專利名稱：：來自Propionibacteriumfreudenreichii的編碼與維生素B的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與維生素B12的生物合成途徑相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)(例如酶)。具體而言，本發(fā)明提供了四個(gè)新穎的基因(及其相應(yīng)的編碼的酶)，所述基因全部得自Propionibacteria，特別是Propionibacteriumfreudenreichii。上述的酶是合酶(synthase)或轉(zhuǎn)移酶，可被用于制造維生素B12。
背景技術(shù)：
：維生素B12對(duì)人類和動(dòng)物來說是很重要的維生素。它是必需的維生素，從人類和動(dòng)物膳食的食品中獲得。維生素B12天然地存在于動(dòng)物性食物中，包括魚、奶及奶制品、蛋、肉類和禽類。某些食品例如早餐谷類食品中增加了維生素B12，為素食者提供了所述維生素的特別珍貴的來源。維生素B12被用于治療惡性貧血和外周神經(jīng)炎，其也被用作動(dòng)物飼料的添加劑。術(shù)語維生素B12被用于描述類咕啉鈷(cobaltcorrinoid)族的化合物，特別是那些鈷胺素(cobalamin)類的。該類中最多被提到的化合物是氰鈷胺素，因此，術(shù)語維生素B12有時(shí)被用于代指氰鈷胺素。在本說明書中，術(shù)語維生素B12應(yīng)當(dāng)作廣義理解，以包括鈷胺素類的所有類咕啉鈷，其特別地包括氰鈷胺素、羥鈷胺素、甲基鈷胺素以及5’-脫氧腺苷鈷胺素(5’-desoxyadenosylcobalamin)，其分別以氰基、羥基、甲基或5’-脫氧腺苷基團(tuán)為特征。維生素B12通過微生物發(fā)酵來進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，尤其是使用Pseudomonasdenitrificans。然而，目前維生素B12的生產(chǎn)水平無法總能使維生素B12的生產(chǎn)成本低而效益高。為提高維生素B12的生產(chǎn)率，需要做出努力來改進(jìn)發(fā)酵方法。維生素B12在Pseudomonasdenitrificans中的生物合成途徑已經(jīng)被很好地描述出來了24。其已經(jīng)闡明了所述途徑中的大部分25?？偣灿?2個(gè)酶被純化，并且有22個(gè)cob基因已被鑒定出來。然而其中某些基因的作用仍是未知的。人們認(rèn)為，一條緊密相關(guān)但又略有不同的途徑作用于Propionibacteriumshermanii中。另外，工作人員已經(jīng)通過Salmonellatyphimurium中的合成途徑對(duì)鈷胺素進(jìn)行了研究。所述的S.typhimurium的cob操縱子被分離出來并被克隆到E.coli中，該方法給予新宿主從頭制造鈷胺素的能力，此能力以前是不存在的。在專利公開文本的方面，關(guān)于能使鈷胺素得以制備的生物合成方法，提到了RhonePoulencRorer的Blanche。總共14個(gè)基因已經(jīng)被提出來了，所述的基因編碼的酶涉及Propionibacteriumfreudenreichii中厭氧的B12途徑中的17個(gè)步驟41。然而，該文件沒有給出任何序列，并僅僅只表達(dá)了兩個(gè)所謂導(dǎo)致甲基化的基因產(chǎn)物。它們被表達(dá)于E.coli中，而且上述基因的實(shí)際生產(chǎn)維生素B12的用途未有公開。雖然人們已經(jīng)在使用Propionibacterium的種對(duì)維生素B12進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，但是產(chǎn)量和生產(chǎn)水平都并非完全令人滿意，還存在改善的空間。因此，我們已經(jīng)開展了研究以闡明Propionibacteriumfreudenreichii中的生物合成途徑，結(jié)果鑒定出了本發(fā)明中的四個(gè)不同的基因和酶。這使維生素B12在工業(yè)規(guī)模上的產(chǎn)量得以改善。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了與維生素B12的生物合成相關(guān)的新穎的酶。最主要地，本發(fā)明在第一個(gè)方面涉及合酶或轉(zhuǎn)移酶，所述合酶或轉(zhuǎn)移酶來自放線菌(Actinomycetales)目的革蘭氏陽性細(xì)菌，例如來自Propionibacteriaceae科的，例如Propionibacterium屬的，例如Propionibacteriumfreudenreichii種。所述的酶是(例如酰胺)合酶或(例如磷酸或核苷酸)轉(zhuǎn)移酶。所述的酶優(yōu)選具有EC6.3.1.-、2.7.7-、2.7.8-或2.5.1.17活性。具體地，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了(經(jīng)分離和/或純化的)合酶或轉(zhuǎn)移酶多肽，包含(i)SEQIDNo2、4、6或8的氨基酸序列；或(ii)(i)的變異體，所述變異體是合酶或轉(zhuǎn)移酶；或(iii)(i)或(ii)的片段，所述片段是合酶或轉(zhuǎn)移酶。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種多核苷酸，其中包含(a)SEQIDNo.1、3、5或7的核苷酸序列，或編碼本發(fā)明多肽的序列；(b)互補(bǔ)于或雜交到(a)中所定義的任意序列的序列；(c)(a)或(b)中的任意序列的片段；(d)與(a)、(b)或(c)中所定義的任意序列具有至少60％、65％或70％的同一性(identity)的序列；或(e)根據(jù)遺傳編碼與(a)至(d)中所定義的任意序列簡(jiǎn)并的序列。本發(fā)明還提供了(例如表達(dá))載體(第三方面)，所述的載體包含本發(fā)明的多核苷酸，并可以表達(dá)本發(fā)明的多肽；宿主(第四方面)，例如包含本發(fā)明載體的細(xì)胞系或細(xì)胞株；生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，所述的方法包括在適于獲得所述多肽的表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞系或細(xì)胞株，以及，如果必要的話，分離所述的多肽；和生產(chǎn)維生素B12或其前體的方法(第五方面)，所述的方法包括將底物與本發(fā)明的多肽或宿主細(xì)胞相接觸。序列說明SEQIDNo.1是本發(fā)明的第一個(gè)酶，酰胺合酶的DNA序列，來自Propionibacteriumfreudenreichii；SEQIDNo.2是所述第一個(gè)酶(A)的氨基酸序列；SEQIDNo.3是第二個(gè)酶的DNA序列，所述的酶是(磷酸和/或核苷酸)轉(zhuǎn)移酶，來自所述的同樣的生物；SEQIDNo.4是所述第二個(gè)酶(B)的氨基酸序列；SEQIDNo.5是第三個(gè)酶的DNA序列，所述的酶是轉(zhuǎn)移酶，也來自所述的同樣的生物；SEQIDNo.6是所述第三個(gè)酶(C)的氨基酸序列；SEQIDNo.7是第四個(gè)酶的DNA序列，所述的酶是(核苷酸)轉(zhuǎn)移酶，也來自所述的同樣的生物；SEQIDNo.8是所述第四個(gè)酶(D)的氨基酸序列；SEQIDNos.9至17是引物。具體實(shí)施例方式A.多核苷酸本發(fā)明提供了(例如經(jīng)過分離或純化的)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。本發(fā)明因此提供了一種多核苷酸，其優(yōu)選編碼合酶或轉(zhuǎn)移酶，所述合酶或轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列示于SEQIDNo.2、4、6和/或8中。本發(fā)明進(jìn)一步地提供了一種多核苷酸，其編碼的多肽與SEQIDNo.2、4、6和/或8中所展示的氨基酸序列具有很高的氨基酸序列同源性。本發(fā)明中還包括了一種多核苷酸，其選自(a)一種多核苷酸，包含SEQIDNo.1、3、5和/或7中展示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；(b)一種多核苷酸，包含能夠(例如選擇性地)與SEQIDNo.1、3、5和/或7中展示的核苷酸序列或其片段雜交的核苷酸序列；(c)一種多核苷酸，包含能夠(例如選擇性地)與SEQIDNo.1、3、5和/或7中展示的核苷酸序列或其片段的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列；和/或(d)一種多核苷酸，包含按照遺傳編碼與(a)、(b)或(c)中定義的多核苷酸簡(jiǎn)并的多核苷酸序列。多核苷酸可以包含2條、3條或更多的本發(fā)明的序列，例如SEQIDNos.3和5，或SEQIDNos.1、3和5(或上述(b)、(c)和(d)中任一項(xiàng)所定義的序列的變異體)。本發(fā)明的多核苷酸還可以包括下述多核苷酸，其(a)編碼具有合酶或轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述的多核苷酸是(1)SEQIDNo.1、3、5或7的編碼序列；(2)與(1)中定義的序列的互補(bǔ)序列選擇性雜交的序列；或(3)按照遺傳編碼與(1)或(2)中定義的序列簡(jiǎn)并的序列；或(b)互補(bǔ)于(a)中定義的多核苷酸的序列?？呻s交序列術(shù)語“能夠與……雜交”意味著本發(fā)明的目標(biāo)多核苷酸能夠以明顯超過背景的水平雜交到用作探針的核酸序列(例如展示于SEQIDNo.1、3、5或7中的序列或者其片段或互補(bǔ)序列)上。本發(fā)明還包括了編碼合酶或轉(zhuǎn)移酶或其變異體的核苷酸序列，以及互補(bǔ)于所述序列的核苷酸序列。所述的核苷酸序列可以是RNA或DNA，因此包括基因組DNA、合成DNA或cDNA。優(yōu)選地，所述核苷酸序列如果合適的話為DNA序列，以及cDNA序列。典型地，本發(fā)明的多核苷酸序列包含連續(xù)的核苷酸序列(contiguoussequence)，所述序列能夠在選擇性條件下恰當(dāng)?shù)仉s交到SEQIDNo.1、3、5或7的編碼序列上，或雜交到所述編碼序列的互補(bǔ)序列上。上述的核苷酸可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法來合成1。本發(fā)明的多核苷酸可以以明顯超過背景的水平(恰當(dāng)?shù)?雜交到SEQIDNo.1、3、5或7的編碼序列或所述編碼序列的互補(bǔ)序列上。背景雜交可以，例如，由于在cDNA文庫(kù)中存在的其它c(diǎn)DNA而發(fā)生。典型地，所述信號(hào)水平(例如，本發(fā)明的多核苷酸與SEQIDNo.1、3、5或7的編碼序列或所述編碼序列的互補(bǔ)序列的相互作用所產(chǎn)生的)是其它多核苷酸與SEQIDNo.1、3、5或7的編碼序列的相互作用的至少10倍，優(yōu)選為至少100倍，或者同其一樣強(qiáng)。相互作用的強(qiáng)度可以測(cè)量，例如，通過對(duì)探針進(jìn)行放射性標(biāo)記，例如用32P。