)段的一種。
dsRNA可通過(guò)酶進(jìn)行產(chǎn)生，或完全或部分通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生。
雙鏈dsRNA結(jié)構(gòu)可自兩個(gè)互補(bǔ)的、分離的RNA鏈起始，或優(yōu)選地自單一的、自動(dòng)互補(bǔ)RNA鏈起始進(jìn)行形成。
在單一的、自動(dòng)互補(bǔ)鏈的情況時(shí)，有義及反義序列可通過(guò)連接序列(接頭)進(jìn)行連接并形成例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，連接序列可為內(nèi)含子，所述內(nèi)含子在合成dsRNA后被剪切掉。
編碼dsRNA的核酸序列可包含額外元件例如轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)或多聚腺苷酸化信號(hào)。
如果dsRNA的兩條鏈在細(xì)胞或植物中進(jìn)行組合，這可以多種方式發(fā)生，例如a)用包含兩種表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植物，b)用兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞或植物，所述兩個(gè)載體的一個(gè)包含有有義鏈的表達(dá)盒及另一個(gè)包含有反義鏈的表達(dá)盒，
c)雜交兩個(gè)植物，所述植物中的每個(gè)用載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述載體的一個(gè)包含有有義鏈的表達(dá)盒及另一個(gè)包含有反義鏈的表達(dá)盒。
RNA雙鏈體的形成可在細(xì)胞外或在同一細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行起始。如在WO 99/53050中，dsRNA也可包含通過(guò)接頭(例如內(nèi)含子)連接的有義及反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。優(yōu)選自身互補(bǔ)dsRNA結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼈冎恍枰獦?gòu)建體的表達(dá)并包含總是等摩爾比值的互補(bǔ)鏈。
優(yōu)選將編碼dsRNA反義或有義鏈的表達(dá)盒或dsRNA的自身互補(bǔ)鏈插入到載體中，并用以下文中描述的方法，穩(wěn)定(例如用選擇標(biāo)記)插入到植物基因組中以確保dsRNA的持續(xù)表達(dá)。
用至少每個(gè)細(xì)胞一個(gè)拷貝的量將dsRNA進(jìn)行導(dǎo)入是可能的。根據(jù)需要，較大量(例如，每個(gè)細(xì)胞至少5、10、100、500或1000個(gè)拷貝)可引起更有效的降低。
如已描述的，為引起NADPH氧化酶表達(dá)的有效降低，dsRNA及NADPH氧化酶基因轉(zhuǎn)錄物或其功能等同基因的基因轉(zhuǎn)錄物之間的100％序列同一性不是必須要求的。因此，耐受如作為基因突變、多態(tài)性或進(jìn)化趨異的結(jié)果存在的序列離散的方法是有優(yōu)越性的。用源自一種生物體NADPH氧化酶序列而產(chǎn)生的dsRNA，例如，因此可能抑制在另一生物體中NAPDH氧化酶表達(dá)。來(lái)自水稻、玉米及大麥的NADPH氧化酶之間的高度序列同源性得到這個(gè)蛋白質(zhì)在植物中高度保守的結(jié)論，因此dsRNA的表達(dá)在其它植物物種中也可能具有有益作用，所述dsRNA衍生自包含如在SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中顯示NADPH氧化酶序列之一。
由于個(gè)體NADPH氧化酶蛋白質(zhì)及它們功能等同物之間的高度同源性，用起始自一種生物體的特異NADPH氧化酶序列產(chǎn)生的單一dsRNA，其抑制其它同源NADPH氧化酶蛋白質(zhì)和/或同一生物體中它們的功能等同物的表達(dá)或在其它相關(guān)物種中NAPDH氧化酶蛋白質(zhì)的表達(dá)也是可能的。為達(dá)到這個(gè)目的，dsRNA優(yōu)選包含對(duì)應(yīng)于保守區(qū)的NADPH氧化酶基因轉(zhuǎn)錄物的序列區(qū)。所述保守區(qū)可自序列比對(duì)中易于推導(dǎo)出。
dsRNA可在體內(nèi)或體外進(jìn)行合成。為此目的，可將編碼dsRNA的DNA序列導(dǎo)入到表達(dá)盒中，所述表達(dá)盒在至少一個(gè)基因控制元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、剪接供體或受體、多腺苷酸化信號(hào))控制下。適當(dāng)?shù)挠幸鏄?gòu)建體在以下文中進(jìn)行了描述。多腺苷酸化不是必需的，用于起始翻譯的元件也不必存在。
dsRNA可用化學(xué)或酶的方法進(jìn)行合成。為此目的，可用細(xì)胞RNA聚合酶或噬菌體RNA聚合酶(例如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)。對(duì)用于RNA體外表達(dá)的此類方法進(jìn)行了描述(WO 97/32016、US 5,593,874、US 5,698,425、US 5,712,135、US 5,789,214、US 5,804,693)。體外通過(guò)化學(xué)或酶的方法合成的dsRNA在導(dǎo)入到細(xì)胞、組織或生物體前，例如可進(jìn)行提取、沉淀、電泳、層析或這些方法的組合從而自反應(yīng)混合物中完全或部分分離。dsRNA可直接導(dǎo)入到細(xì)胞中或通過(guò)細(xì)胞外應(yīng)用(例如導(dǎo)入到細(xì)胞間隙)。
然而，植物優(yōu)選用引起dsRNA表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ谝韵挛闹羞M(jìn)行描述。
b)導(dǎo)入NADPH氧化酶反義核酸序列對(duì)通過(guò)反義技術(shù)阻止其mRNA的積累用于抑制特定蛋白質(zhì)的方法已進(jìn)行了多次描述，在植物中也進(jìn)行了多次描述(Sheehy等人(1988)ProcNatl Acad Sci USA 858805-8809；US 4,801,340；Mol JN等人(1990)FEBS Lett 268(2)427-430)。反義核酸分子與編碼欲抑制的NADPH氧化酶靶蛋白的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，所述雜交或結(jié)合抑制了靶蛋白的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。在傳統(tǒng)方式中通過(guò)穩(wěn)定雙鏈體的形成，或關(guān)于基因組DNA通過(guò)反義核酸分子與基因組DNA雙鏈體的結(jié)合發(fā)生雜交，所述反義核酸分子與基因組DNA雙鏈體的結(jié)合為通過(guò)在DNA螺旋的大溝特異相互作用。
遵循Watson-Crick堿基配對(duì)規(guī)律，適于降低NADPH氧化酶蛋白質(zhì)的反義核酸序列可用編碼這個(gè)蛋白質(zhì)的核酸序列進(jìn)行衍生，所述核酸序列例如包含如在SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中顯示序列的核酸序列。反義核酸序列可與所述蛋白質(zhì)的所有經(jīng)轉(zhuǎn)錄mRNA互補(bǔ)，可限于編碼區(qū)或可只由一個(gè)寡核苷酸組成，所述寡核苷酸與mRNA的編碼或非編碼序列的一部分互補(bǔ)。因此，寡核苷酸可，例如與包含用于所述蛋白質(zhì)的翻譯起始區(qū)互補(bǔ)。反義核酸序列長(zhǎng)度可為例如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸，但也可更長(zhǎng)并包含至少100、200、500、1000、2000或5000個(gè)核苷酸。反義核酸序列可用熟練技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行重組表達(dá)或通過(guò)化學(xué)或酶的方法進(jìn)行合成。關(guān)于化學(xué)合成，可用天然或經(jīng)修飾核苷酸。經(jīng)修飾核苷酸可增強(qiáng)反義核酸序列的生物化學(xué)穩(wěn)定性并可導(dǎo)致反義核酸序列及有義靶序列形成雙鏈體的物理穩(wěn)定性的增強(qiáng)。可用的核苷酸為，例如硫代磷酸衍生物及經(jīng)吖啶取代核苷酸如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、雙氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黃苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基次黃苷、2，2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、queosine，2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶及2，6-二氨基嘌呤。
在又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，NADPH氧化酶蛋白質(zhì)的表達(dá)可通過(guò)這樣的核酸序列進(jìn)行抑制，以至降低NADPH氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，所述核酸序列與NADPH氧化酶基因調(diào)節(jié)區(qū)(例如NADPH氧化酶啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)并與其中的DNA雙螺旋形成三螺旋結(jié)構(gòu)。對(duì)適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行了描述(Helene C(1991)Anticancer Drug Res 6(6)569-84；Helene C等人(1992)Ann NY Acad Sci 66027-36；Maher LJ(1992)Bioassays 14(12)807-815)。
在又一實(shí)施方案中，反義核酸分子可為α-異頭核酸。此種α-異頭核酸分子與互補(bǔ)RNA形成特異雙鏈雜交體，與常規(guī)β-核酸相反，其中的兩條鏈互相平行(Gautier C等人(1987)Nucleic Acids Res 156625-6641)。反義核酸分子也可進(jìn)一步包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)Nucleic Acids Res 156131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(IRoue等人(1987)FEBS Lett 215327-330)。
c)與核酶組合導(dǎo)入NADPH氧化酶反義核酸序列以上描述的反義策略可有益地與核酶方法進(jìn)行聯(lián)合。催化性RNA分子或核酶可適合于任何靶RNA并在特異位點(diǎn)切割磷酸二酯主鏈，藉此將靶DNA進(jìn)行功能性滅活(Tanner NK(1999)FEMS Microbiol Rev 23(3)257-275)。因此核酶自身沒(méi)有被修飾，但能以類似的方式進(jìn)一步切割靶RNA分子，藉此它獲得了酶的特性。核酶序列整合到反義RNA中賦予這些反義RNA酶樣RNA切割特性并因此增強(qiáng)了它們?cè)跍缁畎蠷NA中的效率。適當(dāng)?shù)暮嗣阜戳xRNA分子的制備及應(yīng)用例如Haseloff等人(1988)Nature 334585-591的描述。
以這種方式，核酶(例如錘頭狀核酶；Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591)可用于催化性切割欲進(jìn)行抑制的酶—例如NADPH氧化酶—的mRNA并防止轉(zhuǎn)錄。核酶技術(shù)可增強(qiáng)反義策略的效率。用于降低某些蛋白質(zhì)的核酶表達(dá)的方法在(EP 0 291 533、EP 0 321 201、EP 0 360 257)中進(jìn)行了描述。在植物細(xì)胞中對(duì)核酶表達(dá)也進(jìn)行了描述(Steinecke P等人(1992)EMBO J 11(4)1525-1530；de Feyter R等人(1996)Mol Gen Genet.250(3)329-338)。適當(dāng)?shù)陌行蛄屑昂嗣缚衫缤ㄟ^(guò)“Steinecke P，Ribozymes，Methods in Cell Biology 50，Galbraith等人編輯，Academic出版社，Inc(1995)，第449-460頁(yè)”描述的，計(jì)算核酶RNA及靶RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，及通過(guò)它們的相互作用(Bayley CC等人(1992)Plant Mol Biol.18(2)353-361；Lloyd AM及Davis RW等人(1994)Mol Gen Genet.242(6)653-657)進(jìn)行確定。例如，構(gòu)建四膜蟲(chóng)L-19 IVS RNA衍生物是可能的，所述四膜蟲(chóng)L-19 IVS RNA衍生物具有欲進(jìn)行抑制的NADPH氧化酶蛋白質(zhì)mRNA的互補(bǔ)區(qū)。(也參見(jiàn)US 4,987,071及US 5,116,742)。備選地，此類核酶也可用篩選方法自各種核酶文庫(kù)進(jìn)行鑒定(Bartel D和Szostak JW(1993)Science 2611411-1418)。
d)導(dǎo)入NADPH氧化酶有義核酸序列用于誘導(dǎo)共抑制NADPH氧化酶核酸序列有義方向的表達(dá)可導(dǎo)致相應(yīng)的同源性內(nèi)源基因的共抑制。與內(nèi)源性基因有同源性的有義RNA的表達(dá)可降低或關(guān)閉內(nèi)源基因的表達(dá)，這與反義方法描述的作用相似(Jorgensen等人(1996)Plant Mol Biol 31(5)957-973；Goring等人(1991)Proc Natl Acad SciUSA 881770-1774；Smith等人(1990)Mol Gen Genet 224447-481；Napoli等人(1990)Plant Cell 2279-289；Van der Krol等人(1990)PlantCell 2291-99)。在這里，經(jīng)導(dǎo)入的構(gòu)建體可完全或只部分代表欲進(jìn)行降低的同源性基因。翻譯的可能性是不需要的。應(yīng)用于植物的此種技術(shù)例如通過(guò)Napoli等人(1990)The Plant Cell 2279-289及在US 5,034,323中進(jìn)行了描述。
優(yōu)選地，用這樣的序列進(jìn)行共抑制，所述序列與編碼ANDPH氧化酶蛋白質(zhì)或其功能性等同物的核酸序列至少一部分本質(zhì)相同，所述核酸序列例如包含如SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21顯示序列的核酸序列。
e)導(dǎo)入針對(duì)NADPH氧化酶基因、RNA或蛋白質(zhì)的DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合因子NADPH氧化酶基因表達(dá)的降低用特異DNA結(jié)合因子，例如用鋅指轉(zhuǎn)錄因子類型的因子進(jìn)行也是可能的。這些因子與內(nèi)源性靶基因的基因組序列，優(yōu)選調(diào)節(jié)區(qū)的序列退火，并且引起內(nèi)源性基因的抑制。此種方法的應(yīng)用使降低內(nèi)源性NADPH氧化酶基因的表達(dá)而不必重組操作NADPH氧化酶的序列成為可能。對(duì)用于產(chǎn)生適當(dāng)因子的適當(dāng)方法進(jìn)行了描述(Dreier B等人(2001)J Biol Chem 276(31)29466-78；Dreier B等人(2000)JMol Biol 303(4)489-502；Beerli RR等人(2000)Proc Natl AcadSci USA 97(4)1495-1500；Beerli RR等人(2000)J Biol Chem 275(42)32617-32627；Segal DJ和Barbas CF 3rd(2000)Curr Opin Chem Biol 4(1)34-39；Kang JS和Kim JS(2000)J Biol Chem 275(12)8742-8748；Beerli RR等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(25)14628-14633；Kim JS等人(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(8)3616-3620；KlugA(1999)J Mol Biol 293(2)215-218；Tsai SY等人(1998)Adv Drug DelivRev 30(1-3)23-31；Mapp AK等人(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(8)3930-3935；Sharrocks AD等人(1997)Int J Biochem Cell Biol 29(12)1371-1387；Zhang L等人(2000)J Biol Chem 275(43)33850-33860)。
此類因子可用NADPH氧化酶基因的任何目的部分進(jìn)行選擇。優(yōu)選地，該片段位于啟動(dòng)子區(qū)。然而，對(duì)于基因抑制，也可位于編碼外顯子或內(nèi)含子區(qū)。對(duì)于熟練技術(shù)人員通過(guò)來(lái)自基因文庫(kù)或起始自基因庫(kù)中基因不存在的NADPH氧化酶cDNA的數(shù)據(jù)搜索，通過(guò)選擇用于對(duì)應(yīng)基因組克隆的基因組文庫(kù)可獲得對(duì)應(yīng)的節(jié)段。此目的需要的方法是熟練技術(shù)人員已知的。
此外，將抑制NADPH氧化酶靶蛋白質(zhì)自身的因子導(dǎo)入到細(xì)胞中是可能的。蛋白質(zhì)結(jié)合因子可為，例如aptamers(Famulok M和Mayer G(1999)Curr Top Microbiol Immunol 243123-36)或抗體或抗體片段或單鏈抗體。對(duì)獲得這些因子的方式已進(jìn)行描述并是熟練技術(shù)人員已知的。例如，利用細(xì)胞質(zhì)scFv抗體在經(jīng)遺傳修飾的煙草植物中調(diào)節(jié)植物色素A蛋白質(zhì)的活性(Owen M等人(1992)Biotechnology(NY)10(7)790-794；FrankenE等人(1997)Curr Opin Biotechnol 8(4)411-416；Whitelam(1996)Trend Plant Sci 1286-272)。
基因表達(dá)也可通過(guò)適當(dāng)?shù)牡头肿恿亢铣苫衔锢缇埘０奉愡M(jìn)行抑制(Dervan PB和Bürli RW(1999)Current Opinion in Chemical Biology 3688-693；Gottesfeld JM等人(2000)Gene Expr 9(1-2)77-91)。這些寡聚物由3-(二甲氨基)丙胺、N-甲基-3-羥基吡咯、N-甲基咪唑及N-甲基吡咯組成并且以它們?cè)诖鬁现行蛄刑禺愋缘慕Y(jié)合并抑制位于其中的基因序列表達(dá)的方式可適于雙鏈DNA的任何部分。對(duì)適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行了描述(尤其參見(jiàn)Bremer RE等人(2001)Bioorg Med Chem.9(8)2093-103；Ansari AZ等人(2001)Chem Biol.8(6)583-92；Gottesfeld JM等人(2001)J Mol Biol.309(3)615-29Wurtz NR等人(2001)Org Lett3(8)1201-3；Wang CC等人(2001)Bioorg Med Chem 9(3)653-7；Urbach AR和Dervan PB(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(8)4343-8；Chiang SY等人(2000)J Biol Chem.275(32)24246-54)。
f)導(dǎo)入引起NADPH氧化酶RNA降解的病毒核酸序列及表達(dá)構(gòu)建體NADPH氧化酶表達(dá)降低可通過(guò)植物借助于病毒表達(dá)系統(tǒng)(擴(kuò)增子)，誘導(dǎo)特異NADPH氧化酶RNA降解有效產(chǎn)生(Angell，SM等人(1999)Plant J.20(3)357-362)。此類系統(tǒng)也稱為“VIGS”(經(jīng)病毒誘導(dǎo)的基因沉默)，用病毒載體將與欲進(jìn)行抑制的轉(zhuǎn)錄物同源的核酸序列導(dǎo)入植物中。然后可能通過(guò)植物抗病毒的防御機(jī)制停止轉(zhuǎn)錄。對(duì)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)及方法進(jìn)行了描述(Ratcliff F等人(2001)Plant J 25(2)237-45；Fagard M和Vaucheret H(2000)Plant Mol Biol 43(2-3)285-93；AnandalakshmiR等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(22)13079-84；Ruiz MT(1998)Plant Cell 10(6)937-46)。
g)導(dǎo)入構(gòu)建體用于誘導(dǎo)內(nèi)源性NADPH氧化酶基因的同源重組，例如用于產(chǎn)生敲除突變體為產(chǎn)生具有降低NADPH氧化酶活性的同源重組生物體，例如用包含至少部分這樣的內(nèi)源性NADPH氧化酶基因的核酸構(gòu)建體，所述內(nèi)源性NADPH氧化酶基因通過(guò)以功能性降低或完全無(wú)效的方式缺失、添加或替代至少一個(gè)核苷酸進(jìn)行修飾。修飾也可影響基因的調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)以至編碼序列保持不變，但不發(fā)生表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)或表達(dá)降低。
關(guān)于常規(guī)的同源重組，經(jīng)修飾區(qū)的5’及3’端側(cè)翼為必需具有足夠長(zhǎng)度用于可能重組的其它核酸序列。按規(guī)定，長(zhǎng)度在幾百個(gè)堿基至幾千個(gè)堿基的范圍內(nèi)(Thomas KR和Capecchi MR(1987)Cell 51503；Strepp等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(8)4368-4373)。對(duì)于同源重組，宿主生物體例如植物用以下文中描述的方法用重組構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且進(jìn)行成功重組的克隆例如用抗生素或殺草劑抗性進(jìn)行選擇。
同源重組在高等真核生物，特別是植物中是相對(duì)稀有發(fā)生的事件。隨機(jī)整合到宿主基因組中占主要方面。去除經(jīng)隨機(jī)整合序列并因此富集正確同源重組細(xì)胞克隆的可能性在于如US 6,110,736中描述的用序列特異重組系統(tǒng)，通過(guò)所述同源重組系統(tǒng)可將非特異整合序列進(jìn)行缺失，這有助于選擇通過(guò)同源重組進(jìn)行成功整合的事件?？蓱?yīng)用多種序列特異重組系統(tǒng)，可提及的實(shí)例為噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)、酵母的FLP/FRT系統(tǒng)、噬菌體Mu的Gin重組酶、來(lái)自大腸桿菌(E.coli)的Pin重組酶及質(zhì)粒pSR1的R/RS系統(tǒng)。優(yōu)選的為噬菌體P1 Cre/lox及酵母FLP/FRT系統(tǒng)。FLP/FRT及cre/lox重組酶系統(tǒng)已在植物系統(tǒng)中進(jìn)行應(yīng)用(Odell等人(1990)MolGen Genet 223369-378)。
h)將突變導(dǎo)入到內(nèi)源性NADPH氧化酶基因用于產(chǎn)生功能丟失(例如產(chǎn)生終止密碼、讀框移位等等)用于降低NADPH氧化酶活性的其它適當(dāng)方法為將無(wú)義突變導(dǎo)入到內(nèi)源性NADPH氧化酶基因中，例如通過(guò)將RNA/DNA寡核苷酸導(dǎo)入到植物中(Zhu等人(2000)Nat Biotechnol 18(5)555-558)及例如借助于T-DNA誘變(Koncz等人(1992)Plant Mol Biol 20(5)963-976)及ENU(N-乙基-N-亞硝基脲)誘變或同源重組(Hohn B和Puchta(1999)H Proc Natl Acad Sci USA 968321-8323)產(chǎn)生敲除突變體。點(diǎn)突變也可通過(guò)的DNA-RNA雜交體(Cole-Strauss等人(1999)Nucl Acids Res 27(5)1323-1330；Kmiec(1999)Gene Therapy American Scientist 87(3)240-247)產(chǎn)生，所述DNA-RNA雜交體也已知為嵌合修復(fù)術(shù)(chimeraplasty)。
通過(guò)有義RNA及VIGS(經(jīng)病毒誘導(dǎo)基因沉默)共抑制的dsRNAi方法也可稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。由于欲進(jìn)行抑制的內(nèi)源性基因與經(jīng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的有義或dsRNA核酸序列之間(或內(nèi)源性基因與它們各自顯性抑制的(dominant negative)變體之間)的同源性要求比例如傳統(tǒng)反義方法低，PTGS方法(包括用顯性抑制的NADPH氧化酶變體)對(duì)NADPH氧化酶功能或活性的降低特別有益。適當(dāng)?shù)耐葱詷?biāo)準(zhǔn)在dsRNAi方法的描述中進(jìn)行闡述并一般用于PTGS方法及顯性抑制方法。由于來(lái)自玉米、水稻及大麥的NADPH氧化酶蛋白質(zhì)之間的高度同源性，可推導(dǎo)出植物中這些蛋白質(zhì)的高度保守性。因此，用來(lái)自大麥、玉米或水稻的NADPH氧化酶核酸序列，也可在其它物種中有效地抑制同源性NADPHA氧化酶蛋白質(zhì)的表達(dá)，而不必在這些物種中分離及結(jié)構(gòu)性闡述NADPH氧化酶同源物。這在相當(dāng)程度上降低了相關(guān)的工作量。同樣，推斷也可用來(lái)自水稻、玉米或大麥的NADPH氧化酶蛋白質(zhì)的顯性抑制變體在其它植物物種中有效降低或抑制其同源物的功能/活性。
直接或間接引起NADPH氧化酶蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)量、RNA量、基因活性或蛋白質(zhì)活性降低的所有物質(zhì)及化合物可在下文的術(shù)語(yǔ)“抗NADPH氧化酶”化合物中一起進(jìn)行分組。術(shù)語(yǔ)“抗NADPH氧化酶”化合物清楚地包括以上描述方法中應(yīng)用的核酸序列、肽、蛋白質(zhì)或其它因子。
為了達(dá)到本發(fā)明的目的，“導(dǎo)入”包含適于直接或間接將抗NADPH氧化酶化合物導(dǎo)入到植物或其細(xì)胞、區(qū)室、組織、器官或種子中或在其中將其產(chǎn)生的所有方法。包括直接及間接方法。導(dǎo)入可導(dǎo)致抗NADPH氧化酶化合物(例如dsRNA)瞬時(shí)存在或穩(wěn)定存在。
根據(jù)經(jīng)以上描述方法的不同特性，抗NADPH氧化酶化合物可直接發(fā)揮它們的功能(例如通過(guò)插入內(nèi)源性NADPH氧化酶基因)。然而，也可在轉(zhuǎn)錄成RNA后(例如關(guān)于反義方法)或轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)后(例如結(jié)合因子)間接發(fā)揮功能。根據(jù)本發(fā)明均包括直接及間接作用于抗NADPH氧化酶的化合物。
“導(dǎo)入”包含例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化的方法。
因此，例如，抗NADPH氧化酶化合物也包含引起例如NADPH氧化酶dsRNA或NADPH氧化酶反義RNA的表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄，根據(jù)需要，翻譯)的重組表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)優(yōu)選在植物或其部分、組織、器官或種子中。
在所述表達(dá)構(gòu)建體中，其表達(dá)(轉(zhuǎn)錄及根據(jù)需要，翻譯)產(chǎn)生抗NADPH氧化酶化合物的核酸分子優(yōu)選與至少一個(gè)基因調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子)功能性連接，所述基因調(diào)控元件確保在生物體中優(yōu)選在植物中表達(dá)。如果表達(dá)構(gòu)建體直接導(dǎo)入到植物中并且抗NADPH氧化酶化合物(例如NADPH氧化酶dsRNA)在植物體中產(chǎn)生，則優(yōu)選植物特異的基因調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子)。然而，抗NADPH氧化酶化合物也可在其它生物體或在體外產(chǎn)生并然后導(dǎo)入到植物中(如實(shí)施例6及7描述的)。在這里，優(yōu)選的控制元件為原核或真核基因調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子)，原核或真核基因調(diào)控元件允許在各種情況下用于所述經(jīng)選擇生物體的表達(dá)。
功能性連接理解為表示，例如，啟動(dòng)子與欲進(jìn)行表達(dá)的核酸序列(例如抗NAox化合物)及根據(jù)需要另外的調(diào)節(jié)元件如終止子的依次排列，根據(jù)核酸排列成有義或反義RNA在核酸序列進(jìn)行重組表達(dá)時(shí)，以每個(gè)調(diào)節(jié)元件可實(shí)行它功能的方式進(jìn)行。為此，化學(xué)意義上的直接連接不是必需要求的。基因調(diào)控序列例如增強(qiáng)子序列也可對(duì)來(lái)自遠(yuǎn)離位置或?qū)ζ渌麯NA分子靶序列發(fā)揮功能。優(yōu)選的排列為欲進(jìn)行重組表達(dá)的核酸序列位于作為啟動(dòng)子的序列后，以使兩個(gè)序列互相共價(jià)連接。
在這里，啟動(dòng)子序列與欲進(jìn)行重組表達(dá)的核酸序列之間的距離低于200個(gè)堿基對(duì)，特別優(yōu)選低于100個(gè)堿基對(duì)，非常特別優(yōu)選低于50個(gè)堿基對(duì)。
功能性連接及表達(dá)盒可通過(guò)例如在Maniatis T，F(xiàn)ritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)一書中，在SilhavyTJ，Berman ML和Enquist LW(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)一書中，在Ausubel FM等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.及Wiley Interscience一書中及在Gelvin等人(1990)PlantMolecular Biology Manual一書中描述的，通過(guò)常規(guī)重組及克隆技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)生。然而，例如，可作為具有用于限制性酶特異切割位點(diǎn)的接頭或作為信號(hào)肽的額外序列也可位于兩個(gè)序列之間。序列的插入也可導(dǎo)致融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。優(yōu)選的，由啟動(dòng)子及欲進(jìn)行表達(dá)的核酸序列連接組成的表達(dá)盒，可以經(jīng)載體整合形式存在并例如，通過(guò)轉(zhuǎn)化插入到植物基因組中存在。
然而，表達(dá)盒也可指這樣的構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子位于內(nèi)源性NADPH氧化酶基因后，例如，通過(guò)同源重組并且根據(jù)本發(fā)明，NADPH氧化酶蛋白質(zhì)的降低是通過(guò)表達(dá)反義NADPH氧化酶RNA引起的。同樣地，反義NADPH氧化酶化合物(例如編碼NADPH氧化酶dsRNA或NADPH氧化酶反義RNA的核酸化合物)以發(fā)生同樣作用的方式，也置于內(nèi)源性啟動(dòng)子后。兩種方法均產(chǎn)生本發(fā)明意義上的表達(dá)盒。
術(shù)語(yǔ)植物特異啟動(dòng)子理解為表示，原則上，能調(diào)節(jié)基因，特別是外源基因在植物或植物部分、植物細(xì)胞、植物組織或植物培養(yǎng)物中表達(dá)的任何啟動(dòng)子。在這里，例如，表達(dá)可為組成型、誘導(dǎo)型或發(fā)育依賴型的。
