專利名稱：參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的因子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等等，更具體地，涉及能控制核激素受體引起的轉(zhuǎn)錄的因子或肽。
背景技術：
激素，脂溶性維生素等在生物的穩(wěn)定維持、能量代謝、分化、生長等方面起著重要的作用。這些激素的受體等是存在于核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并且與染色質(zhì)DNA的特定位點結(jié)合從而控制基因的轉(zhuǎn)錄反應。在大多數(shù)情況下，當配體如激素等不與受體結(jié)合時，轉(zhuǎn)錄的發(fā)生將會受到抑制。一旦配體(如激素)與受體結(jié)合，轉(zhuǎn)錄將通過染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變而活化。據(jù)報道，從核內(nèi)受體到轉(zhuǎn)錄裝置(transcriptor)的路程中，許多稱作共活化物(co-activator)和共阻遏物(co-repressor)的因子形成復合體。配體未結(jié)合型受體與包含組蛋白脫乙酰基酶的共阻遏物結(jié)合，從而抑制基因表達。另一方面，當受體結(jié)構(gòu)經(jīng)過與配體的結(jié)合而發(fā)生變化時，共阻遏物復合體被釋放，包含組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶的共活化物復合體被募集(recruited)。比如Skip共活化物(即Ski相互作用蛋白，也稱作N-CoA62)，它直接結(jié)合于某些類型的核內(nèi)受體(比如維生素3受體，視黃酸受體，雌激素受體以及糖皮質(zhì)激素受體)以增強由這些核內(nèi)受體引起的基因表達(Baudino，T.A.，Kraichely，D.M.，Jefcoat，S.C.，Jr.，winchester，S.K.，Partridge，N.C.，and MacDonald，P.N.(1998)J.Biol Chem 273(26)，16434-41，MacDonaldo，P.N.，Baudio，T.A.，Tokumaru，H.，Dowd，D.R.，and Zhang，C.(2001)Streoids 66(3-5)，171-6)。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，盡管目前經(jīng)由核內(nèi)受體介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的概要已明確，參與該機制的因子仍有待說明。因此，本發(fā)明的目的是提供轉(zhuǎn)錄控制因子，尤其是能參與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄受體的轉(zhuǎn)錄控制的新的因子。
本發(fā)明在果蠅crn(彎曲頸(crooked neck))基因的人同系物克隆及其功能分析方面進行了研究，通過該研究發(fā)現(xiàn)，該基因的人同系物參與核內(nèi)受體介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。應注意，果蠅crn基因本身是一種在胚胎形成早期就達到最大表達水平的基因。有報道該基因的失活導致胚胎發(fā)生缺陷并主要地影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育(Zhang，K.，Smouse，D.，and Perrimon，N.(1991)GenesDev5(6)，1080-91)。crn蛋白的一個獨特特征是存在16個拷貝的縱向定向tetratricopepeiderepeat(TRP)。TRP可見于多功能蛋白，它是在進化過程中擴散的34個氨基酸的同義重復基序。有TPR蛋白參與的進程包括細胞周期控制、轉(zhuǎn)錄抑制、應激反應，蛋白激酶抑制以及蛋白運輸(Lamb，J.R.，Tugendreich，S.，and Hiter，P.(1995)Trends Biochem Sci 20(7)，257-9)。
與上述果蠅crn基因一樣，一定數(shù)目的TPR也存在于人crn基因同系物中，但拷貝數(shù)不是15。由我們克隆出的人crn基因與編碼蛋白(XAB2)的基因(Yoshimichi et al.，Journal.Biol.Chem.27534931-34937)一致，該蛋白與迄今所報道的轉(zhuǎn)錄相關性轉(zhuǎn)錄結(jié)合DNA的修復有關。但是，我們新近發(fā)現(xiàn)，來自該基因的產(chǎn)物參與轉(zhuǎn)錄抑制。尤其是，由于基因產(chǎn)物在結(jié)合HDAC(組蛋白脫乙?；?后起阻遏物的作用，其在這里被稱作“HDART”(HDAC相關阻遏物TRP)蛋白。并且，我們發(fā)現(xiàn)，HDART直接與前述作為核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄共活化物的Skip結(jié)合，從而抑制核內(nèi)受體的轉(zhuǎn)錄。此外，也證實HDART是核內(nèi)受體的轉(zhuǎn)錄輔助阻遏物之一，并且HDART與HDAC結(jié)合從而能通過HDAC的組蛋白脫乙酰作用強烈抑制轉(zhuǎn)錄。另一方面，證實獲得了顯性陰性肽，與全長HDART不同，該肽可用于活化轉(zhuǎn)錄。更具體而言，本發(fā)明建立在HDART的新發(fā)現(xiàn)的各種功能之上，并且尤其集中在下面所要陳述的內(nèi)容(1)本發(fā)明在于編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA，包括(A)編碼含有如序列2所示的氨基酸序列的蛋白的DNA，或(B)由序列1所示的堿基序列組成的DNA。
(2)本發(fā)明在于編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA，包括(A)編碼蛋白的DNA，所述蛋白具有在序列2所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多個氨基酸所得到的氨基酸序列，或(B)在嚴格條件下與由序列1所示堿基序列組成的DNA雜交的DNA。
(3)本發(fā)明在于上述(1)或(2)所述的DNA編碼的轉(zhuǎn)錄抑制因子。
(4)本發(fā)明在于上述(3)所述轉(zhuǎn)錄抑制因子并且該轉(zhuǎn)錄抑制因子能抑制核激素受體引起的轉(zhuǎn)錄。
(5)本發(fā)明在于一種由能活化轉(zhuǎn)錄的肽編碼的DNA，包括(A)編碼由序列2的第1-179位所示氨基酸序列組成的肽的DNA，或(B)由序列1的第1-537位堿基所示堿基序列組成的DNA。
(6)本發(fā)明在于編碼能活化轉(zhuǎn)錄的肽的DNA，包括(A)編碼肽的DNA，所述肽具有在序列2的第1-179位氨基酸所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多個氨基酸而得到的氨基酸序列，或(B)與序列1的第1-537位堿基序列組成的DNA雜交的DNA。
(7)本發(fā)明在于上述(5)或(6)所述的DNA編碼的轉(zhuǎn)錄活化肽。
(8)本發(fā)明在于選自上述(1)、(2)、(5)或(6)之一的DNA并具有至少15個核苷酸長度的DNA。
(9)本發(fā)明在于插入了上述(1)、(2)、(5)或(6)之一的DNA的載體。
(10)本發(fā)明在于具有上述(1)、(2)、(5)或(6)之一的DNA或上述(9)的載體的宿主細胞。
(11)本發(fā)明在于能結(jié)合(3)所述因子或(7)所述肽的抗體。
(12)本發(fā)明在于能與(1)、(2)、(5)或(6)之一的DNA雜交并且至少具有10個核苷酸長度的寡核苷酸探針。
(13)本發(fā)明在于固定了下述(A)至(D)之一者的基板(A)如上(12)所述寡核苷酸探針；(B)如上(3)或(4)所述的轉(zhuǎn)錄抑制因子或其中的部分肽；(C)如上(7)所述的轉(zhuǎn)錄活化肽或其中的部分肽；(D)如上(11)所述的抗體。
本發(fā)明的具體內(nèi)容將更加詳細的予以描述。用于說明書中的縮寫詞事先說明如下HAT(組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltranspherase)或組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetylase))；HDAC(組蛋白脫乙?；?histone deacetylase或histone deacetylizing enzyme)；DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole)；RAR(視黃酸受體)；GR(糖皮質(zhì)激素受體)；DBD(DNA結(jié)合域)；AD(活化域)；和ATRA(全反式視黃酸)。
本發(fā)明涉及一種與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關的因子。該轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子包括轉(zhuǎn)錄抑制因子和活化因子。首先，描述轉(zhuǎn)錄抑制因子。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子的例子包括HDART，其氨基酸序列如序列2所示。但是，應注意，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子并不限于序列2所示的HDART，而是當轉(zhuǎn)錄抑制活性在一定范圍內(nèi)時，所述因子包括具有在序列2所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多個氨基酸所得的氨基酸序列的蛋白，和在嚴格條件下與編碼HDART的DNA(序列1)雜交的DNA所編碼的蛋白。
HDART蛋白在人細胞核內(nèi)表達并且能從人細胞核中獲取。起始人細胞并不是關鍵，例如，明顯內(nèi)源表達HDART的293細胞。
具有氨基酸取代的與HDART相似的蛋白的制備，能用例如已知的技術比如噬菌體文庫篩選技術(Molecular Cloning 3rdEd，Chapter 2pp.2.1-2.117)，聚合酶鏈反應(PCRMolecular Cloning 3rdEd，Chapter 8，pp.8.1-8.126)技術而進行。更具體而言，該蛋白通過使用HDART編碼的DNA或者其中的部分作為探針或引物從而獲得由序列1提供的DNA和同系物，接著在該DNA的基礎上制備蛋白。如此獲得的蛋白通常與HDART以及氨基酸序列具有高度同源性。這種高度同源性意味著至少有40％或者更高的堿基序列一致性，優(yōu)選的，60％或者更高，更優(yōu)選80％或者更高，進一步優(yōu)選90％或更高，更進一步優(yōu)選95％或更高，最優(yōu)選97％或更高(即從98％到99％)。