典型地，選擇性雜交可以使用低嚴(yán)謹(jǐn)性條件(例如0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，大約40℃)、中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件(例如0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，大約50℃)或高嚴(yán)謹(jǐn)性(例如0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，大約60℃的)條件來獲得。雜交可以在本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何適合的條件下開展1，作為指南，低嚴(yán)謹(jǐn)性可以是2×SSC，55℃；中等嚴(yán)謹(jǐn)性可以是0.5×至1.0×SSC，60℃；高嚴(yán)謹(jǐn)性可以是0.1×或0.2×SSC，60℃或更高(例如68℃)，全部都在0.5％SDS中。修飾本發(fā)明的多核苷酸可以包含DNA或RNA。它們可以是單鏈或雙鏈的。它們還可以是其中包含一個(gè)或多個(gè)合成的或經(jīng)修飾的核苷酸的多核苷酸。本領(lǐng)域內(nèi)已知對(duì)多核苷酸的多種不同的修飾。上述修飾包括甲基磷酸酯和硫代磷酸主鏈和/或在所述的分子的3’和/或5’末端加入吖啶或多聚賴氨酸鏈。就本發(fā)明的目的而言，應(yīng)該理解在此描述的多核苷酸可以通過本領(lǐng)域中任何可用的方法來修飾。應(yīng)該理解，技術(shù)人員可以采用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行核苷酸的替換，所述替代不影響本發(fā)明多核苷酸所編碼的多肽序列，這反映了任何特定宿主生物的密碼子的使用情況，例如將表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主生物。SEQIDNo.1、3、5或7的編碼序列可以通過核苷酸替換來進(jìn)行修飾，例如從或達(dá)到1、2或3至10、25、50或100個(gè)替換?；蛘呋蛄硗?，所述的多核苷酸可以通過一個(gè)或多個(gè)插入和/或缺失和/或任一末端或全部末端的延伸來進(jìn)行修飾。經(jīng)過修飾的多核苷酸通常編碼具有合酶或轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。簡(jiǎn)并替換是可以進(jìn)行的，和/或在經(jīng)修飾的序列翻譯之時(shí)將導(dǎo)致保守氨基酸替換的替換是可以進(jìn)行的，例如后面關(guān)于多肽的部分所討論的。同源體能夠選擇性地雜交到SEQIDNo.1、3、5或7的DNA編碼序列(例如其互補(bǔ)序列)上的核苷酸序列可以與SEQIDNo.1、3、5或7的編碼序列具有至少50％或60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性(或同源性)。其可以在至少20個(gè)，優(yōu)選至少30個(gè)，例如至少40或50個(gè)、例如至少60或80個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選至少100、200、400、500個(gè)或者甚至600個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域上，或最優(yōu)為在SEQIDNo.1、3、5或7的全長(zhǎng)上。對(duì)個(gè)體序列來說，序列同一性可以(a)對(duì)SEQIDNo.1而言，至少85％或90％；(b)對(duì)SEQIDNo.3而言，至少70％；(c)對(duì)SEQIDNo.5而言，至少90％或95％；和/或(d)對(duì)SEQIDNo.7而言，至少90％、95％或98％。上述的同源性程度和大小下限的任意組合可被用來定義本發(fā)明的多核苷酸，更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕M合(即在更長(zhǎng)長(zhǎng)度上的更高的同源性)是優(yōu)選的。因此，例如在25個(gè)核苷酸上，優(yōu)選在30個(gè)核苷酸上，至少80％或90％同源的多核苷酸就形成了本發(fā)明的一個(gè)方面，在40個(gè)核苷酸上至少90％同源的多核苷酸也是。典型地，多核苷酸(或蛋白質(zhì))序列的同源體具有至少70％的同源性，優(yōu)選至少80％、90％、95％、97％或99％的同源性，例如在至少15個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、100個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸(或氨基酸)的區(qū)域上。所述的同源性可以在氨基酸同一性(有時(shí)被稱為“硬同源性(hardhomology)”)的基礎(chǔ)上來計(jì)算。除非另有說明，同一性(identity)或同源性(homology)通常都是在完整序列的基礎(chǔ)上來計(jì)算的。例如，UWGCGPackage提供了BESTFIT程序，其可以用來計(jì)算同源性(例如采用其缺省設(shè)置5)。PILEUP和BLAST算法可以用來計(jì)算同源性或?qū)π蛄羞M(jìn)行排列(lineup)(例如鑒定等同或相應(yīng)的序列，例如用其缺省設(shè)置6，7)。用以開展BLAST分析的軟件可以通過國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)為公眾所獲得。該算法包括通過確定被查詢的序列中的長(zhǎng)度為W的短字(shortword)，首先確定出高分?jǐn)?shù)序列對(duì)(highscoringsequencepair，HSP)，所述的短字與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中同樣長(zhǎng)度的字進(jìn)行比對(duì)(align)時(shí)匹配或能達(dá)到為正值的某閾值分?jǐn)?shù)T。T被稱為相鄰字分?jǐn)?shù)閾值(neighbourhoodwordscorethreshold)6，7。上述最初的相鄰字命中(wordhit)被作為種子對(duì)搜索進(jìn)行初始化，以找到含有它們的HSP。所述的字命中在每條序列的兩個(gè)方向上都延伸，直到累積比對(duì)分?jǐn)?shù)(cumulativealignmentscore)能夠增加。當(dāng)累積比對(duì)分?jǐn)?shù)從其獲得的最大值降低了數(shù)量X；由于一個(gè)或多個(gè)分?jǐn)?shù)為負(fù)的殘基比對(duì)的積累，所述累積分?jǐn)?shù)到了零或以下；或到達(dá)了序列的末端之時(shí)，所述字配對(duì)在每個(gè)方向上的延伸就被中斷。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定了所述比對(duì)的敏感性和速度。所述的BLAST程序缺省使用的字長(zhǎng)度(wordlength，W)為11，BLOSUM62分?jǐn)?shù)矩陣8比對(duì)(BLOSUM62scoringmatrixalignments，B)為50，期望值(expectation，E)為10，M＝5，N＝4，缺省比較兩條鏈。BLAST算法進(jìn)行了兩條序列間相似性的統(tǒng)計(jì)分析9。由BLAST算法提供的一種對(duì)相似性的測(cè)量是最小總和概率(smallestsumprobability(P(N)))，它提供了對(duì)兩段核苷酸或氨基酸序列間的匹配將偶然發(fā)生的概率的指示。例如，如果第一條序列與第二條序列進(jìn)行比較時(shí)的最小總和概率小于1左右，優(yōu)選小于0.1左右，更優(yōu)選小于0.01左右，以及最優(yōu)選小于0.001左右，則該序列就被認(rèn)為與另一條相似。片段、同源體以及其它變異體的長(zhǎng)度可以是至少500或550個(gè)核苷酸(例如，對(duì)SEQIDNo.7而言)，并且編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的至少(例如，最開始的)170、180或200個(gè)氨基酸。引物和探針本發(fā)明的多核苷酸包括并可被用作引物，例如PCR引物、用于其它擴(kuò)增反應(yīng)的引物，探針或可以被克隆到載體中的多核苷酸。上述引物、探針和其它片段的長(zhǎng)度將為至少或達(dá)到20個(gè)核苷酸、例如至少25、30或40個(gè)核苷酸。典型地，它們將達(dá)到40、50、60、70、100、150、200或300個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，甚至達(dá)到與SEQIDNo.1、3、5或7的編碼序列相同的數(shù)量或少一些核苷酸(例如5或10個(gè)核苷酸)。一般來說，引物將通過合成的手段來產(chǎn)生，涉及以每次一個(gè)核苷酸的方式，對(duì)期望得到的核酸序列進(jìn)行逐步生產(chǎn)。使用自動(dòng)技術(shù)來完成上述任務(wù)的技術(shù)在本領(lǐng)域中是容易獲得的。更長(zhǎng)的多核苷酸通常將通過重組手段來產(chǎn)生，例如使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)克隆技術(shù)。這將包括對(duì)想要克隆的合酶或轉(zhuǎn)移酶的區(qū)域制作一對(duì)(例如大約15-30個(gè)核苷酸的)引物；將所述的引物與從目標(biāo)(例如酵母、細(xì)菌、植物、原核或真菌)細(xì)胞中獲得的mRNA或cDNA相接觸，所述目標(biāo)細(xì)胞優(yōu)選為細(xì)菌，例如Propionibacterium的菌株；在導(dǎo)致期望區(qū)域的擴(kuò)增的條件下開展聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行分離(例如，通過在瓊脂糖凝膠上對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行純化)；以及回收擴(kuò)增出的DNA。所述的引物可以被設(shè)計(jì)為含有合適的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，從而使得擴(kuò)增后的DNA可以被克隆到合適的克隆載體中。上述技術(shù)可以被用來獲得在此描述的合酶或轉(zhuǎn)移酶序列的全部或部分。本發(fā)明中還包括基因組克隆，所述克隆與SEQIDNo.1、3、5或7的cDNA相對(duì)應(yīng)，或者與含有例如內(nèi)含子及啟動(dòng)子區(qū)域的合酶或轉(zhuǎn)移酶基因相對(duì)應(yīng)；所述克隆也可以從來自真菌、酵母、細(xì)菌、植物或原核細(xì)胞的基因組DNA開始，以類似的方式(例如重組手段、PCR、克隆技術(shù))獲得。所述的多核苷酸或引物可以攜帶顯示標(biāo)記(revealinglabel)，例如放射性或非放射性的標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括放射性同位素比如32P或35S，酶標(biāo)記或其它蛋白質(zhì)標(biāo)記例如生物素。