以下是優(yōu)選的a)組成型啟動(dòng)子優(yōu)選的載體為使在植物中組成型表達(dá)成為可能的載體(Benfey等人(1989)EMBO J 82195-2202)?！敖M成型”啟動(dòng)子理解為表示在植物發(fā)育的相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期，優(yōu)選植物發(fā)育的所有時(shí)期很多組織，優(yōu)選所有組織中確保表達(dá)的啟動(dòng)子。特別優(yōu)選應(yīng)用的為植物啟動(dòng)子或衍生自植物病毒的啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的為CaMV花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄物啟動(dòng)子(Franck等人(1980)Cell 21285-294；Odell等人(1985)Nature 313810-812；Shewmaker等人(1985)Virology 140281-288；Gardner等人(1986)Plant Mol Biol 6221-228)或19S CaMV啟動(dòng)子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等人(1989)EMBO J 82195-2202)。另一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?gòu)成型啟動(dòng)子為核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)小亞單位(SSU)啟動(dòng)子(US 4,962,028)、豆球蛋白B啟動(dòng)子(基因庫(kù)登錄號(hào)X03677)、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子、TR雙元啟動(dòng)子、農(nóng)桿菌OCS(章魚堿合酶)啟動(dòng)子、遍在蛋白啟動(dòng)子(Holtorf S等人(1995)PlantMol Biol 29637-649)、遍在蛋白1啟動(dòng)子(Christensen等人(1992)Plant Mol Biol 18675-689；Bruce等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869692-9696)、Smas啟動(dòng)子、桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(US 5,683,439)、ATPase亞單位啟動(dòng)子或來(lái)自小麥富含脯氨酸蛋白質(zhì)啟動(dòng)子(WO 91/13991)及熟練技術(shù)人員已知的在植物中組成型表達(dá)的其它基因啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的組成型啟動(dòng)子為來(lái)自擬南芥菜(A.thaliana)的腈水解酶1(nit1)基因啟動(dòng)子(基因庫(kù)登錄號(hào)Y07648.2，核苷酸2456-4340，Hillebrand等人(1996)Gene 170197-200)。
b)組織特異性啟動(dòng)子優(yōu)選的為對(duì)于花藥、子房、花、葉、莖、根及種子具有特異性的其它啟動(dòng)子。
種子特異啟動(dòng)子包含，例如菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5,504,200；Bustos MM等人(1989)Plant Cell 1(9)839-53)、2S白蛋白啟動(dòng)子(Joseffson LG等人(1987)J Biol Chem 26212196-12201)、豆球蛋白啟動(dòng)子(ShirsatA等人(1989)Mol Gen Genet 215(2)326-331)、USP(未知種子蛋白)啟動(dòng)子(Bumlein H等人(1991)Mol Gen Genet 225(3)459-467)、napin啟動(dòng)子(US 5,608,152；Stalberg K等人(1996)L Planta 199515-519)、蔗糖結(jié)合蛋白啟動(dòng)子(WO00/26388)、豆球蛋白B4啟動(dòng)子(LeB4；Bumlein H等人(1991)Mol Gen Genet 225121-128；Bumlein H等人(1992)Plant J 2(2)233-239；Fiedler U等人(1995)Biotechnology(NY)13(10)1090f)、Arabidopsis油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(WO 98/45461)、蕓苔Bce4啟動(dòng)子(WO91/13980)。其它適當(dāng)?shù)姆N子特異啟動(dòng)子為編碼高分子量麥谷蛋白(HMWG)、麥溶醇蛋白、分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸酶(AGPase)或淀粉合酶基因的啟動(dòng)子。此外優(yōu)選的啟動(dòng)子為允許在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黑麥、水稻等等中種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子。以下可有益的進(jìn)行應(yīng)用lpt2或lpt1基因啟動(dòng)子(WO95/15389、WO95/23230)或如WO99/16890中描述的啟動(dòng)子(大麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、oryzin基因、水稻種子儲(chǔ)存蛋白(prolamin)基因、麥溶醇蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、kasirin基因或黑麥堿基因啟動(dòng)子)。
莖、貯藏根或根特異啟動(dòng)子包含，例如I類patatin啟動(dòng)子(B33)、馬鈴薯組織蛋白酶D抑制劑啟動(dòng)子。
葉特異啟動(dòng)子包含馬鈴薯胞質(zhì)FBPase啟動(dòng)子(WO97/05900)、核酮糖二磷酸羧化酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU(小亞單位)啟動(dòng)子或來(lái)自馬鈴薯的ST-LSI啟動(dòng)子(Stockhaus等人(1989)EMBO J 82445-2451)。非常特別優(yōu)選的為表皮特異啟動(dòng)子例如，OXLP基因(草酸鹽氧化酶樣蛋白)啟動(dòng)子(Wei等人(1998)Plant Mol Biol 36101-112)。
花特異啟動(dòng)子包含，例如八氫番茄紅素合酶啟動(dòng)子(WO92/16635)或P-rr基因啟動(dòng)子(WO98/22593)。
花藥特異啟動(dòng)子包含，例如5126啟動(dòng)子(US5,689,049、US5,689,051)、glob-l啟動(dòng)子及γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子。
c)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)盒也可包含化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(綜述文章Gatz等人(1997)AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol 4889-108)，通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在植物中外源基因在特定時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)可及時(shí)得到控制。可談及的實(shí)例為PRP1啟動(dòng)子(Ward等人(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、唾液酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO95/19443)、苯磺胺誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(EP 0 388 186)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等人(1992)Plant J 2397-404)、脫落酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(EP 0 335 528)或乙醇或環(huán)己酮誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO 93/21334)。
d)應(yīng)激或病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子其它優(yōu)選的啟動(dòng)子為通過(guò)生物或非生物應(yīng)激誘導(dǎo)的啟動(dòng)子如來(lái)自馬鈴薯的PRP1基因的病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(或gst1啟動(dòng)子)(WO 96/28561；Ward等人(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、番茄高溫誘導(dǎo)型hsp70或hsp80啟動(dòng)子(US 5,187,267)、馬鈴薯低溫誘導(dǎo)型α-淀粉酶啟動(dòng)子(WO96/12814)或光誘導(dǎo)型PPDK啟動(dòng)子。其它病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含亞麻Fis1啟動(dòng)子(WO 96/34949)、Vst1啟動(dòng)子(Schubert等人(1997)PlantMol Biol 34417-426及煙草EAS4倍半萜環(huán)化酶啟動(dòng)子(US 6,100,451)。
病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)一步包含作為病原體感染結(jié)果而誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子，所述基因例如PR蛋白質(zhì)、SAR蛋白質(zhì)、β-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶的基因等等(例如Redolfi等人(1983)Neth J Plant Pathol 89245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell 4645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral4111-116；Marineau等人(1987)Plant Mol Biol 9335-342；Matton等人(1987)Molecular Plant-Microbe Interactions 2325-342；Somssich等人(1986)Proc Natl Acad Sci USA 832427-2430；Somssich等人(1988)Mol Gen Genetics 293-98；Chen等人(1996)Plant J 10955-966；Zhang和Sing(1994)Proc Natl Acad Sci USA 912507-2511；Warner等人(1993)Plant J 3191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell 1961-968(1989)。
也包含創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如pinII基因啟動(dòng)子(EP-A 0 375 091；Ryan(1990)Ann Rev Phytopath 28425-449；Duan等人(1996)Nat Biotech14494-498)、wun1及wun2基因啟動(dòng)子(US 5,428,148)、win1及win2基因啟動(dòng)子(Stanford等人(1989)Mol Gen Genet 215200-208)、系統(tǒng)素基因啟動(dòng)子(McGurl等人(1992)Science 2251570-1573)、WIP1基因啟動(dòng)子(Rohmeier等人(1993)Plant Mol Biol 22783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Letters 32373-76)、MPI基因啟動(dòng)子(Corderok等人(1994)Plant J 6(2)141-150)等等。
其它病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的來(lái)源為PR基因家族。這些啟動(dòng)子的一系列元件證明是有益的。因此，PR-2d啟動(dòng)子的-364至-288區(qū)介導(dǎo)水楊酸特異性(Buchel等人(1996)Plant Mol Biol 30，493-504)。5’-TCATCTTCTT-3’序列在大麥β-1，3-葡聚糖酶啟動(dòng)子及在30個(gè)以上其它經(jīng)應(yīng)激誘導(dǎo)基因重復(fù)存在。在煙草中，該區(qū)與通過(guò)水楊酸而增加的核蛋白質(zhì)結(jié)合。來(lái)自煙草及擬南芥(Arabidopsis)的PR-1啟動(dòng)子(EP-A 0 332 104、WO 98/03536)同樣適于病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。由于特別的為經(jīng)病原體誘導(dǎo)的，優(yōu)選的為來(lái)自大麥(Schweizer等人(1997)Plant Physiol 11479-88)及小麥(Rebmann等人(1991)Plant Mol Biol 16329-331)的酸性PR-5(aPR5)啟動(dòng)子。在病原體攻擊后約4至6小時(shí)，PR5蛋白質(zhì)積聚并顯示只有非常少的背景表達(dá)(WO 99/66057)。用于達(dá)到增強(qiáng)經(jīng)病原體誘導(dǎo)特異性的方法為產(chǎn)生來(lái)自病原體反應(yīng)元件組合的合成啟動(dòng)子(Rushton等人(2002)Plant Cell 14，749-762；WO 00/01830；WO 99/66057)。其它來(lái)自不同物種的病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是熟練技術(shù)人員已知的(EP-A 1 165 794；EP-A1 062 356；EP-A 1 041 148；EP-A 1 032 684)。
e)發(fā)育依賴啟動(dòng)子其它適當(dāng)啟動(dòng)子為，例如果實(shí)成熟特異啟動(dòng)子例如番茄果實(shí)成熟特異啟動(dòng)子(WO 94/21794、EP 409 625)。由于單獨(dú)的組織發(fā)育本身是發(fā)育依賴方式的，發(fā)育依賴啟動(dòng)子部分包含組織特異啟動(dòng)子。
特別優(yōu)選的為組成型啟動(dòng)子及也特別優(yōu)選葉和/或莖特異、病原體誘導(dǎo)型及表皮特異性啟動(dòng)子，病原體誘導(dǎo)型及表皮特異性啟動(dòng)子為最優(yōu)選的。
此外，啟動(dòng)子可與欲進(jìn)行表達(dá)的核酸序列功能性連接，所述啟動(dòng)子使在其它植物組織或在其它生物體例如大腸桿菌中表達(dá)成為可能。原則上，適當(dāng)?shù)闹参飭?dòng)子為所有以上描述的啟動(dòng)子。
存在于根據(jù)本發(fā)明表達(dá)盒的核酸序列可與除啟動(dòng)子外的其它基因調(diào)控序列連可操縱的連接。術(shù)語(yǔ)“基因調(diào)控序列”在廣義上進(jìn)行理解并指的是對(duì)根據(jù)本發(fā)明表達(dá)盒的產(chǎn)生或功能有作用的所有序列。例如，基因調(diào)控序列修飾原核生物或真核生物體的轉(zhuǎn)錄及翻譯。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒包含對(duì)于胚芽上皮和/或花具有特異性的位于欲重組表達(dá)的所述核酸序列的5’-上游的啟動(dòng)子，及作為進(jìn)一步基因調(diào)控序列的3’-下游終止序列，并且，根據(jù)需要，還包含與欲進(jìn)行重組表達(dá)的核酸序列功能性連接的其他常見(jiàn)調(diào)控元件。
基因調(diào)控序列也包含其它啟動(dòng)子、啟動(dòng)子元件或小啟動(dòng)子，所有所述調(diào)控序列可修飾表達(dá)特性。因此，例如，由于基因調(diào)控序列，組織特異性表達(dá)又可依賴于某些應(yīng)激因子。例如對(duì)于水應(yīng)激、脫落酸(Lam E和ChuaNH(1991)J Biol Chem 266(26)17131-17135)及熱應(yīng)激(Schoffl F等人(1989)Mol Gen Genetics 217(2-3)246-53)對(duì)此類元件進(jìn)行了描述。
原則上，所有天然啟動(dòng)子與它們的調(diào)節(jié)序列(如以上闡述的序列)一起可用于根據(jù)本發(fā)明所述的方法。此外，合成啟動(dòng)子也可有益的進(jìn)行應(yīng)用。
此外基因調(diào)控序列也包含基因的5’-非翻譯區(qū)、內(nèi)含子或非編碼3’-區(qū)，如肌動(dòng)蛋白-1內(nèi)含子或Adh1-S內(nèi)含子1、2及6(一般性參考文獻(xiàn)The Maize Handbook，第116章，F(xiàn)reeling和Walbot編輯，Springer，紐約(1994))。已經(jīng)證實(shí)它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)節(jié)中起重要作用。因此，已經(jīng)證實(shí)5’-非翻譯序列可增強(qiáng)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)。可進(jìn)行談及的翻譯增強(qiáng)子的實(shí)例為煙草花葉病毒5’前導(dǎo)序列(Gallie等人(1987)Nucl Acids Res 158693-8711)等等。此外，它們可促進(jìn)組織特異性(Rouster J等人(1998)Plant J 15435-440)。
表達(dá)盒可有益的包含一個(gè)或多個(gè)已知的與啟動(dòng)子功能性連接的增強(qiáng)子序列，這樣使核酸序列的重組表達(dá)增強(qiáng)成為可能。其它有益序列，如其它調(diào)控元件或終止子，也可插入到欲進(jìn)行表達(dá)核酸序列的3’端。一個(gè)或多個(gè)拷貝的欲進(jìn)行重組表達(dá)的核酸序列可存在于基因構(gòu)建體中。
適于作為調(diào)控序列的多腺苷酸化信號(hào)為植物多腺苷酸化信號(hào)，優(yōu)選基本上對(duì)應(yīng)于來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefacien)的T-DNA多腺苷酸化信號(hào)，特別是Ti質(zhì)粒pTiACHS T-DNA的基因3(章魚堿合酶)(Gielen等人(1984)EMBO J 3835等序列)或其功能等同物。特別適當(dāng)?shù)慕K止序列的實(shí)例為OCS(章魚堿合酶)終止子及NOS(胭脂堿合酶)終止子。
調(diào)控序列進(jìn)一步理解為使同源重組或插入到宿主生物體基因組或允許自基因組去除成為可能的序列。在同源重組時(shí)，例如特定基因的天然啟動(dòng)子可交換為對(duì)胚芽上皮和/或花具有特異性的啟動(dòng)子。方法如cre/lox技術(shù)，根據(jù)需要可誘導(dǎo)，允許自宿主生物體基因組組織特異去除表達(dá)盒(Sauer B(1998)Methods.14(4)381-92)。在這里，將某些側(cè)翼序列(lox序列)加入到靶基因中，所述側(cè)翼序列后來(lái)通過(guò)cre重組酶去除成為可能。
衍生自它們的表達(dá)盒及載體可包含額外功能性元件。術(shù)語(yǔ)功能性元件在廣義上理解并指的是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒、載體或轉(zhuǎn)基因生物體的產(chǎn)生、擴(kuò)增或功能有作用的所有元件。以下可通過(guò)舉例的方式，但不受限制進(jìn)行闡述a)對(duì)代謝抑制劑(如2-脫氧葡糖-6-磷酸鹽(WO 98/45456))、抗生素、殺生物劑，優(yōu)選除草劑如卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮霉素或膦絲霉素等等具有抗性的選擇標(biāo)記。特別優(yōu)選的選擇標(biāo)記為對(duì)除草劑具有抗性的選擇標(biāo)記?？蛇M(jìn)行闡述的實(shí)例為編碼膦絲霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)及滅活谷氨酰胺合酶抑制劑(bar及pat基因)、對(duì)草甘磷(N-(膦?；谆?甘氨酸)有抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸鹽合酶基因(EPSP合酶基因)、編碼草甘磷降解酶(草甘磷氧化還原)的gox基因、deh基因(編碼滅活茅草枯的脫鹵素酶)、黃酰脲及咪唑啉酮滅活乙酰乳酸合酶，及編碼溴草腈降解腈水解酶的bxn基因、對(duì)抗生素apectinomycin有抗性的aasa基因、對(duì)鏈霉素有抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(spt)基因、對(duì)卡那霉素或遺傳霉素有抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)基因、介導(dǎo)潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因、對(duì)磺酰脲除草劑(例如例如有S4和/或Hra突變的經(jīng)突變ALS變體)具有抗性的乙酰乳酸合酶基因(ALS)。
b)編碼易于可計(jì)量蛋白質(zhì)的報(bào)道基因及，通過(guò)它們的顏色或酶活性使評(píng)估轉(zhuǎn)化率、表達(dá)位點(diǎn)或表達(dá)時(shí)間成為可能。在文中非常特別優(yōu)選的為報(bào)道蛋白質(zhì)(Schenborn E，Groskreutz D.Mol Biotechnol.1999；13(1)29-44)如綠色熒光蛋白(GFP)(Sheen等人(1995)Plant Journal8(5)777-784；Haseloff等人(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94(6)2122-2127；Reichel等人(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(12)5888-5893；Tian等人(1997)Plant Cell Rep 16267-271；WO 97/41228；Chui WL等人(1996)Curr Biol 6325-330；Leffel SM等人(1997)Biotechniques.23(5)912-8)、氯霉素轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶(Ow等人(1986)Science 234856-859；Millar等人(1992)PlantMol Biol Rep 10324-414)、aequoringen(Prasher等人(1985)BiochemBiophys Res Commun 126(3)1259-1268)、β-半乳糖苷酶、R-基因座基因(在植物組織中編碼調(diào)節(jié)花色素苷色素(紅色)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)并因此使直接分析啟動(dòng)子活性而不添加額外佐劑或顯色底物成為可能；Dellaporta等人，染色體結(jié)構(gòu)和功能新概念的沖擊，第18屆Stadler遺傳專題研討會(huì)，11263-282，1988中)，β-半乳糖苷酶是非常特別優(yōu)選的(Jefferson等人，EMBO J.1987，6，3901-3907)。
c)確保根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或載體在例如大腸桿菌擴(kuò)增的復(fù)制起始區(qū)?？烧劶暗膶?shí)例為ORI(DNA復(fù)制起始區(qū))pBR322 ori或P15A ori(Sambrook等人Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
d)經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化必需的元件例如，T-DNA或vir區(qū)的右或左邊界。
將根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒導(dǎo)入到生物體或其細(xì)胞、組織、器官、部分或種子(優(yōu)選導(dǎo)入到植物或植物細(xì)胞、組織、器官、部分或種子)可用包含表達(dá)盒的載體有益地完成。通過(guò)適當(dāng)?shù)南拗菩郧懈钗稽c(diǎn)可將表達(dá)盒導(dǎo)入到載體(例如質(zhì)粒載體)中。形成的質(zhì)粒首先導(dǎo)入到大腸桿菌中。將正確轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進(jìn)行選擇、生長(zhǎng)并通過(guò)熟練技術(shù)人員熟悉的方法獲得重組質(zhì)粒。限制性分析及測(cè)序可用于驗(yàn)證克隆步驟。
載體的實(shí)例可為質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或農(nóng)桿菌。在有益的實(shí)施方案中，表達(dá)盒通過(guò)質(zhì)粒載體進(jìn)行導(dǎo)入。優(yōu)選的載體為使表達(dá)盒穩(wěn)定整合到宿主基因組中的載體。
經(jīng)轉(zhuǎn)化生物體(或經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織)的增殖需要將所述DNA、RNA或蛋白質(zhì)導(dǎo)入到對(duì)應(yīng)的宿主細(xì)胞。
可獲得多種方法用于此過(guò)程，所述過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)(Keown等人(1990)Methods in Enzymology 185527-537)。例如，通過(guò)微注射或用經(jīng)DNA包裹微粒轟擊將DNA或RNA直接導(dǎo)入。并且，也將細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)透化處理，例如用聚乙二醇處理以便DNA通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。也可通過(guò)與其它DNA包含單元如微細(xì)胞、細(xì)胞、溶酶體或脂質(zhì)體的原生質(zhì)體融合將DNA導(dǎo)入。另一個(gè)導(dǎo)入DNA的適當(dāng)方法為電穿孔，細(xì)胞通過(guò)電脈沖可逆地進(jìn)行透化。對(duì)適當(dāng)?shù)姆椒ㄒ堰M(jìn)行了描述(例如通過(guò)Bilang等人(1991)Gene 100247-250；Scheid等人(1991)Mol Gen Genet228104-112；Guerche等人(1987)Plant Science 52111-116；Neuhause等人(1987)Theor Appl Genet 7530-36；Klein等人(1987)Nature 32770-73；Howell等人(1980)Science 2081265；Horsch等人(1985)Science2271229-1231；DeBlock等人(1989)Plant Physiology 91694-701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach編輯)Academic Press Inc.(1988)；及Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski編輯Academic Press Inc.(1989))。
在植物中，以上描述的自植物組織或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化及再生植物的方法用于瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。適當(dāng)?shù)姆椒橥ㄟ^(guò)經(jīng)聚乙二醇誘導(dǎo)DNA攝取的特定原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、用基因槍的生物彈射擊(biolistic)方法、已知為粒子轟擊方法、電穿孔、干胚芽在DNA包含溶液中孵育及顯微注射。
除了這些“直接”轉(zhuǎn)化技術(shù)外，轉(zhuǎn)化也可通過(guò)根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的細(xì)菌感染進(jìn)行完成。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最好適于雙子葉植物細(xì)胞。例如通過(guò)Horsch RB等人(1985)Science 2251229f對(duì)此方法進(jìn)行了描述。
當(dāng)應(yīng)用農(nóng)桿菌時(shí)，表達(dá)盒必需整合到特異性質(zhì)粒，或整合到穿梭或中間載體或整合到雙元載體中。如果Ti或Ri質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化，Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA的至少右邊界，但大多數(shù)情況下右邊界及左邊界與欲進(jìn)行導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體以側(cè)翼區(qū)的形式連接。
優(yōu)選應(yīng)用雙元載體。雙元載體均能在大腸桿菌及農(nóng)桿菌中復(fù)制。作為規(guī)則，它們包含用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化植物(參見(jiàn)以上內(nèi)容)的選擇標(biāo)記基因及側(cè)翼為右及左T-DNA邊界序列的接頭或多接頭。它們可直接轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中(Holsters等人(1978)Mol Gen Genet 163181-187)。除了T-DNA區(qū)外，它們可另外包含如用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌或農(nóng)桿菌的選擇標(biāo)記基因(例如nptIII基因)的元件。在這種情況下作為宿主生物體的農(nóng)桿菌應(yīng)已包含具有vir區(qū)的質(zhì)粒。需要具有vir區(qū)的質(zhì)粒用于將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。以這種方式轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌可用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的T-DNA的用途已進(jìn)行了研究及詳細(xì)描述(EP 120 516；Hoekema，在The Binary Plant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，第V章；An等人(1985)EMBO J 4277-287)。多種雙元載體是已知的，一些是商業(yè)上可獲得的如pBI101.2或pBIN19(ClontechLaboratories，Inc.美國(guó))。
對(duì)適于在植物中表達(dá)的其它啟動(dòng)子進(jìn)行了描述(Rogers等人(1987)Meth in Enzymol 153253-277；Schardl等人(1987)Gene 611-11；Berger等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA 868402-8406)。
直接轉(zhuǎn)化技術(shù)適于任何生物體及細(xì)胞類型。
在將DNA或RNA注射或電穿孔入植物細(xì)胞的情況下，應(yīng)用的質(zhì)粒不需符合任何特定要求?？蓱?yīng)用簡(jiǎn)單質(zhì)粒如pUC系列。如果整株植物自經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行再生，額外可選擇標(biāo)記基因位于質(zhì)粒上是有益處的。
經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，即包含整合到宿主細(xì)胞DNA的經(jīng)導(dǎo)入DNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，當(dāng)可選擇標(biāo)記為導(dǎo)入DNA的部分時(shí)可自未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中進(jìn)行選擇?？勺鳛闃?biāo)記的基因的實(shí)例為對(duì)殺生物劑(例如抗生素、除草劑或代謝抑制劑如2-脫氧葡糖-6-磷酸WO 98/45456)有抗性的基因(參見(jiàn)以上內(nèi)容)。表達(dá)此類標(biāo)記基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞在殺死未轉(zhuǎn)化野生型的對(duì)應(yīng)濃度的抗生素或除草劑存在的條件下存活。實(shí)例在以上談及并優(yōu)選包含對(duì)除草劑膦絲霉素有抗性的bar基因(Rathore KS等人(1993)Plant Mol Biol 21(5)871-884)、對(duì)卡那霉素有抗性的nptII基因、對(duì)潮霉素有抗性的hpt基因或?qū)Τ輨┎莞柿子锌剐缘腅PSP基因。選擇標(biāo)記允許自未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞(McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 581-84)。獲得的植物可按常規(guī)方式進(jìn)行繁殖及雜交。應(yīng)生長(zhǎng)兩代或多代以確保基因組整合是穩(wěn)定及遺傳的。