“嚴格雜交條件”是指能由本領域技術人員適當?shù)倪x擇的那些條件。例如，所提到的雜交通過在雜交溶液中進行預雜交而實現(xiàn)，雜交溶液包括25％的甲酰胺或嚴格條件下的50％的甲酰胺，4XSSC，50mM Hepes pH7.0，10XDenhalt溶液，20μg/ml改良鮭精在42℃過夜后，將標記探針加入溶液中，在42℃過夜。用于隨后洗滌的洗滌液和溫度條件包括1XSSC，0.1％SDS和大約37℃，較嚴格的條件包括0.5XSSC，0.1％SDS和大約42℃，進一步的嚴格條件包括0.2XSSC，0.1％SDS和大約65℃。該SSC，SDS和溫度的結(jié)合僅僅作為例證而提及，本領域的技術人員可以進行適當?shù)母淖儭?br> 序列的同源性可利用BLASTn(核酸水平)或BLASTx(氨基酸水平)程序確定(Altschul et al.J.Mol.Biol.215403-420，1990)。該程序基于Karlin和Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sei.USA 872264-2268，1990，Proc.Natl.Acad.Sei.USA 905873-5877，1993)。根據(jù)BLASTN分析堿基序列時，其參數(shù)例如score＝100和wordlength＝12。另一方面，根據(jù)BLASTX分析氨基酸序列時，其參數(shù)例如score＝50和wordlength＝3。使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列時，該分析能通過Altechul等描述的方式進行(Nucleic.Acids.Res.253389-3402，1997)。當使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各自程序的默認參數(shù)。這些分析的專門程序是本領域已知的(heep//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
倘若序列2所示序列經(jīng)人工修飾，則認為該修飾通常在總氨基酸的10％以內(nèi)，優(yōu)選在總氨基酸的5％以內(nèi)，更優(yōu)選在總氨基酸的1％以內(nèi)。在能保持轉(zhuǎn)錄抑制活性的范圍內(nèi)，氨基酸序列可以被取代至超過上述指出的修飾百分比的程度。人工修飾氨基酸序列的技術能通過例如已知的方法完成，包括缺失突變體的制備，PCR法，定點誘變等。應注意，以這種方式修飾的蛋白是否具有與HDART一樣的轉(zhuǎn)錄抑制活性，能，用，下文實施例中描述的多種報告子分析方法進行確定，從而分析轉(zhuǎn)錄抑制能力。
該HDART以及與之相似蛋白具有如上所述的轉(zhuǎn)錄抑制活性，所以該功能被用來通過與所需轉(zhuǎn)錄裝置結(jié)合而抑制所需基因的轉(zhuǎn)錄。該轉(zhuǎn)錄裝置可以是體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。由于HDART的轉(zhuǎn)錄抑制能力是自主的，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子單獨使用時能抑制轉(zhuǎn)錄。但是，在這種場合，HDART沒有結(jié)合DNA的能力，應該優(yōu)先被用作與DNA結(jié)合區(qū)融合的融合蛋白。HDART具有結(jié)合HDAC的能力，因此能募集HDAC從而通過組蛋白脫乙?；富钚詮娏乙种妻D(zhuǎn)錄。在這一點，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子能通過與HDAC一同使用或通過誘導HDAC而抑制轉(zhuǎn)錄。已知HDAC具有I型(HDAC1，HDAC2，HDAC3)和II型(HDAC4，HDAC5，HDAC6，HDAC7，HDAC8)。本發(fā)明的HDART被認為與HDAC2，HDAC5，HDAC7，HDAC8等結(jié)合。因此，在本發(fā)明實踐過程中，HDAC2，HDAC5，HDAC7和HDAC8能被很方便地使用。但是，不應該僅僅限于這些HDAC的使用，屬于I型或II型的HDAC也可以使用。
由于HDART能抑制核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄，通過核內(nèi)受體起作用的轉(zhuǎn)錄裝置可以很方便地用作能借助本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子而受到抑制的轉(zhuǎn)錄裝置。適宜的核內(nèi)受體是視黃酸和糖皮質(zhì)激素受體。此外，針對激素和脂溶性維生素的核內(nèi)受體，比如retinoin X受體，維生素D受體，雄激素受體，雌激素(esterogen)受體，tiroid激素受體等，也可以包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中本發(fā)明的因子確保能抑制轉(zhuǎn)錄。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子對于治療由那些核內(nèi)受體因子的轉(zhuǎn)錄失調(diào)引起的疾病是有用的。尤其是，對于過度轉(zhuǎn)錄而引起的疾病的治療有用。特別是，如下文所述例子中，由于清楚地解釋了HDART抑制視黃酸受體的轉(zhuǎn)錄并且也抑制由視黃酸受體轉(zhuǎn)錄引起的分化，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子可以被用作針對由視黃酸受體轉(zhuǎn)錄引起的分化亢進的治療性藥物。
本發(fā)明涉及編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA。所提到的DNA，例如是由序列1所示的堿基序列組成的DNA，盡管并不限于此。此外，也可以是編碼序列2所示的氨基酸序列的DNA，編碼蛋白的DNA(所述蛋白具有其中一個或一個以上的氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加至如序列2所示的氨基酸序列的氨基酸序列)，以及在嚴格條件下與由序列1所示的堿基序列組成的DNA雜交的DNA。
上述DNA用序列1所示DNA或其部分作為探針或引物，與例如人細胞cDNA文庫進行雜交或聚合酶鏈反應(PCR)而獲得，例如，所述人細胞為在下文實施例1中的人胰島細胞?；蛘?，該DNA可以通過另一種方法從RT-PCR獲得(Molecular Cloning 3rdEd，Chapter 8，Protocol8，pp.8.46-8.53)，用其中人細胞的mRNA作模板，并且用序列1所示DNA的一部分作引物。應注意，盡管人細胞的例子如上闡述，除此之外，其制備還可以通過利用除此之外的其它哺乳動物細胞，真核細胞等進行。此外，分離DNA的雜交條件如前所述。
除了上述的克隆DNA的方法，該DNA可以用DNA合成儀分別合成序列1及其互補鏈所示的DNA，然后退火來形成。
上述DNA由轉(zhuǎn)錄抑制因子編碼，因此能作為一種制備轉(zhuǎn)錄抑制因子的工具，或者在導入細胞或個體后作為表達轉(zhuǎn)錄抑制因子的工具。當用于這一目的時，優(yōu)選將所述DNA摻入表達載體或類似載體。表達載體的類型可以根據(jù)用于制備蛋白的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)或者將被導入的細胞進行適當?shù)倪x擇。
為了利用DNA結(jié)合載體制備轉(zhuǎn)錄抑制因子，將該載體首先導入到宿主細胞中，然后對宿主細胞進行培養(yǎng)。通過這種方法在宿主細胞中產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄抑制因子。將載體引入細胞的方法可以根據(jù)所使用細胞的類型加以適當?shù)倪x擇。例如，可以使用病毒載體或者噬菌體介導的生物技術；化學技術如磷酸鈣法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法等；物理技術如基因槍法和電穿孔法等。如果需要，宿主細胞中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以在經(jīng)過純化后(如通過親和純化)加以利用。
摻入了DNA的表達載體還可以用來抑制在細胞或個體內(nèi)的所需轉(zhuǎn)錄。更具體而言，當表達載體被導入細胞或個體以表達轉(zhuǎn)錄表達因子時，所需轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)能被抑制。特別是HDART具有自主的轉(zhuǎn)錄抑制能力，從而使本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子在單獨使用時表現(xiàn)出具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。應注意HDART不具備結(jié)合到DNA上的能力，優(yōu)選將本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子作為一種融合蛋白加以表達，該融合蛋白具有一個能與所期望基因的控制區(qū)DNA相結(jié)合的DNA結(jié)合區(qū)。通過這樣做，目標基因的轉(zhuǎn)錄能被抑制。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制因子具有結(jié)合到HDAC的能力，所以當表達轉(zhuǎn)錄抑制因子時，HDAC得以募集，由此使得轉(zhuǎn)錄的抑制更加強烈。
由于本發(fā)明DNA所編碼的轉(zhuǎn)錄抑制因子具有有效地抑制核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄的能力，所以摻入了這些DNA的載體可以用來作為治療由這些核內(nèi)受體引發(fā)的不斷增加的轉(zhuǎn)錄所導致疾病的成分。用于治療目的的載體例如逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體、腺病毒載體、相關腺病毒載體、牛痘病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、alpha病毒載體、EB病毒載體、papiroma病毒載體、泡沫病毒載體等等。
本發(fā)明還涉及選自轉(zhuǎn)錄抑制因子的一種肽，它具有與上面示例所不同的活化轉(zhuǎn)錄能力。HDART以其全部長度起到轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能。相反，HDART的顯性陰性肽起到轉(zhuǎn)錄活化劑的作用。該顯性陰性肽的例子包括N末端四個TPR編碼的肽(此后簡稱為“4NTPR”)，也就是，包含序列2中從位置1到位置179的氨基酸序列的肽，但并不受限于此。還可以包括其中的一個或多個氨基酸被取代、刪除、插入和\或添加到序列2中的位置1到179的氨基酸序列中的那些肽，只要它們具有轉(zhuǎn)錄活性。