上述標(biāo)記可以加入到本發(fā)明的多核苷酸或引物中，并且可以用本身已知的技術(shù)來探測(cè)。標(biāo)記過或未標(biāo)記過的多核苷酸可以被用于基于核酸的試驗(yàn)，用以探測(cè)(例如細(xì)菌)樣品中的合酶或轉(zhuǎn)移酶或其變異體，或?qū)ζ溥M(jìn)行測(cè)序。上述用于探測(cè)的試驗(yàn)通常包括將(懷疑)含有DNA的(例如細(xì)菌)樣品與本發(fā)明的探針或引物在雜交條件下相互作用，并探測(cè)樣品中的核酸和探針之間形成的任何雙鏈體(duplex)。上述探測(cè)可以使用例如PCR的技術(shù)來獲得，或者通過將所述探針固定到固體支持物上，移走未雜交到探針上的樣品中的核酸，然后探測(cè)雜交到探針上的核酸來獲得?；蛘?，所述的樣品核酸可以被固定到固體支持物上，結(jié)合到該支持物上的探針的數(shù)量可以被探測(cè)出來。本發(fā)明的探針可以以試劑盒的形式被方便地包裝進(jìn)合適的容器。在上述試劑盒中，所述的探針可以結(jié)合到固體支持物上，其中適合采用該試劑盒的化驗(yàn)形式(assayformat)需要上述的結(jié)合。該試劑盒還可以含有用于處理有待檢測(cè)的樣品的合適試劑、用于將探針雜交到樣品中的核酸上去的合適試劑、對(duì)照試劑、說明書等等。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以從同樣的生物中獲得，例如細(xì)菌，特別是Mycobacteriaceae科的，優(yōu)選Propionibacterium屬的。本發(fā)明的多核苷酸還包括SEQIDNo.1、3、5或7序列的變異體，所述變異體具有合酶或轉(zhuǎn)移酶的活性。變異體可以通過增加、替換和/或缺失來形成，并且可以具有作為合酶或轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用的能力，或者具有EC6.3.1-，2.7.7(或8).-或2.5.1.17的活性。多核苷酸的生產(chǎn)可以用多種方法來獲得與SEQIDNo.1、3、5或7不具有100％的同一性但落在本發(fā)明范疇之內(nèi)的多核苷酸。因此在此描述的序列的變異體可以通過多種方法獲得，例如通過對(duì)從一系列生物中制得的基因組DNA文庫(kù)進(jìn)行探測(cè)來獲得，所述的生物例如是作為本發(fā)明多肽的來源被加以討論的那些。此外，也可以獲得其它的細(xì)菌或原核的同源體，上述的同源體及其片段通常能夠雜交到SEQIDNo.1、3、5或7上。上述序列可以通過探測(cè)來自其它物種的cDNA文庫(kù)或基因組DNA文庫(kù)，并通過用包含SEQIDNo.1、3、5或7的全部或部分的探針在中等至高嚴(yán)謹(jǐn)度(見前述)的條件下探測(cè)上述的文庫(kù)來獲得。包含SEQIDNo.1、3、5或7的全部或部分的核酸探針可以被用于探測(cè)來自其它物種的cDNA文庫(kù)，例如作為本發(fā)明多肽的來源被描述的那些物種。物種同源體還可以使用簡(jiǎn)并PCR來獲得，所述的PCR將使用為檢測(cè)目標(biāo)序列而設(shè)計(jì)的引物，所述的目標(biāo)序列編碼變異體和同源體中的保守氨基酸序列。所述的引物可以含有一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并位置，并且較之用單序列引物對(duì)已知序列進(jìn)行序列克隆所使用的嚴(yán)謹(jǐn)性條件，所述引物被用于更低的嚴(yán)謹(jǐn)性條件下?；蛘撸鲜龅亩嗪塑账峥梢酝ㄟ^對(duì)所述合酶或轉(zhuǎn)移酶序列或其變異體進(jìn)行定點(diǎn)突變來獲得。某些情況下這可能是有用的，例如在需要對(duì)序列進(jìn)行沉默密碼子改變(silentcodonchange)，以便最優(yōu)化特定宿主細(xì)胞的密碼子偏愛的情況下，其中所述多核苷酸序列表達(dá)于所述宿主細(xì)胞中。為了導(dǎo)入限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，或者為了改變由所述的多核苷酸編碼的多肽的功能或特性，有可能需要其它的序列改變。本發(fā)明包括雙鏈多核苷酸，所述多核苷酸包含本發(fā)明的多核苷酸及其互補(bǔ)序列。本發(fā)明還提供了編碼下述的本發(fā)明多肽的多核苷酸。鑒于上述的多核苷酸作為用于本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)的序列是有用的，所以雜交到SEQIDNo.1、3、5或7的序列上的能力對(duì)它們來說并非必需，雖然通常這將是期望得到的。另外，如果需要的話，可按上文所述對(duì)上述的多核苷酸進(jìn)行標(biāo)記、使用以及制備。B.多肽本發(fā)明涉及(經(jīng)過(例如，充分地)純化和/或分離的)合酶或轉(zhuǎn)移酶或后面所定義的其變異體。本發(fā)明的多肽可以基本由SEQIDNo.2、4、6或8或所述序列的變異體組成。多肽還可以由上述的本發(fā)明的多核苷酸所編碼。本發(fā)明的多肽可以是經(jīng)分離的或充分純化的形式。可以理解所述的多肽可以與載體或稀釋劑混合，這將不會(huì)妨礙多肽的預(yù)定用途和/或功能，并且所述的多肽仍可以被視為經(jīng)過了充分地分離。在制備物中通常包含所述的多肽，其中，按制備物中多肽的重量計(jì)，超過20％，例如超過30％、40％、50％、80％、90％、95％或99％的多肽是本發(fā)明的多肽?？梢允褂贸Ｒ?guī)方法純化和/或合成根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)1。對(duì)一些(例如對(duì)非制藥用途的)制劑而言，多肽的存在量可以很少，例如0.01％至10％，例如0.1％至5％或2％，甚至從0.2％至1％。本發(fā)明的多肽優(yōu)選從微生物中獲得，例如含有編碼具有合酶或轉(zhuǎn)移酶活性的酶的基因的微生物。所述的微生物更優(yōu)選為細(xì)菌，例如革蘭氏陽性細(xì)菌。所述的微生物可以是放線菌(Actinobacteria)門或放線菌綱的，例如Adinobacteridae亞綱的。所述的微生物優(yōu)選為Actinomycetales目的，例如Propionibacterineae亞目的，最優(yōu)為來自Propionibacteriaceae科。優(yōu)選的微生物因此是Propionibacterium屬的，例如Propionibacteriumfreudenreichii種的。優(yōu)選地，所述的微生物能夠生產(chǎn)或合成維生素B12?；钚员景l(fā)明的多肽可以具有如下特征中的一種或多種，即，所述的多肽(1)具有合酶或轉(zhuǎn)移酶的活性；(2)作為酰胺合酶或磷酸轉(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶或芳香基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用；(3)催化維生素B12生物合成途徑中的至少一步；(4)具有EC6.3.1-、EC2.7.7-、EC2.7.8-或EC2.5.1.17中的活性；(5)具有150或170個(gè)至270或300個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，或者800或840個(gè)至880或920個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度；(6)是鈷啉酸a，c-二酰胺合酶(cobyrinicacid-a，c-diamidesynthase)、鈷啉醇酰胺激酶(cobinamidekinase)、鈷啉醇酰胺磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶(cobinamidephosphateguanyltransferase)、鈷胺素(5’-磷酸)合酶(cobalamin(5’-phosphate)synthase)和/或腺苷轉(zhuǎn)移酶(adenosyltransferase)；(7)作用于底物，或生產(chǎn)出產(chǎn)物，其包含(i)咕啉核或環(huán)系統(tǒng)；(ii)可達(dá)4個(gè)芳香環(huán)，也可以是吡咯環(huán)；(iii)四吡咯環(huán)系統(tǒng)和/或過渡金屬(例如鈷)原子；和/或(iv)酰胺、磷酸、胍基、芳香基或腺苷部分或基團(tuán)；和/或(8)催化酰胺化、磷酸化、核苷酸化、芳基化、三氮唑核苷(ribazole)或腺苷的添加和/或腺苷化。下面給出了本發(fā)明多肽主要特征的表格。變異體和同源體本發(fā)明的多肽可以包含SEQIDNo.2、4、6或8中展示的氨基酸序列，(或其變異體，例如)基本同源的序列，或上述序列的片段，所述的多肽可以具有合酶或轉(zhuǎn)移酶活性。一般而言，SEQIDNo.2、4、6或8中所示的天然氨基酸序列是優(yōu)選的。具體而言，本發(fā)明的多肽可以包含(a)SEQIDNo.2、4、6或8中的多肽序列；(b)其天然出現(xiàn)的變異體或物種同源體(specieshomolog)、橫向同源體(paralog)或直向同源體(ortholog)；或(c)與(a)或(b)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的蛋白質(zhì)。變異體可以是天然出現(xiàn)的，例如在真菌、細(xì)菌、酵母或植物細(xì)胞中；變異體可以以與SEQIDNo.2、4、6或8中蛋白質(zhì)基本相似的方式行使功能，例如所述的變異體具有合酶或轉(zhuǎn)移酶活性。類似地，所述蛋白質(zhì)的物種同源體將是天然出現(xiàn)于另外物種中的并能作為合酶或轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮功能的等同(equivalent)蛋白質(zhì)。變異體包括等位基因變異體，其與本發(fā)明多肽來自相同的株系，或者來自不同的株系，但仍是同一屬或同一種的。變異體和物種同源體可以通過遵循在此描述的用于生產(chǎn)SEQIDNo.2、4、6或8多肽的工序，在合適的細(xì)胞來源例如細(xì)菌、酵母、真菌或植物細(xì)胞中開展上述工序來獲得。使用上面定義的探針來探測(cè)從酵母、細(xì)菌、真菌或植物細(xì)胞中制得的文庫(kù)，來獲得包括所述變異體或物種同源體的克隆也將是可能的?？梢杂脗鹘y(tǒng)技術(shù)來處理所述的克隆，以產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，本發(fā)明的多肽也可以再通過本身已知的重組或合成技術(shù)來生產(chǎn)。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽與SEQIDNo.2、4、6或8中的任何蛋白質(zhì)具有至少70％的序列同一性，更優(yōu)選地，與其有至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性，例如，對(duì)每條序列而言，在至少60個(gè)，至少100、150、200、250或300個(gè)(甚至500、600、700或800個(gè))連續(xù)氨基酸的區(qū)域上，或在SEQIDNo.2、4、6或8的全長(zhǎng)之上。