對(duì)以上談及的方法進(jìn)行了描述，例如在SD Kung和R Wu編輯，Transgenic Plants第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press一書中Jenes B等人(1993)，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，128-143頁(yè)，以及在Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42205-225。優(yōu)選將欲進(jìn)行表達(dá)的構(gòu)建體克隆到載體中，所述載體例如pBin19適用于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Bevan等人(1984)Nucl Acids Res 128711f)。
經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞一產(chǎn)生，用熟練技術(shù)人員已知的方法就可獲得整株植物。例如，將愈傷組織培養(yǎng)物用作起始材料。用已知的方式，莖及根的發(fā)育可自這個(gè)尚未分化的細(xì)胞生物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)。獲得的莖可種植在室外并進(jìn)行育種。
熟練技術(shù)人員熟悉自植物細(xì)胞及植物部分再生完整植物的此類方法。對(duì)此類方法例如，通過(guò)Fennell等人(1992)Plant Cell Rep.11567-570；Stoeger等人(1995)Plant Cell Rep.14273-278；Jahne等人(1994)TheorAppl Genet 89525-533進(jìn)行了描述。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法可有益的與其它方法進(jìn)行組合，所述其它方法引起病原體抗性(例如對(duì)昆蟲(chóng)、真菌、細(xì)菌、線蟲(chóng)等等)、應(yīng)激抗性或植物特性的其它改進(jìn)。實(shí)例在Dunwell JM，改良作物的轉(zhuǎn)基因方法，J ExpBot.2000；51 Spec No；第487-96頁(yè)等等中提及。
例如，關(guān)于核酸序列、包含所述核酸序列的表達(dá)盒或載體或用所述核酸序列轉(zhuǎn)化的生物體、表達(dá)盒或載體，“轉(zhuǎn)基因”表示所有通過(guò)重組方法產(chǎn)生的所有構(gòu)建體，其中a)NADPH氧化酶核酸序列，或b)與NADPH氧化酶核酸序列功能性連接的基因調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子或c)(a)及(b)不位于它們的天然遺傳環(huán)境中或通過(guò)重組方法已進(jìn)行修飾，修飾的實(shí)例為替代、添加、缺失、倒位或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基。天然遺傳環(huán)境指的是來(lái)源生物體的天然染色體基因座，或存在于基因組文庫(kù)。對(duì)于基因組文庫(kù)，核酸序列的天然遺傳環(huán)境優(yōu)選至少部分保留。環(huán)境在核酸序列側(cè)翼的至少一側(cè)并具有序列長(zhǎng)度至少為50bp，優(yōu)選至少500bp，特別優(yōu)選至少1000bp，非常特別優(yōu)選至少5000bp。當(dāng)天然存在的組合通過(guò)非天然的人工(“人工”)方法如例如誘變處理進(jìn)行修飾時(shí)，天然存在表達(dá)盒—例如NADPH氧化酶啟動(dòng)子及對(duì)應(yīng)的NADPH氧化酶基因的天然存在組合成為轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。對(duì)適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行了描述(US 5,565,350；WO 00/15815；也參見(jiàn)以上內(nèi)容)。
本發(fā)明的另一方面涉及用至少一個(gè)核苷酸序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因生物體、根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或載體，并涉及細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、部分—如對(duì)于植物生物體、葉、根等等—或衍生自此類生物體的繁殖材料。生物體在廣義上進(jìn)行理解并表示原核及真核生物體，優(yōu)選細(xì)菌、酵母、真菌、動(dòng)物及植物生物體。
以下是優(yōu)選的a)真菌如曲霉屬、假囊酵母屬(Eremothecium)、木霉屬(Trichoderma)、阿舒囊霉屬(Ashbya)、鏈孢霉屬(Neurospora)、鐮孢屬、白僵菌屬(Beauveria)或在Indian Chem Eng.B部分第37卷，第1、2期(1995)第15頁(yè)表6中描述的其它真菌。特別優(yōu)選的為絲狀半子囊菌棉阿舒囊霉(Ashbya gossypi)或阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)。
b)酵母如念珠菌(Candida)、酵母菌(Saccharomyces)、漢森(Hansenula)或畢赤(Pichia)酵母，其中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(ATCC登錄號(hào)201178)是特別優(yōu)選的，c)根據(jù)上述用于“植物”定義的植物，d)脊椎動(dòng)物及無(wú)脊椎動(dòng)物。特別優(yōu)選的脊椎動(dòng)物為非人哺乳動(dòng)物如犬、貓、綿羊、山羊、雞、小鼠、大鼠、?；蝰R。優(yōu)選的動(dòng)物細(xì)胞包含CHO、COS、HEK293細(xì)胞。優(yōu)選的無(wú)脊椎動(dòng)物包含昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2及灰翅夜蛾屬(Spodoptera)Sf9或Sf21細(xì)胞，
e)原核生物體如革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌如醋酸桿菌(Acetobacter)、葡萄糖桿菌(Gluconobacter)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、短桿菌(Brevibacterium)、芽孢桿菌(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacter)、埃希桿菌(Escherichia)(特別是大腸桿菌)、沙雷氏菌(Serratia)、葡萄球菌(Staphylococcus)、產(chǎn)氣桿菌(Aerobacter)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)、青霉菌(Penicillium)或克雷博氏菌(Klebsiella)。
優(yōu)選作為轉(zhuǎn)基因生物體的宿主或原初生物體為根據(jù)上述定義的特定植物。本發(fā)明范圍內(nèi)包括的為植物界高等或低等的所有屬或種。此外包括的為成熟植物、種子、莖及幼苗及衍生自它們的部分、繁殖材料及培養(yǎng)物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物。成熟植物表示除幼苗階段外處于任何發(fā)育階段的植物。幼苗表示處于早期發(fā)育階段的幼小未成熟植物?？蓱?yīng)用特別優(yōu)選作為宿主生物體的植物，所述植物為可應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明方法的植物，所述根據(jù)本發(fā)明所述的方法為根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)用于獲得病原體抗性的方法。非常特別優(yōu)選的為單子葉植物如小麥、燕麥、谷子、大麥、黑麥、玉米、水稻、玉米、蕎麥、高粱、黑小麥、斯佩耳特小麥、亞麻子、甘蔗，及雙子葉植物如油菜、蕓苔、水芹、蕓苔、擬南芥、卷心菜、大豆、苜蓿、豌豆、豆科植物、花生、馬鈴薯、煙草、番茄、茄子、辣椒、向日葵、萬(wàn)壽菊、萵苣、金展草、瓜、南瓜/西葫蘆或胡瓜。
轉(zhuǎn)基因生物體可用上述用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染生物體的方法進(jìn)行產(chǎn)生。
本發(fā)明的又一方面涉及根據(jù)本發(fā)明所述的生物體的用途及細(xì)胞培養(yǎng)物部分—如例如對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物生物體根、葉等等—及轉(zhuǎn)基因繁殖材料如衍生自這些生物體的種子或果實(shí)用于產(chǎn)生糧食、飼料、藥物或精細(xì)化學(xué)品的用途。
此外優(yōu)選的為用于在宿主生物體中重組產(chǎn)生藥物或精細(xì)化學(xué)品的方法，宿主生物體用經(jīng)以上描述表達(dá)盒之一進(jìn)行轉(zhuǎn)化并且該表達(dá)盒包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因，所述結(jié)構(gòu)基因編碼目的精細(xì)化學(xué)品或催化目的精細(xì)化學(xué)品的生物合成。將經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主生物體進(jìn)行培養(yǎng)，并且將目的精細(xì)化學(xué)品自培養(yǎng)基中進(jìn)行分離。該方法可廣泛用于精細(xì)化學(xué)品如酶、維生素、氨基酸、糖、脂肪酸、天然及合成調(diào)味劑、芳香物質(zhì)及著色劑。特別優(yōu)選的為生育酚及生育三烯酸的產(chǎn)生及類蘿卜素的產(chǎn)生。培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主生物體及自宿主生物體或自培養(yǎng)基中的分離，用熟練技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。藥物例如抗體或疫苗的產(chǎn)生，通過(guò)Hood EE，Jilka JM(1999)Curr OpinBiotechnol 10(4)382-6；Ma JK，Vine ND(1999)Curr Top MicrobiolImmunol 236275-92進(jìn)行了描述。
序列1.SEQ ID NO1編碼大麥(Hordeum vulgare)NADPH氧化酶的核酸序列。
2.SEQ ID NO2編碼大麥NADPH氧化酶的氨基酸序列。
3.SEQ ID NO3編碼水稻(Oryza sativa var.japonica)NADPH氧化酶的核酸序列。
4.SEQ ID NO4編碼水稻(Oryza sativa var.japonica)NADPH氧化酶的氨基酸序列。
5.SEQ ID NO5編碼煙草(Nicotiana tabacum)NADPH氧化酶的核酸序列6.SEQ ID NO6編碼煙草)NADPH氧化酶的氨基酸序列7.SEQ ID NO7編碼馬鈴薯(Solanum tuberosum)NADPH氧化酶的核酸序列8.SEQ ID NO8編碼馬鈴薯NADPH氧化酶的氨基酸序列9.SEQ ID NO9編碼番茄(Lycopersicon esculentum)NADPH氧化酶的核酸序列10.SEQ ID NO10編碼番茄NADPH氧化酶的氨基酸序列11.SEQ ID NO11編碼南方擬南芥菜(aus Arabidopsis thaliana)(RbohF)NADPH氧化酶的核酸序列12.SEQ ID NO12編碼南方擬南芥菜(RbohF)NADPH氧化酶的氨基酸序列
13.SEQ ID NO13編碼擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)(RbohD)NADPH氧化酶的核酸序列14.SEQ ID NO14編碼擬南芥菜(RbohD)NADPH氧化酶的氨基酸序列15.SEQ ID NO15編碼煙草(rboh)NADPH氧化酶的核酸序列16.SEQ ID NO16編碼煙草(rboh)NADPH氧化酶的氨基酸序列17.SEQ ID NO17編碼水稻(Oryza sativa var.japonica)NADPH氧化酶的核酸序列18.SEQ ID NO18編碼水稻(Oryza sativa var.japonica)NADPH氧化酶的氨基酸序列19.SEQ ID NO19編碼擬南芥菜(RbohC)NADPH氧化酶的核酸序列20.SEQ ID NO20編碼擬南芥菜(RbohC)NADPH氧化酶的氨基酸序列21.SEQ ID NO21編碼擬南芥菜(RbohA)NADPH氧化酶的核酸序列22.SEQ ID NO22編碼擬南芥菜(RbohA)NADPH氧化酶的氨基酸序列23.SEQ ID NO23寡核苷酸引物5’NAOX5’-GARCAAGGCTCTTTTGATTG-3’24.SEQ ID NO24寡核苷酸引物3’Naox5’-GAAATGCTCCTTATGGAATTC-3’附1用pNAox-dsRNA進(jìn)行RNA干擾降低大麥中大麥BghA6白粉病的穿透率在用來(lái)自大麥cv Pallas的Bgh接種的五個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中對(duì)相對(duì)穿透率(RPE)進(jìn)行確定。將RPE計(jì)算為經(jīng)pNAox-dsRNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的穿透率與經(jīng)對(duì)照-dsRNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的穿透率之間的差異(在這里平均穿透率為38.74％)。RPE百分率(％RPE)自RPE減1并乘以100進(jìn)行計(jì)算
％RPE＝100*(RPE-1)對(duì)于每種情況下一個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，當(dāng)評(píng)估至少100個(gè)相互作用位點(diǎn)時(shí)，柱(1)至(5)代表％RPE(即自對(duì)照的平均穿透率的穿透率離散性)。柱(m)代表實(shí)驗(yàn)的平均％RPE。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤。
“對(duì)照dsRNA”代表用對(duì)照dsRNA進(jìn)行的平行實(shí)驗(yàn)?！皃NAox”dsRNA代表用大麥NADPH氧化酶dsRNA進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。
在用pNAox-dsRNA進(jìn)行轟擊的細(xì)胞中，與用對(duì)照dsRNA(TR人甲狀腺受體dsRNA)轟擊的細(xì)胞湘比，％RPE顯著(顯著性p＝0.0054)降低。
實(shí)施例一般方法寡核苷酸的化學(xué)合成可例如通過(guò)磷酰亞胺(phosphoamidite)法的已知方式進(jìn)行(Voet，Voet，第2版，Wiley出版社，紐約，第896-897頁(yè))?？寺〔襟E在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行，例如限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的純化、核酸轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜及尼龍膜、DNA片段結(jié)合、大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、細(xì)菌培養(yǎng)、噬菌體增殖及重組DNA的序列分析，通過(guò)Sambrook等人(1989)Cold Spring Harbor Laboratory出版社；ISBN0-87969-309-6描述的方法進(jìn)行。重組DNA分子根據(jù)Sanger方法(Sanger等人(1977)Proc Natl Acad Sci USA 745463-5467)用來(lái)自MWG Licor的激光熒光DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)施例1植物、病原體及接種Pallas變種由丹麥哥本哈根皇家獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系LisaMunk提供。對(duì)它的產(chǎn)生進(jìn)行了描述( P等人(1986)Crop Sci 26903-907)。
除了另有說(shuō)明外，將在濕濾紙上于暗處進(jìn)行預(yù)發(fā)芽12至36小時(shí)的種子每孔5粒置于P類型Fruhstorfer土壤的方形罐(8×8cm)邊緣，用土壤覆蓋并規(guī)律的用自來(lái)水澆灌。所有植物在經(jīng)控制環(huán)境櫥或環(huán)境箱中生長(zhǎng)5至8天，所述經(jīng)控制環(huán)境的櫥或環(huán)境箱為16至18℃，50至60％相對(duì)大氣濕度及16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗光周期為3000或5000勒克斯(光子通量密度50或60μmols-1m-2)并在幼苗階段期間在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)中對(duì)完全發(fā)育的子葉進(jìn)行處理。
進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前，植物在經(jīng)控制環(huán)境櫥或環(huán)境箱中生長(zhǎng)，所述經(jīng)控制環(huán)境的櫥或箱為24℃的日間溫度，20℃夜間溫度，50至60％相對(duì)大氣濕度及3000勒克斯的16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗光周期。
禾谷類白粉菌大麥?；虴m.Marchal race A6(Wiberg A(1974)Hereditas 7789-148)(BghA6)用于接種大麥。真菌是自JLU Gieβen的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)系提供的。接種物在經(jīng)控制環(huán)境櫥或環(huán)境箱中如以上描述的用于植物的相同條件下進(jìn)行繁殖，通過(guò)以密度為100個(gè)分生孢子/平方毫米將感染材料的分生孢子轉(zhuǎn)移到規(guī)律生長(zhǎng)的7日齡大麥植物cv.GoldenPromise中。
通過(guò)在接種塔內(nèi)以大約100個(gè)分生孢子/平方毫米(除了特別注明外)自經(jīng)感染植物抖落分生孢子，從而對(duì)7日齡幼苗進(jìn)行BghA6接種。
實(shí)施例2；大麥pNAox cDNA序列的克隆用于分離HvpNAox cDNA所需的cDNA片段、其克隆、測(cè)序及探針的產(chǎn)生通過(guò)用“一步RT-PCR試劑盒”(Life Technologies，Karlsruhe，德國(guó)，或Qiagen，Hilden，德國(guó))獲得。為此目的，將來(lái)自大麥幼苗的總RNA用作模板。RNA分離自發(fā)芽后3、5及7天的Pallas。此外，RNA自Pallas分離，并自發(fā)芽后第7天在用BghA6接種后1、2及5天的mlo5、Mlg或Mla12回交系分離。用衍生自水稻及擬南芥菜的gp91phox同源物(基因庫(kù)登錄號(hào)X93301和AB008111)保守區(qū)的引物進(jìn)行RT-PCR。5’NAOX5’-GARCAAGGCTCTTTTGATTG-3’(SEQ ID NO23)及3’Naox5’GAAATGCTCCTTATGGAATTC 3’(SEQ ID NO24)每種情況下，1000ng總DNA，0.4mM dNTPs，每種情況下0.6mMOPN-1及OPN-2引物，10μl RNase抑制劑及1x RT緩沖液中1μl酶混合物(一步RT-PCR試劑盒，Qiagen，Hilden)用于反應(yīng)。
應(yīng)用以下溫度程序(PTC-100TM model 96V；MJ Research；Inc.；Watertown；馬薩諸塞州)于50℃，30分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)于94℃，150秒進(jìn)行1個(gè)循環(huán)94℃45秒，55℃1分鐘及72℃2分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)72℃7分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物通過(guò)2％w/v瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。這得到編碼大麥NADPH氧化酶可讀框部分的378bp RT-PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO1)。對(duì)應(yīng)的cDNA自瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離并通過(guò)T-突出端連接克隆入pGEM-T載體(Promega，Mannheim，德國(guó))。cDNAs用“熱測(cè)序酶經(jīng)熒光標(biāo)記引物循環(huán)測(cè)序試劑盒”(Amersham，F(xiàn)reiburg，德國(guó))自質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。將構(gòu)建體命名為pGEM-T-pNAox。
實(shí)施例3pNAox dsRNA的體外合成用于體外RNA轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒在所插入核酸序列的兩側(cè)分別包含T7及SP6啟動(dòng)子，使有義RNA及反義RNA的合成成為可能。質(zhì)粒可用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?ApaI用于SP6聚合酶及PstI用于T7聚合酶)進(jìn)行線性化，以確保經(jīng)插入核酸序列的正確轉(zhuǎn)錄及以防止通讀到載體序列。為此目的，每種情況下，10μgpGEM-T-pNAox質(zhì)粒DNA用ApaI進(jìn)行切割用于SP6聚合酶并用PstI切割用于T7聚合酶。經(jīng)切割質(zhì)粒用200μl水中含等量體積的酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行提取，轉(zhuǎn)移到新Eppendorf管(無(wú)RNAse)并于20 000g離心5分鐘。180μl質(zhì)粒溶液用420μl乙醇進(jìn)行處理，置于冰上并隨后通過(guò)于-4℃，20 000g離心30分鐘進(jìn)行沉淀。將沉淀物用10μl TE緩沖液進(jìn)行懸浮。所述沉淀物分別直接用于T7-RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶獲自Roche Molecular Biology，Mannheim，德國(guó)。
每種轉(zhuǎn)錄混合物在40μl體積中包含以下物質(zhì)2μl線性化質(zhì)粒DNA(1∝g)2μl NTPs(25mM)(1.25mM每種NTP)4μl 10x反應(yīng)緩沖液(Roche Molecular Biology)，1μl RNAsin RNAsin(27個(gè)單位；Roche Molecular Biology)，2μl RNA聚合酶(40個(gè)單位)29μl DEPC水于37℃孵育2小時(shí)后，在每種情況下將來(lái)自轉(zhuǎn)錄有義及反義鏈的一些反應(yīng)混合物進(jìn)行混合，于95℃變性5分鐘，然后通過(guò)冷卻30分鐘至最終溫度37℃互相雜交(退火)。備選地，有義及反義鏈混合物也可在退火后于-20℃冷卻30分鐘。在變性及雜交期間形成的蛋白質(zhì)沉淀物通過(guò)于20 800g簡(jiǎn)短離心進(jìn)行去除，將上清直接用于包裹鎢顆粒(參見(jiàn)下文)。每種情況下，1μl每條RNA鏈及1μl dsRNA在非變性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離用于分析。與單一鏈相比，帶移向較高分子量處表明為成功的雜交。
4μl dsRNA用乙醇(加入6μl水、1μl 3M乙酸鈉溶液及25μl乙醇，并于20 000g及4℃至少離心5分鐘)進(jìn)行沉淀并在500μl水中重新懸浮。測(cè)定230及300nm之間的吸收譜或確定在280及260nm的吸光度以確定dsRNA的純度及濃度。原則上，獲得80至100μg OD260/OD280比率為1.80至1.95的dsRNA。如果需要，可用DNaseI進(jìn)行消化，但這對(duì)后來(lái)結(jié)果沒(méi)有本質(zhì)影響。
人甲狀腺受體dsRNA(原初載體pT7betaSal(Norman C等人(1988)Cell 55(6)989-1003)由德國(guó)，Gieβen，遺傳學(xué)系Baniahmad博士提供，在基因庫(kù)登錄號(hào)NM-000461下描述的插入片段序列作為對(duì)照dsRNA。質(zhì)粒用PvuII進(jìn)行消化以產(chǎn)生有義RNA及用HindIII進(jìn)行消化以產(chǎn)生反義RNA，然后將RNA用T7或SP6 RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。用于產(chǎn)生對(duì)照dsRNA的各過(guò)程步驟用類似于經(jīng)以上描述的用于pNAox-dsRNA的過(guò)程步驟進(jìn)行。
實(shí)施例4瞬時(shí)轉(zhuǎn)化、RNAi及真菌病原體發(fā)育的評(píng)估大麥cv Pallas葉節(jié)用pNAox dsRNA與GFP表達(dá)載體一起進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后葉用Bgh進(jìn)行接種并且在48小時(shí)后通過(guò)光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。對(duì)GFP表達(dá)細(xì)胞的穿透性通過(guò)檢測(cè)活細(xì)胞中的吸器進(jìn)行評(píng)估并精確評(píng)估這些細(xì)胞中的真菌發(fā)育。在所有五個(gè)實(shí)驗(yàn)中，與用外源對(duì)照dsRNA(人甲狀腺激素受體dsRNA，TR)轟擊的細(xì)胞相比，用pNAoxdsRNA轟擊大麥cv Pallas成功導(dǎo)致被Bgh穿透的細(xì)胞數(shù)降低。pNAoxdsRNA的抗性誘導(dǎo)作用導(dǎo)致Bgh穿透效率平均降低達(dá)35％(圖4)。
已經(jīng)描述的用于生物導(dǎo)入dsRNA至大麥葉的上皮細(xì)胞的方法用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化(Schweizer P等人(1999)Mol Plant Microbe Interact 12647-54；Schweizer P等人(2000)Plant J 2000 24895-903)。直徑為1.1μm的鎢顆粒(顆粒密度為25mg/ml)用dsRNA(制備參見(jiàn)以上內(nèi)容)與載體pGFP(GFP處于CaMV 35S啟動(dòng)子控制下)質(zhì)粒DNA一起進(jìn)行包裹作為轉(zhuǎn)錄標(biāo)記。為此目的，以下量的dsRNA及報(bào)道質(zhì)粒用于每次包裹1μgpGFP及2μg dsRNA。雙鏈RNA通過(guò)有義及反義RNA的體外退火進(jìn)行合成(參見(jiàn)以上內(nèi)容)。
為制備微載體，55mg鎢顆粒(M17，直徑1.1μm；Bio-Rad，慕尼黑)用1ml高壓滅菌蒸餾水洗滌兩次并用1ml無(wú)水乙醇洗滌一次，進(jìn)行干燥并用1ml 50％強(qiáng)度甘油(大約50mg/ml貯液)懸浮。溶液用50％甘油進(jìn)行稀釋到25mg/ml，用前仔細(xì)混勻并在超聲浴中懸浮。為包裹微載體，每次1μg質(zhì)粒、2μg dsRNA(1μl)、12.5μl鎢顆粒懸液(25mg/ml)、12.5μl 1M Ca(NO3)2溶液(pH10)在經(jīng)?；靹蛳逻M(jìn)行逐滴混合，于室溫靜置10分鐘，簡(jiǎn)短離心并將20μl上清進(jìn)行去除。將與鎢顆粒一起的剩余物進(jìn)行重新懸浮(超聲浴)并用于實(shí)驗(yàn)。
用大約4cm長(zhǎng)的大麥第一葉節(jié)。將組織置于添加20μg/ml苯并咪唑的0.5％ Phytagar(GibcoBRLTMLife TechnologiesTM，Karlsruhe)培養(yǎng)皿(直徑6.5cm)中，并在離子轟擊前，將邊緣用具有尺寸為2.2cm×2.3cm的長(zhǎng)方形開(kāi)口的模板進(jìn)行覆蓋。將培養(yǎng)皿一個(gè)接一個(gè)置于真空箱底部(Schweizer P等人(1999)Mol Plant Microbe Interact 12647-54)，在上面的帶孔板上插入尼龍過(guò)濾網(wǎng)(過(guò)濾網(wǎng)大小為0.2mm，Millipore，Eschborn)作為擴(kuò)散器(底部以上5cm，微載體下11cm，參見(jiàn)下文)以散開(kāi)顆粒塊放慢顆粒流速。每次用5.8μl DNA包裹的鎢顆粒裝到吸附在箱頂部的微載體上(塑料無(wú)菌漏斗架，13mm，Gelman Sciences，Swinney，英國(guó))(微載體，參見(jiàn)下文)。用隔膜真空泵(Vacuubrand，Wertheim)將箱內(nèi)的壓力降到0.9巴。并且鎢顆粒在9巴氦氣壓力下的植物組織表面著火。然后立即將箱進(jìn)行充氣。為標(biāo)記經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，葉用質(zhì)粒進(jìn)行轟擊(pGFP；基于pUC18的載體，具有經(jīng)插入GFP基因的CaMV 35S啟動(dòng)子/終止子盒；Schweizer P等人(1999)Mol Plant Microbe Interact 12647-54；由德國(guó)，Gatersleben，植物遺傳學(xué)IPK系，P.Schweizer博士提供)。每次將不同的質(zhì)粒用于轟擊，微載體預(yù)先用水進(jìn)行仔細(xì)清潔。轟擊后用輕微打開(kāi)的培養(yǎng)皿于室溫及有日光的條件下孵育四小時(shí)后，葉與大麥白粉病的100個(gè)分生孢子/平方毫米(race A6)進(jìn)行孵育并在同樣條件下繼續(xù)孵育40至48小時(shí)。
葉節(jié)用顆粒流量槍用經(jīng)包裹顆粒進(jìn)行轟擊。每次用312μg鎢顆粒。轟擊后4小時(shí)，葉用禾谷類白粉菌大麥?；?race A6)進(jìn)行接種并再經(jīng)過(guò)40小時(shí)后評(píng)估感染癥狀。結(jié)果(如用成熟吸器攻擊細(xì)胞的百分率定義的穿透率及通過(guò)熒光及光學(xué)顯微鏡對(duì)繼發(fā)延長(zhǎng)菌絲進(jìn)行分析。用100個(gè)分生孢子/平方毫米接種得到經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的大約50％的感染率。至少100個(gè)相互作用位點(diǎn)用于每個(gè)分別實(shí)驗(yàn)的評(píng)估。經(jīng)轉(zhuǎn)化(GFP表達(dá)的)細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下進(jìn)行鑒定。經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分出三個(gè)不同類別1.包含易于識(shí)別吸器的經(jīng)穿透細(xì)胞。具有一個(gè)以上吸器的細(xì)胞認(rèn)為是一個(gè)細(xì)胞。
2.雖然被真菌附著器攻擊但不包含吸器的細(xì)胞。被Bgh攻擊一次以上但不包含吸器的細(xì)胞，認(rèn)為是一個(gè)細(xì)胞。
3.沒(méi)有被Bgh感染的細(xì)胞。
氣孔細(xì)胞及衛(wèi)細(xì)胞排除在評(píng)估之外。Bgh的表面結(jié)構(gòu)通過(guò)光學(xué)顯微鏡或用0.1％熒光鈣(Calcofluor)(在水中的w/v)將真菌熒光染色30秒進(jìn)行分析。真菌的發(fā)育經(jīng)熒光鈣染色后通過(guò)熒光顯微鏡易于進(jìn)行評(píng)估。在經(jīng)pNAox-dsRNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，真菌發(fā)育成初級(jí)及附著芽管，但沒(méi)有發(fā)育成吸器。吸器的發(fā)育是二級(jí)菌絲發(fā)育的條件。
相對(duì)穿透率(RPE)通過(guò)經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞(用pNAox或?qū)φ誨sRNA轉(zhuǎn)化)的穿透率與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的穿透率之間的差異進(jìn)行計(jì)算(在這里平均穿透率為38.74％)。RPE百分率(％RPE)自RPE減1并乘以100進(jìn)行計(jì)算。
％RPE＝100*(RPE-1)％RPE值(對(duì)照的平均穿透率的離散性)用于確定用pNAox-dsRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的易感性(圖4)。