顯性陰性肽能通過以由序列1中1到537的堿基序列組成的DNA為基礎合成的肽來制備。而且，該肽以及其中1到537堿基序列之后的堿基被取代的肽能通過基于DNA而合成的肽來制備，其中DNA的密碼子通過將變異(取代、缺失、插入和/或加入)添加到氨基酸序列的1到537位的堿基序列中而改變。
上述肽具有轉(zhuǎn)錄活化活性并且用于促進所需轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄。特別如實施例所示，因為HDART的N4TPR活化了核內(nèi)受體的轉(zhuǎn)錄，它可以用來促進這些核內(nèi)受體的轉(zhuǎn)錄。核內(nèi)受體優(yōu)選例如Skip作用于其上的核內(nèi)受體如視黃酸受體、糖皮質(zhì)激素受體、維生素D受體、雌激素受體等。在本發(fā)明的肽確保轉(zhuǎn)錄活性的范圍內(nèi)，還可以包括針對激素或者脂溶性維生素的核內(nèi)受體，如retinoin X受體、雄激素受體、tiroid激素受體等。
此后文中的實施例顯示，在N4TPR作用下，視黃酸受體引起的轉(zhuǎn)錄活化活性比由ATRT引起的轉(zhuǎn)錄活化活性高。因此，惡性腫瘤如白血病的分化誘導治療目前通過依靠ATRA促進的視黃酸受體轉(zhuǎn)錄活化活性而進行。而且維生素A以及其衍生物包括ATRA已經(jīng)開始用于治療除了白血病以外的肝細胞癌(okuno，M.et al.，(2002)Front Biosci 7，204-18)，卵巢癌(Zhang D.et.al.，(2000)J，cell physiol 185(1)，1-20)，甲狀腺癌(Schmutzler C.and KohrleJ.(2000) Tyroid 10(5)，393-406)，皮膚癌(Niles R.M.(2000) Nutrition16(11-12)，1084-9)，胰腺癌(Riecken E.O.and Rosewicz S.(1999)10 suppl 4，197-200)等。本發(fā)明的肽可用來取代ATRA或者與ATRA相結(jié)合。
本發(fā)明還涉及編碼具有上述轉(zhuǎn)錄活化活性的肽的DNA。所述DNA例如編碼由序列2的1至179位氨基酸序列組成的肽的DNA，例如由序列1中的1到537位堿基所示堿基序列組成的DNA。但并不限于此，它們還可包括編碼具有在序列2中從1到179的氨基酸序列中替換、刪除、插入和\或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列的肽的DNA，還可以包括由序列1中的1到537位堿基的堿基序列組成的DNA，以及在嚴格條件下雜交的DNA，只要它們具有轉(zhuǎn)錄活化活性。
編碼轉(zhuǎn)錄活化肽的DNA能通過獲得編碼前述轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA并使例如C末端缺失而制備?？梢赃x擇的是，DNA還可以通過DNA合成儀合成。
該DNA能用于導入細胞個體后產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活化肽或者表達所述轉(zhuǎn)錄活化肽。當使用DNA產(chǎn)生肽時，它優(yōu)選摻入表達載體。在這種情況下，表達載體可以根據(jù)用于產(chǎn)生肽的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)加以適當選擇。該轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)可以在體外或體內(nèi)。對于體內(nèi)系統(tǒng)，摻入了所述DNA的表達載體被導入細胞然后對細胞進行培養(yǎng)從而在細胞內(nèi)部產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活化肽。導入細胞的步驟與此前所述相似。
被引入細胞或個體的DNA用于表達轉(zhuǎn)錄活化肽時，該DNA可以被直接導入細胞進行短時表達或者插入染色體后進行穩(wěn)定的表達，也可以在摻入表達載體之后被導入細胞中。
如上所述，轉(zhuǎn)錄活化肽可以與ATRA一樣用于惡性腫瘤的分化誘導治療，其中所述治療不直接應用轉(zhuǎn)錄活化肽，而是將該DNA注射或施用于病人以表達轉(zhuǎn)錄活化肽，并由此能被用于這樣的治療。由此，優(yōu)選使用摻入載體的DNA以將該DNA攜帶到所需組織或細胞中。用于該類型的治療的載體可以使用病毒載體，如前所示的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體等。
如上所述，編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA能通過使其N末端側(cè)的DNA變短而被修飾為編碼轉(zhuǎn)錄活化肽的DNA。此外，編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA或者編碼轉(zhuǎn)錄活化肽的DNA能以更短片段的形式用作雜交探針，PCR引物或核酶衍生物。當DNA的一部分用于這一目的時，優(yōu)選該片段具有能保留作為一個探針或類似物的足夠特異性的長度，具體地，保留15個核苷酸的長度。通過與本發(fā)明的DNA(如序列1所示的DNA或同系物)雜交，本發(fā)明提供了一種具有至少10個核苷酸長度的寡核苷酸探針。例如，包括由序列1所示的堿基序列構(gòu)成的一條DNA或者與其中的互補鏈特異雜交的DNA的多核苷酸。本文術語“特異性雜交”指在雜交過程中，沒有與編碼其它蛋白類型的DNA有明顯雜交的發(fā)生。上面提到的探針或引物能被用于克隆編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子等的DNA等。
本發(fā)明涉及一種能結(jié)合到轉(zhuǎn)錄抑制因子或者轉(zhuǎn)錄活化肽的抗體。本發(fā)明的抗體可以是能特異結(jié)合到轉(zhuǎn)錄抑制因子或者轉(zhuǎn)錄活化肽的多克隆抗體或單克隆抗體。該多克隆抗體能通過如下的方法加以制備將本發(fā)明的蛋白或者部分肽與Freund’s佐劑相混合；如果必要，根據(jù)已知的方法對非人的動物如兔、山羊、豚鼠等進行免疫；然后在確定抗體水平提高后從免疫過的動物外圍血中收集血清。另一方面，單克隆抗體可以通下如下方法加以制備根據(jù)已知的方法，利用轉(zhuǎn)錄抑制因子、轉(zhuǎn)錄活化肽或其部分肽對動物如小鼠進行免疫；從抗體水平已經(jīng)增加的免疫過的動物中移去脾臟或者淋巴結(jié)；使抗體生成細胞與組織中的mieroma細胞融合從而制備雜交瘤；其后，從培養(yǎng)物上清液中收集產(chǎn)生自雜交瘤的抗體從而獲得單克隆抗體。
這些抗體不僅可以用于轉(zhuǎn)錄抑制因子或者轉(zhuǎn)錄活性肽的親和純化，也可以用于在不同細胞中對轉(zhuǎn)錄抑制因子表達量進行免疫學分析，或者可以用于抑制轉(zhuǎn)錄抑制因子。
本發(fā)明提供了一種與其上寡核苷酸固定的基板。該基板采用生物芯片的形式，使人們能在測試生物(細胞)時，分析本發(fā)明的DNA的表達條件。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的DNA(如序列1中所示的DNA或其部分DNA片段)從測試的生物(細胞)中擴增，接下來提供使有待與DNA雜交的寡核苷酸探針固定的基板。之后，使該DNA和基板開始彼此接觸。當與固定在基板上的核酸探針雜交的DNA被檢測到時，能對本發(fā)明DNA的表達時的狀態(tài)加以分析。
這樣的方法包括，例如，DNA陣列技術，通過本領域已知的技術從測試生物(細胞)中制備DNA樣品是可行的。在一個優(yōu)選的制備DNA樣品的實施方式中，以從細胞中提取的染色體DNA為基礎進行制備是可能的。對于從染色體DNA中制備本方法的DNA樣品來說，可通過PCR，使用染色體DNA作為模板，使用比如將與本發(fā)明的DNA雜交的引物制備本發(fā)明的DNA。如果需要的話，如此制備的DNA樣品可以通過本領域已知的方法加以標記以用于檢測。
本發(fā)明中所用的術語“基板”是指一種能固定核酸的平板狀材料，通常被稱作芯片。在本發(fā)明的一個實際應用中，核苷酸包括寡核苷酸和多核苷酸。盡管本發(fā)明的基板并不是關鍵的，只要它能固定其上的核苷酸即可，優(yōu)選使用通常被用于DNA陣列技術的基板。
通常，DNA陣列包括以高密度印在基板上的幾千個核苷酸。這些DNA常常被印在非透過性基板的表層。該基板的表層通常由玻璃組成，并且可以使用透過性膜，如硝化纖維膜。
在本發(fā)明的實際應用中，一種基于寡核苷酸并且由Affymetrix Inc.開發(fā)的陣列被作為核苷酸的固定陣列方法的示例。在寡核苷酸陣列中，寡核苷酸在原位合成。例如，已知的寡核苷酸原位合成方法包括如，光蝕刻技術(photolithography)(Affymetrix Inc.)，固定化學物質(zhì)的噴墨技術(ink-jettechnique)(Rosetta Inpharmatics LLC Co.)等等。所有這些技術都可以被用來制造本發(fā)明的基板。
固定在基板上的核苷酸探針的類型并不是關鍵的，只要能檢測到用于本發(fā)明的DNA。更具體而言，該探針是例如與序列1所示的DNA進行特異雜交的探針。如果特異雜交是可能的，則該核苷酸探針相對于本發(fā)明的DNA不必是完全互補的。
在本發(fā)明的實際應用中，當核苷酸被固定時，結(jié)合到基板上的核苷酸長度一般為10到100個堿基，優(yōu)選為10到50個堿基，更優(yōu)選為15到25個堿基。
在本發(fā)明的實際應用中，使DNA樣品和基板隨后彼此接觸。根據(jù)這一方法，DNA樣品與核苷酸探針雜交。用于雜交的反應溶液和反應條件可以根據(jù)包括待固定在基板上的核苷酸長度等在內(nèi)的因素進行改變，而所述雜交按本領域技術中眾所周知的方法來進行。
接下來，根據(jù)本發(fā)明，可以檢測到在DNA樣品與固定在基板上的核苷酸探針之間的雜交的有無或者雜交的強度。例如，該檢測可以通過諸如用掃描儀等讀取熒光信號的辦法來實施。應當指出，在DNA陣列里，一般把固定在載片上的DNA稱作探針，把溶液中標記的DNA稱作目標。因此，固定在基板上的核苷酸在本說明書被作為核苷酸探針加以陳述。上述方法中如果必要的話，將如此檢測到的雜交強度與對照相比較。本方法例如DNA陣列法(Tactics of SNP Gene Variation，by Kenichi Matsubara and YosiyukiSakaki，published by Nakayama Shoten，p.128-135，Nature Genetics(1999)22164-167)等，這些方法能由本領域技術人員通過已知的有關文獻而適當?shù)丶右詫嵤?br> 本發(fā)明提供了一種基板，在其上固定了本發(fā)明的蛋白或蛋白的部分片段。當使用那些基板作為生物芯片時，檢測結(jié)合本發(fā)明的蛋白的分子成為可能，篩選HDAS抑制復合物等成為可能。