對(duì)個(gè)別序列來說，序列同一性可以是(a)對(duì)SEQIDNo.2而言，至少55％、60％或65％；(b)對(duì)SEQIDNo.4而言，至少50％、55％或60％；(c)對(duì)SEQIDNo.6而言，至少40％、45％或50％；和/或(d)對(duì)SEQIDNo.8而言，至少90％、95％、98％或99％(例如，在至少150個(gè)、170個(gè)、200個(gè)或230個(gè)氨基酸之上，或所述的序列長(zhǎng)于至少150個(gè)、170個(gè)、200個(gè)或230個(gè)氨基酸)。SEQIDNo.2、4、6或8的多肽及變異體和物種同源體的序列因此可以被修飾，以提供本發(fā)明的多肽?？梢赃M(jìn)行氨基酸的替換，例如從或多達(dá)1、2或3個(gè)至10、20、30、50或100個(gè)替換。同樣數(shù)量的缺失和插入也是可以進(jìn)行的。上述的變化可以在對(duì)多肽功能很關(guān)鍵的區(qū)域之外進(jìn)行，所以仍然可以得到具有活性的酶。經(jīng)修飾的多肽通常保留作為合酶或轉(zhuǎn)移酶的活性。本發(fā)明的多肽包括上述全長(zhǎng)多肽的片段及其變異體的片段，包括SEQIDNo.2、4、6或8所展示的序列的片段。典型地，此類片段保留了作為合酶或轉(zhuǎn)移酶的活性。片段的長(zhǎng)度可以為至少50個(gè)、100個(gè)、150個(gè)、200個(gè)或250個(gè)氨基酸，或者可以是(顯示于SEQIDNo.2、4、6或8中的)所述的全長(zhǎng)序列去掉上述數(shù)目的氨基酸之后那么長(zhǎng)。如果必要的話，本發(fā)明的多肽可以通過合成的手段來生產(chǎn)，雖然通常將按照下面所描述的方法對(duì)其進(jìn)行重組制備。它們可以被修飾，例如通過添加組氨酸殘基或T7標(biāo)簽來協(xié)助其鑒別或純化，或者通過添加信號(hào)序列來促進(jìn)其從細(xì)胞中分泌。術(shù)語“變異體”指與所述的合酶或轉(zhuǎn)移酶具有相同的基本特征或基本生物學(xué)功能性的多肽，其中包括等位基因變異體。合酶的基本特征是，其是表現(xiàn)了EC6.3.-.-.(例如EC6.3.1.-.)活性的酶或是能向底物(例如酰胺化物)添加胺(amine)基的酶。對(duì)轉(zhuǎn)移酶而言，其是表現(xiàn)了EC2.7.-.-.(例如EC2.7.7.-或2.7.8.-)或EC2.5.-.-.(例如EC2.5.1.-，例如EC2.5.1.17)活性并能從一個(gè)化合物向另一個(gè)化合物轉(zhuǎn)移取代基團(tuán)或化學(xué)部分(chemicalmoiety)的酶。變異體多肽優(yōu)選具有所述的相同的活性。具有相同的基本特征的多肽可以通過開展底物降解試驗(yàn)來鑒定。SEQIDNo.2、4、6或8的變異體還包括下述序列，所述序列與SEQIDNo.2、4、6或8不同，但卻不一定源自天然出現(xiàn)的酶。所述的變異體可以被描述成與SEQIDNo.2、4、6或8具有百分比同源性(percentagehomology)，或在該序列內(nèi)具有若干替換?；蛘?，變異體可以被多核苷酸編碼，所述多核苷酸是能雜交到SEQIDNo.1、3、5或7上的?？梢杂门c定義SEQIDNo.1、3、5或7的變異體相似的方式來定義上述變異體。因此上述變異體可以包含源自其它細(xì)菌株系的變異體序列，例如Propionibacterium?？梢园凑丈衔乃鰧ふ液厦富蜣D(zhuǎn)移酶活性并克隆及測(cè)序，來從其它株系中鑒定出其它變異體。變異體可以包括在蛋白質(zhì)序列內(nèi)缺失、修飾或添加單個(gè)氨基酸或氨基酸的組，只要所述的肽保持基本的生物學(xué)功能性，例如合酶或轉(zhuǎn)移酶。例如，保守替代可以根據(jù)下表所述進(jìn)行。第二列中同一格內(nèi)的氨基酸之間，優(yōu)選第三列中同一行的氨基酸之間，可以進(jìn)行相互替換。優(yōu)選地，替換不影響所述多肽的折疊或活性。更短的多肽序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，長(zhǎng)度為至少50個(gè)氨基酸或達(dá)到60、70、80、100、150、200、400、500、600或700個(gè)氨基酸的多肽，只要其顯示出所述合酶或轉(zhuǎn)移酶的基本生物學(xué)功能性，就被認(rèn)為是落入了本發(fā)明的范疇內(nèi)。具體而言，但并非僅有地，本發(fā)明的該方面包含下述情況所述的蛋白質(zhì)是所述完全蛋白質(zhì)序列的片段，并且可以包含或代表底物結(jié)合區(qū)域、切割和/或轉(zhuǎn)移區(qū)域。修飾本發(fā)明的多肽可以是經(jīng)過化學(xué)修飾的，例如翻譯后修飾。例如，所述的多肽可以包含經(jīng)過修飾的氨基酸殘基。還可以通過添加組氨酸殘基(以協(xié)助其純化)或通過添加信號(hào)序列(以促進(jìn)向細(xì)胞膜的插入)來對(duì)其進(jìn)行修飾。所述的多肽可以具有一個(gè)或多個(gè)(N)氨基末端或(C)羧基末端的延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基，長(zhǎng)達(dá)大約20-25個(gè)殘基的小的接頭(linker)肽或幫助純化的(小的)延伸，例如多聚組氨酸或T7標(biāo)簽、抗原表位或(例如麥芽糖的)結(jié)合域14(例如，處于C-末端的)。上述延伸可以通過接頭添加，或者可以不通過接頭添加。本發(fā)明的多肽可以用顯示標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。所述的顯示標(biāo)記可以是任何能使所述多肽被探測(cè)的合適的標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括放射性同位素，例如125I、35S，酶，抗體，多核苷酸和接頭，例如生物素?？梢詫?duì)所述的多肽進(jìn)行修飾，以便向其中引入非天然出現(xiàn)的氨基酸，或增加所述多肽的穩(wěn)定性。當(dāng)用合成手段來生產(chǎn)所述的肽時(shí)，上述氨基酸可以在生產(chǎn)期間被導(dǎo)入。還可以在合成或重組生產(chǎn)之后來對(duì)所述的肽進(jìn)行修飾。本發(fā)明的多肽還可以使用(一個(gè)或多個(gè))D-氨基酸來生產(chǎn)，或者本發(fā)明的多肽包含(一個(gè)或多個(gè))D-氨基酸。很多側(cè)鏈修飾都為本領(lǐng)域所已知，可以用于本發(fā)明蛋白質(zhì)或肽的側(cè)鏈。此類修飾包括，例如，通過還原性烷基化、酰胺化或芳基化來進(jìn)行的氨基酸修飾，所述還原性烷基化中，首先進(jìn)行醛反應(yīng)，隨后進(jìn)行NaBH4還原，所述酰胺化中使用甲基亞氨逐乙酸酯(methylacetimidate)，所述芳基化中使用乙酸酐。本發(fā)明提供的序列還可以被用作構(gòu)建“第二代”酶的起始原料?！暗诙泵甘峭ㄟ^突變技術(shù)(例如定點(diǎn)突變)改造得到的，其具有的特性不同于野生或重組酶，例如本發(fā)明所生產(chǎn)的那些。例如，可以改變最適溫度或pH、比活性、底物親和性或熱穩(wěn)定性，以更適于在確定的過程中的應(yīng)用。對(duì)活性來說是必要的氨基酸，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的工序鑒定出來，例如定點(diǎn)突變或丙氨酸掃描突變(alanine-scanningmutagenesis)10，因此所述氨基酸是優(yōu)選的經(jīng)歷替換的氨基酸。在后一項(xiàng)技術(shù)中，突變被引入所述分子的每一個(gè)殘基，得到的突變分子被用于生物活性(例如合酶或轉(zhuǎn)移酶活性)的測(cè)試，以鑒別出對(duì)所述分子的活性來說很關(guān)鍵的氨基酸殘基。酶-底物相互作用的位點(diǎn)也可以通過對(duì)晶體結(jié)構(gòu)的分析來確定，例如通過核磁共振、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記11，12，13或分子模擬(moleculemodelling)等技術(shù)來確定。使用酵母或真菌宿主細(xì)胞可以提供任何影響本發(fā)明重組表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性的翻譯后修飾(例如，蛋白酶處理、十四烷基化、糖基化、截?cái)?truncation)以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的磷酸化)。本發(fā)明的多肽可以以能令其處于其天然細(xì)胞環(huán)境之外的形式被提供。因此，其可以如上所述經(jīng)過充分地分離或純化，或處于于自然界中其不會(huì)出現(xiàn)的細(xì)胞中，例如其它細(xì)菌菌種、動(dòng)物、酵母或真菌的細(xì)胞中。C.重組方面本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明多核苷酸的載體，所述載體包括克隆及表達(dá)載體，以及提供了在合適的宿主細(xì)胞中培育、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染上述載體的方法，例如在本發(fā)明多肽發(fā)生表達(dá)的條件下。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞，其中所述的多核苷酸與所述宿主細(xì)胞的基因組是異源的。術(shù)語“異源”通常是相對(duì)于宿主細(xì)胞而言的，意味著所述的多核苷酸不是天然出現(xiàn)于所述基因組中的或者所述的多肽不由上述細(xì)胞天然地生產(chǎn)。宿主細(xì)胞優(yōu)選為細(xì)菌細(xì)胞，例如Propionibacteriaceae科的(革蘭氏陽性)細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸可以被插入到重組復(fù)制載體中，例如克隆或表達(dá)載體。所述載體可以被用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制所述的核酸。因此在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制造本發(fā)明多核苷酸的方法通過將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入復(fù)制載體，將所述載體導(dǎo)入相容的宿主細(xì)胞，在導(dǎo)致載體復(fù)制的條件下培育所述的宿主細(xì)胞。所述載體可以從宿主細(xì)胞中回收。適合的宿主細(xì)胞連同表達(dá)載體在下面進(jìn)行描述。載體本發(fā)明的多核苷酸可以被插入到表達(dá)盒(expressioncassette)中。所述表達(dá)盒或本發(fā)明多核苷酸被插入到載體中，所述載體可以是任何可方便地進(jìn)行重組DNA工序的載體，對(duì)載體的選擇通常將取決于其將被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，所述的載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外物質(zhì)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘?，當(dāng)該載體被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，其可以被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，并與染色體一同進(jìn)行復(fù)制。優(yōu)選地，載體中的本發(fā)明的多核苷酸被可操作地連接(operablylinked)到調(diào)控序列上，所述的調(diào)控序列能提供宿主細(xì)胞對(duì)編碼序列的表達(dá)，即所述的載體是表達(dá)載體。術(shù)語“可操作地連接”指并置(juxtaposition)，其中，所述的元件(component)處于允許其按照其預(yù)定方式發(fā)揮功能的關(guān)系中?！翱刹僮鞯剡B接”到編碼序列上的調(diào)控序列例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它表達(dá)調(diào)控信號(hào)，以下述方式被放置在與所述控制序列相容的條件下獲得編碼序列的表達(dá)。所述的載體可以是質(zhì)粒、粘粒、病毒或噬菌體載體，通常含有復(fù)制起始位點(diǎn)，也可能含有用于所述多核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)子，以及增強(qiáng)子和/或所述啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)子(regulator)。終止子序列可以存在，聚腺苷化序列也可以存在。所述的載體可以含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)志(selectablemarker)基因，例如氨芐青霉素抗性基因(在細(xì)菌質(zhì)粒的情況下)或新霉素抗性基因(用于哺乳動(dòng)物載體)。載體可以于體外使用，例如用于RNA的生產(chǎn)或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。它們可以包含兩個(gè)或更多的本發(fā)明的多核苷酸，例如為了過量表達(dá)。所述的載體可以包含兩個(gè)、三個(gè)或者全部四個(gè)本發(fā)明的多核苷酸，換句話說，至少兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)編碼本發(fā)明四個(gè)多肽(如前面定義的，SEQIDNos.2、4、6和8或變異體(其片段或基本同源的序列))的多核苷酸序列。優(yōu)選的組合包括編碼蛋白質(zhì)B(cobU)和蛋白質(zhì)C(cobS)的序列，可選地，還可包括編碼第三個(gè)蛋白質(zhì)A(cobA/cbiA)的序列。因此，所述的載體可以包含SEQIDNos.1、3、5和/或7，或其片段，或者如說明書前面部分所定義的雜交到其上的序列。優(yōu)選地，至少2個(gè)、3個(gè)以及(最佳地)4個(gè)所述的多核苷酸在同樣的操縱子中，例如操縱子C。它們可被排列，使得所述載體(或最終的宿主)包含操縱子或序列，其中包含編碼一個(gè)或多個(gè)下述酶的序列，按順序是(核苷酸)轉(zhuǎn)移酶、(酰胺)合酶、(磷酸)轉(zhuǎn)移酶和/或(核苷酸)轉(zhuǎn)移酶、(芳基)轉(zhuǎn)移酶。因此，如果全部四個(gè)多核苷酸都出現(xiàn)的話，它們排列的順序優(yōu)選為SEQIDNos.7、1、3、5(或如前面所定義的上述序列的變異體)。編碼所述多肽的DNA序列優(yōu)選作為表達(dá)盒(或構(gòu)建體(construct))的一部分被導(dǎo)入合適的宿主，在所述表達(dá)盒(或構(gòu)建體)中，所述的DNA序列被可操作地連接到表達(dá)信號(hào)上，所述表達(dá)信號(hào)能夠指導(dǎo)所述DNA序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。對(duì)用表達(dá)構(gòu)建體對(duì)合適的載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化而言，轉(zhuǎn)化工序是可以獲得的，其被技術(shù)人員所熟知3，4。所述的表達(dá)構(gòu)建體可作為攜帶有選擇性標(biāo)志的載體的一部分用于對(duì)宿主的轉(zhuǎn)化，或者該表達(dá)構(gòu)建體可作為單獨(dú)的分子與攜帶有選擇性標(biāo)志的載體共同轉(zhuǎn)化。所述的載體可以包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)志基因。優(yōu)選的選擇性標(biāo)志15，16包括但不限于在宿主細(xì)胞中補(bǔ)償缺陷或賦予對(duì)藥物的抗性的那些。它們包括，例如可用于對(duì)細(xì)菌(例如E.coli)、大部分絲狀真菌或酵母的轉(zhuǎn)化的各種(versatile)標(biāo)志基因，例如乙酰胺酶基因或cDNA(來自A.nidulans、A.oryzae、A.niger的amdS、niaD、facA基因或cDNA)，或提供對(duì)G418、潮霉素、博來霉素、卡那霉素、腐草霉素等抗生素抗性的基因，或提供苯菌靈(benomyl)抗性的基因(benA)?；蛘?，可以使用特異性選擇標(biāo)記，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)志，其需要相應(yīng)的突變宿主菌株例如(來自S.cerevisiae的)URA3(或來自其它酵母的類似基因)、pyrG或pyrA(來自A.nidulans或A.niger)、argB(來自A.nidulans或A.niger)或者trpC。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的表達(dá)構(gòu)建體被導(dǎo)入之后，選擇標(biāo)志從經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中被除去，以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞能產(chǎn)生沒有選擇標(biāo)志基因的多肽21，22。其它標(biāo)志包括ATP合成酶、亞基9(oliC)、乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(pvrA)、細(xì)菌的G418抗性基因(其也可以在酵母中使用，但不能在真菌中使用)、氨芐青霉素抗性基因(E.coli)、新霉素抗性基因(Bacillus)和編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase，GUS)的E.coli的uidA基因。載體可以在體外使用，例如用于RNA的生產(chǎn)或用來轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。對(duì)大多數(shù)(絲狀)真菌、酵母或細(xì)菌而言，所述的載體或表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選被整合到例如宿主細(xì)胞的基因組中去，以獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。然而，對(duì)某些酵母來說，為了穩(wěn)定及高水平的表達(dá)，合適的附加型載體(episomalvectors)也是可以利用的，所述的表達(dá)構(gòu)建體可以被插入進(jìn)去，其例子包括分別來自Saccharomyces和Kluyveromyces的2μ和pKD1質(zhì)粒的載體，或含有AMA序列(例如，來自Aspergillus的AMA13，20)的載體。在表達(dá)構(gòu)建體被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的情況下，所述的構(gòu)建體或者被整合到基因組中的隨機(jī)基因座，或者運(yùn)用同源重組被整合到預(yù)定的目標(biāo)基因座，在此情況下目標(biāo)基因座優(yōu)選包含高度表達(dá)的基因。高度表達(dá)的基因是其mRNA占到細(xì)胞總mRNA中至少0.01％(w/w)的基因，例如，在誘導(dǎo)條件下，或者，是其基因產(chǎn)物占到細(xì)胞總蛋白的至少0.2％(w/w)的基因(或者，對(duì)分泌的基因產(chǎn)物而言，能分泌到至少0.05g/l的水平)。合適的高度表達(dá)的基因的多個(gè)例子將在下面提供。用于給定的宿主細(xì)胞的載體或表達(dá)構(gòu)建體可以包含如下元件，它們以5’端到3’端的連續(xù)順序，互相可操作地連接，這是相對(duì)于編碼第一發(fā)明的多肽序列的編碼鏈而言的(1)啟動(dòng)子序列，所述序列能指導(dǎo)編碼所述多肽的DNA序列在給定的宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄；(2)可選地，信號(hào)序列，所述序列能指導(dǎo)所述的多肽從給定的宿主細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌；(3)DNA序列，所述序列編碼所述多肽的成熟形式，優(yōu)選地，編碼所述多肽的活性形式；以及優(yōu)選地(4)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(終止子)，所述區(qū)域能終止編碼所述多肽的DNA序列的下游轉(zhuǎn)錄。在編碼所述多肽的DNA序列的下游可以有3’非翻譯區(qū)域，所述區(qū)域含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(例如終止子)。終止子的起點(diǎn)相對(duì)并不重要。所述的終止子可以例如是編碼所述多肽的DNA序列原有的。然而，優(yōu)選在酵母宿主細(xì)胞中使用酵母的終止子，在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用絲狀真菌的終止子，以及在細(xì)菌細(xì)胞中使用細(xì)菌的終止子。更優(yōu)選地，所述的終止子是所述宿主細(xì)胞(其中將要表達(dá)編碼所述多肽的DNA序列)內(nèi)源的。編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的增強(qiáng)表達(dá)也可以通過選擇異源調(diào)控區(qū)域來獲得，例如，啟動(dòng)子和/或終止區(qū)域，其可以用于提高表達(dá)，以及如果需要的話，提高關(guān)注的蛋白從表達(dá)宿主中分泌的水平，和/或提供對(duì)本發(fā)明多肽表達(dá)的誘導(dǎo)型控制。除編碼本發(fā)明多肽的基因原有的啟動(dòng)子之外，其它的啟動(dòng)子也可以被用于指導(dǎo)本發(fā)明多肽的表達(dá)?？梢葬槍?duì)所述啟動(dòng)子在期望的表達(dá)宿主中指導(dǎo)本發(fā)明多肽表達(dá)的效率來對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行選擇。啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控信號(hào)可以被加以選擇，以使其與宿主細(xì)胞相容，表達(dá)載體是為所述的宿主細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。例如，原核啟動(dòng)子可被使用，特別是那些適合用于E.coli株系的。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中開展表達(dá)時(shí)，可以使用哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子，例如肝細(xì)胞的細(xì)胞特異性啟動(dòng)子也是可以使用的。還可以使用病毒啟動(dòng)子，例如莫洛尼鼠類白血病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Moloneymurineleukaemiaviruslongterminalrepeat，MMLVLTR)啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(roussarcomavirus，RSV)LTR啟動(dòng)子、SV40(例如大T抗原)啟動(dòng)子、人類巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)IE啟動(dòng)子、單純皰疹病毒啟動(dòng)子或腺病毒啟動(dòng)子、HSV啟動(dòng)子(例如HSVIE啟動(dòng)子)或HPV啟動(dòng)子，特別是HPV的上游調(diào)控區(qū)域(upstreamregulatoryregion，URR)。酵母啟動(dòng)子包括S.cerevisiae的GAL4和ADH啟動(dòng)子、S.pombe的nmt1和adh啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子包括可以被鎘等重金屬誘導(dǎo)的金屬硫蛋白啟動(dòng)子以及β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子，特別是內(nèi)皮細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(例如DDAHI及DDAHII啟動(dòng)子)是特別優(yōu)選的。各種各樣能指導(dǎo)本發(fā)明宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子15，16可以被使用。所述的啟動(dòng)子序列優(yōu)選源自前面定義的高度表達(dá)的基因。優(yōu)選的高度表達(dá)的基因例子包括但不限于編碼糖酵解酶的基因，例如丙糖磷酸異構(gòu)酶(triose-phosphateisomerase，TPI)、甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase，PGK)、丙酮酸激酶(pyruvatekinase，PYK)、醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase，ADH)，以及編碼淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白質(zhì)的基因；啟動(dòng)子優(yōu)選來自上述高度表達(dá)的基因，和/或上述基因被包含于優(yōu)選的預(yù)定目標(biāo)基因座中，所述基因座是用于表達(dá)構(gòu)建體的整合的。合適的高度表達(dá)的基因的特殊例子包括例如來自Kluyveromycessp.的LAC4基因、分別來自Hansenula和Pichia的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)、來自A.niger和A.awamori的葡糖淀粉酶(glucoamylase，glaA)基因、A.oryzae的TAKA-淀粉酶基因、A.nidulans的gpdA基因以及T.reesei的纖維二糖水解酶基因。優(yōu)選的用于真菌表達(dá)宿主的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子和/或誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子的例子是可以從真菌的木聚糖酶(xylanase，xlnA)、肌醇六磷酸酶、ATP-合成酶、亞基9(oliC)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、醇脫氫酶(AdhA)、α-淀粉酶(α-amylase，amy)、淀粉葡糖苷酶(amyloglucosidase，AG-來自glaA基因)、乙酰胺酶(acetamidase，amdS)以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)基因啟動(dòng)子中獲得的那些。酵母強(qiáng)啟動(dòng)子的例子是可以從醇脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因中獲得的那些。細(xì)菌強(qiáng)啟動(dòng)子的例子是α-淀粉酶及SPo2的啟動(dòng)子，以及來自胞外蛋白酶基因的啟動(dòng)子。適合于植物細(xì)胞的啟動(dòng)子包括napaline合酶(napalinesynthase，nos)、章魚氨酸合酶(octopinesynthase，ocs)、甘露氨酸合酶(mannopinesynthase，mas)、核酮糖小亞基(ribulosesmallsubunit，rubiscossu)、組蛋白、水稻肌動(dòng)蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus，CMV)35S及19S和環(huán)狀病毒的啟動(dòng)子。上述所有啟動(dòng)子在本領(lǐng)域中都是容易獲得的。所述的載體可以進(jìn)一步地包括產(chǎn)生RNA的多核苷酸側(cè)翼的序列，所述側(cè)翼序列中包含與真核基因組序列同源的序列，優(yōu)選是哺乳動(dòng)物基因組序列或病毒基因組序列。這將允許本發(fā)明的多核苷酸通過同源重組被導(dǎo)入到真核細(xì)胞或病毒的基因組中。具體而言，包含側(cè)翼有病毒序列的表達(dá)盒的質(zhì)粒載體可被用于制備病毒載體，所述病毒載體適于將本發(fā)明的多核苷酸引入哺乳細(xì)胞。其它合適的病毒載體的例子包括單純皰疹病毒載體18，19和逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒(lentivirus)、腺病毒、腺伴隨病毒和HPV病毒(例如HPV-16或HPV-18)。使用上述病毒的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒可以被用來將產(chǎn)生反義RNA的多核苷酸穩(wěn)定地整合到到宿主基因組中。與此相反，復(fù)制缺陷型腺病毒載體保持游離狀態(tài)(episomal)，并因此允許暫時(shí)的表達(dá)。所述的載體可以含有定位于反義方向的本發(fā)明的多核苷酸，用以進(jìn)行反義RNA的生產(chǎn)。如果期望的話，這可以用于降低所述多肽的表達(dá)水平。對(duì)細(xì)菌而言，可以使用專門的載體，例如表達(dá)載體或質(zhì)粒。用于Propionibacteria的合適的載體及表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的27，28，30。例如人們可以使用來自其它Propionibacterium菌種，例如P.acidipropionici的質(zhì)粒。該質(zhì)?？捎糜谥苽浯┧筝d體(例如pPK705)，所述穿梭載體含有P.acidipropionici質(zhì)粒的六個(gè)開放閱讀框中的一個(gè)或多個(gè)。該載體可以含有一個(gè)藥物標(biāo)志，例如潮霉素B抗性基因。該載體已能夠成功轉(zhuǎn)化Propionibacteriumfreudenreichii的亞種shermanii。轉(zhuǎn)化可以通過電穿孔進(jìn)行。若干特別適合于Propionibacterium的啟動(dòng)子可以被使用，特別是來自Propionibacteriumfreudenreichii亞種shermanii的。上述啟動(dòng)子包括Propionibacterium細(xì)菌的啟動(dòng)子P4和P138?；蛘撸蛄硗?，人們可以使用一個(gè)或多個(gè)Propionibacterium的內(nèi)源質(zhì)粒，或來自上述質(zhì)粒的載體，以在細(xì)菌中表達(dá)優(yōu)選為異源的蛋白質(zhì)。上述的質(zhì)粒和載體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的29，其可以基于來自Propionibacterium細(xì)菌LMG16545(保藏登記號(hào)CBS101022及CBS101023)的質(zhì)粒。宿主細(xì)胞及表達(dá)在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法，所述的方法包括在能提供編碼所述多肽的編碼序列的(通過載體的)表達(dá)的條件下，培養(yǎng)(例如用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的)宿主細(xì)胞，并且可選地，回收表達(dá)的多肽。本發(fā)明的多核苷酸可以被插入到重組可復(fù)制(replicable)載體中去，例如表達(dá)載體中。該載體可以用來在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制所述的核酸。其可能含有本發(fā)明多核苷酸的至少一個(gè)拷貝(例如多個(gè)拷貝)。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制造本發(fā)明多核苷酸的方法通過向可復(fù)制載體中導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸，向相容的宿主細(xì)胞中導(dǎo)入所述的載體，以及在能導(dǎo)致載體復(fù)制的條件下培育宿主細(xì)胞。該載體可以從宿主細(xì)胞中回收。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌，優(yōu)選是革蘭氏陽性的，例如Propionibacteriaceae科的。其它包括E.coli、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系以及其它真核細(xì)胞系，例如昆蟲細(xì)胞，例如Sf9細(xì)胞和(例如絲狀的)真菌細(xì)胞。所述的多肽可以作為(分泌的)蛋白質(zhì)來生產(chǎn)，在此情況下，表達(dá)構(gòu)建體中編碼所述多肽的成熟形式的DNA序列被可操作地連接到編碼信號(hào)序列的DNA序列上。優(yōu)選地，該信號(hào)序列與編碼所述多肽的DNA序列來自同一物種(同源)。或者，該信號(hào)序列對(duì)編碼所述多肽的DNA序列來說是外來的(異源的)，在此情況下，該信號(hào)序列優(yōu)選是宿主細(xì)胞內(nèi)源的，其中所述的DNA序列表達(dá)于該宿主細(xì)胞。