對(duì)于對(duì)照dsRNA，五個(gè)不同實(shí)驗(yàn)顯示在關(guān)于Bgh的穿透率方面用對(duì)照dsRNA及水轉(zhuǎn)染之間沒(méi)有差異。
為排除dsRNA的作用及經(jīng)攻擊細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率或存活率，將對(duì)照實(shí)驗(yàn)及pNAox-dsRNA實(shí)驗(yàn)中GFP表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行了比較。pNAox-dsRNA對(duì)經(jīng)攻擊GFP表達(dá)細(xì)胞的總數(shù)或數(shù)目沒(méi)有影響。
實(shí)施例5用氯化二亞苯基碘對(duì)NADPH氧化酶的抑制結(jié)果通過(guò)用NADPH氧化酶抑制劑氯化二亞苯基碘(DPI)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證(表1)。一般而言，實(shí)驗(yàn)通過(guò)如Hückelhoven及Kogel，1998描述的進(jìn)行。
表1Pallas中DPI對(duì)病原體的防御作用a
a用病原體接種后12小時(shí)進(jìn)行DPI處理并在接種后36小時(shí)進(jìn)行評(píng)估。
b用10mM磷酸鉀緩沖液，pH7.8作為對(duì)照，DMSO含量如在DPI處理中的含量。
c DPI溶解于10mM磷酸鉀緩沖液，pH7.8中，其來(lái)自于DMSO中的10mg/ml DPI貯液。
序列表<110>巴斯福植物科學(xué)有限公司<120>在植物中獲得病原體抗性的方法<130>AE20020416<140>
<141>
<160>24<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>337<212>DNA<213>大麥(Hordeum vulgare)<220>
<221>CDS<222>(2)..(337)<223>編碼NADPH氧化酶(片段)<400>1g ttt aaa gga atc atg aat gag att gct gaa cta gat caa agg aat atc 49Phe Lys Gly Ile Met Asn Glu Ile Ala Glu Leu Asp Gln Arg Asn Ile1 5 10 15att gag atg cac aac tat ctc aca agt gtt tat gag gaa ggg gat gct 97Ile Glu Met His Asn Tyr Leu Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala20 25 30cgg tca gca ctc atc aca atg ctg caa gct ctc aac cat gcc aag aat 145Arg Ser Ala Leu Ile Thr Met Leu Gln Ala Leu Asn His Ala Lys Asn35 40 45ggt gtc gat gta gtg tct ggm act cga gtc cgg aca cat ttt gca aga 193Gly Val Asp Val Val Ser Xaa Thr Arg Val Arg Thr His Phe Ala Arg50 55 60cca aat ttt aag agg gtg ctg tct aag gta gcc gcc aaa cat cct tat 241Pro Asn Phe Lys Arg Val Leu Ser Lys Val Ala Ala Lys His Pro Tyr65 70 75 80gcc aag ata gga gtg ttc tat tgc gga gct cca gtt ctg gcg cag gaa 289Ala Lys Ile Gly Val Phe Tyr Cys Gly Ala Pro Val Leu Ala Gln Glu85 90 95cta agc aac ctt tgc cat gag ttc aat ggc aaa tgc acg aca aaa ttc 337Leu Ser Asn Leu Cys His Glu Phe Asn Gly Lys Cys Thr Thr Lys Phe100 105 110<210>2<211>112<212>PRT<213>大麥<400>2
Phe Lys Gly Ile Met Asn Glu Ile Ala Glu Leu Asp Gln Arg Asn Ile1 5 10 15Ile Glu Met His Asn Tyr Leu Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala20 25 30Arg Ser Ala Leu Ile Thr Met Leu Gln Ala Leu Asn His Ala Lys Asn35 40 45Gly Val Asp Val Val Ser Xaa Thr Arg Val Arg Thr His Phe Ala Arg50 55 60Pro Asn Phe Lys Arg Val Leu Ser Lys Val Ala Ala Lys His Pro Tyr65 70 75 80Ala Lys Ile Gly Val Phe Tyr Cys Gly Ala Pro Val Leu Ala Gln Glu85 90 95Leu Ser Asn Leu Cys His Glu Phe Asn Gly Lys Cys Thr Thr Lys Phe100 105 110<210>3<211>2832<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
<221>CDS<222>(1)..(2829)<223>編碼NADPH氧化酶<400>3atg agg ggc ggc gcc tcc tcg gga ccc cag cga tgg ggc tcg gcg ggg 48Met Arg Gly Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Arg Trp Gly Ser Ala Gly1 5 10 15acg aca ccg cgg tcg ctg agc acg ggc tcg tcg ccg cgc ggg tcc gac 96Thr Thr Pro Arg Ser Leu Ser Thr Gly Ser Ser Pro Arg Gly Ser Asp20 25 30gac cgg agc tcc gac gac ggg gag gag ctg gtc gag gtc acg ctc gac 144Asp Arg Ser Ser Asp Asp Gly Glu Glu Leu Val Glu Val Thr Leu Asp35 40 45ctg cag gac gac gac acc att gtg ctt cgg agc gtc gag ccc gcg gcg 192Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Val Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala Ala50 55 60gcg gcg gcg gcg ggg gtg ggg gcg ggg gcg ggg gcg gcg tcg gcg cgg 240Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ser Ala Arg65 70 75 80ggg gag ctc acg ggt ggc ccg tcg tcg tcg tcg tcg cgg tcg agg tcg 288Gly Glu Leu Thr Gly Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser Arg Ser85 90 95ccg tcg atc cgg agg agc tcg tcg cac cgg ctg ctg cag ttc tcg cag 336Pro Ser Ile Arg Arg Ser Ser Ser His Arg Leu Leu Gln Phe Ser Gln
100 105 110gag ctc aag gcg gag gcc atg gcc cgg gcg cgg cag ttc tcg cag gac 384Glu Leu Lys Ala Glu Ala Met Ala Arg Ala Arg Gln Phe Ser Gln Asp115 120 125ctg acc aag cgg ttc ggc cgc agc cac agc cgc agc gaa gcg cag gcg 432Leu Thr Lys Arg Phe Gly Arg Ser His Ser Arg Ser Glu Ala Gln Ala130 135 140ccg tcg ggc ctc gag tcc gcg ctc gcc gcc cgc gcc gcg cgg cgg cag 480Pro Ser Gly Leu Glu Ser Ala Leu Ala Ala Arg Ala Ala Arg Arg Gln145 150 155 160cgc gcg cag ctc gac cgc aca cgc tcc ggc gcc cac aag gcg ctc cgc 528Arg Ala Gln Leu Asp Arg Thr Arg Ser Gly Ala His Lys Ala Leu Arg165 170 175ggc ctc cgc ttc atc agc agc aac aag gcc aac aac gcc tgg atg gag 576Gly Leu Arg Phe Ile Ser Ser Asn Lys Ala Asn Asn Ala Trp Met Glu180 185 190gtg cag gcc aac ttc gac cgc ctc gcc cgc gac ggc tac ctc tcc cgc 624Val Gln Ala Asn Phe Asp Arg Leu Ala Arg Asp Gly Tyr Leu Ser Arg195 200 205tcc gac ttc gcc gaa tgc atc ggg atg acg gaa tcg aag gag ttc gcg 672Ser Asp Phe Ala Glu Cys Ile Gly Met Thr Glu Ser Lys Glu Phe Ala210 215 220ctc gag ctg ttc gac acg ctg agc cgg cga cga cag atg aag gtg gac 720Leu Glu Leu Phe Asp Thr Leu Ser Arg Arg Arg Gln Met Lys Val Asp225 230 235 240acg att aac aag gat gaa ctc cgc gag atc tgg cag cag atc acc gat 768Thr Ile Asn Lys Asp Glu Leu Arg Glu Ile Trp Gln Gln Ile Thr Asp245 250 255aac agc ttc gac tcc cgt ctc caa atc ttc ttc gaa atg gtg gat aag 816Asn Ser Phe Asp Ser Arg Leu Gln Ile Phe Phe Glu Met Val Asp Lys260 265 270aac gcg gac ggc cgg att acg gag gcg gag gtg aaa gag att att atg 864Asn Ala Asp Gly Arg Ile Thr Glu Ala Glu Val Lys Glu Ile Ile Met275 280 285ttg agc gcg tct gcc aat aaa ctg tcg agg ctt aag gag caa gca gaa 912Leu Ser Ala Ser Ala Asn Lys Leu Ser Arg Leu Lys Glu Gln Ala Glu290 295 300gag tac gcc gct ttg atc atg gag gag ctt gat cct gaa ggg ctc ggc 960Glu Tyr Ala Ala Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Glu Gly Leu Gly305 310 315 320tac att gag cta tgg caa ttg gag aca ctt ctg ttg cag aaa gat acc 1008Tyr Ile Glu Leu Trp Gln Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln Lys Asp Thr325 330 335tat atg aac tat agt cag gcc ctt agt tac aca agc caa gca ctg agc 1056
Tyr Met Asn Tyr Ser Gln Ala Leu Ser Tyr Thr Ser Gln Ala Leu Ser340 345 350cag aat ctt gca ggg cta agg aag aag agt tca atc cgc aaa ata agc 1104Gln Asn Leu Ala Gly Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ile Arg Lys Ile Ser355 360 365acc tct tta agc tac tat ttc gag gac aac tgg aaa cgt tta tgg gtg 1152Thr Ser Leu Ser Tyr Tyr Phe Glu Asp Asn Trp Lys Arg Leu Trp Val370 375 380ctt gca ttg tgg att ggg ata atg gct gga ctg ttc acc tgg aaa ttc 1200Leu Ala Leu Trp Ile Gly Ile Met Ala Gly Leu Phe Thr Trp Lys Phe385 390 395 400atg cag tat cgt aac cga tat gtc ttt gat gtg atg ggc tac tgt gtc 1248Met Gln Tyr Arg Asn Arg Tyr Val Phe Asp Val Met Gly Tyr Cys Val405 410 415aca aca gca aaa gga gct gct gaa acc cta aag ctg aat atg gca att 1296Thr Thr Ala Lys Gly Ala Ala Glu Thr Leu Lys Leu Asn Met Ala Ile420 425 430atc ctc ctg cca gta tgc cgt aac acc att act tgg ttg cga agt aca 1344Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Thr Ile Thr Trp Leu Arg Ser Thr435 440 445agg gct gca cgg gca cta cct ttt gat gac aac atc aac ttc cac aag 1392Arg Ala Ala Arg Ala Leu Pro Phe Asp Asp Asn Ile Asn Phe His Lys450 455 460act att gca gca gca att gtg gtt ggt ata atc ctc cat gca ggg aac 1440Thr Ile Ala Ala Ala Ile Val Val Gly Ile Ile Leu His Ala Gly Asn465 470 475 480cac ctt gta tgc gat ttt cca cgg tta ata aaa tca tca gat gag aag 1488His Leu Val Cys Asp Phe Pro Arg Leu Ile Lys Ser Ser Asp Glu Lys485 490 495tat gct cct ttg ggc cag tat ttt ggg gaa ata aag cca aca tat ttt 1536Tyr Ala Pro Leu Gly Gln Tyr Phe Gly Glu Ile Lys Pro Thr Tyr Phe500 505 510aca ttg gtc aaa gga gtg gag ggc atc act ggg gta atc atg gtt gta 1584Thr Leu Val Lys Gly Val Glu Gly Ile Thr Gly Val Ile Met Val Val515 520 525tgc atg ata att gct ttt act cta gca acc cgg tgg ttc cgc cgt agc 1632Cys Met Ile Ile Ala Phe Thr Leu Ala Thr Arg Trp Phe Arg Arg Ser530 535 540ttg gtt aag ctt cca agg cca ttt gac aaa ctg act ggc ttc aat gcc 1680Leu Val Lys Leu Pro Arg Pro Phe Asp Lys Leu Thr Gly Phe Asn Ala545 550 555 560ttt tgg tat tct cat cat ctg ttc atc att gtg tat atc gcg ctc att 1728Phe Trp Tyr Ser His His Leu Phe Ile Ile Val Tyr Ile Ala Leu Ile565 570 575
gtt cat gga gag tgt cta tac ctt att cat gtc tgg tac aga aga acg 1776Val His Gly Glu Cys Leu Tyr Leu Ile His Val Trp Tyr Arg Arg Thr580 585 590aca tgg atg tat ctt tca gtg cct gtt tgc ttg tat gta ggg gag agg 1824Thr Trp Met Tyr Leu Ser Val Pro Val Cys Leu Tyr Val Gly Glu Arg595 600 605att cta agg ttc ttc agg tct ggc agt tat tct gtc cgg cta ttg aag 1872Ile Leu Arg Phe Phe Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Val Arg Leu Leu Lys610 615 620gtg gcc ata tat cca ggt aat gtt ttg aca ctg caa atg tcc aag cct 1920Val Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Val Leu Thr Leu Gln Met Ser Lys Pro625 630 635 640ccc acg ttc cgt tac aag agt gga caa tat atg ttt gtt caa tgt cca 1968Pro Thr Phe Arg Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr Met Phe Val Gln Cys Pro645 650 655gca gtg tct ccc ttt gaa tgg cat ccc ttc tca att act tca gca cct 2016Ala Val Ser Pro Phe Glu Trp His Pro Phe Ser Ile Thr Ser Ala Pro660 665 670ggg gat gac tac ctc agc att cat gtt cga caa ctt ggt gat tgg aca 2064Gly Asp Asp Tyr Leu Ser Ile His Val Arg Gln Leu Gly Asp Trp Thr675 680 685cga gaa ctc aag aga gta ttt gct gca gct tgt gag ccc cca gcg ggt 2112Arg Glu Leu Lys Arg Val Phe Ala Ala Ala Cys Glu Pro Pro Ala Gly690 695 700ggt aaa agc ggc ctt ctt agg gca gat gag aca act aag aaa atc tta 2160Gly Lys Ser Gly Leu Leu Arg Ala Asp Glu Thr Thr Lys Lys Ile Leu705 710 715 720ccc aag ctt ctg att gat gga ccg tat ggt tct cct gct cag gat tac 2208Pro Lys Leu Leu Ile Asp Gly Pro Tyr Gly Ser Pro Ala Gln Asp Tyr725 730 735agc aag tat gat gtt tta tta ctt gtt gga tta gga att ggt gcg aca 2256Ser Lys Tyr Asp Val Leu Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly Ala Thr740 745 750ccc ttt att agc ata tta aaa gat ctt ctg aat aac atc atc aaa atg 2304Pro Phe Ile Ser Ile Leu Lys Asp Leu Leu Asn Asn Ile Ile Lys Met755 760 765gag gaa gag gag gat gct tct act gat ctt tat cca cca atg ggt cgg 2352Glu Glu Glu Glu Asp Ala Ser Thr Asp Leu Tyr Pro Pro Met Gly Arg770 775 780aat aag cca cat gtt gat ctg ggc aca ctt atg acg att acc tca aga 2400Asn Lys Pro His Val Asp Leu Gly Thr Leu Met Thr Ile Thr Ser Arg785 790 795 800cca aag aag atc ttg aag acc aca aat gct tac ttt tac tgg gtg aca 2448Pro Lys Lys Ile Leu Lys Thr Thr Asn Ala Tyr Phe Tyr Trp Val Thr
805 810 815cgt gag caa ggc tct ttt gat tgg ttc aaa gga gtc atg aat gaa att 2496Arg Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Gly Val Met Asn Glu Ile820 825 830gct gac ttg gat caa agg aat atc att gag atg cac aac tac cta aca 2544Ala Asp Leu Asp Gln Arg Asn Ile Ile Glu Met His Asn Tyr Leu Thr835 840 845agc gtc tat gag gag ggg gat gcc agg tca gca ctc atc acc atg ctc 2592Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu Ile Thr Met Leu850 855 860caa gct ctg aac cat gcc aag aat gga gtt gat att gtc tct ggg aca 2640Gln Ala Leu Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp Ile Val Ser Gly Thr865 870 875 880aaa gtc cgg aca cat ttt gca cga cca aat tgg aga aag gtc ctt tct 2688Lys Val Arg Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp Arg Lys Val Leu Ser885 890 895aaa att tcc tcc aag cat cca tat gcc aaa ata ggt gta ttc tac tgt 2736Lys Ile Ser Ser Lys His Pro Tyr Ala Lys Ile Gly Val Phe Tyr Cys900 905 910gga gct cca gtc ctg gca caa gaa cta agc aaa ctt tgc cat gaa ttc 2784Gly Ala Pro Val Leu Ala Gln Glu Leu Ser Lys Leu Cys His Glu Phe915 920 925aac ggg aaa tgc aca acg aag ttc gaa ttc cat aag gag cat ttc tga 2832Asn Gly Lys Cys Thr Thr Lys Phe Glu Phe His Lys Glu His Phe930 935 940<210>4<211>943<212>PRT<213>水稻<400>4Met Arg Gly Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Arg Trp Gly Ser Ala Gly1 5 10 15Thr Thr Pro Arg Ser Leu Ser Thr Gly Ser Ser Pro Arg Gly Ser Asp20 25 30Asp Arg Ser Ser Asp Asp Gly Glu Glu Leu Val Glu Val Thr Leu Asp35 40 45Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Val Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala Ala50 55 60Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ser Ala Arg65 70 75 80Gly Glu Leu Thr Gly Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser Arg Ser85 90 95Pro Ser Ile Arg Arg Ser Ser Ser His Arg Leu Leu Gln Phe Ser Gln100 105 110
Glu Leu Lys Ala Glu Ala Met Ala Arg Ala Arg Gln Phe Ser Gln Asp115 120 125Leu Thr Lys Arg Phe Gly Arg Ser His Ser Arg Ser Glu Ala Gln Ala130 135 140Pro Ser Gly Leu Glu Ser Ala Leu Ala Ala Arg Ala Ala Arg Arg Gln145 150 155 160Arg Ala Gln Leu Asp Arg Thr Arg Ser Gly Ala His Lys Ala Leu Arg165 170 175Gly Leu Arg Phe Ile Ser Ser Asn Lys Ala Asn Asn Ala Trp Met Glu180 185 190Val Gln Ala Asn Phe Asp Arg Leu Ala Arg Asp Gly Tyr Leu Ser Arg195 200 205Ser Asp Phe Ala Glu Cys Ile Gly Met Thr Glu Ser Lys Glu Phe Ala210 215 220Leu Glu Leu Phe Asp Thr Leu Ser Arg Arg Arg Gln Met Lys Val Asp225 230 235 240Thr Ile Asn Lys Asp Glu Leu Arg Glu Ile Trp Gln Gln Ile Thr Asp245 250 255Asn Ser Phe Asp Ser Arg Leu Gln Ile Phe Phe Glu Met Val Asp Lys260 265 270Asn Ala Asp Gly Arg Ile Thr Glu Ala Glu Val Lys Glu Ile Ile Met275 280 285Leu Ser Ala Ser Ala Asn Lys Leu Ser Arg Leu Lys Glu Gln Ala Glu290 295 300Glu Tyr Ala Ala Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Glu Gly Leu Gly305 310 315 320Tyr Ile Glu Leu Trp Gln Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln Lys Asp Thr325 330 335Tyr Met Asn Tyr Ser Gln Ala Leu Ser Tyr Thr Ser Gln Ala Leu Ser340 345 350Gln Asn Leu Ala Gly Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ile Arg Lys Ile Ser355 360 365Thr Ser Leu Ser Tyr Tyr Phe Glu Asp Asn Trp Lys Arg Leu Trp Val370 375 380Leu Ala Leu Trp Ile Gly Ile Met Ala Gly Leu Phe Thr Trp Lys Phe385 390 395400Met Gln Tyr Arg Asn Arg Tyr Val Phe Asp Val Met Gly Tyr Cys Val405 410 415Thr Thr Ala Lys Gly Ala Ala Glu Thr Leu Lys Leu Asn Met Ala Ile420 425 430Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Thr Ile Thr Trp Leu Arg Ser Thr435 440 445Arg Ala Ala Arg Ala Leu Pro Phe Asp Asp Asn Ile Asn Phe His Lys450 455 460
Thr Ile Ala Ala Ala Ile Val Val Gly Ile Ile Leu His Ala Gly Asn465 470 475 480His Leu Val Cys Asp Phe Pro Arg Leu Ile Lys Ser Ser Asp Glu Lys485 490 495Tyr Ala Pro Leu Gly Gln Tyr Phe Gly Glu Ile Lys Pro Thr Tyr Phe500 505 510Thr Leu Val Lys Gly Val Glu Gly Ile Thr Gly Val Ile Met Val Val515 520 525Cys Met Ile Ile Ala Phe Thr Leu Ala Thr Arg Trp Phe Arg Arg Ser530 535 540Leu Val Lys Leu Pro Arg Pro Phe Asp Lys Leu Thr Gly Phe Asn Ala545 550 555 560Phe Trp Tyr Ser His His Leu Phe Ile Ile Val Tyr Ile Ala Leu Ile565 570 575Val His Gly Glu Cys Leu Tyr Leu Ile His Val Trp Tyr Arg Arg Thr580 585 590Thr Trp Met Tyr Leu Ser Val Pro Val Cys Leu Tyr Val Gly Glu Arg595 600 605Ile Leu Arg Phe Phe Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Val Arg Leu Leu Lys610 615 620Val Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Val Leu Thr Leu Gln Met Ser Lys Pro625 630 635 640Pro Thr Phe Arg Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr Met Phe Val Gln Cys Pro645 650 655Ala Val Ser Pro Phe Glu Trp His Pro Phe Ser Ile Thr Ser Ala Pro660 665 670Gly Asp Asp Tyr Leu Ser Ile His Val Arg Gln Leu Gly Asp Trp Thr675 680 685Arg Glu Leu Lys Arg Val Phe Ala Ala Ala Cys Glu Pro Pro Ala Gly690 695 700Gly Lys Ser Gly Leu Leu Arg Ala Asp Glu Thr Thr Lys Lys Ile Leu705 710 715 720Pro Lys Leu Leu Ile Asp Gly Pro Tyr Gly Ser Pro Ala Gln Asp Tyr725 730 735Ser Lys Tyr Asp Val Leu Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly Ala Thr740 745 750Pro Phe Ile Ser Ile Leu Lys Asp Leu Leu Asn Asn Ile Ile Lys Met755 760 765Glu Glu Glu Glu Asp Ala Ser Thr Asp Leu Tyr Pro Pro Met Gly Arg770 775 780Asn Lys Pro His Val Asp Leu Gly Thr Leu Met Thr Ile Thr Ser Arg785 790 795 800Pro Lys Lys Ile Leu Lys Thr Thr Asn Ala Tyr Phe Tyr Trp Val Thr805 810 815