通常，固定有蛋白的基板被稱作蛋白芯片。同DNA芯片一樣，該原理是蛋白以高密度被固定在載片上或者薄膜上以用于檢測此間相互作用的蛋白或核酸。
因為與不同類型的HDAC蛋白相結(jié)合，本發(fā)明的HDART蛋白可以被用于HDAC抑制化合物的篩選。更具體而言，本發(fā)明的HDART蛋白在固相表面的固定允許不同類型的HDAC結(jié)合到一個表面。當不同類型的化合物被固定到這一固相表面并且測量HDAC活性時，HDAC抑制化合物得以篩選。
通過篩選而收集的HDAC抑制復合物的實例包括在癌癥的分化誘導治療中用作藥物的tricostatin A。
本發(fā)明固定抗體的基板能被用作生物芯片。分離和純化的高純度抗體在芯片表面的固定可以高密度化(densification)。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，在將樣品點樣到基板上之后，那些對點樣表面不顯示任何親和力的蛋白或者夾雜物通過沖洗而被溶出。隨后的檢測步驟可由本領域的技術人員根據(jù)基板類型的適當?shù)摹⒁阎奶幚矸椒ㄟM行操作是可行的，從而檢測到親和力的有無(或親和力的水平)。例如，能量吸收分子(EAM)被添加到洗凈后的基板上，烘干并且通過質(zhì)譜儀(TOF-MS)測量結(jié)合在點樣表面的蛋白的分子量范圍。
任意一種DNA的固定可以由本領域的技術人員根據(jù)已知的方法方便地加以實施。


圖1表明HDART是TPR(tetra trico pepeide repeat)蛋白，并且顯示了它的結(jié)構(gòu)和與相關基因的關系，還顯示了HDART的一級結(jié)構(gòu)，并顯示了TRP，酸性區(qū)，skip相互作用區(qū)和CRN同源區(qū)。
圖2顯示人HDART與人CTN的CRN同源區(qū)的比較。
圖3顯示HDART/CRN蛋白-蛋白的系統(tǒng)樹。該系統(tǒng)樹用GENETYX-MAC程序構(gòu)建(軟件開發(fā))。
圖4的照片顯示免疫沉淀分析所鑒定的結(jié)果，分析的是外源或內(nèi)源HDART與外源skip之間的相互作用。
(A)顯示外源HDART與外源skip之間相互作用的分析結(jié)果。條帶1是單獨的GFP-HDART，條帶4是單獨的Flag-Skip，條帶2和條帶3分別表示上述二者在293細胞中的表達，條帶5表示不含任何載體的對照。條帶1、2、4和5分別指示與抗-flag抗體發(fā)生免疫沉淀的樣品。條帶3指示與對照小鼠IgG發(fā)生免疫沉淀的樣品。上方的兩個圖分別顯示蛋白的表達，下方的兩個圖分別顯示免疫沉淀。應注意，上面的兩個圖顯示用抗-GFP抗體進行免疫印跡的結(jié)果，下面的兩個圖顯示用抗-flag抗體進行免疫印跡的結(jié)果。
(B)顯示內(nèi)源HDART與外源Skip之間相互作用的分析結(jié)果。將Flag-Skip(條帶1)或Flag-螢光素酶(條帶2)導入含有內(nèi)源HDART的293細胞，然后使細胞提取物與抗-flag抗體進行免疫沉淀。同時進行不含載體的對照實驗(條帶3)。HDART蛋白在細胞中的表達狀況(上圖)，免疫沉淀的Flag(中圖)或HDART(下圖)用圖左側(cè)顯示為“WB”的抗體進行免疫印跡法而加以鑒別。
圖5顯示Skip和HDART蛋白上相互作用區(qū)的鑒別結(jié)果。
(A)顯示Skip上HDART結(jié)合區(qū)位點的圖譜。加號(+)表示在酵母雙雜交系統(tǒng)β-半乳糖苷酶活性基礎上檢測到相互作用。加號的數(shù)量指示相互作用的相對強度。NHR結(jié)合核激素受體結(jié)合區(qū)，TA反式活化區(qū)。
(B)顯示HDART上Skip結(jié)合區(qū)的圖譜，符號定義如上。
圖6顯示HDART對核激素(視黃酸或糖皮質(zhì)激素)引起的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用。
(A)顯示了HDART對由視黃酸活化的轉(zhuǎn)錄的濃度依賴性抑制作用的結(jié)果。根據(jù)在缺乏配體的情況下導入空載體(1.0μg)時所測定的CAT活性為基準而修正的CAT活性也在圖中示出。圖中還顯示了三次重復測量的平均結(jié)果以及用于表示S.D.的誤差棒。
(B)顯示了HDART對由糖皮質(zhì)激素活化的轉(zhuǎn)錄的濃度依賴性抑制作用的結(jié)果。
圖7的照片顯示HDART在細胞中的定位。
(A)顯示了內(nèi)源HDART蛋白的定位。左側(cè)圖是用抗-HDART抗體(上圖)或免疫前血清(下圖)進行免疫熒光染色的結(jié)果，右側(cè)圖是在左側(cè)圖的相應視野中進行DAPI染色的結(jié)果。
(B)顯示了HDART在活細胞中的定位。圖中還顯示了將GFP-HDART表達載體(左上)或GFP表達載體(左下)導入Hela細胞后由GFP引起的熒光的觀察結(jié)果，以及用Hoechest 33342染料(右上)觀察細胞核的結(jié)果。
圖8顯示了HDART的自主性啟動子抑制活性。
(A)顯示，將不同量的Gal4 DBD-HDART表達質(zhì)粒(0，0.1，0.3，0.5ug)導入載有報告子(螢光素酶)質(zhì)粒的NIH3T3細胞時，啟動子抑制活性的研究結(jié)果。根據(jù)單獨導入空載體所獲得的螢光素酶活性(100％)而修正的螢光素酶值也顯示在圖中。圖中還顯示了三次重復測量的平均結(jié)果以及用于表示S.D.的誤差棒。
(B)顯示了使用U-20S細胞獲得的結(jié)果。
圖9的照片顯示HDART與HDAC之間的直接相互作用。
(A)顯示HDART與HDAC之間的相互作用。在將GFP-HDART表達載體和FLAG-HDAC表達載體(條帶1；HDAC1，條帶3；HDAC3，條帶4；HDAC4，條帶5；HDAC6)共同轉(zhuǎn)染至293細胞后，采用被抗FLAG免疫沉淀并標記的抗體(抗-Flag抗體或抗-GFP抗體)進行免疫印跡的結(jié)果也顯示在圖中(分別在中圖和下圖)。應注意，條帶2表示僅導入了GFP-HDART的樣品。上圖顯示用免疫沉淀以前的樣品確認GFP-HDART蛋白表達的結(jié)果。
(B)顯示了HDART與HDAC3直接相互作用的結(jié)果。
圖10顯示兩種類型的HDAC抑制物質(zhì)(tricostatin A，丁酸鈉)(C，D)對HDART抑制作用的阻遏。
圖11包括圖表和照片，它們顯示HDART N末端的四個TPR(N4TPR)的顯性陰性效果。
(A)顯示了N4TPR對內(nèi)源HDART，Skip和相互作用的抑制。在另一項檢測中，用Flag-skip和GFP(條帶1)或GFP-N4TRP(條帶2)轉(zhuǎn)染293細胞，使細胞提取物與抗-Flag抗體進行免疫沉淀，所得沉淀產(chǎn)物用SDS-Page進行分離，最終的結(jié)果也顯示在圖中。下方三個圖分別表示免疫沉淀的Skip(上圖)、內(nèi)源HDART(中圖)和N4TPR(下圖)。免疫沉淀之前的HDART蛋白表達見最上圖。
(B)顯示N4TPR對由視黃酸受體引起的轉(zhuǎn)錄的活化。
(C)顯示N4TPR對由糖皮質(zhì)激素受體引起的轉(zhuǎn)錄的活化。
圖12包括圖表和照片，它們顯示HDART對MM-1-19-P細胞內(nèi)由視黃酸誘導的分化進行的抑制。將HDART表達載體或空載體導入MM-1-19-P細胞，分析有或無ATRA(2μM)時對分化的誘導。為了鑒定被轉(zhuǎn)導的細胞，將GFP載體與上述的載體一起轉(zhuǎn)染。用標準顯微照相術拍攝的GFP綠色熒光照片(12A，12B，12C和12D)以及在相差顯微鏡下拍攝的照片(12E，12F)也顯示在圖中。
(A)為ATRA(-)且導入了空載體的樣品，(B)為ATRA(+)且導入了空載體的樣品，(C)為ATRA(-)且表達了HDART的載體，(D)為ATRA(+)且表達了HDART的載體，(E)是與(C)為同一區(qū)域的相差照片，(F)是與(D)為同一區(qū)域的相差照片。在(F)中，黑色箭頭指示非特異性GFP陽性細胞，白色的箭頭指示特異性GFP陽性細胞。在(G)中，圖表顯示了在GFP陽性細胞中的形態(tài)學分化細胞的百分比。四個獨立試驗的結(jié)果用平均值和S.D.(誤差棒)表示(在ATRA(+)條件下，模擬與HDART之間P＜1％，student t-檢驗)。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明用實施例進行詳細描述，但不應被解釋為本發(fā)明僅限于此。
人HDART的克隆用BLAST數(shù)據(jù)庫檢索果蠅(Drosophila)crn基因的人同系物，結(jié)果顯示源自胰島的人EST(表達序列標簽)克隆#52930與crn基因具有高度同源性?？寺?52930的完整序列按照常規(guī)方法確定。另外，根據(jù)5’-RACE法(cDNA5’末端快速擴增策略)，將該基因鑒定為由2660個堿基組成的全長cDNA，帶有一個長閱讀框。應注意，所鑒定的蛋白在結(jié)合HDAC(組蛋白脫乙?；?之后起到如下將要描述的阻遏物的作用，并因此被稱作“HDART(HDAC結(jié)合型阻遏物TPR)”蛋白。HDART是由855個氨基酸編碼的高度保守性TPR蛋白(圖1)。由DNA序列推定的人HDART蛋白明顯表明與人CRN蛋白相似。尤其是，人HDART蛋白的262-770殘基區(qū)域在HDART和CRN蛋白中高度保守(圖1、2)。對多個物種的上述蛋白的遺傳分析表明，這些蛋白構(gòu)成了一個基因家族(圖3)。
HDART與轉(zhuǎn)錄共活化物Skip的直接相互作用我們注意到HDART上存在的多個TPR區(qū)域，并分析了是否存在任何能通過這些TPs與HDART發(fā)生相互作用的蛋白。
為了分離與HDART結(jié)合的蛋白，使用了酵母雙雜交系統(tǒng)。更具體地，用酵母MATCHMAKET雙雜交分析試劑盒(Clontech)進行分離。插入HDART的ORF全長，使在pAS-1載體(Clontech)中Gal4 DNA結(jié)合區(qū)與閱讀框彼此一致。該誘餌質(zhì)粒隨同亞克隆有HeLa cDNA(Clontech)的pACT2捕獲質(zhì)粒一起被轉(zhuǎn)化至釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y190。根據(jù)試劑盒所附的操作說明對導入有兩種質(zhì)粒的克隆進行篩選。如此得到約1×107水平的克隆，從而能分離多個克隆。對這些克隆的分析顯示，有一個與Skip相一致。
哺乳動物細胞內(nèi)HDART與Skip之間的相互作用通過免疫沉淀分析確認。為了進行確認，用Effectene試劑盒(QIAGEN)將表達Flag-Skip融合蛋白的Flag-Skip表達載體與表達GFP-HDART融合蛋白的GFP-HDART表達載體(圖4A)轉(zhuǎn)染到HEK293細胞。應注意，對照實驗是將Flag-Skip表達載體和GFP-HDART表達載體在相同條件下分別轉(zhuǎn)染到相同類型的細胞中。