對(duì)酵母宿主細(xì)胞而言，合適的信號(hào)序列是從酵母α-因子基因得到的信號(hào)序列。類似地，對(duì)絲狀真菌宿主細(xì)胞而言合適的信號(hào)序列是例如，從絲狀真菌的淀粉葡糖苷酶(AG)基因，例如A.niger的glaA基因得到的信號(hào)序列。其可以與淀粉葡糖苷酶(也叫作(葡糖)淀粉酶))啟動(dòng)子本身組合使用，也可以與其它啟動(dòng)子組合。根據(jù)本發(fā)明的上下文，還可以使用雜交信號(hào)序列(hybridsignalsequence)。合適的異源分泌引導(dǎo)序列是那些來自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18個(gè)和24個(gè)氨基酸的形式，例如來自Aspergillus的)、α-因子基因(酵母，例如Saccharomyces和Kluyveromyces的)或(Bacillus的)α-淀粉酶基因的序列?？筛鶕?jù)上文所述，將所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞中，以提供本發(fā)明多肽的表達(dá)或維生素B12的生產(chǎn)。該方法可以包括在提供編碼所述多肽的編碼序列通過載體表達(dá)的條件下，按上文所述培養(yǎng)經(jīng)過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面因此提供了用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，或包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述的多核苷酸被載體攜帶，用于多核苷酸的復(fù)制和表達(dá)。所述的細(xì)胞將被進(jìn)行選擇，以與所述的載體相容，其可以是例如原核(例如細(xì)菌)、真菌、酵母或植物細(xì)胞。本發(fā)明包含生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法通過編碼所述多肽的DNA序列的重組表達(dá)來進(jìn)行。就此目的而言，本發(fā)明的DNA序列可被用于基因擴(kuò)增和/或表達(dá)信號(hào)的交換，以使所述的多肽在適合的同源或異源宿主細(xì)胞中得以經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)，所述表達(dá)信號(hào)例如是啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列。同源宿主細(xì)胞在此被定義為與獲得所述DNA序列的物種相同的物種的宿主細(xì)胞，或該相同物種的變異體的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以是原核微生物，例如細(xì)菌，或者是真核生物，例如真菌，例如酵母或絲狀真菌，或者是植物細(xì)胞。一般來說，酵母細(xì)胞比真菌細(xì)胞更為優(yōu)選，因?yàn)樗鼈兏撞僮?。然而，某些蛋白質(zhì)或者是很少?gòu)慕湍钢蟹置冢蛘咴谀承┣闆r下不能被正確加工(例如，酵母中的過度糖基化)。在上述情況下，可以選擇真菌或細(xì)菌宿主生物。對(duì)維生素B12的生產(chǎn)而言，原核或細(xì)菌宿主是優(yōu)選的。所述的宿主細(xì)胞可以過量表達(dá)所述的多肽，設(shè)計(jì)過量表達(dá)的技術(shù)是公知的3。該宿主因此可以具有兩個(gè)或多個(gè)編碼多核苷酸的拷貝(并且，所述的載體因此可以具有兩個(gè)或多個(gè)拷貝)。來自Bacillus屬的細(xì)菌是合適的異源宿主，因其能向培養(yǎng)基中分泌蛋白質(zhì)。其它適于用作宿主的細(xì)菌是Streptomyces屬和Pseudomonas屬的。然而，優(yōu)選地，宿主來自與從中獲得本發(fā)明多核苷酸的細(xì)菌(P.freudenreichii)相同的(例如放線菌)目或(Propionibacteriaceae)科。用于編碼所述多肽的DNA序列的表達(dá)的優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞是Saccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula、Pichia、Yarrowia和Schizosaccharomyces屬的。更優(yōu)選地，酵母宿主細(xì)胞選自由如下物種Saccharomycescerevisiae、Kluyveromyceslactis(也叫Kluyveromycesmarxianusvar.lactis)、Hansenulapolymorpha、Pichiapastoris、Yarrowialipolytica和Schizosaccharomycespombe構(gòu)成的組。然而，最優(yōu)選的是(例如絲狀)真菌宿主細(xì)胞。優(yōu)選的絲狀真菌宿主細(xì)胞選自由Aspergillus、Trichoderma、Fusarium、Disporotrichum、Penicillium、Acremonium、Neurospora、Thermoascus、Myceliophtora、Sporotrichum、Thielavia和Talaromyces屬構(gòu)成的組。更優(yōu)選地，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Aspergillusoyzae、Aspergillussojae、Aspergillusnidulans種的，或是Aspergillusniger類(group)中的種的23。上述細(xì)胞包括但不限于Aspergillusniger、Aspergillusawamori、Aspergillustubingensis、Aspergillusaculeatus、Aspergillusfoetidus、Aspergillusnidulans、Aspergillusjaponicus、Aspergillusoryzae和Aspergillusficuum，以及進(jìn)一步地由Trichodermareesei、Fusariumgraminearum、Penicilliumchrysogenum、Acremoniumalabamense、Neurosporacrassa、Myceliophtorathermophilum、Sporotrichumcellulophilum、Disporotrichumdimorphosporum和Thielaviaterrestris種構(gòu)成。在本發(fā)明范疇之內(nèi)的表達(dá)宿主的例子是真菌，例如Aspergillus的種31，32和Trichoderma的種；細(xì)菌，例如Bacillus的種33，34，例如Bacillussubtilis、Bacilluslicheniformis、Bacillusamyloliquefaciens，Pseudomonas的種；以及酵母，例如Kluyveromyces的種35，例如Kluyveromyceslactis36，和Saccharomyces的種，例如Saccharomycescerevisiae。宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和重組生產(chǎn)[cobA或cbiA]本發(fā)明還包括被修飾以表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞。該宿主優(yōu)選具有所述多核苷酸的至少兩個(gè)或多個(gè)拷貝。此類細(xì)胞包括臨時(shí)的(transient)或優(yōu)選為穩(wěn)定的高等真核細(xì)胞系，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞，低等真核細(xì)胞，例如酵母和(例如絲狀)真菌細(xì)胞或原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞(例如放線菌目的)。對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)而言，還可以將其暫時(shí)表達(dá)于細(xì)胞系中或表達(dá)于膜上，比方說，表達(dá)在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)本發(fā)明多肽的生產(chǎn)可以通過在傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)已經(jīng)一種或多種本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化的微生物表達(dá)宿主來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域已知的工序來培養(yǎng)。對(duì)啟動(dòng)子和宿主細(xì)胞的每種組合而言，有益于編碼所述多肽的DNA序列的表達(dá)和/或有益于維生素B12的生產(chǎn)的培養(yǎng)條件是可以獲得的。達(dá)到期望的細(xì)胞密度或效價(jià)之后，培養(yǎng)可以停止，使用已知的工序來回收所述的多肽或維生素。發(fā)酵培養(yǎng)基可以包含碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜、纖維素、β-葡聚糖等)和(無機(jī))氮源(例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等)和/或(有機(jī))氮源(例如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨等)。無機(jī)營(yíng)養(yǎng)源(例如磷酸、鎂、鉀、鋅、鐵等)和/或誘導(dǎo)物(例如纖維素、β-葡聚糖、麥芽糖或麥芽糖糊精)可以存在。對(duì)合適培養(yǎng)基的選擇可以基于對(duì)表達(dá)宿主的選擇和/或基于所述表達(dá)構(gòu)建體的調(diào)控需要。上述培養(yǎng)基對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。如果期望的話，該培養(yǎng)基可以含有其它成分，所述成分更有利于經(jīng)過轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主而不是其它潛在的污染性微生物。發(fā)酵可以開展0.5-30天的時(shí)間。其可以是分批的、連續(xù)的或分批進(jìn)料(fed-batch)的過程，溫度適于在0℃到45℃的范圍內(nèi)，以及例如，pH在2至10之間。優(yōu)選的發(fā)酵條件是溫度處于20℃到37℃的范圍內(nèi)和/或pH在3和9之間。對(duì)適當(dāng)條件的選擇通?；趯?duì)表達(dá)宿主的選擇和對(duì)被表達(dá)的蛋白的選擇。發(fā)酵之后，如果必要的話，可以通過離心或過濾的手段將細(xì)胞從發(fā)酵培養(yǎng)液中移出。在發(fā)酵停止之后或細(xì)胞被移出之后，可以回收本發(fā)明的多肽，如果期望的話，可以通過傳統(tǒng)手段對(duì)其進(jìn)行純化和分離。D.