Arg Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Gly Val Met Asn Glu Ile820 825 830Ala Asp Leu Asp Gln Arg Asn Ile Ile Glu Met His Asn Tyr Leu Thr835 840 845Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu Ile Thr Met Leu850 855 860Gln Ala Leu Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp Ile Val Ser Gly Thr865 870 875 880Lys Val Arg Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp Arg Lys Val Leu Ser885 890 895Lys Ile Ser Ser Lys His Pro Tyr Ala Lys Ile Gly Val Phe Tyr Cys900 905 910Gly Ala Pro Val Leu Ala Gln Glu Leu Ser Lys Leu Cys His Glu Phe915 920 925Asn Gly Lys Cys Thr Thr Lys Phe Glu Phe His Lys Glu His Phe930 935 940<210>5<211>2889<212>DNA<213>煙草(Nicotiana tabacum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(2886)<223>編碼NADPH氧化酶<400>5atg agg ggt tta cct ggg cat gaa cgc cgg tgg aca tcc gat acg gta 48Met Arg Gly Leu Pro Gly His Glu Arg Arg Trp Thr Ser Asp Thr Val1 5 10 15tct tcc gac aag gat ttt agt ggt gaa tta tcg ccg gga gct gat tcc 96Ser Ser Asp Lys Asp Phe Ser Gly Glu Leu Ser Pro Gly Ala Asp Ser20 25 30ggc tat aat tcc ggt ttt gct tcc gag gag ttt gtt gaa gtc acg ctt 144Gly Tyr Asn Ser Gly Phe Ala Ser Glu Glu Phe Val Glu Val Thr Leu35 40 45gat ctt cag gat gat gat acc att att cta cgg agc gtt gaa ccg gct 192Asp Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Ile Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala50 55 60act gtg att aac att gac gct cct gat ctt ccc gcc gga gtc ggt att 240Thr Val Ile Asn Ile Asp Ala Pro Asp Leu Pro Ala Gly Val Gly Ile65 70 75 80tcc gga gtt tca att gaa act ccg acg tca gca tcg gtg tcg gaa tct 288Ser Gly Val Ser Ile Glu Thr Pro Thr Ser Ala Ser Val Ser Glu Ser85 90 95
cga tcg ccg acg atc cgc cgg agt tca tct agt aaa ctt cgt cag ttt 336Arg Ser Pro Thr Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Lys Leu Arg Gln Phe100 105 110tca cag gag ttg aaa gct gag gcg gtt gcg aaa gcg agg cag ttt tca 384Ser Gln Glu Leu Lys Ala Glu Ala Val Ala Lys Ala Arg Gln Phe Ser115 120 125caa gag ctg aag gcg gag tta agg aga ttc tca tgg agc cat ggg cat 432Gln Glu Leu Lys Ala Glu Leu Arg Arg Phe Ser Trp Ser His Gly His130 135 140gcg tct cgc gcg ttt tcg ccc tcg tcg ttt ttt caa aac gcc gtc gtt 480Ala Ser Arg Ala Phe Ser Pro Ser Ser Phe Phe Gln Asn Ala Val Val145 150 155 160gga aca ggt aac ggc gtg gac tcg gct tta gcg gca cgt gca tta cgt 528Gly Thr Gly Asn Gly Val Asp Ser Ala Leu Ala Ala Arg Ala Leu Arg165 170 175cgg caa cgc gcg cag ctt gat cgg act cgt tcc agc gcc cat aga gct 576Arg Gln Arg Ala Gln Leu Asp Arg Thr Arg Ser Ser Ala His Arg Ala180 185 190ctt cgt aga ctc aaa ttc att agc aat aac aaa acc aat gga tgg aat 624Leu Arg Arg Leu Lys Phe Ile Ser Asn Asn Lys Thr Asn Gly Trp Asn195 200 205gaa gtt gaa aac aat ttc tca aag ctc gct aaa gac ggt tat ctt tac 672Glu Val Glu Asn Asn Phe Ser Lys Leu Ala Lys Asp Gly Tyr Leu Tyr210 215 220cgt tcc gat ttc gca caa tgc ata ggt atg aag gat tcg aag gaa ttt 720Arg Ser Asp Phe Ala Gln Cys Ile Gly Met Lys Asp Ser Lys Glu Phe225 230 235 240gca ttg gaa tta ttt gat gct ttg agt aga aga aga aga tta aag gtt 768Ala Leu Glu Leu Phe Asp Ala Leu Ser Arg Arg Arg Arg Leu Lys Val245 250 255gat aaa att agc aag gag gaa ttg tat gag tac tgg tct caa atc acc 816Asp Lys Ile Ser Lys Glu Glu Leu Tyr Glu Tyr Trp Ser Gln Ile Thr260 265 270gat cag agt ttc gat tct cgg ctt cag atc tcc ttc gac atg gtg gac 864Asp Gln Ser Phe Asp Ser Arg Leu Gln Ile Ser Phe Asp Met Val Asp275 280 285aag aat gaa gat ggt cga att gct gaa gag gaa gta aaa gag atc atc 912Lys Asn Glu Asp Gly Arg Ile Ala Glu Glu Glu Val Lys Glu Ile Ile290 295 300atg cta agt gca tct gca aac aag tta tca aga tta aaa gaa caa gca 960Met Leu Ser Ala Ser Ala Asn Lys Leu Ser Arg Leu Lys Glu Gln Ala305 310 315 320gag gag tat gca gct tta atc atg gaa gaa tta gat cct gaa aga ctc 1008Glu Glu Tyr Ala Ala Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Glu Arg Leu
325 330 335ggc tac att gag cta tgg cag ctg gaa aca ctt ctc ctc caa aag gac 1056Gly Tyr Ile Glu Leu Trp Gln Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln Lys Asp340 345 350act tac ctc aac tac agt caa gca cta agt tac acg agc caa gcc ttg 1104Thr Tyr Leu Asn Tyr Ser Gln Ala Leu Ser Tyr Thr Ser Gln Ala Leu355 360 365agc caa aac ctt cac gga tta agg aag aaa agc cca ata aaa aga atg 1152Ser Gln Asn Leu His Gly Leu Arg Lys Lys Ser Pro Ile Lys Arg Met370 375 380agc aca aaa ctt gtc tat tca ttg caa gaa aac tgg aag aga att tgg 1200Ser Thr Lys Leu Val Tyr Ser Leu Gln Glu Asn Trp Lys Arg Ile Trp385 390 395 400gtt ctc act tta tgg att ttg ata atg att ggg ctt ttt ctt tgg aag 1248Val Leu Thr Leu Trp Ile Leu Ile Met Ile Gly Leu Phe Leu Trp Lys405 410 415ttc tat cag tac aaa aac aag agt gca ttc cgt gtc atg ggt tat tgc 1296Phe Tyr Gln Tyr Lys Asn Lys Ser Ala Phe Arg Val Met Gly Tyr Cys420 425 430ctt gtc acg gct aag ggc gct gct gag act ctc aag ttc aac atg gct 1344Leu Val Thr Ala Lys Gly Ala Ala Glu Thr Leu Lys Phe Asn Met Ala435 440 445ctt ata tta ttg cca gta tgc aga aac act att aca tgg ctc agg tcc 1392Leu Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Thr Ile Thr Trp Leu Arg Ser450 455 460acc aag ttg agc cat ttt gta ccc ttt gac gac aac atc aac ttt cac 1440Thr Lys Leu Ser His Phe Val Pro Phe Asp Asp Asn Ile Asn Phe His465 470 475 480aag act gtc gct gca gcc att gtc act ggt atc ata ctc cat gct ggt 1488Lys Thr Val Ala Ala Ala Ile Val Thr Gly Ile Ile Leu His Ala Gly485 490 495aac cat ctt gta tgt gat ttc cca agg ctt ata cat gca gat gat caa 1536Asn His Leu Val Cys Asp Phe Pro Arg Leu Ile His Ala Asp Asp Gln500 505 510gat tat caa agt ttt ttg tcg aat gat ttt ggc caa agt aag cct gga 1584Asp Tyr Gln Ser Phe Leu Ser Asn Asp Phe Gly Gln Ser Lys Pro Gly515 520 525tac ata gac ctt gtt aaa gga gtt gag ggt gtg acg gga ata ata atg 1632Tyr Ile Asp Leu Val Lys Gly Val Glu Gly Val Thr Gly Ile Ile Met530 535 540gta atc ctt atg gcc att gct ttc act ctt gct aca cga tgg ttt aga 1680Val Ile Leu Met Ala Ile Ala Phe Thr Leu Ala Thr Arg Trp Phe Arg545 550 555 560cgg agc ctc att aag ttg ccc aaa cct ttt gat aga ctc act ggc ttc 1728
Arg Ser Leu Ile Lys Leu Pro Lys Pro Phe Asp Arg Leu Thr Gly Phe565 570 575aat gca ttc tgg tat tca cac cac ctt ctt gtc att gtc tac atc cta 1776Asn Ala Phe Trp Tyr Ser His His Leu Leu Val Ile Val Tyr Ile Leu580 585 590ctg atc atc cat ggc acg ttc ctc ttc ctt gtg cat aaa tgg tac tcc 1824Leu Ile Ile His Gly Thr Phe Leu Phe Leu Val His Lys Trp Tyr Ser595 600 605aag acg acg tgg atg tat cta gca gtt cct gtg ctt ctc tac gca ggg 1872Lys Thr Thr Trp Met Tyr Leu Ala Val Pro Val Leu Leu Tyr Ala Gly610 615 620gaa aga act ctt aga ttc ttc cgg tca ggc ttg tac act gtc cgg ctt 1920Glu Arg Thr Leu Arg Phe Phe Arg Ser Gly Leu Tyr Thr Val Arg Leu625 630 635 640ctg aaa gta gca ata tat cct gga aat gtc ctc act cta caa atg tct 1968Leu Lys Val Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Val Leu Thr Leu Gln Met Ser645 650 655aag cct cct caa ttt cga tac aaa agt gga caa tat atg ttt gtc cag 2016Lys Pro Pro Gln Phe Arg Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr Met Phe Val Gln660 665 670tgt cca gct gtt tct cca ttc gag tgg cat cca ttt tcc att act tca 2064Cys Pro Ala Val Ser Pro Phe Glu Trp His Pro Phe Ser Ile Thr Ser675 680 685gct cct ggg gat gac tac ttg agc att cac atc cgg caa ctt ggt gac 2112Ala Pro Gly Asp Asp Tyr Leu Ser Ile His Ile Arg Gln Leu Gly Asp690 695 700tgg act caa gaa ctc aag cgg gtc ttt tct gag gct tgc gag cgg cca 2160Trp Thr Gln Glu Leu Lys Arg Val Phe Ser Glu Ala Cys Glu Arg Pro705 710 715 720gag gct gga aag agt ggc ctg ctc aga gct gac gaa aac act aag aaa 2208Glu Ala Gly Lys Ser Gly Leu Leu Arg Ala Asp Glu Asn Thr Lys Lys725 730 735agt ttg cca aag cta tta ata gat gga cct tac gga gct cca gca caa 2256Ser Leu Pro Lys Leu Leu Ile Asp Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gln740 745 750gat tac cga aaa tat gat gtc ttg ctg ctt gtt ggt ctt ggc att gga 2304Asp Tyr Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly755 760 765gca acg ccg ttc ata agt atc ctg aaa gac ttg ctc gtt aac atc gtg 2352Ala Thr Pro Phe Ile Ser Ile Leu Lys Asp Leu Leu Val Asn Ile Val770 775 780aaa atg gag gag caa gca gat tta gcc tca gat ttc agt ggg aac tca 2400Lys Met Glu Glu Gln Ala Asp Leu Ala Ser Asp Phe Ser Gly Asn Ser785 790 795 800
gac atg agc gtt gcg aca agt gaa caa cca gct ctc aac aag att tct 2448Asp Met Ser Val Ala Thr Ser Glu Gln Pro Ala Leu Asn Lys Ile Ser805 810 815ctg aaa agg aga aag agc act cta aga acc aca aat gca tat ttt tat 2496Leu Lys Arg Arg Lys Ser Thr Leu Arg Thr Thr Asn Ala Tyr Phe Tyr820 825 830tgg gtg acc cgg gag caa gga tca ttt gat tgg ttc aaa ggc gtt atg 2544Trp Val Thr Arg Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Gly Val Met835 840 845aac gaa gtg gct gaa ctt gat caa agg ggg gtc atc gag atg cat aac 2592Asn Glu Val Ala Glu Leu Asp Gln Arg Gly Val Ile Glu Met His Asn850 855 860tac ttg acg agt gtt tat gag gaa ggg gat gct cgt tca gct ctc att 2640Tyr Leu Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu Ile865 870 875 880acc atg gtc cag gca ctt aac cat gct aag aat ggg gtt gat att gta 2688Thr Met Val Gln Ala Leu Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp Ile Val885 890 895tca ggc acc agg gtg agg aca cat ttt gct agg cca aat tgg aag aaa 2736Ser Gly Thr Arg Val Arg Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp Lys Lys900 905 910gta ttt tcc aag acc tta acc aag cat gca aat gca aga ata ggg gtt 2784Val Phe Ser Lys Thr Leu Thr Lys His Ala Asn Ala Arg Ile Gly Val915 920 925ttc tac tgt ggt gca ccc gta tta gca aaa gaa ctc agc aaa ctc tgc 2832Phe Tyr Cys Gly Ala Pro Val Leu Ala Lys Glu Leu Ser Lys Leu Cys930 935 940aaa gag tat aat caa aag ggt gca aca aag ttc gag ttt cac aaa gaa 2880Lys Glu Tyr Asn Gln Lys Gly Ala Thr Lys Phe Glu Phe His Lys Glu945 950 955 960cat ttt tag 2889His Phe<210>6<211>962<212>PRT<213>煙草<400>6Met Arg Gly Leu Pro Gly His Glu Arg Arg Trp Thr Ser Asp Thr Val1 5 10 15Ser Ser Asp Lys Asp Phe Ser Gly Glu Leu Ser Pro Gly Ala Asp Ser20 25 30Gly Tyr Asn Ser Gly Phe Ala Ser Glu Glu Phe Val Glu Val Thr Leu35 40 45Asp Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Ile Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala
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405 410 415Phe Tyr Gln Tyr Lys Asn Lys Ser Ala Phe Arg Val Met Gly Tyr Cys420 425 430Leu Val Thr Ala Lys Gly Ala Ala Glu Thr Leu Lys Phe Asn Met Ala435 440 445Leu Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Thr Ile Thr Trp Leu Arg Ser450 455 460Thr Lys Leu Ser His Phe Val Pro Phe Asp Asp Asn Ile Asn Phe His465 470 475 480Lys Thr Val Ala Ala Ala Ile Val Thr Gly Ile Ile Leu His Ala Gly485 490 495Asn His Leu Val Cys Asp Phe Pro Arg Leu Ile His Ala Asp Asp Gln500 505 510Asp Tyr Gln Ser Phe Leu Ser Asn Asp Phe Gly Gln Ser Lys Pro Gly515 520 525Tyr Ile Asp Leu Val Lys Gly Val Glu Gly Val Thr Gly Ile Ile Met530 535 540Val Ile Leu Met Ala Ile Ala Phe Thr Leu Ala Thr Arg Trp Phe Arg545 550 555 560Arg Ser Leu Ile Lys Leu Pro Lys Pro Phe Asp Arg Leu Thr Gly Phe565 570 575Asn Ala Phe Trp Tyr Ser His His Leu Leu Val Ile Val Tyr Ile Leu580 585 590Leu Ile Ile His Gly Thr Phe Leu Phe Leu Val His Lys Trp Tyr Ser595 600 605Lys Thr Thr Trp Met Tyr Leu Ala Val Pro Val Leu Leu Tyr Ala Gly610 615 620Glu Arg Thr Leu Arg Phe Phe Arg Ser Gly Leu Tyr Thr Val Arg Leu625 630 635 640Leu Lys Val Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Val Leu Thr Leu Gln Met Ser645 650 655Lys Pro Pro Gln Phe Arg Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr Met Phe Val Gln660 665 670Cys Pro Ala Val Ser Pro Phe Glu Trp His Pro Phe Ser Ile Thr Ser675 680 685Ala Pro Gly Asp Asp Tyr Leu Ser Ile His Ile Arg Gln Leu Gly Asp690 695 700Trp Thr Gln Glu Leu Lys Arg Val Phe Ser Glu Ala Cys Glu Arg Pro705 710 715 720Glu Ala Gly Lys Ser Gly Leu Leu Arg Ala Asp Glu Asn Thr Lys Lys725 730 735Ser Leu Pro Lys Leu Leu Ile Asp Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gln740 745 750Asp Tyr Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly
755 760 765Ala Thr Pro Phe Ile Ser Ile Leu Lys Asp Leu Leu Val Asn Ile Val770 775 780Lys Met Glu Glu Gln Ala Asp Leu Ala Ser Asp Phe Ser Gly Asn Ser785 790 795 800Asp Met Ser Val Ala Thr Ser Glu Gln Pro Ala Leu Asn Lys Ile Ser805 810 815Leu Lys Arg Arg Lys Ser Thr Leu Arg Thr Thr Asn Ala Tyr Phe Tyr820 825 830Trp Val Thr Arg Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Gly Val Met835 840 845Asn Glu Val Ala Glu Leu Asp Gln Arg Gly Val Ile Glu Met His Asn850 855 860Tyr Leu Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu Ile865 870 875 880Thr Met Val Gln Ala Leu Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp Ile Val885 890 895Ser Gly Thr Arg Val Arg Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp Lys Lys900 905 910Val Phe Ser Lys Thr Leu Thr Lys His Ala Asn Ala Arg Ile Gly Val915 920 925Phe Tyr Cys Gly Ala Pro Val Leu Ala Lys Glu Leu Ser Lys Leu Cys930 935 940Lys Glu Tyr Asn Gln Lys Gly Ala Thr Lys Phe Glu Phe His Lys Glu945 950 955 960His Phe<210>7<211>3733<212>DNA<213>馬鈴薯(Solanum tuberosum)<220>
<221>CDS<222>(92)..(2980)<223>編碼NADPH氧化酶<400>7ggcacgagaa taaccaaaac ttttggtcag gcttctgcag aaaactctgt tttcaacata 60tatttattta ttgtgctttg atttgggaca a atg agg ggt tta cct ggg cat112Met Arg Gly Leu Pro Gly His1 5gaa cgc cgg tgg acg tcg gat acg gta tct tcc ggc aag gat tta agt 160Glu Arg Arg Trp Thr Ser Asp Thr Val Ser Ser Gly Lys Asp Leu Ser10 15 20
ggt gag tca tcg ccg gga act gat tcc ggg aat att tcc ggt ttt gct 208Gly Glu Ser Ser Pro Gly Thr Asp Ser Gly Asn Ile Ser Gly Phe Ala25 30 35tcc gag gag ttt gtt gaa gtt ata ctt gat ctt cag gat gat gat acg 256Ser Glu Glu Phe Val Glu Val Ile Leu Asp Leu Gln Asp Asp Asp Thr40 45 50 55att att cta cgg agc gtt gaa ccg gct act gta atc aac att gat gct 304Ile Ile Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala Thr Val Ile Asn Ile Asp Ala60 65 70tct gat cct gct acc gga gtc ggt att ggt gga gta tcg att gaa act 352Ser Asp Pro Ala Thr Gly Val Gly Ile Gly Gly Val Ser Ile Glu Thr75 80 85ccg gcg tcg ctg act tcg acg tcg gga act cga tcg ccg acg atg cgt 400Pro Ala Ser Leu Thr Ser Thr Ser Gly Thr Arg Ser Pro Thr Met Arg90 95 100cgg agt aca tcg aat aaa tta cgt cag ttt tca cag gag ttg aaa gct 448Arg Ser Thr Ser Asn Lys Leu Arg Gln Phe Ser Gln Glu Leu Lys Ala105 110 115gag gct gtc gcg aaa gcg aag cat ttc tcg caa gag ctt aaa gcg gag 496Glu Ala Val Ala Lys Ala Lys His Phe Ser Gln Glu Leu Lys Ala Glu120 125 130 135cta agg aga ttc tca tgg agc cat gga cat gcg tct cgc act ttt tcg 544Leu Arg Arg Phe Ser Trp Ser His Gly His Ala Ser Arg Thr Phe Ser140 145 150ccg gcg tcg ttt ttc caa aac gcc gtc gtc ggt aca ggc aac ggt gta 592Pro Ala Ser Phe Phe Gln Asn Ala Val Val Gly Thr Gly Asn Gly Val155 160 165gat tcg gct tta gca gct cga gca tta cga cgg cag cgc gct cag ctc 640Asp Ser Ala Leu Ala Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Arg Ala Gln Leu170 175 180gat cgg act cgt tcc agc gct cac aag gct ctt cgt gga ctc aaa ttc 688Asp Arg Thr Arg Ser Ser Ala His Lys Ala Leu Arg Gly Leu Lys Phe185 190 195atc agc aat aac aaa act aac gga tgg aat gaa gtt gaa aac aat ttt 736Ile Ser Asn Asn Lys Thr Asn Gly Trp Asn Glu Val Glu Asn Asn Phe200 205 210 215gct aag ctc gct aaa gac ggt tac ctt tat cgc tcc gat ttc gca caa 784Ala Lys Leu Ala Lys Asp Gly Tyr Leu Tyr Arg Ser Asp Phe Ala Gln220 225 230tgc atc ggt atg aag gat tca aag gaa ttt gca ttg gaa ttg ttt gat 832Cys Ile Gly Met Lys Asp Ser Lys Glu Phe Ala Leu Glu Leu Phe Asp235 240 245gct ttg agt aga aga aga aga ttg aag gtt gat aag att agc aaa gag 880Ala Leu Ser Arg Arg Arg Arg Leu Lys Val Asp Lys Ile Ser Lys Glu