轉(zhuǎn)染24小時后，將細胞置于含有10μl蛋白酶抑制物質(zhì)混合物(Sigma#p8340)的100μl Nonidet P-40緩沖液(50mM tris HCL(pH7.6)，150mM NaCl，5mM EDTA，0.5％Nonidet P-40，1mM PMSF)中，在冰上靜置30分鐘，進行細胞溶解，以便制備細胞提取物(1mg)。將該提取物與40μl蛋白A/GSepharose一起于4℃保溫30分鐘以達到初步澄清。再將上述澄清的上清液提取物與抗-Flag抗體或陰性對照小鼠IgG抗體(2μg)一起保溫1小時，然后用40μl蛋白A/G Sepharose珠沉淀30分鐘。所得免疫沉淀物用Nonidet P-40緩沖液洗4次。結(jié)合的蛋白在SDS-加載緩沖液中從A/G Sepharose珠上解離，洗脫物通過SDS-PAGE展開。之后，轉(zhuǎn)移到膜上，接下來用常規(guī)方法對膜進行免疫印跡。用抗-FLAG抗體M2(Sigma)和抗-GFP單克隆抗體錐(cone)1E4(MBL)作為免疫印跡抗體。
免疫沉淀分析的結(jié)果顯示于圖4A中。在該圖中，上方兩個圖顯示各自蛋白的表達結(jié)果，下方兩個圖顯示免疫沉淀的結(jié)果。如圖4A所示，只有當上述兩種符合蛋白都被表達時，GFP-HDART蛋白才能與Flag-Skip融合蛋白一起借助抗-Flag抗體產(chǎn)生免疫沉淀反應(條帶2)。在沒有FLAG-skip表達的情況下，未觀察到GFP-HDART被抗-FLAG抗體沉淀(條帶1)，同樣的，在使用陰性對照抗體的情況下，也未觀察到沉淀(條帶3)。這些結(jié)果提示HDART和Skip在體內(nèi)特異地相互作用。
進一步，對內(nèi)源HDART與外源導入的Skip之間的相互作用進行分析。用Flag-skip表達載體或者Flag-螢光素酶表達載體轉(zhuǎn)染293細胞(既高表達HDART的細胞)，24小時后用上述同樣的方法制備細胞提取物。將該細胞提取物與抗-Flag抗體一起溫育，進行免疫沉淀。將免疫沉淀前的免疫復合物或細胞提取物用SDS-PAGE展開，然后轉(zhuǎn)移到膜上。同一膜用抗-HDART抗體或抗-Flag抗體進行免疫印跡。結(jié)果顯示于圖4B。應注意，在圖4B中，上圖顯示細胞提取物用抗-HDART抗體進行免疫印跡的結(jié)果，中圖顯示用抗-Flag抗體進行免疫沉淀后，用抗-Flag抗體進行免疫印跡的結(jié)果，下圖顯示用抗-Flag抗體進行免疫沉淀后，用抗-HDART抗體進行免疫印跡的結(jié)果。
如圖4B所示，HDART只有在表達Flag-Skip的條件下才能借助抗-Flag抗體共沉淀(圖4B，條帶1)，而在有Flag-Luc蛋白表達(條帶2)以及無任何轉(zhuǎn)染的親本293克隆(條帶3)的條件下，沒有觀察到共沉淀。
HDART與Skip的結(jié)合區(qū)為了定為Skip上參與與HDART的相互作用的區(qū)域，檢測了Skip不同區(qū)域(N末端區(qū)(密碼子1-220)，核激素結(jié)合區(qū)(NHR結(jié)合，密碼子221-388)以及反式活化區(qū)(TA，密碼子438-536))中的一系列缺失突變。使用實施例2提到的Gal4DBD-HDART，按照酵母雙雜交分析法，對HDART和突變的Skip之間的相互作用進行了分析。分析結(jié)果顯示于圖5A中。圖5A右側(cè)顯示的符號“+”表示，通過β-半乳糖苷酶活性的filter lift分析觀察到的相互作用，“+”號的數(shù)量表明相互作用的相對強度。符號“-”表示沒有檢測到相互作用。
如圖5A中所示，我們發(fā)現(xiàn)兩個不同的區(qū)域參與了與HDART的相互作用。者兩個區(qū)域一個在97-119殘基內(nèi)，另一個在220-437殘基內(nèi)。另外還顯示，Skip的反式活化區(qū)很少參與與HDART的結(jié)合活性。用類似的方法分析HDART上參與與Skip的相互作用的區(qū)域。更具體地，制備Gal4DBD-HDART的各種等位基因缺失突變，通過與Gal4DBD-Skip的相互作用分析半乳糖激酶。分析結(jié)果見圖5B，它們證實包括四個TPRs(1-179殘基)在內(nèi)的N-末端區(qū)確保了與Skip最大程度的相互作用(圖5B)。因此，HDART能通過N-末端的四TPR區(qū)直接與Skip發(fā)生相互作用。
HDART對核內(nèi)受體隨引起的基因轉(zhuǎn)錄的抑制由于上述實施例顯示HDART能與Skip相互作用，分析了HDART對核內(nèi)受體引起的轉(zhuǎn)錄途徑的作用。首先，分析了HDART對由視黃酸受體進行的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。為此目的，用RAR(視黃酸受體)進行CAT分析，在該受體中，摻入胸苷激酶最小啟動子(pTREpal-tata)，且其中視黃醛衍生物反應元件下游使用的是CAT基因。
更具體地，用Effectene試劑盒(QIAGEN)將RAR報告質(zhì)粒和能穩(wěn)定表達HDART的pcDNA3-HDART同時轉(zhuǎn)染至HepG2細胞。應注意，pcDNA3-HDART表達載體的導入量為0，0.5和1.0μg，并且每次轉(zhuǎn)染中的DNA量在pcDNA空載體控制下均為相同的1μg。轉(zhuǎn)染之后，在有或無ARTA(10-8M)的情況下進行培養(yǎng)以檢測當時的CAT活性。根據(jù)無ATRA時導入1.0μg空載體所獲得的CAT活性，修正測量值，結(jié)果見圖6。圖中還顯示了三次實驗結(jié)果的平均值以及根據(jù)誤差棒表示的標準偏差。
如圖6A所示，細胞中導入空載體后，在ATRA的作用下，CAT的活性是未導入時的5倍。然而，對這種ARTA誘導的CAT活性的抑制取決于HDART的濃度。
進一步，HDART對糖皮質(zhì)激素受體(GR)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用通過使用GR陽性Hela細胞內(nèi)的GR報告質(zhì)粒而加以分析。除了使用Hela細胞以及10-8M地塞米松外，按照與視黃酸受體實驗相同的方式進行糖皮質(zhì)激素應答性啟動子的轉(zhuǎn)錄活性的測試。測試的結(jié)果以與上面相同方式顯示。
HDART的共同表達受到抑制，且抑制程度與RAR(視黃酸受體)誘導的反式活化的觀察結(jié)果相似，因此與糖皮質(zhì)激素相關的報告基因的活化也受到抑制(圖6B)。這些結(jié)果顯示HDART選擇性抑制由核內(nèi)受體活化的轉(zhuǎn)錄。
HDART在細胞核中的定位由于HDART顯示出直接參與了轉(zhuǎn)錄控制，因此假定HDART定位在細胞核。在此基礎上，制備出針對HDART重組蛋白的多克隆抗體，通過免疫熒光實驗分析HDART在細胞內(nèi)的定位。
在大腸桿菌(Escherichia coli)中制備His-HDART(氨基酸殘基296-431)融合蛋白形式的多克隆抗體，用對His具有親和力的Ni-NTA樹脂(QIAGEN)純化。接下來，用His-HDART蛋白免疫兔子，產(chǎn)生的抗-HDART抗血清用ProtOn試劑盒1(MPS)通過親和層析純化。如此純化的兔抗-HDART抗體與含有內(nèi)源HDART的Hela細胞一起保溫，再與PE(藻紅蛋白)融合的兔抗體一起保溫，進行免疫熒光染色。需要注意的是，對照實驗是在免疫前使用兔血清取代兔抗HDART抗體并重復類似的步驟。另外，為了明確在核中的位置，還進行了DAPI染色。
如圖7A所示，使用抗-HDART抗體進行免疫熒光染色的圖像與用DAPI染色的圖像一致。另一方面，免疫前的血清中核未被染色。從這些結(jié)果可以看出，HDART主要定位在Hela細胞的核內(nèi)(圖7)。
分析了HADRT在活細胞中的定位。用GFP或GFP-HDART表達載體轉(zhuǎn)染Hela細胞。24小時后，檢測GFP熒光。GFP-HDART細胞用Hoechest 33342染料進行保溫，從而使核可見。
如圖7B中所示，在被GFP-HDART載體轉(zhuǎn)染的細胞中，用Hoechest 33342染料(右上圖)觀察到核發(fā)出GFP熒光(左上圖)。尤其是，GFP-HDART顯示出與迄今報導的Skip分子的核斑點圖案部分相似的圖案。在HT1080細胞和293細胞中也觀察到相似的結(jié)果(未顯示)。
HDART引起的自主抑制功能假定HDART參與了更加直接的抑制作用，預計它有自主抑制功能。為了確認上述預計，將能使HDART與DNA相結(jié)合的全長HDART cDNA與到Gal4 DNA結(jié)合區(qū)(GAL4DBD一個僅具有與GAL4 DNA相結(jié)合的區(qū)、不具有轉(zhuǎn)錄控制區(qū)的區(qū)域)融合，分析在NIH3T3細胞內(nèi)由GAL4A啟動子引起的轉(zhuǎn)錄過程是否可以控制。
更具體地，將能表達HDART全長蛋白與Gal4 DBD的融合蛋白的Gal4DBD-HDART質(zhì)粒以不同的量(0，0.1，0.3和0.5ug)轉(zhuǎn)染至事先已導入了Gal4報告質(zhì)粒(pGal4-螢光素酶)的NIH3T3細胞。應注意，為了使轉(zhuǎn)染所用的DNA的總量相一致，在每次轉(zhuǎn)染時用Gal4 DBD空載體將表達載體的量控制在0.5μg。轉(zhuǎn)染24小時以后，分析由啟動子引起的報告基因的表達活性(螢光素酶活性)。每份試樣的螢光素酶活性表示為，根據(jù)單獨導入空載體所獲得的螢光素酶活性參考值(％)而修正的值(圖8)。應注意，分析的結(jié)果表示為三次實驗結(jié)果的平均值，標準偏差以誤差棒表示(圖8A)。用另一種細胞U-20S以及Gal4 DBD-HDART(0或0.5μg)進行類似的分析(圖8B)。
HDART以濃度依賴方式明顯抑制NIH-3T3細胞內(nèi)的啟動子活性，在最高濃度(0.5ug)使螢光素酶表達降低了80％(圖8A)。使用U-20S細胞(圖8B)觀測到相似的結(jié)果。這些結(jié)果顯示，HDART自身具有自主轉(zhuǎn)錄抑制作用。
對于不具有GAL4 DNA結(jié)合區(qū)的HDART，沒有觀察到螢光素酶的表達抑制(未顯示)?？梢?，HDART不具備啟動子區(qū)與DNA結(jié)合的活性。
歸因于HDART的抑制機制有報道認為，通過實現(xiàn)這一機制，快速轉(zhuǎn)錄通過一種有HDAC(組蛋白脫乙?；?抑制作用參與的機制而受HAT(組蛋白乙酰基酶)活化以及核心組蛋白乙?；某潭鹊恼{(diào)控。為了說明由HDART引起的遺傳抑制機制，根據(jù)用Flag-HDAC表達載體所進行的免疫沉淀分析，檢測HDART的這種作用是否通過與HDAC形成復合體來表現(xiàn)。