250 255 260gaa ttg tat gag tat tgg tct caa atc acc gat cag agt ttc gat tct 928Glu Leu Tyr Glu Tyr Trp Ser Gln Ile Thr Asp Gln Ser Phe Asp Ser265270 275cgg ctt cag atc ttc ttc gac atg gtg gac aag aat gaa gat ggt cga 976Arg Leu Gln Ile Phe Phe Asp Met Val Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg280 285 290 295att ggt gaa gaa gaa gta aaa gag atc atc atg cta agt gcc tct gca 1024Ile Gly Glu Glu Glu Val Lys Glu Ile Ile Met Leu Ser Ala Ser Ala300 305 310aac aaa tta tca aga tta aaa gaa caa gca gag gag tat gca gct ctg 1072Asn Lys Leu Ser Arg Leu Lys Glu Gln Ala Glu Glu Tyr Ala Ala Leu315 320 325atc atg gaa gaa tta gat cct gaa aga ctt ggc tac att gag cta tgg 1120Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Tyr Ile Glu Leu Trp330 335 340cag ctg gaa acg ctt ctc ctc caa aag gac act tac ctc aac tac agt 1168Gln Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln Lys Asp Thr Tyr Leu Asn Tyr Ser345 350 355caa gca cta agc tac aca agc caa gct ttg agc caa aac ctg caa ggg 1216Gln Ala Leu Ser Tyr Thr Ser Gln Ala Leu Ser Gln Asn Leu Gln Gly360 365 370 375ttg agg aag aga agc cca ata aga aga atg agc aca aaa ctt gtc tat 1264Leu Arg Lys Arg Ser Pro Ile Arg Arg Met Ser Thr Lys Leu Val Tyr380 385 390tca ctg caa gag aat tgg aag aga att tgg gtt ctg gtc ttg tgg att 1312Ser Leu Gln Glu Asn Trp Lys Arg Ile Trp Val Leu Val Leu Trp Ile395 400 405ttg ata atg att gga ctt ttt ctt tgg aag ttc tat ctg tac aaa cag 1360Leu Ile Met Ile Gly Leu Phe Leu Trp Lys Phe Tyr Leu Tyr Lys Gln410 415 420aaa agt gca ttt caa gtt atg ggt tat tgc ctt cta aca gct aag ggt 1408Lys Ser Ala Phe Gln Val Met Gly Tyr Cys Leu Leu Thr Ala Lys Gly425 430 435gct gct gag act cta aag ttc aac atg gct ttg ata ttg ttg cca gtt 1456Ala Ala Glu Thr Leu Lys Phe Asn Met Ala Leu Ile Leu Leu Pro Val440 445 450 455tgc agg aac acc att aca ttc ctc agg tct act aaa ttg agt tgt ttt 1504Cys Arg Asn Thr Ile Thr Phe Leu Arg Ser Thr Lys Leu Ser Cys Phe460 465 470gta ccc ttt gat gac aac atc aac ttc cac aag act gtt gct gca gcc 1552Val Pro Phe Asp Asp Asn Ile Asn Phe His Lys Thr Val Ala Ala Ala475 480 485att gtt act ggt atc ata ctc cat gcc ggt aat cat ctt gta tgt gat 1600
Ile Val Thr Gly Ile Ile Leu His Ala Gly Asn His Leu Val Cys Asp490 495 500ttc cca aag ctt ata cat gca aat aat acg aat tat cag aaa tat ttg 1648Phe Pro Lys Leu Ile His Ala Asn Asn Thr Asn Tyr Gln Lys Tyr Leu505 510 515gtg aat gat ttt ggc cca agc cag cct cag tac ata gat ctt gtt aaa 1696Val Asn Asp Phe Gly Pro Ser Gln Pro Gln Tyr Ile Asp Leu Val Lys520 525 530 535gga gtg gag ggt gtg aca gga ata ata atg gta atc ctc atg gcc att 1744Gly Val Glu Gly Val Thr Gly Ile Ile Met Val Ile Leu Met Ala Ile540 545 550gct ttc act ctt gca acg cga tgg ttt agg cgg agc ctc att aag ttt 1792Ala Phe Thr Leu Ala Thr Arg Trp Phe Arg Arg Ser Leu Ile Lys Phe555 560 565ccc aaa cct ttt gat aga ctc act ggt ttc aat gcg ttc tgg tac tcg 1840Pro Lys Pro Phe Asp Arg Leu Thr Gly Phe Asn Ala Phe Trp Tyr Ser570 575 580cac cac ctt ctc atc att gtc tac atc gta ctg atc atc cat ggc aca 1888His His Leu Leu Ile Ile Val Tyr Ile Val Leu Ile Ile His Gly Thr585 590 595ttc ctc tac ctt gtg cat aac tgg tac tcc aaa acg aca tgg atg tat 1936Phe Leu Tyr Leu Val His Asn Trp Tyr Ser Lys Thr Thr Trp Met Tyr600 605 610 615cta gca gtt cct gta ctt ctc tac gca ggg gaa aga act ctt aga ttc 1984Leu Ala Val Pro Val Leu Leu Tyr Ala Gly Glu Arg Thr Leu Arg Phe620 625 630ttc cga tca ggc tta tat aca gtc cgg ctt cta aaa gta gca ata tat 2032Phe Arg Ser Gly Leu Tyr Thr Val Arg Leu Leu Lys Val Ala Ile Tyr635 640 645cct gga aat gtc ctt act ctg caa atg tct aag cct ccg caa ttt cga 2080Pro Gly Asn Val Leu Thr Leu Gln Met Ser Lys Pro Pro Gln Phe Arg650 655 660tac aag agt gga caa tat atg ttt gtc cag tgt cca gct gtt tct cca 2128Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr Met Phe Val Gln Cys Pro Ala Val Ser Pro665 670 675ttc gag tgg cat cca ttt tcc att act tca gct cct ggg gat gac tac 2176Phe Glu Trp His Pro Phe Ser Ile Thr Ser Ala Pro Gly Asp Asp Tyr680 685 690 695ttg agc att cat atc cga caa ctt ggt gac tgg act caa gaa ctc aag 2224Leu Ser Ile His Ile Arg Gln Leu Gly Asp Trp Thr Gln Glu Leu Lys700 705 710cgg gtg ttt tcc gag gct tgc gag cag cca gag gct gga aag agt ggc 2272Arg Val Phe Ser Glu Ala Cys Glu Gln Pro Glu Ala Gly Lys Ser Gly715 720 725
ctg ctc aga gct gac gaa aac acc aaa aca agt ttg cca aag cta ttg 2320Leu Leu Arg Ala Asp Glu Asn Thr Lys Thr Ser Leu Pro Lys Leu Leu730 735 740ata gat gga cct tat gga gct cca gca caa gat tac cga aag tat gat 2368Ile Asp Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Asp Tyr Arg Lys Tyr Asp745 750 755gtc tta ctg ctt gtt ggt ctt ggc att gga gca act ccc ttt ata agt 2416Val Leu Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly Ala Thr Pro Phe Ile Ser760 765 770 775atc ctg aaa gac ttg ctc aaa aac atc gtc aca atg gag gag caa gca 2464Ile Leu Lys Asp Leu Leu Lys Asn Ile Val Thr Met Glu Glu Gln Ala780 785 790gat tta gtc tcg gat ttt tca ggg aac tca gac atg agc gct gca aca 2512Asp Leu Val Ser Asp Phe Ser Gly Asn Ser Asp Met Ser Ala Ala Thr795 800 805agt gaa caa cca gct ctc aac aag att tct cca aaa aag aga aag agt 2560Ser Glu Gln Pro Ala Leu Asn Lys Ile Ser Pro Lys Lys Arg Lys Ser810 815 820act cta aaa acc aca aat gca tat ttt tat tgg gtg acc cgg gag caa 2608Thr Leu Lys Thr Thr Asn Ala Tyr Phe Tyr Trp Val Thr Arg Glu Gln825 830 835gga tca ttt gat tgg ttc aaa ggt gtt atg aac gaa gtg gct gaa ctt 2656Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Gly Val Met Asn Glu Val Ala Glu Leu840 845 850 855gat caa agg ggg gtc atc gag atg cat aac tac tta acg agt gtt tat 2704Asp Gln Arg Gly Val Ile Glu Met His Asn Tyr Leu Thr Ser Val Tyr860 865 870gag gaa ggg gat gca cgt tca gct ctc att acc atg gtc cag gcg ctt 2752Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu Ile Thr Met Val Gln Ala Leu875 880 885aac cat gct aag aat ggg gtt gat att gta tca ggc acc agt gtg agg 2800Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp Ile Val Ser Gly Thr Ser Val Arg890 895 900aca cat ttt gcc aga ccg aat tgg agg aaa gta ttt tcc aag acc tta 2848Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp Arg Lys Val Phe Ser Lys Thr Leu905 910 915acc aag cat gca aat gca aga ata gga gtt ttc tac tgc ggt gca ccc 2896Thr Lys His Ala Asn Ala Arg Ile Gly Val Phe Tyr Cys Gly Ala Pro920 925 930 935ata tta gct aaa gaa ctc agc aaa ctc tgc aaa gag ttt aac caa aag 2944Ile Leu Ala Lys Glu Leu Ser Lys Leu Cys Lys Glu Phe Asn Gln Lys940 945 950ggc aca acg aag ttc gag ttt cac aaa gaa cat ttt tagaaggccc2990Gly Thr Thr Lys Phe Glu Phe His Lys Glu His Phe
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<221>CDS<222>(146)..(3112)<223>編碼NADPH氧化酶<400>9cgccactcgt gccgaattcg gcacgaggct ctgaaaaact tttcatacaa agccaatcta 60tttctctctc tttcttttgg tcaggcttct acagaaaact ctgttttcaa cgtatattta 120tttattgtca tttgatttgg gacag atg agg ggt tta cct ggg cat gaa cgc 172Met Arg Gly Leu Pro Gly His Glu Arg1 5cgg tgg acg tcg gat acg gtg tct tcc ggg aag gat tta agt ggt gag 220Arg Trp Thr Ser Asp Thr Val Ser Ser Gly Lys Asp Leu Ser Gly Glu10 15 20 25tca tcg ccg gga act gat tcc ggg aat att tcc ggt ttt gct tcg gag 268Ser Ser Pro Gly Thr Asp Ser Gly Asn Ile Ser Gly Phe Ala Ser Glu30 35 40gag ttt gtt gaa gtt ata ctt gat ctt cag gat gat gat acg att att 316Glu Phe Val Glu Val Ile Leu Asp Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Ile45 50 55tta cgg agc gtt gaa ccg gct act gta atc aac att gat ggt tct gat 364Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala Thr Val Ile Asn Ile Asp Gly Ser Asp60 65 70cct gct tcc gga gtc ggt att ggt gga gca tcg att gaa act ccg gcg 412Pro Ala Ser Gly Val Gly Ile Gly Gly Ala Ser Ile Glu Thr Pro Ala75 80 85tcg gtg acg tcg acg tcg gaa act cga tcg ccg atg atg cgt cgg agt 460Ser Val Thr Ser Thr Ser Glu Thr Arg Ser Pro Met Met Arg Arg Ser90 95 100 105aca tct aat aag ttt cgt cag ttt tca cag gag ttg aaa gct gag gct 508Thr Ser Asn Lys Phe Arg Gln Phe Ser Gln Glu Leu Lys Ala Glu Ala
110 115 120gtt gcg aaa gcg aag cat ttc tcg caa gag ctt aaa gcg gag cta agg 556Val Ala Lys Ala Lys His Phe Ser Gln Glu Leu Lys Ala Glu Leu Arg125 130 135aga ttc tca tgg agc cat gga cat gcg tct cgt gct ttt tcg ccg gcg 604Arg Phe Ser Trp Ser His Gly His Ala Ser Arg Ala Phe Ser Pro Ala140 145 150tcg ttt ttc caa aac gct gtc gtc gga aca ggc aac ggt gta gac tcg 652Ser Phe Phe Gln Asn Ala Val Val Gly Thr Gly Asn Gly Val Asp Ser155 160 165gct tta gcg gct cga gca tta cgt cgg cag cgt gct cag ctc gac cgg 700Ala Leu Ala Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Arg Ala Gln Leu Asp Arg170 175 180 185act cgt tcc agc gca cac aag gct ctt cgt gga ctc aaa ttc atc agc 748Thr Arg Ser Ser Ala His Lys Ala Leu Arg Gly Leu Lys Phe Ile Ser190 195 200aat aac aaa act aac gga tgg aat gaa gtt gaa aac aat ttc gct aag 796Asn Asn Lys Thr Asn Gly Trp Asn Glu Val Glu Asn Asn Phe Ala Lys205 210 215ctc gct aaa gac ggt tac ctt tat cgt tcc gat ttc gca caa tgc atc 844Leu Ala Lys Asp Gly Tyr Leu Tyr Arg Ser Asp Phe Ala Gln Cys Ile220 225 230ggt cag tac tca cgc cgg cga tca cta cag ttt aat tat aga tta att 892Gly Gln Tyr Ser Arg Arg Arg Ser Leu Gln Phe Asn Tyr Arg Leu Ile235 240 245aca tta att ttg att aat tat ttg gtt aaa ggt atg aag gat tca aag 940Thr Leu Ile Leu Ile Asn Tyr Leu Val Lys Gly Met Lys Asp Ser Lys250 255 260 265gaa ttt gcg ttg gaa ttg ttt gat gct tta agt aga aga aga aga ttg 988Glu Phe Ala Leu Glu Leu Phe Asp Ala Leu Ser Arg Arg Arg Arg Leu270 275 280aag gtt gat aag att agc caa gag gaa ttg tat gag tat tgg tct caa 1036Lys Val Asp Lys Ile Ser Gln Glu Glu Leu Tyr Glu Tyr Trp Ser Gln285 290 295atc acc gat cag agt ttc gat tct cgg ctt cag atc ttc ttc gac atg 1084Ile Thr Asp Gln Ser Phe Asp Ser Arg Leu Gln Ile Phe Phe Asp Met300 305 310gtg gac aag aat gaa gat ggt cga att ggt gaa gaa gaa gta aaa gag 1132Val Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Ile Gly Glu Glu Glu Val Lys Glu315 320 325atc atc atg cta agt gcc tct gca aac aaa tta tca aga tta aaa gaa 1180Ile Ile Met Leu Ser Ala Ser Ala Asn Lys Leu Ser Arg Leu Lys Glu330 335 340 345caa gca gag gag tat gca gct ctg atc atg gaa gaa tta gat cct gaa 1228
Gln Ala Glu Glu Tyr Ala Ala Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Glu350 355 360aga ctt ggc tac att gag cta tgg cag ctg gaa aca ctt ctc ctc caa 1276Arg Leu Gly Tyr Ile Glu Leu Trp Gln Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln365 370 375aag gac act tac ctc aac tac agt caa gca cta agc tac aca agc caa 1324Lys Asp Thr Tyr Leu Asn Tyr Ser Gln Ala Leu Ser Tyr Thr Ser Gln380 385 390gct ttg agc caa aat ctg caa ggg ttg agg aag aga agc cca ata aga 1372Ala Leu Ser Gln Asn Leu Gln Gly Leu Arg Lys Arg Ser Pro Ile Arg395 400 405aga atg agc aca aaa ctt gtc tat tca ctg caa gag aat tgg aag aga 1420Arg Met Ser Thr Lys Leu Val Tyr Ser Leu Gln Glu Asn Trp Lys Arg410 415 420 425att tgg gtt ctg gtc ttg tgg att ttg ata atg att gga ctt ttt ctt 1468Ile Trp Val Leu Val Leu Trp Ile Leu Ile Met Ile Gly Leu Phe Leu430 435 440tgg aag ttc tat cag tac aaa cag aaa agt gca ttt caa gtc atg ggt 1516Trp Lys Phe Tyr Gln Tyr Lys Gln Lys Ser Ala Phe Gln Val Met Gly445 450 455tat tgc ctt cta aca gct aag ggt gct gct gag act ctc aag ttc aac 1564Tyr Cys Leu Leu Thr Ala Lys Gly Ala Ala Glu Thr Leu Lys Phe Asn460 465 470atg gct tta ata ttg ttg cca gta tgc agg aac acc att aca ttc ctc 1612Met Ala Leu Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Thr Ile Thr Phe Leu475 480 485agg tct act aaa ttg agc tgt ttt gta ccc ttt gat gac aac ata aac 1660Arg Ser Thr Lys Leu Ser Cys Phe Val Pro Phe Asp Asp Asn Ile Asn490 495 500 505ttt cac aag act gtt gct gca gcc att gtc act ggt atc ata ctc cat 1708Phe His Lys Thr Val Ala Ala Ala Ile Val Thr Gly Ile Ile Leu His510 515 520gcc ggt aat cac ctt gta tgt gat ttc cca aag ctt ata cat gca aat 1756Ala Gly Asn His Leu Val Cys Asp Phe Pro Lys Leu Ile His Ala Asn525 530 535agt acg aat tat cag aaa tat ttg gtg aat gat ttt ggc cca agc cag 1804Ser Thr Asn Tyr Gln Lys Tyr Leu Val Asn Asp Phe Gly Pro Ser Gln540 545 550cct cag tac ata gat ctt gtt aaa gga gtg gag ggt gtg act gga ata 1852Pro Gln Tyr Ile Asp Leu Val Lys Gly Val Glu Gly Val Thr Gly Ile555 560 565gtt atg gta atc ctc atg gcc att gct ttc act ctt gca acg cga tgg 1900Val Met Val Ile Leu Met Ala Ile Ala Phe Thr Leu Ala Thr Arg Trp570 575 580 585
ttt agg cgg agc ctc att aag tta ccc aaa cct ttt gat aga ctc act 1948Phe Arg Arg Ser Leu Ile Lys Leu Pro Lys Pro Phe Asp Arg Leu Thr590 595 600ggt ttc aat gcg ttc tgg tac tcg cac cac ctt ctc atc att gtc tac 1996Gly Phe Asn Ala Phe Trp Tyr Ser His His Leu Leu Ile Ile Val Tyr605 610 615atc gta ctg atc atc cat ggc aca ttc ctc tac ctt gtg cat aac tgg 2044Ile Val Leu Ile Ile His Gly Thr Phe Leu Tyr Leu Val His Asn Trp620 625 630tac tcc aaa acg aca tgg atg tat ata gca gtt cct gta ctt ctt tac 2092Tyr Ser Lys Thr Thr Trp Met Tyr Ile Ala Val Pro Val Leu Leu Tyr635 640 645gca ggg gaa aga act ctt aga ttc ttc cga tca ggc tta tac agt gtc 2140Ala Gly Glu Arg Thr Leu Arg Phe Phe Arg Ser Gly Leu Tyr Ser Val650 655 660 665cgg ctt cta aaa gta gca ata tat cct gga aat gtc ctt act ctg caa 2188Arg Leu Leu Lys Val Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Val Leu Thr Leu Gln670 675 680atg tct aag cct ccg caa ttt cga tac aag agt gga cag tat atg ttt 2236Met Ser Lys Pro Pro Gln Phe Arg Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr Met Phe685 690 695gtc cag tgt cca gct gtt tct cca ttc gag tgg cat cca ttt tcc att 2284Val Gln Cys Pro Ala Val Ser Pro Phe Glu Trp His Pro Phe Ser Ile700 705 710act tca gct cct ggg gat gac tac ttg agc att cat atc cga caa ctt 2332Thr Ser Ala Pro Gly Asp Asp Tyr Leu Ser Ile His Ile Arg Gln Leu715 720 725ggt gac tgg act caa gaa ctc aag cga gtg ttt tcc gag gct tgc gag 2380Gly Asp Trp Thr Gln Glu Leu Lys Arg Val Phe Ser Glu Ala Cys Glu730 735 740 745cag cca gag gct gga aag agt ggc ctg ctc aga gct gac gaa aac acc 2428Gln Pro Glu Ala Gly Lys Ser Gly Leu Leu Arg Ala Asp Glu Asn Thr750 755 760aaa aca agt ttg cca aag cta tta ata gat gga cct tat gga gct cca 2476Lys Thr Ser Leu Pro Lys Leu Leu Ile Asp Gly Pro Tyr Gly Ala Pro765 770 775gca caa gat tac cgg aag tat gat gtc tta ctg ctt gtt ggt ctt ggc 2524Ala Gln Asp Tyr Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu Leu Val Gly Leu Gly780 785 790att gga gca act ccc ttt ata agt atc ctg aaa gac ttg ctc aaa aac 2572Ile Gly Ala Thr Pro Phe Ile Ser Ile Leu Lys Asp Leu Leu Lys Asn795 800 805atc gtc gca atg gag gag caa gca gat tta gtc tcg gat ttc agt gga 2620Ile Val Ala Met Glu Glu Gln Ala Asp Leu Val Ser Asp Phe Ser Gly
810 815 820 825aac tcg gac atg agt gct gca aca agt gaa caa cca gct ctc aac aag 2668Asn Ser Asp Met Ser Ala Ala Thr Ser Glu Gln Pro Ala Leu Asn Lys830 835 840att tct cca aaa aag aga aag agt act cta aaa acc aca aat gca tat 2716Ile Ser Pro Lys Lys Arg Lys Ser Thr Leu Lys Thr Thr Asn Ala Tyr845 850 855ttt tat tgg gtg acc cgg gag caa gga tca ttt gat tgg ttc aaa ggt 2764Phe Tyr Trp Val Thr Arg Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Gly860 865 870gtt atg aat gaa gtg gct gaa ctt gat caa agg ggt gtc atc gag atg 2812Val Met Asn Glu Val Ala Glu Leu Asp Gln Arg Gly Val Ile Glu Met875 880 885cat aac tac ttg acg agt gtt tat gag gaa ggg gat gca cgt tca gct 2860His Asn Tyr Leu Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala890 895 900 905ctc att acc atg gtc cag gca ctt aac cat gct aag aat ggg gtt gat 2908Leu Ile Thr Met Val Gln Ala Leu Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp910 915 920att gta tca ggc acc agt gtg agg aca cat ttc gcc agg ccg aat tgg 2956Ile Val Ser Gly Thr Ser Val Arg Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp925 930 935agg aaa gta ttt tcc aag acc tta acc aag cat gca aat gca aga ata 3004Arg Lys Val Phe Ser Lys Thr Leu Thr Lys His Ala Asn Ala Arg Ile940 945 950gga gtt ttc tac tgt ggt gca ccc ata tta gct aaa gaa ctc agc caa 3052Gly Val Phe Tyr Cys Gly Ala Pro Ile Leu Ala Lys Glu Leu Ser Gln955 960 965ctc tgc aaa gag ttt aac caa aag ggc aca aca aag ttc gag ttt cac 3100Leu Cys Lys Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Thr Lys Phe Glu Phe His970 975 980 985aaa gaa cat ttt tagaagggcc tggagtatga ttaatcttgc atcaacggta 3152Lys Glu His Phecacacatcta tcttcggtac cttatttgat tattctactg aagagataac attagtaagg 3212aataagtcag agataaattg tacataatag ggaagaagac tatttcaaga gaaaatacat 3272accaataaga tgtgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactcgt gccg 3316<210>10<211>989<212>PRT<213>番茄<400>10Met Arg Gly Leu Pro Gly His Glu Arg Arg Trp Thr Ser Asp Thr Val1 5 10 15Ser Ser Gly Lys Asp Leu Ser Gly Glu Ser Ser Pro Gly Thr Asp Ser
20 25 30Gly Asn Ile Ser Gly Phe Ala Ser Glu Glu Phe Val Glu Val Ile Leu35 40 45Asp Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Ile Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala50 55 60Thr Val Ile Asn Ile Asp Gly Ser Asp Pro Ala Ser Gly Val Gly Ile65 70 75 80Gly Gly Ala Ser Ile Glu Thr Pro Ala Ser Val Thr Ser Thr Ser Glu85 90 95Thr Arg Ser Pro Met Met Arg Arg Ser Thr Ser Asn Lys Phe Arg Gln100 105 110Phe Ser Gln Glu Leu Lys Ala Glu Ala Val Ala Lys Ala Lys His Phe115 120 125Ser Gln Glu Leu Lys Ala Glu Leu Arg Arg Phe Ser Trp Ser His Gly130 135 140His Ala Ser Arg Ala Phe Ser Pro Ala Ser Phe Phe Gln Asn Ala Val145 150 155 160Val Gly Thr Gly Asn Gly Val Asp Ser Ala Leu Ala Ala Arg Ala Leu165 170 175Arg Arg Gln Arg Ala Gln Leu Asp Arg Thr Arg Ser Ser Ala His Lys180 185 190Ala Leu Arg Gly Leu Lys Phe Ile Ser Asn Asn Lys Thr Asn Gly Trp195 200 205Asn Glu Val Glu Asn Asn Phe Ala Lys Leu Ala Lys Asp Gly Tyr Leu210 215 220Tyr Arg Ser Asp Phe Ala Gln Cys Ile Gly Gln Tyr Ser Arg Arg Arg225 230 235240Ser Leu Gln Phe Asn Tyr Arg Leu Ile Thr Leu Ile Leu Ile Asn Tyr245 250 255Leu Val Lys Gly Met Lys Asp Ser Lys Glu Phe Ala Leu Glu Leu Phe260 265 270Asp Ala Leu Ser Arg Arg Arg Arg Leu Lys Val Asp Lys Ile Ser Gln275 280 285Glu Glu Leu Tyr Glu Tyr Trp Ser Gln Ile Thr Asp Gln Ser Phe Asp290 295 300Ser Arg Leu Gln Ile Phe Phe Asp Met Val Asp Lys Asn Glu Asp Gly305 310 315 320Arg Ile Gly Glu Glu Glu Val Lys Glu Ile Ile Met Leu Ser Ala Ser325 330 335Ala Asn Lys Leu Ser Arg Leu Lys Glu Gln Ala Glu Glu Tyr Ala Ala340 345 350Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Tyr Ile Glu Leu355 360 365Trp Gln Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln Lys Asp Thr Tyr Leu Asn Tyr
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<221>CDS<222>(15)..(2846)<223>編碼NADPH氧化酶<400>11ccgactttgg atct atg aaa ccg ttc tca aag aac gat cgg cga cgg tgg 50
Met Lys Pro Phe Ser Lys Asn Asp Arg Arg Arg Trp1 5 10tca ttt gat tca gtt tcc gcc gga aaa acc gcc gtc gga agt gca tca 98Ser Phe Asp Ser Val Ser Ala Gly Lys Thr Ala Val Gly Ser Ala Ser15 20 25act tca ccg gga act gaa tac tcc att aac ggt gat caa gag ttc gtt 146Thr Ser Pro Gly Thr Glu Tyr Ser Ile Asn Gly Asp Gln Glu Phe Val30 35 40gaa gtc aca atc gat ctt caa gac gat gac aca atc gtt ctt cgt agc 194Glu Val Thr Ile Asp Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Val Leu Arg Ser45 50 55 60gtc gag cca gca acc gcc att aat gtc atc gga gat atc tcc gac gac 242Val Glu Pro Ala Thr Ala Ile Asn Val Ile Gly Asp Ile Ser Asp Asp65 70 75aac acc gga ata atg act ccg gtt tcg att tcg aga tct ccg acg atg 290Asn Thr Gly Ile Met Thr Pro Val Ser Ile Ser Arg Ser Pro Thr Met80 85 90aaa cga act tca tct aat cgg ttc cga caa ttc tca caa gag ctt aaa 338Lys Arg Thr Ser Ser Asn Arg Phe Arg Gln Phe Ser Gln Glu Leu Lys95 100 105gcc gaa gct gtg gcg aaa gcg aaa cag tta tct cag gag ttg aaa cga 386Ala Glu Ala Val Ala Lys Ala Lys Gln Leu Ser Gln Glu Leu Lys Arg110 115 120ttc tca tgg tct cgt tct ttc tca ggt aac tta acc act act agt acc 434Phe Ser Trp Ser Arg Ser Phe Ser Gly Asn Leu Thr Thr Thr Ser Thr125 130 135 140gcc gct aat caa agc ggc ggt gct ggt ggt ggt ttg gtg aac tcg gct 482Ala Ala Asn Gln Ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Leu Val Asn Ser Ala145 150 155tta gaa gcg cga gcg ttg cga aag caa cgt gct cag tta gat cgg act 530Leu Glu Ala Arg Ala Leu Arg Lys Gln Arg Ala Gln Leu Asp Arg Thr160 165 170cgg tct agt gct caa aga gct ctt cgt ggt ttg aga ttc att agc aat 578Arg Ser Ser Ala Gln Arg Ala Leu Arg Gly Leu Arg Phe Ile Ser Asn175 180 185aag caa aag aac gtt gat ggt tgg aac gat gtt caa tca aat ttc gaa 626Lys Gln Lys Asn Val Asp Gly Trp Asn Asp Val Gln Ser Asn Phe Glu190 195 200aaa ttc gaa aaa aat ggt tac atc tat cgc tcc gat ttc gct caa tgc 674Lys Phe Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Arg Ser Asp Phe Ala Gln Cys205 210 215 220ata gga atg aaa gat tcg aaa gaa ttt gca ttg gaa ctg ttc gat gca 722Ile Gly Met Lys Asp Ser Lys Glu Phe Ala Leu Glu Leu Phe Asp Ala225 230 235
ttg agt aga aga aga aga tta aaa gta gag aaa atc aat cac gat gag 770Leu Ser Arg Arg Arg Arg Leu Lys Val Glu Lys Ile Asn His Asp Glu240 245 250ctt tat gag tat tgg tca caa atc aac gac gag agt ttt gat tct cgt 818Leu Tyr Glu Tyr Trp Ser Gln Ile Asn Asp Glu Ser Phe Asp Ser Arg255 260 265ctc cag atc ttc ttc gac ata gtg gac aag aat gaa gat ggg aga att 866Leu Gln Ile Phe Phe Asp Ile Val Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Ile270 275 280aca gaa gag gaa gta aaa gag ata ata atg ttg agt gca tct gca aat 914Thr Glu Glu Glu Val Lys Glu Ile Ile Met Leu Ser Ala Ser Ala Asn285 290 295 300aag cta tca aga tta aag gaa caa gca gag gaa tat gca gct ttg att 962Lys Leu Ser Arg Leu Lys Glu Gln Ala Glu Glu Tyr Ala Ala Leu Ile305 310 315atg gaa gag tta gat cct gaa aga ctt ggc tac ata gag cta tgg caa 1010Met Glu Glu Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Tyr Ile Glu Leu Trp Gln320 325 330cta gag act ttg ctt cta caa aaa gac aca tac ctc aat tac agt caa 1058Leu Glu Thr Leu Leu Leu Gln Lys Asp Thr Tyr Leu Asn Tyr Ser Gln335 340 345gca ttg agc tat acg agc caa gca ttg agc caa aac ctt caa ggg tta 1106Ala Leu Ser Tyr Thr Ser Gln Ala Leu Ser Gln Asn Leu Gln Gly Leu350 355 360agg gga aag agt cga ata cat aga atg agt tcg gat ttc gtc tac att 1154Arg Gly Lys Ser Arg Ile His Arg Met Ser Ser Asp Phe Val Tyr Ile365 370 375 380atg caa gag aat tgg aaa agg ata tgg gtt tta tcc tta tgg atc atg 1202Met Gln Glu Asn Trp Lys Arg Ile Trp Val Leu Ser Leu Trp Ile Met385 390 395atc atg atc gga tta ttc ttg tgg aaa ttc ttc caa tac aag caa aaa 1250Ile Met Ile Gly Leu Phe Leu Trp Lys Phe Phe Gln Tyr Lys Gln Lys400 405 410gat gca ttt cat gtg atg gga tat tgt tta ctc aca gcc aaa gga gca 1298Asp Ala Phe His Val Met Gly Tyr Cys Leu Leu Thr Ala Lys Gly Ala415 420 425gct gaa aca ctt aaa ttc aac atg gct cta ata ctt ttc cca gtt tgc 1346Ala Glu Thr Leu Lys Phe Asn Met Ala Leu Ile Leu Phe Pro Val Cys430 435 440aga aac acc att act tgg ctt aga tcc aca aga ctc tct tac ttc gtt 1394Arg Asn Thr Ile Thr Trp Leu Arg Ser Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Val445 450 455 460cct ttt gat gat aat atc aac ttc cac aag aca att gct gga gcc att 1442Pro Phe Asp Asp Asn Ile Asn Phe His Lys Thr Ile Ala Gly Ala Ile
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Val Phe Ser Glu Val Cys Glu Pro Pro Val Gly Gly Lys Ser Gly Leu705 710 715ctc aga gcc gac gaa aca aca aag aaa agt ttg cca aag cta ttg ata 2210Leu Arg Ala Asp Glu Thr Thr Lys Lys Ser Leu Pro Lys Leu Leu Ile720 725 730gat gga ccg tac ggt gca cca gca caa gat tat agg aaa tat gat gtt 2258Asp Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Asp Tyr Arg Lys Tyr Asp Val735 740 745ctc tta tta gtt ggt ctt ggc att ggt gca act cca ttt atc agt atc 2306Leu Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly Ala Thr Pro Phe Ile Ser Ile750 755 760ttg aaa gat ttg ctt aac aac att gtt aaa atg gaa gag cat gcg gat 2354Leu Lys Asp Leu Leu Asn Asn Ile Val Lys Met Glu Glu His Ala Asp765 770 775 780tcg atc tcg gat ttc agt aga tca tca gaa tac agc aca gga agc aac 2402Ser Ile Ser Asp Phe Ser Arg Ser Ser Glu Tyr Ser Thr Gly Ser Asn785 790 795ggt gac acg cca aga cga aag aga ata cta aaa acc aca aat gct tat 2450Gly Asp Thr Pro Arg Arg Lys Arg Ile Leu Lys Thr Thr Asn Ala Tyr800 805810ttc tac tgg gtc aca aga gaa caa ggc tct ttt gat tgg ttc aaa ggt 2498Phe Tyr Trp Val Thr Arg Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Gly815 820 825gtc atg aac gaa gtt gca gaa ctt gac caa cgg ggt gtg ata gag atg 2546Val Met Asn Glu Val Ala Glu Leu Asp Gln Arg Gly Val Ile Glu Met830 835 840cat aac tat tta aca agt gtg tat gaa gaa ggt gat gct cgt tct gct 2594His Asn Tyr Leu Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala845 850 855 860ctc att aca atg gtt caa gct ctt aat cat gcc aaa aat ggt gtc gac 2642Leu Ile Thr Met Val Gln Ala Leu Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp865 870 875att gtc tct ggc act agg gtc aga aca cac ttt gca aga cct aat tgg 2690Ile Val Ser Gly Thr Arg Val Arg Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp880 885 890aag aag gtt ctc aca aag cta agt tcc aag cat tgc aat gca aga aca 2738Lys Lys Val Leu Thr Lys Leu Ser Ser Lys His Cys Asn Ala Arg Thr895 900 905gga gtg ttt tat tgc gga gta ccg gtt tta ggg aag gag ctt agc aaa 2786Gly Val Phe Tyr Cys Gly Val Pro Val Leu Gly Lys Glu Leu Ser Lys910 915 920cta tgc aac aca ttc aat caa aaa ggt tca acc aag ttt gaa ttt cac 2834Leu Cys Asn Thr Phe Asn Gln Lys Gly Ser Thr Lys Phe Glu Phe His925 930 935 940
aag gag cat ttc taaaagacaa gaaggaagaa gccaaaagcc ctctagattc 2886Lys Glu His Phetttaatatct caaatttagc cacttatagt ataaaggcaa tctcttcact atttaattca 2946aagtgattaa acgttaacac actgtcaaaa gtgagtgtgt taacgtttag ctccacacgt 3006tctaggttta tatacaccga ggcatacgtg taaatatacg agacagaaga aattcaaggg 3066ggtttgatag aagc 3080<210>12<211>944<212>PRT<213>擬南芥菜<400>12Met Lys Pro Phe Ser Lys Asn Asp Arg Arg Arg Trp Ser Phe Asp Ser1 5 10 15Val Ser Ala Gly Lys Thr Ala Val Gly Ser Ala Ser Thr Ser Pro Gly20 25 30Thr Glu Tyr Ser Ile Asn Gly Asp Gln Glu Phe Val Glu Val Thr Ile35 40 45Asp Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Val Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala50 55 60Thr Ala Ile Asn Val Ile Gly Asp Ile Ser Asp Asp Asn Thr Gly Ile65 70 75 80Met Thr Pro Val Ser Ile Ser Arg Ser Pro Thr Met Lys Arg Thr Ser85 90 95Ser Asn Arg Phe Arg Gln Phe Ser Gln Glu Leu Lys Ala Glu Ala Val100 105 110Ala Lys Ala Lys Gln Leu Ser Gln Glu Leu Lys Arg Phe Ser Trp Ser115 120 125Arg Ser Phe Ser Gly Asn Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Ala Asn Gln130 135 140Ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Leu Val Asn Ser Ala Leu Glu Ala Arg145 150 155 160Ala Leu Arg Lys Gln Arg Ala Gln Leu Asp Arg Thr Arg Ser Ser Ala165 170 175Gln Arg Ala Leu Arg Gly Leu Arg Phe Ile Ser Asn Lys Gln Lys Asn180 185 190Val Asp Gly Trp Asn Asp Val Gln Ser Asn Phe Glu Lys Phe Glu Lys195 200 205Asn Gly Tyr Ile Tyr Arg Ser Asp Phe Ala Gln Cys Ile Gly Met Lys210 215 220Asp Ser Lys Glu Phe Ala Leu Glu Leu Phe Asp Ala Leu Ser Arg Arg225 230 235 240Arg Arg Leu Lys Val Glu Lys Ile Asn His Asp Glu Leu Tyr Glu Tyr245 250 255Trp Ser Gln Ile Asn Asp Glu Ser Phe Asp Ser Arg Leu Gln Ile Phe
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175 180 185gat aaa ctc tcc gct gat tcc aac ggc ctc tta ctc tct gcc aag ttt 746Asp Lys Leu Ser Ala Asp Ser Asn Gly Leu Leu Leu Ser Ala Lys Phe190 195 200 205tgg gaa tgc tta gga atg aat aag gaa tct aaa gac ttc gct gac cag 794Trp Glu Cys Leu Gly Met Asn Lys Glu Ser Lys Asp Phe Ala Asp Gln210 215 220ctc ttt aga gca tta gct cgc cgg aat aac gtc tcc ggc gat gca atc 842Leu Phe Arg Ala Leu Ala Arg Arg Asn Asn Val Ser Gly Asp Ala Ile225 230 235aca aag gaa cag ctt agg ata ttc tgg gaa cag atc tca gac gaa agc 890Thr Lys Glu Gln Leu Arg Ile Phe Trp Glu Gln Ile Ser Asp Glu Ser240 245 250ttt gat gcc aaa ctc caa gtc ttt ttt gac atg gtg gac aaa gat gaa 938Phe Asp Ala Lys Leu Gln Val Phe Phe Asp Met Val Asp Lys Asp Glu255 260 265gat ggg cga gta aca gaa gaa gag gtg gct gag att att agt ctt agt 986Asp Gly Arg Val Thr Glu Glu Glu Val Ala Glu Ile Ile Ser Leu Ser270 275 280 285gct tct gca aac aag ctc tca aat att caa aag caa gcc aaa gaa tat 1034Ala Ser Ala Asn Lys Leu Ser Asn Ile Gln Lys Gln Ala Lys Glu Tyr290 295 300gcg gca ctg ata atg gaa gag ttg gac cca gac aat gct ggg ttt att 1082Ala Ala Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Asp Asn Ala Gly Phe Ile305 310 315atg atc gaa aac ttg gaa atg ttg cta tta caa gca ccg aac cag tcg 1130Met Ile Glu Asn Leu Glu Met Leu Leu Leu Gln Ala Pro Asn Gln Ser320 325 330gtg cgg atg gga gac agc agg ata ctt agt cag atg tta agt cag aag 1178Val Arg Met Gly Asp Ser Arg Ile Leu Ser Gln Met Leu Ser Gln Lys335 340 345ctt aga ccg gca aaa gag agc aac cct tta ttg aga tgg tcg gag aaa 1226Leu Arg Pro Ala Lys Glu Ser Asn Pro Leu Leu Arg Trp Ser Glu Lys350 355 360 365atc aaa tat ttc ata ctt gat aat tgg cag aga tta tgg atc atg atg 1274Ile Lys Tyr Phe Ile Leu Asp Asn Trp Gln Arg Leu Trp Ile Met Met370 375 380tta tgg ctt ggc atc tgt ggt ggc ctc ttt act tat aaa ttc att cag 1322Leu Trp Leu Gly Ile Cys Gly Gly Leu Phe Thr Tyr Lys Phe Ile Gln385 390 395tac aag aac aaa gct gcc tat ggt gtg atg ggt tat tgt gtt tgt gtc 1370Tyr Lys Asn Lys Ala Ala Tyr Gly Val Met Gly Tyr Cys Val Cys Val400 405 410gcc aaa gga ggc gcc gag act ctc aaa ttc aac atg gct ctc ata ttg 1418
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gct ctt aaa ggt ctc aag ttt att agt aag acc gac ggc ggc gct ggt 831Ala Leu Lys Gly Leu Lys Phe Ile Ser Lys Thr Asp Gly Gly Ala Gly160 165 170tgg gcc gcc gtc gag aag cgg ttc gat gag att act gct tct act act 879Trp Ala Ala Val Glu Lys Arg Phe Asp Glu Ile Thr Ala Ser Thr Thr175 180 185ggt ttg ctt cct cgt gcc aaa ttt gga gaa tgt ata ggt atg aat aag 927Gly Leu Leu Pro Arg Ala Lys Phe Gly Glu Cys Ile Gly Met Asn Lys190 195 200 205gag tct aag gaa ttt gct gtt gag cta tat gat gcg cta gct cgg agg 975Glu Ser Lys Glu Phe Ala Val Glu Leu Tyr Asp Ala Leu Ala Arg Arg210 215 220aga aac att aca act gat tcc att aac aaa gca cag ctc aaa gag ttc 1023Arg Asn Ile Thr Thr Asp Ser Ile Asn Lys Ala Gln Leu Lys Glu Phe225 230 235tgg gac caa gtg gct gac caa agt ttt gat tct cgc ctt caa aca ttt 1071Trp Asp Gln Val Ala Asp Gln Ser Phe Asp Ser Arg Leu Gln Thr Phe240 245 250ttt gac atg gtt gat aaa gat gct gat ggt aga att aca gaa gaa gaa 1119Phe Asp Met Val Asp Lys Asp Ala Asp Gly Arg Ile Thr Glu Glu Glu255 260 265gtc aga gag att ata ggc ctt agc gcg tcg gcc aac agg ctg tca aca 1167Val Arg Glu Ile Ile Gly Leu Ser Ala Ser Ala Asn Arg Leu Ser Thr270 275 280 285atc cag aaa caa gct gat gaa tac gca gca atg atc atg gaa gag ttg 1215Ile Gln Lys Gln Ala Asp Glu Tyr Ala Ala Met Ile Met Glu Glu Leu290 295 300gat cct aac aac ctc gga tac att atg att gag aac ttg gaa atg ctt 1263Asp Pro Asn Asn Leu Gly Tyr Ile Met Ile Glu Asn Leu Glu Met Leu305 310 315tta ctg caa gca cca aat caa tca gtg caa aga gga ggc gaa agt cgg 1311Leu Leu Gln Ala Pro Asn Gln Ser Val Gln Arg Gly Gly Glu Ser Arg320 325 330aac ttg agt caa atg cta agt caa aaa cta aag cat aca caa gag aga 1359Asn Leu Ser Gln Met Leu Ser Gln Lys Leu Lys His Thr Gln Glu Arg335 340 345aat cca ata gta aga tgg tac aag agt ttc atg tac ttt ttg ctg gat 1407Asn Pro Ile Val Arg Trp Tyr Lys Ser Phe Met Tyr Phe Leu Leu Asp350 355 360 365aat tgg caa aga gtt tgg gta ttg tta ctg tgg att gga att atg gct 1455Asn Trp Gln Arg Val Trp Val Leu Leu Leu Trp Ile Gly Ile Met Ala370 375 380ggt cta ttt aca tgg aaa tat ata cag tat aaa gaa aaa gct gca tat 1503Gly Leu Phe Thr Trp Lys Tyr Ile Gln Tyr Lys Glu Lys Ala Ala Tyr
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Val Leu Ala Leu His Met Ser Lys Pro Gln Gly Tyr Lys Tyr Lys Ser625 630 635ggg caa tac atg ttt gtc aac tgt gct gca gtt tct cca ttt gag tgg 2271Gly Gln Tyr Met Phe Val Asn Cys Ala Ala Val Ser Pro Phe Glu Trp640 645 650cat cca ttt tca att act tcg gcc cca gga gat gac tat ctc agt gtc 2319His Pro Phe Ser Ile Thr Ser Ala Pro Gly Asp Asp Tyr Leu Ser Val655 660 665cat att cga act ctt ggt gat tgg acc agg caa ctt aaa act gtt ttc 2367His Ile Arg Thr Leu Gly Asp Trp Thr Arg Gln Leu Lys Thr Val Phe670 675 680 685tcc gag gtt tgc cag cca cca cct aat gga aaa agt gga ctc ctc aga 2415Ser Glu Val Cys Gln Pro Pro Pro Asn Gly Lys Ser Gly Leu Leu Arg690 695 700gct gac tac ttg caa gga gag aat aat cct aat ttc cca agg gtg tta 2463Ala Asp Tyr Leu Gln Gly Glu Asn Asn Pro Asn Phe Pro Arg Val Leu705 710 715ata gat gga cca tat gga gca cca gca caa gac tac aag aaa tat gag 2511Ile Asp Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Asp Tyr Lys Lys Tyr Glu720 725 730gtg gtt ttg ttg gta ggt ctt gga att gga gct aca cca atg atc agt 2559Val Val Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly Ala Thr Pro Met Ile Ser735 740 745att gtt aaa gac att gtc aac aac atg aag gca atg gac gaa gaa gaa 2607Ile Val Lys Asp Ile Val Asn Asn Met Lys Ala Met Asp Glu Glu Glu750 755 760 765aat tcc ttg gaa gat gga cac aat aat aat atg gca cca aat tct agc 2655Asn Ser Leu Glu Asp Gly His Asn Asn Asn Met Ala Pro Asn Ser Ser770 775 780ccc aat att gca aaa aat aag ggt aat aaa tca ggt tca gca agt gga 2703Pro Asn Ile Ala Lys Asn Lys Gly Asn Lys Ser Gly Ser Ala Ser Gly785 790 795gga aat aat ttc aat aca agg aga gca tat ttc tat tgg gtt act aga 2751Gly Asn Asn Phe Asn Thr Arg Arg Ala Tyr Phe Tyr Trp Val Thr Arg800 805 810gaa caa ggt tca ttt gat tgg ttc aaa ggt ata atg aat gaa gct gct 2799Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Gly Ile Met Asn Glu Ala Ala815 820 825gaa atg gac cat aag gga gta att gaa atg cat aat tat tgt act agt 2847Glu Met Asp His Lys Gly Val Ile Glu Met His Asn Tyr Cys Thr Ser830 835 840 845gtt tat gaa gaa ggt gat gct cgt tct gct ctt att act atg ctt cag 2895Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu Ile Thr Met Leu Gln850 855 860