能表達不同類型HDAC(1，3，4，或6)的Flag-HDAC表達載體和GFP-HDART表達載體以與實施例2相應的方式分別與293細胞共轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24小時后提供細胞提取物。各自的細胞提取物與抗-Flag抗體一起保溫，接下來進行免疫沉淀反應。所得免疫沉淀物用SDS-PAGE分離，將分離模式轉(zhuǎn)移到膜上，用抗-Flag抗體或抗-GFP抗體進行免疫印跡。作為參考，為了確認GFP-HDART蛋白在各自細胞中的表達，免疫沉淀反應前的各個樣品用SDS-PAGE進行同樣的展開，用抗-GFP抗體進行免疫印跡。應注意，圖9A中，上圖顯示免疫沉淀反應前的GFP-HDART蛋白的表達結(jié)果，中圖顯示物免疫沉淀用抗-Flag抗體進行免疫印跡的結(jié)果，下圖顯示免疫沉淀物用抗-GFP抗體進行免疫印跡的結(jié)果。圖左側(cè)如下顯示HDAC的類型條帶1；HDAC1，條帶3；HDAC3，條帶4；HDAC4，條帶5；HDAC6。應注意，條帶2是僅僅由GFP-HDAR表達的樣品。
如圖9A所示，在用Flag-HDAC表達載體和GFP-HDART表達載體共轉(zhuǎn)染的293細胞的提取物中，確認GFP-HDART與抗-Flag抗體發(fā)生免疫沉淀(下圖左起，條帶1，3，4，5)。但是，當加入抗-Flag抗體時(下圖，條帶2)，在缺少Flag-HDAC(未導入Flag-HDAC表達載體的細胞系)的條件下沒有觀察到GFP-HDART沉淀。因此，證實GFP-HDART與抗-Flag抗體的沉淀依賴于Flag-HDAC與GFP-DART之間特異性的相互作用。而且，還表明HDART與包括I型(HDAC 1和3)和II型(HDAC 4和6)在內(nèi)的兩種類型HDAC都發(fā)生相互作用。
進一步，通過GST pulldown分析檢測HDART與HDAC3之間的直接相互作用。GST pulldown分析基本上按照已知方法進行(Tzamarias，D.，andStruhl，K.(1995)Gene Dev 9(7)，821-31.)。使用TNT(注冊商標)體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)(Promega)，在35S-蛋氨酸存在的條件下進行HDAC3的體外翻譯。GST蛋白或者GST-HDART融合蛋白分別在大腸桿菌中表達，接下來，在GST結(jié)合緩沖溶液(50mM tris-Hcl，200mM Licl，0.5％ NP40，5mM EDTA，1mMPMSF)中利用glutachion Sepharose進行純化。制備1ml GST結(jié)合緩沖溶液，其中有包含GST-HDART融合蛋白或?qū)φ誈ST蛋白(大約1μg)的結(jié)合反應溶液和1ml35S-放射標記的體外翻譯產(chǎn)物(10μl)。將該反應溶液4℃振蕩保溫1小時，然后將所得Sepharose-GST蛋白復合物用GST結(jié)合緩沖溶液洗5次。與GST蛋白結(jié)合的蛋白通過在含有十二烷基硫酸鈉(SDS)的樣品緩沖液中煮沸而解離，接下來用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。通過考馬斯亮蘭(Coomassie brilliant blue)染色證實，GST融合蛋白進行同等地泳動，通過放射自顯影檢測到35S-放射標記的HDAC。
如圖9B所示，體外翻譯的HDAC3并不與純GST結(jié)合且不能被洗脫下來(pull down)，但在使用GST-HDART融合蛋白時被洗脫下來(圖9B)。從HDAC1可獲得同樣結(jié)果，但未在附圖中顯示。由此可見，HDART和HDAC之間的相互作用事實上是直接的。
為了分析HDART轉(zhuǎn)錄抑制作用對HADC脫乙酰化的影響，在有特異性抑制HDAC的tricostatin A(TSA)存在的條件下，采用與實施例4同樣的方式進行CAT報告子分析(圖10C和D)。但是，在該實施例中，一定量的pcDNA3-HDART表達載體(1μg)(圖10中“HDART+”)和100nM TSA或1mA丁酸鈉與配體(ATRA或地塞米松)一起添加。
如圖10C和D所示，與單獨的配體對應的啟動子所導致報告基因的表達增加了，其中當HDART表達時，表達活性受到抑制。當進一步加入triconstatin A時，HDART引起的表達抑制被完全抵消。當加入另一種類型組蛋白脫乙?；敢种埔蜃雍投∷徕c(Buty)時觀察到了相同的結(jié)果。這些結(jié)果說明，HDART的轉(zhuǎn)錄抑制作用通過脫乙?；富钚詠肀憩F(xiàn)。
HDART-Skip相互作用對配體未結(jié)合型受體的主動抑制在體內(nèi)(Baniahmad，A.，Kohne，A.C.，and Renkawitz，R.(1992)Embo J11(3)，1015-23)和體外(Fondell，J.D.，Roy，A.L.，and Roeder，R.G.(1993)GenesDev 7(7B)，1400-10)缺少配體的情況下，RAR和TR抑制基因活性。因此這被稱作主動抑制。Skip在不依賴于配體的情況下與NHR相互作用(MacDonald，P.N.，Baudino，T.A.，Toumaru，H.Dowd，D.R.，and zhang，C.(2001)Steroids 66(3-5)，171-6)。這些抑制效果與Skip生理學的關系提示，配體未結(jié)合型受體表面可能存在HDART-Skip復合體或者所述相互作用可能參與受體的主動抑制。為了澄清這些可能性，使HDART顯性陰性株過度表達，以此檢測RAR對轉(zhuǎn)錄的影響。如實施例2所示，HDART N末端的四個TRP(N4TRP)屬于Skip結(jié)合區(qū)，從而可以預計，當這一區(qū)域的表達抑制內(nèi)源HDART與Skip之間的相互作用時，HDART作為顯性陰性肽的固有功能被抑制。為此，本實施例中用N4TPR作為顯性陰性肽的候選者。
Flag-Skip與帶有GFP標記的N4TPR，或與GFP一起被轉(zhuǎn)染至293細胞。轉(zhuǎn)染24小時后，制備細胞提取物，用抗-Flag抗體進行免疫沉淀反應。所得免疫沉淀產(chǎn)物通過SDS-PAGE分離。為了確認免疫沉淀反應前的內(nèi)源HDART的表達，將免疫沉淀反應前的細胞提取物同樣用SDS-PAGE分離。分離后的圖案拷貝到膜上。用抗-Flag抗體檢測Flag-Skip的表達，用抗-GFP抗體檢測GFP和GFP-N4TPR的表達，用抗-HDART抗體檢測內(nèi)源HDART的表達(圖11A)。應注意，在圖11A中，下面的三個圖分別顯示沉淀的Skip(下面三個圖中最上圖)，內(nèi)源HDART(下面三個圖中的中間圖)，和N4TPR(下面三個圖中的最下圖)，上面的一個圖顯示了免疫沉淀反應前的內(nèi)源HDART的表達。
如圖11A所示，N4TPR的表達導致HDART與Skip共沉淀的量相比于N4TPR未表達的對照(僅GFP，條帶1)來講更加減少(下部中圖，條帶2)。另一方面，N4TPR的過表達使得N4TPR和Skip之間的相互作用增加，并且共沉淀的Skip的量明顯增加(條帶2，下面的底部條板)。對照蛋白(GFP)的表達沒有表現(xiàn)出對HDAR和Skip之間的相互作用(條帶1)產(chǎn)生影響。這些結(jié)果顯示，N4TPR起到代替HDART而與Skip相互作用的顯性陰性蛋白的作用。
其次，檢測了N4TRP的過表達對于RAR或糖皮質(zhì)激素應答性啟動子所導致的轉(zhuǎn)錄的影響。應注意，該檢測采用實施例4中報告子分析所用的相同方法進行，但使用了GFP-N4TPR表達載體(0，0.3和0.5μg)。
該結(jié)果如圖11B，C所示，其中與在缺乏配體時限制N4TPR的情況下(導入量0.3μg)相比，由RAR或糖皮質(zhì)激素應答性啟動子誘導的轉(zhuǎn)錄活性增強，達到了在有配體存在時允許表達的情況下所誘導的轉(zhuǎn)錄活性(灰柱)的程度。在N4TPR的最高表達水平(導入量0.5μg)，缺乏配體時的轉(zhuǎn)錄活性被顯著增強(達到約20倍)。這些結(jié)果提示，HDART是主動抑制RAR和糖皮質(zhì)激素受體等核激素受體所必需的。
通過HDART的過表達來抑制視黃酸誘導橫紋肌肉瘤細胞系分化為肌肉組織已知ATRA(全反式視黃酸)是腫瘤細胞分化的重要誘導劑(20-22)。人橫紋肌肉瘤細胞系MM-1-19-P主要由多角形細胞組成，并最終由視黃酸誘導分化為肌管狀巨細胞。為了明確HDART在歸因于核激素受體的反應中的生理學作用，分析了HDART表達對ATRA所致MM-1-19-P分化的影響。
將MM-1-19-P細胞置于100mM Petri培養(yǎng)皿中，用0.4μg pGFP載體和2μg pcDNA3(空載體)或pcDNA3-HDART(HDART表達載體)共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時后，將培養(yǎng)基替換為含有ATRA(2μM)或不含ATRA的新鮮培養(yǎng)基。誘導24小時后，在細胞變?yōu)榫哂屑」軤罹藜毎硇偷募氶L紡錘形細胞時，評價該細胞已有形態(tài)學分化。所有試驗重復4次，GFP陽性用所評價的細胞數(shù)確定。該結(jié)果見圖12。應注意，在圖12中，GFP綠色熒光的標準顯微照片見圖12A、12B、12C和12D，相差顯微照片見圖12E和12F。圖12A顯示未經(jīng)ATRA處理但導入了空載體的細胞，12B顯示經(jīng)過ATRA處理且導入了空載體的細胞，12C顯示未經(jīng)ATRA處理但導入了HDART表達載體的細胞，12D顯示經(jīng)過ATRA處理且導入了HDART表達載體的細胞，12E顯示與12C同樣條件下的細胞，12F顯示與12D同樣條件下細胞。此外，圖12F中的黑色箭頭顯示未分化的GFP陽性細胞，白色箭頭顯示分化的細胞。圖12G的圖表顯示GFP陽性細胞中形態(tài)分化細胞的百分比，其表示為四個獨立試驗的平均值，標準偏差用誤差棒表示(在空載體和ATRA(+)和HDART表達載體之間P＜1％，Student t檢驗)。
在各個實驗中，GFP陽性細胞數(shù)為30-70。在導入了空載體并經(jīng)ATRA處理的細胞中，由于ATRA所誘導的細胞毒性，GFP陽性細胞數(shù)不到30％。在導入了HDART表達載體的細胞中，ATRA處理組和非處理組的GFP陽性細胞數(shù)是相同的。
大多數(shù)導入了空載體的細胞分化為具有肌管狀巨細胞表型的肌肉組織(圖12B，12G)。在導入了空載體的細胞中，ATRA處理引起表型變化的程度對于陽性和陰性細胞是等同的。但是，在導入了HDART的細胞中，當GFP陽性細胞受到ATRA處理時，表型變化很少(圖12D，12G中的黑色箭頭)。另一方面，在GFP陰性細胞中，可觀察到特征性肌管狀巨細胞(圖12F中的白色箭頭)。這些結(jié)果表明，HDART的表達可抑制視黃酸誘導的分化。所述結(jié)果與報告子分析中HDART抑制RAR轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)果一致。這些結(jié)果揭示，HDART至少作為視黃酸受體生理性轉(zhuǎn)錄的共阻遏物而起作用。
工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄阻遏物可以自主抑制轉(zhuǎn)錄，特別是核內(nèi)受體的轉(zhuǎn)錄，并因此作用于所需轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，和用于抑制轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄。并且，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄阻遏物具有HDAC結(jié)合能力，可通過HDAC的組蛋白脫乙?；钚詠戆l(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制能力。因此，用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄阻遏物可以募集HDAC，從而借助HDAC作用來抑制轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明轉(zhuǎn)錄阻遏物的這一作用可適用于例如因核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄增加而導致的疾病。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄阻遏物可作為用于治療這些疾病的藥物。
轉(zhuǎn)錄阻遏物的顯性陰性肽可作為轉(zhuǎn)錄活性因子起作用。因此，顯性陰性肽能用于促進轉(zhuǎn)錄。該顯性陰性肽也可作用于核內(nèi)受體的轉(zhuǎn)錄和反向促進轉(zhuǎn)錄。因此，該肽可作為核內(nèi)受體的轉(zhuǎn)錄促進物質(zhì)。尤其是，在HDARTN末端的4個TRR(N4TPR)具有比ATRA更高的視黃酸受體轉(zhuǎn)錄活性，因此，本發(fā)明的肽適于在目前采用ATRA進行的疾病治療中(例如在惡性腫瘤的分化誘導治療中)代替ATRA或與ATRA一起作為治療藥物。
序列表<110>水谷修紀(MIZUTANI，Shuki)山田孝之(YAMADA，Takayuki)<120>參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的因子<130>SEN-A0122P<140>
<141>
<150>JP 2002-217233<151>2002-07-25<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2684<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS
<222>(37)..(2601)<400>1agcgcgcgac tctcctgtac ctgggcatcc agaaaa atg gtg gtg atg gcg cga54Met Val Val Met Ala Arg1 5ctt tcg cgg ccc gag cgg ccg gac ctt gtc ttc gag gaa gag gac ctc102Leu Ser Arg Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val Phe Glu Glu Glu Asp Leu10 15 20ccc tat gag gag gaa atc atg cgg aac caa ttc tct gtc aaa tgc tgg150Pro Tyr Glu Glu Glu Ile Met Arg Asn Gln Phe Ser Val Lys Cys Trp25 30 35ctt cgc tac atc gag ttc aaa cag ggc gcc ccg aag ccc agg ctc aat198Leu Arg Tyr Ile Glu Phe Lys Gln Gly Ala Pro Lys Pro Arg Leu Asn40 45 50cag cta tac gag cgg gca ctc aag ctg ctg ccc tgc agc tac aaa ctc246Gln Leu Tyr Glu Arg Ala Leu Lys Leu Leu Pro Cys Ser Tyr Lys Leu55 60 65 70tgg tac cga tac ctg aag gcg cgt cgg gca cag gtg aag cat cgc tgt294Trp Tyr Arg Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ala Gln Val Lys His Arg Cys75 80 85
gtg acc gac cct gcc tat gaa gat gtc aac aac tgt cat gag agg gcc 342Val Thr Asp Pro Ala Tyr Glu Asp Val Asn Asn Cys His Glu Arg Ala90 95 100ttt gtg ttc atg cac aag atg cct cgt ctg tgg cta gat tac tgc cag 390Phe Val Phe Met His Lys Met Pro Arg Leu Trp Leu Asp Tyr Cys Gln105 110115ttc ctc atg gac cag ggg cgc gtc aca cac acc cgc cgc acc ttc gac 438Phe Leu Met Asp Gln Gly Arg Val Thr His Thr Arg Arg Thr Phe Asp120 125 130cgt gcc ctc cgg gca ctg ccc atc acg cag cac tct cga att tgg ccc 486Arg Ala Leu Arg Ala Leu Pro Ile Thr Gln His Ser Arg Ile Trp Pro135 140 145 150ctg tat ctg cgc ttc ctg cgc tca cac cca ctg cct gag aca gct gtg 534Leu Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Ser His Pro Leu Pro Glu Thr Ala Val155 160 165cga ggc tat cgg cgc ttc ctc aag ctg agt cct gag agt gca gag gag 582Arg Gly Tyr Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser Pro Glu Ser Ala Glu Glu170 175 180tac att gag tac ctc aag tca agt gac cgg ctg gat gag gcc gcc cag 630
Tyr Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg Leu Asp Glu Ala Ala Gln185 190 195cgc ctg gcc acc gtg gtg aac gac gag cgt ttc gtg tct aag gcc ggc678Arg Leu Ala Thr Val Val Asn Asp Glu Arg Phe Val Ser Lys Ala Gly200 205 210aag tcc aac tac cag ctg tgg cac gag ctg tgc gac ctc atc tcc cag726Lys Ser Asn Tyr Gln Leu Trp His Glu Leu Cys Asp Leu Ile Ser Gln215 220 225 230aat ccg gac aag gta cag tcc ctc aat gtg gac gcc atc atc cgc ggg774Asn Pro Asp Lys Val Gln Ser Leu Asn Val Asp Ala Ile Ile Arg Gly235 240 245ggc ctc acc cgc ttc acc gac cag ctg ggc aag ctc tgg tgt tct ctc822Gly Leu Thr Arg Phe Thr Asp Gln Leu Gly Lys Leu Trp Cys Ser Leu250 255 260gcc gac tac tac atc cgc agc ggc cat ttc gag aag gct cgg gac gtg870Ala Asp Tyr Tyr Ile Arg Ser Gly His Phe Glu Lys Ala Arg Asp Val265 270 275tac gag gag gcc atc cgg aca gtg atg acc gtg cgg gac ttc aca cag9l8Tyr Glu Glu Ala Ile Arg Thr Val Met Thr Val Arg Asp Phe Thr Gln280 285 290
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Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gln Val Asn Pro Glu Glu Ile Gln Leu Gly810 815 820gag gac gag gac gag gac gag atg gac ctg gag ccc aac gag gtt cgg2550Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu Glu Pro Asn Glu Val Arg825 830 835ctg gag cag cag agc gtg cca gcc gca gtg ttt ggg agc ctg aag gaa2598Leu Glu Gln Gln Ser Val Pro Ala Ala Val Phe Gly Ser Leu Lys Glu840 845 850gac tgacccgtcc ctcccccatc ccccctcccc accccctccc caatacagct 2651Asp855acgtttgtac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2684<210>2<211>855<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Val Val Met Ala Arg Leu Ser Arg Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val1 5 10 15