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740 745 750atg aac gaa gtc gcg gaa cga gat gcc aac cgc gtc atc gaa atg cat 2304Met Asn Glu Val Ala Glu Arg Asp Ala Asn Arg Val Ile Glu Met His755 760 765aac tat tgt aca agt gtc tat gaa gaa ggt gac gct cgt tcc gca ctt 2352Asn Tyr Cys Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu770 775 780ata cat atg ctt caa tca cta aac cat gca aag aac ggc gtc gac att 2400Ile His Met Leu Gln Ser Leu Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp Ile785 790 795 800gtc tct gga aca aga gtt atg tcc cat ttc gct aaa cct aat tgg aga 2448Val Ser Gly Thr Arg Val Met Ser His Phe Ala Lys Pro Asn Trp Arg805 810 815aat gtt tac aag cgt ata gct atg gat cat cct aac acc aaa gtt gga 2496Asn Val Tyr Lys Arg Ile Ala Met Asp His Pro Asn Thr Lys Val Gly820 825 830gtg ttt tac tgt gga gca cca gca ttg aca aag gag cra agg cat cta 2544Val Phe Tyr Cys Gly Ala Pro Ala Leu Thr Lys Glu Leu Arg His Leu835 840 845gct tta gat ttc acc cac aaa aca agc acc aga ttc tcc ttc cac aaa 2592Ala Leu Asp Phe Thr His Lys Thr Ser Thr Arg Phe Ser Phe His Lys850 855 860gag aat ttc taa 2604Glu Asn Phe865<210>20<211>867<212>PRT<213>擬南芥菜<400>20Met Ser Arg Val Ser Phe Glu Val Ser Gly Gly Tyr His Ser Asp Ala1 5 10 15Glu Ala Gly Asn Ser Gly Pro Met Ser Gly Gly Gln Leu Pro Pro Ile20 25 30Tyr Lys Lys Pro Gly Asn Ser Arg Phe Thr Ala Glu Asn Ser Gln Arg35 40 45Thr Arg Thr Ala Pro Tyr Val Asp Leu Thr Val Asp Val Gln Asp Asp50 55 60Thr Val Ser Val His Ser Leu Lys Met Glu Gly Gly Ser Ser Val Glu65 70 75 80Glu Ser Pro Glu Leu Thr Leu Leu Lys Arg Asn Arg Leu Glu Lys Lys85 90 95Thr Thr Val Val Lys Arg Leu Ala Ser Val Ser His Glu Leu Lys Arg100 105 110
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Ala Ile Ala Phe Thr Leu Ala Thr Pro Trp Phe Arg Arg Gly Lys Leu465 470 475 480Asn Tyr Leu Pro Gly Pro Leu Lys Lys Leu Ala Ser Phe Asn Ala Phe485 490 495Trp Tyr Thr His His Leu Phe Val Ile Val Tyr Ile Leu Leu Val Ala500 505 510His Gly Tyr Tyr Leu Tyr Leu Thr Arg Asp Trp His Asn Lys Thr Thr515 520 525Trp Met Tyr Leu Val Val Pro Val Val Leu Tyr Ala Cys Glu Arg Leu530 535 540Ile Arg Ala Phe Arg Ser Ser Ile Lys Ala Val Thr Ile Arg Lys Val545 550 555 560Ala Val Tyr Pro Gly Asn Val Leu Ala Ile His Leu Ser Arg Pro Gln565 570 575Asn Phe Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr Met Phe Val Asn Cys Ala Ala580 585 590Val Ser Pro Phe Glu Trp His Pro Phe Ser Ile Thr Ser Ala Pro Gln595 600 605Asp Asp Tyr Leu Ser Val His Ile Arg Val Leu Gly Asp Trp Thr Arg610 615 620Ala Leu Lys Gly Val Phe Ser Glu Val Cys Lys Pro Pro Pro Ala Gly625 630 635 640Val Ser Gly Leu Leu Arg Ala Asp Met Leu His Gly Ala Asn Asn Pro645 650 655Asp Phe Pro Lys Val Leu Ile Asp Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gln660 665 670Asp Tyr Lys Lys Tyr Glu Val Val Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly675 680 685Ala Thr Pro Met Ile Ser Ile Val Lys Asp Ile Val Asn Asn Ile Lys690 695 700Ala Lys Glu Gln Ala Gln Leu Asn Arg Met Glu Asn Gly Thr Ser Glu705 710 715 720Pro Gln Arg Ser Lys Lys Glu Ser Phe Arg Thr Arg Arg Ala Tyr Phe725 730 735Tyr Trp Val Thr Arg Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ile740 745 750Met Asn Glu Val Ala Glu Arg Asp Ala Asn Arg Val Ile Glu Met His755 760 765Asn Tyr Cys Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu770 775 780Ile His Met Leu Gln Ser Leu Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp Ile785 790 795 800Val Ser Gly Thr Arg Val Met Ser His Phe Ala Lys Pro Asn Trp Arg805 810 815
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130 135 140aag act gat ggt gtc act ggt tgg cct gaa gtt gag aaa cgg ttt tat 480Lys Thr Asp Gly Val Thr Gly Trp Pro Glu Val Glu Lys Arg Phe Tyr145 150 155 160gtg atg aca atg act aat aac gga tta tta cac cga tcc aga ttc ggt 528Val Met Thr Met Thr Asn Asn Gly Leu Leu His Arg Ser Arg Phe Gly165 170 175gaa tgt ata ggg atg aaa tcg acg gag ttt gcg ttg gca ttg ttc gat 576Glu Cys Ile Gly Met Lys Ser Thr Glu Phe Ala Leu Ala Leu Phe Asp180 185 190gct tta gcg agg agg gaa aac gta agc gga gat tca ata aac atg aat 624Ala Leu Ala Arg Arg Glu Asn Val Ser Gly Asp Ser Ile Asn Met Asn195 200 205gag ctt aaa gag ttc tgg aag cag atc act gat caa gat ttt gat tca 672Glu Leu Lys Glu Phe Trp Lys Gln Ile Thr Asp Gln Asp Phe Asp Ser210 215 220agg cta cga act ttc ttc gcc atg gtc gat aag gat tcg gat ggg cgg 720Arg Leu Arg Thr Phe Phe Ala Met Val Asp Lys Asp Ser Asp Gly Arg225 230 235 240ttg aat gaa gcc gaa gta aga gag att ata act tta agt gct tct gca 768Leu Asn Glu Ala Glu Val Arg Glu Ile Ile Thr Leu Ser Ala Ser Ala245 250 255aac gag ttg gat aac att cgg aga caa gct gat gaa tat gct gct ttg 816Asn Glu Leu Asp Asn Ile Arg Arg Gln Ala Asp Glu Tyr Ala Ala Leu260 265 270att atg gaa gaa ctc gat cct tat cat tat gga tac atc atg ata gag 864Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Tyr His Tyr Gly Tyr Ile Met Ile Glu275 280 285aat ctc gag ata ctt cta ttg caa gcg ccg atg cag gat gtg aga gat 912Asn Leu Glu Ile Leu Leu Leu Gln Ala Pro Met Gln Asp Val Arg Asp290 295 300gga gag agt aag aag cta agc aag atg cta agt cag aat ctc atg gtt 960Gly Glu Ser Lys Lys Leu Ser Lys Met Leu Ser Gln Asn Leu Met Val305 310 315 320ccg cag agt agg aat ctc ggg gca cgt ttt tgc aga ggg atg aag tat 1008Pro Gln Ser Arg Asn Leu Gly Ala Arg Phe Cys Arg Gly Met Lys Tyr325 330 335ttt ttg ttt gat aat tgg aag aga gtg tgg gtg atg gct cta tgg ata 1056Phe Leu Phe Asp Asn Trp Lys Arg Val Trp Val Met Ala Leu Trp Ile340 345 350ggt gct atg gcg ggt ttg ttc acg tgg aag ttt atg gag tat cga aaa 1104Gly Ala Met Ala Gly Leu Phe Thr Trp Lys Phe Met Glu Tyr Arg Lys355 360 365aga tcc gct tac gaa gtc atg gga gtt tgt gtt tgt ata gct aaa gga 1152
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835 840 845aac tgg aga agc gtt ttc aaa agg atc gct gtg aat cat cct aag act 2592Asn Trp Arg Ser Val Phe Lys Arg Ile Ala Val Asn His Pro Lys Thr850 855 860aga gtc gga gtg ttt tat tgt gga gca gct ggg tta gtg aaa gag tta 2640Arg Val Gly Val Phe Tyr Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Lys Glu Leu865 870 875 880cga cac tta tca ctg gat ttc tct cat aag acc tcc acc aag ttc atc 2688Arg His Leu Ser Leu Asp Phe Ser His Lys Thr Ser Thr Lys Phe Ile885 890 895ttc cat aaa gag aat ttc taa 2709Phe His Lys Glu Asn Phe900<210>22<211>902<212>PRT<213>擬南芥菜<400>22Met Met Asn Arg Ser Glu Met Gln Lys Leu Gly Phe Glu His Val Arg1 5 10 15Tyr Tyr Thr Glu Ser Pro Tyr Asn Arg Gly Glu Ser Ser Ala Asn Val20 25 30Ala Thr Thr Ser Asn Tyr Tyr Gly Glu Asp Glu Pro Tyr Val Glu Ile35 40 45Thr Leu Asp Ile His Asp Asp Ser Val Ser Val Tyr Gly Leu Lys Ser50 55 60Pro Asn His Arg Gly Ala Gly Ser Asn Tyr Glu Asp Gln Ser Leu Leu65 70 75 80Arg Gln Gly Arg Ser Gly Arg Ser Asn Ser Val Leu Lys Arg Leu Ala85 90 95Ser Ser Val Ser Thr Gly Ile Thr Arg Val Ala Ser Ser Val Ser Ser100 105 110Ser Ser Ala Arg Lys Pro Pro Arg Pro Gln Leu Ala Lys Leu Arg Arg115 120 125Ser Lys Ser Arg Ala Glu Leu Ala Leu Lys Gly Leu Lys Phe Ile Thr130 135 140Lys Thr Asp Gly Val Thr Gly Trp Pro Glu Val Glu Lys Arg Phe Tyr145 150 155 160Val Met Thr Met Thr Asn Asn Gly Leu Leu His Arg Ser Arg Phe Gly165 170 175Glu Cys Ile Gly Met Lys Ser Thr Glu Phe Ala Leu Ala Leu Phe Asp180 185 190Ala Leu Ala Arg Arg Glu Asn Val Ser Gly Asp Ser Ile Asn Met Asn195 200 205
Glu Leu Lys Glu Phe Trp Lys Gln Ile Thr Asp Gln Asp Phe Asp Ser210 215 220Arg Leu Arg Thr Phe Phe Ala Met Val Asp Lys Asp Ser Asp Gly Arg225 230 235 240Leu Asn Glu Ala Glu Val Arg Glu Ile Ile Thr Leu Ser Ala Ser Ala245 250 255Asn Glu Leu Asp Asn Ile Arg Arg Gln Ala Asp Glu Tyr Ala Ala Leu260 265 270Ile Met Glu Glu Leu Asp Pro Tyr His Tyr Gly Tyr Ile Met Ile Glu275 280 285Asn Leu Glu Ile Leu Leu Leu Gln Ala Pro Met Gln Asp Val Arg Asp290 295 300Gly Glu Ser Lys Lys Leu Ser Lys Met Leu Ser Gln Asn Leu Met Val305 310 315 320Pro Gln Ser Arg Asn Leu Gly Ala Arg Phe Cys Arg Gly Met Lys Tyr325 330 335Phe Leu Phe Asp Asn Trp Lys Arg Val Trp Val Met Ala Leu Trp Ile340 345 350Gly Ala Met Ala Gly Leu Phe Thr Trp Lys Phe Met Glu Tyr Arg Lys355 360 365Arg Ser Ala Tyr Glu Val Met Gly Val Cys Val Cys Ile Ala Lys Gly370 375 380Ala Ala Glu Thr Leu Lys Leu Asn Met Ala Met Ile Leu Leu Pro Val385 390 395 400Cys Arg Asn Thr Ile Thr Trp Leu Arg Thr Lys Thr Lys Leu Ser Ala405 410 415Ile Val Pro Phe Asp Asp Ser Leu Asn Phe His Lys Val Ile Ala Ile420 425 430Gly Ile Ser Val Gly Val Gly Ile His Ala Thr Ser His Leu Ala Cys435 440 445Asp Phe Pro Arg Leu Ile Ala Ala Asp Glu Asp Gln Tyr Glu Pro Met450 455 460Glu Lys Tyr Phe Gly Pro Gln Thr Lys Arg Tyr Leu Asp Phe Val Gln465 470 475 480Ser Val Glu Gly Val Thr Gly Ile Gly Met Val Val Leu Met Thr Ile485 490 495Ala Phe Thr Leu Ala Thr Thr Trp Phe Arg Arg Asn Lys Leu Asn Leu500 505 510Pro Gly Pro Leu Lys Lys Ile Thr Gly Phe Asn Ala Phe Trp Tyr Ser515 520 525His His Leu Phe Val Ile Val Tyr Ser Leu Leu Val Val His Gly Phe530 535 540Tyr Val Tyr Leu Ile Ile Glu Pro Trp Tyr Lys Lys Thr Thr Trp Met545 550 555 560
Tyr Leu Met Val Pro Val Val Leu Tyr Leu Cys Glu Arg Leu Ile Arg565 570 575Ala Phe Arg Ser Ser Val Glu Ala Val Ser Val Leu Lys Val Ala Val580 585 590Leu Pro Gly Asn Val Leu Ser Leu His Leu Ser Arg Pro Ser Asn Phe595 600 605Arg Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr Met Tyr Leu Asn Cys Ser Ala Val Ser610 615 620Thr Leu Glu Trp His Pro Phe Ser Ile Thr Ser Ala Pro Gly Asp Asp625 630 635 640Tyr Leu Ser Val His Ile Arg Val Leu Gly Asp Trp Thr Lys Gln Leu645 650 655Arg Ser Leu Phe Ser Glu Val Cys Lys Pro Arg Pro Pro Asp Glu His660 665 670Arg Leu Asn Arg Ala Asp Ser Lys His Trp Asp Tyr Ile Pro Asp Phe675 680 685Pro Arg Ile Leu Ile Asp Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Asp Tyr690 695 700Lys Lys Phe Glu Val Val Leu Leu Val Gly Leu Gly Ile Gly Ala Thr705 710 715 720Pro Met Ile Ser Ile Val Ser Asp Ile Ile Asn Asn Leu Lys Gly Val725 730 735Glu Glu Gly Ser Asn Arg Arg Gln Ser Pro Ile His Asn Met Val Thr740 745 750Pro Pro Val Ser Pro Ser Arg Lys Ser Glu Thr Phe Arg Thr Lys Arg755 760 765Ala Tyr Phe Tyr Trp Val Thr Arg Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe770 775 780Lys Asn Val Met Asp Glu Val Thr Glu Thr Asp Arg Lys Asn Val Ile785 790 795 800Glu Leu His Asn Tyr Cys Thr Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg805 810 815Ser Ala Leu Ile Thr Met Leu Gln Ser Leu Asn His Ala Lys His Gly820 825 830Val Asp Val Val Ser Gly Thr Arg Val Met Ser His Phe Ala Arg Pro835 840 845Asn Trp Arg Ser Val Phe Lys Arg Ile Ala Val Asn His Pro Lys Thr850 855 860Arg Val Gly Val Phe Tyr Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Lys Glu Leu865 870 875 880Arg His Leu Ser Leu Asp Phe Ser His Lys Thr Ser Thr Lys Phe Ile885 890 895Phe His Lys Glu Asn Phe900
<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>23garcaaggct cttttgattg 20<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>24gaaatgctcc ttatggaatt c2權(quán)利要求
1.在植物中用于產(chǎn)生或增強(qiáng)對(duì)至少一種病原體的抗性的方法，所述方法包括實(shí)施以下步驟a)降低植物或其組織、器官、部分或細(xì)胞中NADPH氧化酶的蛋白質(zhì)量、活性或功能，及b)與起始植物相反或相比較，選擇其中對(duì)至少一種病原體存在抗性或抗性增強(qiáng)的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中NADPH氧化酶由以下序列編碼a)包含如在SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中所示序列的多肽序列，或b)包含如在SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中所示序列的多肽功能等同物的多肽序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中功能等同物與如在SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22中所示多肽之一具有至少50％的同源性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中NADPH氧化酶蛋白質(zhì)量、活性或功能的降低通過(guò)應(yīng)用選自以下的方法進(jìn)行確保a)導(dǎo)入雙鏈NADPH氧化酶RNA核酸序列或確保其表達(dá)的表達(dá)盒，b)導(dǎo)入NADPH氧化酶反義核酸序列或確保其表達(dá)的表達(dá)盒，c)導(dǎo)入NADPH氧化酶反義核酸序列與核酶的組合或確保其表達(dá)的表達(dá)盒，d)導(dǎo)入用于誘導(dǎo)共抑制的NADPH氧化酶有義核酸序列或確保它們表達(dá)的表達(dá)盒，e)導(dǎo)入針對(duì)NADPH氧化酶基因、RNAs或蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合因子或蛋白質(zhì)結(jié)合因子或確保它們表達(dá)的表達(dá)盒，f)導(dǎo)入引起NADPH氧化酶RNA降解的病毒核酸序列和表達(dá)構(gòu)建體，或?qū)氪_保它們表達(dá)的表達(dá)盒，g)導(dǎo)入用于在內(nèi)源性NADPH氧化酶基因處誘導(dǎo)同源重組的構(gòu)建體，及h)導(dǎo)入突變至內(nèi)源性NADPH氧化酶基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括(i)用重組表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述重組表達(dá)盒包含與植物中有活性的啟動(dòng)子功能性連接的編碼以下的核酸序列a)雙鏈NADPH氧化酶RNA核糖核酸序列或b)NADPH氧化酶反義核酸序列或c)與核酶組合的NADPH氧化酶反義核酸序列或d)用于誘導(dǎo)共抑制的NADPH氧化酶有義核酸序列或e)針對(duì)NADPH氧化酶基因、RNA或蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合因子或蛋白質(zhì)結(jié)合因子f)引起NADPH氧化酶RNA降解的病毒核酸序列，(ii)自所述植物細(xì)胞再生植物，及(iii)表達(dá)所述核酸序列，其表達(dá)量及表達(dá)時(shí)間足以在所述植物中產(chǎn)生或增強(qiáng)病原體抗性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中病原體選自細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、病毒及線蟲(chóng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中病原體選自根腫菌門(Plasmodiophoramycota)、卵菌門(Oomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、壺菌綱(Chytridiomycetes)、接合菌綱(Zygomycetes)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)及半知菌綱(Deuteromyceten)的真菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中植物選自單子葉及雙子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中植物選自小麥、燕麥、谷子、大麥、黑麥、玉米、水稻、蕎麥、高粱、黑小麥、斯佩爾特小麥、亞麻子或甘蔗的單子葉植物。
10.用于降低NADPH氧化酶蛋白表達(dá)的雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子包含a)含有至少一個(gè)核苷酸序列的有義RNA鏈，其與編碼NADPH氧化酶的核酸序列的至少部分有義RNA轉(zhuǎn)錄物基本相同，及b)與a)的RNA有義鏈基本互補(bǔ)的反義RNA鏈。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的雙鏈RNA分子，其中雙鏈RNA的兩條RNA鏈相互共價(jià)結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的雙鏈RNA分子，其中兩條RNA鏈之一由至少部分這樣的核酸序列編碼，所述核酸序列為如SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示的編碼NADPH氧化酶序列的核酸序列或其功能等同物。
13.轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其包含與在植物生物體中有功能的啟動(dòng)子功能性連接的編碼根據(jù)權(quán)利要求10至12之一的雙鏈RNA分子的核酸序列。
14.轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其包含至少部分編碼NADPH氧化酶的如SEQ IDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示的核酸序列或其功能等同物，其中所述核酸序列以反義方向與植物生物體中有功能的啟動(dòng)子功能性連接。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其中在植物中有功能的啟動(dòng)子為病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
16.轉(zhuǎn)基因載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求13至15中任意一項(xiàng)的表達(dá)盒。
17.轉(zhuǎn)基因生物體，其包含根據(jù)權(quán)利要求10至12中任意一項(xiàng)所述的雙鏈RNA分子、根據(jù)權(quán)利要求13至15中任意一項(xiàng)所述的表達(dá)盒或根據(jù)權(quán)利要求16所述的載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)基因生物體，其選自細(xì)菌、酵母、動(dòng)物及植物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的轉(zhuǎn)基因生物體，其選自小麥、燕麥、谷子、大麥、黑麥、玉米、水稻、蕎麥、高粱、黑小麥、斯佩爾特小麥、亞麻子、甘蔗、油菜籽、蕓苔、水芹、擬南芥、卷心菜、大豆、苜蓿、豌豆、豆類、花生、馬鈴薯、煙草、番茄、茄子、辣椒、向日葵、萬(wàn)壽菊、萵苣、金盞草、瓜、南瓜/西葫蘆及胡瓜的植物。
20.來(lái)自根據(jù)權(quán)利要求18或19所述轉(zhuǎn)基因生物體的組織、器官、部分、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或繁殖材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)降低NADPH氧化酶的表達(dá)、活性或功能，在植物中產(chǎn)生或增強(qiáng)病原體抗性的方法。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1671847SQ03817728
公開(kāi)日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2003年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月22日
發(fā)明者K－H·科格爾, R·許克爾霍芬, M·特魯希略 申請(qǐng)人:巴斯福植物科學(xué)有限公司