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145 150 155 160Leu Pro Glu Thr Ala Val Arg Gly Tyr Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser165 170 175Pro Glu Ser Ala Glu Glu Tyr Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg180 185 190Leu Asp Glu Ala Ala Gln Arg Leu Ala Thr Val Val Asn Asp Glu Arg195 200 205Phe Val Ser Lys Ala Gly Lys Ser Asn Tyr Gln Leu Trp His Glu Leu210 215 220Cys Asp Leu Ile Ser Gln Asn Pro Asp Lys Val Gln Ser Leu Asn Val225 230 235 240Asp Ala Ile Ile Arg Gly Gly Leu Thr Arg Phe Thr Asp Gln Leu Gly245 250 255Lys Leu Trp Cys Ser Leu Ala Asp Tyr Tyr Ile Arg Ser Gly His Phe260 265 270Glu Lys Ala Arg Asp Val Tyr Glu Glu Ala Ile Arg Thr Val Met Thr275 280 285
Val Arg Asp Phe Thr Gln Val Phe Asp Ser Tyr Ala Gln Phe Glu Glu290 295 300Ser Met Ile Ala Ala Lys Met Glu Thr Ala Ser Glu Leu Gly Arg Glu305 310 315 320Glu Glu Asp Asp Val Asp Leu Glu Leu Arg Leu Ala Arg Phe Glu Gln325 330 335Leu Ile Ser Arg Arg Pro Leu Leu Leu Asn Ser Val Leu Leu Arg Gln340 345 350Asn Pro His His Val His Glu Trp His Lys Arg Val Ala Leu His Gln355 360 365Gly Arg Pro Arg Glu Ile Ile Asn Thr Tyr Thr Glu Ala Val Gln Thr370 375 380Val Asp Pro Phe Lys Ala Thr Gly Lys Pro His Thr Leu Trp Val Ala385 390 395 400Phe Ala Lys Phe Tyr Glu Asp Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ala Arg Val405 410 415Ile Leu Glu Lys Ala Thr Lys Val Asn Phe Lys Gln Val Asp Asp Leu420 425 430
Ala Ser Val Trp Cys Gln Cys Gly Glu Leu Glu Leu Arg His Glu Asn435 440 445Tyr Asp Glu Ala Leu Arg Leu Leu Arg Lys Ala Thr Ala Leu Pro Ala450 455 460Arg Arg Ala Glu Tyr Phe Asp Gly Ser Glu Pro Val Gln Asn Arg Val465 470 475 480Tyr Lys Ser Leu Lys Val Trp Ser Met Leu Ala Asp Leu Glu Glu Ser485 490 495Leu Gly Thr Phe Gln Ser Thr Lys Ala Val Tyr Asp Arg Ile Leu Asp500 505 510Leu Arg Ile Ala Thr Pro Gln Ile Val Ile Asn Tyr Ala Met Phe Leu515 520 525Glu Glu His Lys Tyr Phe Glu Glu Ser Phe Lys Ala Tyr Glu Arg Gly530 535 540Ile Ser Leu Phe Lys Trp Pro Asn Val Ser Asp Ile Trp Ser Thr Tyr545 550 555 560Leu Thr Lys Phe Ile Ala Arg Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Glu Arg Ala
565 570 575Arg Asp Leu Phe Glu Gln Ala Leu Asp Gly Cys Pro Pro Lys Tyr Ala580 585 590Lys Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Ala Gln Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu595 600 605Ala Arg His Ala Met Ala Val Tyr Glu Arg Ala Thr Arg Ala Val Glu610 615 620Pro Ala Gln Gln Tyr Asp Met Phe Asn Ile Tyr Ile Lys Arg Ala Ala625 630 635 640Glu Ile Tyr Gly Val Thr His Thr Arg Gly Ile Tyr Gln Lys Ala Ile645 650 655Glu Val Leu Ser Asp Glu His Ala Arg Glu Met Cys Leu Arg Phe Ala660 665 670Asp Met Glu Cys Lys Leu Gly Glu Ile Asp Arg Ala Arg Ala Ile Tyr675 680 685Ser Phe Cys Ser Gln Ile Cys Asp Pro Arg Thr Thr Gly Ala Phe Trp690 695 700
Gln Thr Trp Lys Asp Phe Glu Val Arg His Gly Asn Glu Asp Thr Ile705 7l0 715 720Lys Glu Met Leu Arg Ile Arg Arg Ser Val Gln Ala Thr Tyr Asn Thr725 730 735Gln Val Asn Phe Met Ala Ser Gln Met Leu Lys Val Ser Gly Ser Ala740 745 750Thr Gly Thr Val Ser Asp Leu Ala Pro Gly Gln Ser Gly Met Asp Asp755 760 765Met Lys Leu Leu Glu Gln Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Glu Ala Glu770 775 780Arg Asp Gln Pro Leu Arg Ala Gln Ser Lys Ile Leu Phe Val Arg Ser785 790 795 800Asp Ala Ser Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gln Val Asn Pro805 810 815Glu Glu Ile Gln Leu Gly Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu820 825 830Glu Pro Asn Glu Val Arg Leu Glu Gln Gln Ser Val Pro Ala Ala Val835 840 845
Phe Gly Ser Leu Lys Glu Asp850 85權(quán)利要求
1.編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA，包括(A)編碼具有序列2所示氨基酸序列的蛋白的DNA，或(B)由序列1所示堿基序列組成的DNA。
2.編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA，包括(A)編碼蛋白的DNA，所述蛋白具有在序列2所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多個氨基酸所得到的氨基酸序列，或(B)在嚴格條件下與由序列1所示堿基序列組成的DNA雜交的DNA。
3.轉(zhuǎn)錄抑制因子，由權(quán)利要求1或2所述的DNA編碼。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)錄抑制因子，其可抑制核激素受體引起的轉(zhuǎn)錄。
5.編碼能活化轉(zhuǎn)錄的肽的DNA，包括(A)編碼由序列2的第1-179位所示氨基酸序列組成的肽的DNA，或(B)由序列1的第1-537位堿基所示堿基序列組成的DNA。
6.編碼能活化轉(zhuǎn)錄的肽的DNA，包括(A)編碼肽的DNA，所述肽具有在序列2的第1-179位氨基酸所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多個氨基酸而得到的氨基酸序列，或(B)與序列1的第1-537位堿基序列組成的DNA雜交的DNA。
7.轉(zhuǎn)錄活化肽，由權(quán)利要求5或6的DNA編碼。
8.DNA，選自權(quán)利要求1、2、5或6之一的DNA并具有至少15個核苷酸的長度。
9.載體，插入了權(quán)利要求1、2、5或6之一的DNA。
10.宿主細胞，具有權(quán)利要求1、2、5或6之一的DNA或權(quán)利要求9的載體。
11.抗體，能結(jié)合權(quán)利要求3的因子或權(quán)利要求7的肽。
12.寡核苷酸探針，其能與權(quán)利要求1、2、5或6之一的DNA雜交并具有至少10個核苷酸的長度。
13.基板，固定了以下(A)至(D)之一(A)權(quán)利要求12的寡核苷酸探針；(B)權(quán)利要求3或4的轉(zhuǎn)錄抑制因子或該因子的部分肽；(C)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)錄活化肽或該肽的部分肽；(D)權(quán)利要求11的抗體。
全文摘要
HDART結(jié)合于HDAC(組蛋白脫乙酰基酶)并起到阻遏物的作用。同樣，HDART直接結(jié)合于起核內(nèi)受體共活化物作用的Skip，以抑制核內(nèi)受體的轉(zhuǎn)錄。并且，HDART能結(jié)合于作為核內(nèi)受體的轉(zhuǎn)錄共阻遏物之一的HDAC，由此強烈的抑制通過HDAC的組蛋白脫乙酰作用的轉(zhuǎn)錄。另一方面，獲得了一種HDART的顯性陰性肽，并證實該肽活化轉(zhuǎn)錄，與全長HDART蛋白作用相反。特別是，該肽在活化視黃酸受體轉(zhuǎn)錄的活性方面優(yōu)于全反式視黃酸(ATRA)。
文檔編號C12N5/08GK1671843SQ0381783
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月25日
發(fā)明者水谷修紀, 山田孝之 申請人:索尼株式會社