所述多肽在生物合成途徑中以及生產(chǎn)維生素B12中的用途(反應(yīng)/酶)A酰胺化((酰胺)合酶)本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及酰胺化的方法，或用于制備胺的方法，所述的方法包括用本發(fā)明的多肽與底物相接觸。該方法因此包括對(duì)底物進(jìn)行酰胺化。所述的多肽優(yōu)選為合酶，例如酰胺合酶。所述的多肽可以是具有SEQIDNo.2序列的多肽，或如前面，例如第一方面所定義的其變異體或片段?；蛘撸摱嚯目梢允莵碜訫ycobacteriaceae科的細(xì)菌的合酶，例如Propionibacterium屬的，特別是Propionibacteriumfreudenreichii種的。所述的方法可以在谷氨酰胺存在的情況下進(jìn)行。谷氨酰胺在反應(yīng)中可以被轉(zhuǎn)化成谷氨酸。所述的多肽可以具有將羥基轉(zhuǎn)化為胺或?qū)Ⅳ然?COOH)轉(zhuǎn)化為羧基酰胺基團(tuán)(CONH2)的能力。該方法得到的產(chǎn)物因此可以是一級(jí)胺。所述的方法可以重復(fù)，因?yàn)樗龅亩嚯目梢詫?duì)底物進(jìn)行兩次酰胺化，換句話說可以在底物的(不同)取代基上產(chǎn)生兩個(gè)(優(yōu)選為一級(jí))胺的基團(tuán)。因此，該方法可以包括將第一個(gè)羧基轉(zhuǎn)化為羧基酰胺基團(tuán)(carboxyamidegroup)。該過程可以重復(fù)，第二個(gè)羧基也可以被轉(zhuǎn)化成羧基酰胺基團(tuán)。以這種方式，該方法可以包括兩次酰胺化，例如產(chǎn)生兩個(gè)單獨(dú)的(例如一級(jí))胺。(第二次)酰胺化優(yōu)選發(fā)生于底物的不同取代基(例如羧基)上。優(yōu)選地，所述的底物是鈷啉酸或鈷啉酸c-酰胺和/或所述的產(chǎn)物是鈷啉酸c-酰胺或鈷啉酸-a，c-二酰胺。在此反應(yīng)中，谷氨酰胺可以被轉(zhuǎn)化為谷氨酸。谷氨酰胺的添加量或存在量可以是鈷啉酸的大約兩倍(換言之，谷氨酰胺的摩爾濃度是鈷啉酸摩爾濃度的大約兩倍)。這是因?yàn)殁掃岬谝淮伪货０坊赦掃醕-酰胺；作為中間產(chǎn)物，鈷啉酸c-酰胺再在第二次酰胺化反應(yīng)中被酰胺化得到鈷啉酸a，c-二酰胺。因此，該方法中的多肽優(yōu)選為鈷啉酸a，c-二酰胺合酶(例如cobA或cbiA)。所述的多肽可以具有EC6.3.1.-中的活性。B1(磷酸)轉(zhuǎn)移酶(磷酸化)[cobU]本發(fā)明還涉及磷酸化的方法，或用于制備含磷酸化合物的方法，所述的方法包括用本發(fā)明的多肽與底物相接觸。所述的多肽優(yōu)選包含SEQIDNo.4，或如前面定義的其變異體或片段?；蛘?，該多肽可以是來自Mycobacteriaceae科的細(xì)菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶，例如Propionibacterium屬的，特別是Propionibacteriumfreudenreichii種的。該方法因此包括對(duì)底物進(jìn)行磷酸化(或?qū)⒘姿峄鶊F(tuán)加到底物上)。該方法可以在核苷酸(例如，三)磷酸，例如ATP存在的情況下進(jìn)行。所述的底物可以包含核苷酸，例如包括腺苷的核苷酸。該方法優(yōu)選包括對(duì)磷酸部分的(從一個(gè)化合物到另一個(gè)化合物，例如到底物的)轉(zhuǎn)移，例如對(duì)羥基(OH)進(jìn)行磷酸化以形成磷酸基團(tuán)(-PO4-)。所述的多肽因此可以作為磷酸轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用，以醇基團(tuán)(例如羥基)作為接納體(acceptor)。優(yōu)選地，所述的底物是腺苷鈷啉醇酰胺(分子式II)和/或產(chǎn)物是腺苷鈷啉醇酰胺磷酸(分子式IIA)。該方法可以另外包含核苷酸三磷酸到核苷酸二磷酸(例如，ATP到ADP)的轉(zhuǎn)化。所述的多肽因此可以是鈷啉醇酰胺激酶(例如cobU)。其優(yōu)選具有EC2.7.1.-中的活性。B2(核苷酸)轉(zhuǎn)移酶(核苷酸化)在本方面，本發(fā)明涉及核苷酸化的方法，或用于制備含核苷酸化合物的方法，所述的方法包括用多肽與底物相互作用，所述多肽是核苷酸轉(zhuǎn)移酶。該多肽可以與上面B1中所述的相同。這是因?yàn)樵?被稱作B的)(第二個(gè))酶具有雙重功能，其是一個(gè)雙功能酶。因此酶B可以作為一般的(general)轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用，轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)及核苷酸基團(tuán)。因此其既可以作為磷酸轉(zhuǎn)移酶(B1)發(fā)揮作用，又可以作為核苷酸轉(zhuǎn)移酶(B2)來發(fā)揮作用。被稱作B2的第二功能涉及所述的酶作為含有核苷酸的轉(zhuǎn)移酶的活性。因此該方法優(yōu)選包括對(duì)底物進(jìn)行核苷酸化，例如(對(duì)底物)進(jìn)行鳥苷酸化。所述的底物優(yōu)選將包含至少一個(gè)磷酸基團(tuán)。適合地，所述的多肽能夠?qū)α姿峄鶊F(tuán)進(jìn)行核苷酸化。所述的方法可以在(例如三)磷酸核苷，例如GTP存在的情況下進(jìn)行。因此在該方法中，所述的多肽優(yōu)選催化磷酸基團(tuán)的鳥苷酸化(guanidylation)。優(yōu)選地，所述的底物是腺苷鈷啉醇酰胺磷酸(分子式IIA)和/或所述的產(chǎn)物是腺苷-GDP-鈷啉醇酰胺(分子式IIB)。因此所述的酶可以催化含核苷酸化合物的形成，例如腺苷-GDP-鈷啉醇酰胺，其來自底物，例如腺苷鈷啉醇酰胺磷酸。該多肽因此可以是(核苷酸)轉(zhuǎn)移酶，或者具有EC2.7.7.-中的活性。該多肽的其它優(yōu)選特征參見前面關(guān)于磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(B1)的章節(jié)中所述。C芳基化(芳基轉(zhuǎn)移酶)或三氮唑核苷(ribazole)的添加[cobS]本發(fā)明的這一方法包括芳基化或?qū)蓟衔锏闹苽洌摲椒òㄓ帽景l(fā)明的多肽，優(yōu)選為(例如芳基)轉(zhuǎn)移酶，與底物相接觸。該多肽優(yōu)選包含SEQIDNo.6，或按照前面所定義的其變異體或片段。或者，該多肽可以是來自Mycobacteriaceae科的細(xì)菌的芳基轉(zhuǎn)移酶，例如Propionibacterium屬的，特別是Propionibacteriumfreudenreichii種的。該方法因此包括對(duì)底物進(jìn)行芳基化。(例如三氮唑核苷中的，例如經(jīng)過反應(yīng)轉(zhuǎn)移來的)芳基部分可以包含芳香環(huán)系統(tǒng)。該芳基部分可以包含一個(gè)或兩個(gè)芳香環(huán)。所述的環(huán)系統(tǒng)可以被一個(gè)至四個(gè)C1-8烷基取代。所述的芳基部分可以不包含雜原子或包含一個(gè)或兩個(gè)雜原子，例如一個(gè)或兩個(gè)氮原子。優(yōu)選地，該芳基部分包含苯并咪唑環(huán)。所述的方法因此可以包括對(duì)含(例如二甲基(dimethyl))苯并咪唑(benzimidazole，DMB)化合物的制備。所述的芳基可以結(jié)合或連接(join)到(中心)金屬原子上，例如鈷原子?；蛘撸蛄硗?，該芳基還可以結(jié)合到碳原子上，例如核糖基團(tuán)中的碳原子。(在反應(yīng)產(chǎn)物中，即得到的含苯并咪唑的化合物中)該芳基部分優(yōu)選既結(jié)合到鈷原子又結(jié)合到核糖基團(tuán)上。所述的方法可以在三氮唑核苷存在的情況下進(jìn)行，例如α-三氮唑核苷。其可以以與所述底物大約相等的摩爾數(shù)量而存在。該反應(yīng)可以包括(向底物中)添加alpha-三氮唑核苷。所述的底物優(yōu)選為腺苷-GDP-鈷胺酰胺。反應(yīng)產(chǎn)物，含芳基的化合物，優(yōu)選為腺苷-5，6-二甲基苯并咪唑鈷胺酰胺(分子式IIC)。在反應(yīng)過程中，苯并咪唑可以轉(zhuǎn)化為GMP。在該方法中使用的多肽優(yōu)選為鈷胺素(5’-磷酸)合酶(例如cobS)。所述的多肽可以具有EC2.7.8.-的活性。D腺苷化(腺苷轉(zhuǎn)移酶)本發(fā)明的這一方法涉及腺苷化，或?qū)佘栈衔锏闹苽洌龅姆椒òㄓ帽景l(fā)明的多肽，優(yōu)選為轉(zhuǎn)移酶，例如腺苷轉(zhuǎn)移酶與底物相接觸。所述的多肽優(yōu)選包含SEQIDNo.7，或如前面所定義的其片段或變異體?；蛘撸摱嚯目梢允莵碜訫ycobacteriaceae科細(xì)菌的轉(zhuǎn)移酶，例如Propionibacterium屬的，特別是Propionibacteriumfreudenreichii種的。該方法因此包括對(duì)底物進(jìn)行腺苷化。該方法因此包括腺苷的轉(zhuǎn)移，優(yōu)選轉(zhuǎn)移到底物上。所述的腺苷優(yōu)選結(jié)合到金屬原子上，例如過渡金屬(例如第一系的)，例如鈷。所述的底物(和/或產(chǎn)物)可以是酰胺，例如二酰胺。優(yōu)選地，底物是鈷啉酸a，c-二酰胺和/或產(chǎn)物是腺苷鈷啉酸a，c-二酰胺。該方法可以在(例如三)磷酸核苷，例如ATP存在的情況下進(jìn)行。其也可以進(jìn)行于腺苷存在的情況下。優(yōu)選地，腺苷和磷酸核苷都以與底物大約相等的摩爾數(shù)量存在。所述的三磷酸核苷可被轉(zhuǎn)化為二磷酸核苷。該方法中的多肽優(yōu)選為腺苷轉(zhuǎn)移酶。其可以具有EC2.5.1.7中的活性。該多肽優(yōu)選是能轉(zhuǎn)移烷基或芳香基而非甲基的轉(zhuǎn)移酶。進(jìn)行甲基化或?qū)е录谆亩嚯目梢砸虼吮慌懦谕狻?經(jīng)催化的反應(yīng)的)底物(或產(chǎn)物)維生素B12的中間產(chǎn)物和/或前體所述的底物和/或產(chǎn)物優(yōu)選包含咕啉核心或環(huán)系統(tǒng)。其優(yōu)選包含具有達(dá)到四個(gè)(可以是相同的也可以是不同的)環(huán)的芳香環(huán)系統(tǒng)。然而，優(yōu)選是四個(gè)環(huán)，并且它們都是相同的。每個(gè)環(huán)可以含有一個(gè)或兩個(gè)雜原子，例如一個(gè)氮原子。所述的環(huán)可以是五邊形的。因此優(yōu)選的環(huán)是吡咯，并且因此所述的環(huán)系統(tǒng)優(yōu)選包含四吡咯系統(tǒng)。優(yōu)選地，吡咯環(huán)中的兩個(gè)互相連接，另外兩個(gè)通過橋(bridge)來連接，例如通過亞甲基單元。所述的環(huán)系統(tǒng)可以包含金屬原子，例如在其核心處。該金屬可以是過渡金屬，例如第一系的(VIII組)。其可以是第四周期的。優(yōu)選地，該金屬是鈷，其可以是單個(gè)的中心鈷原子。該環(huán)系統(tǒng)可以是連上了酰胺、磷酸、鳥苷或腺苷部分或基團(tuán)的。除金屬原子和環(huán)系統(tǒng)之外，還可以有第五個(gè)取代基，可選地，甚至有第六個(gè)取代基，例如結(jié)合到金屬上的。該取代基或每個(gè)取代基可以適宜地在環(huán)平面之上和/或之下。適當(dāng)時(shí)(以及對(duì)維生素B12而言)，上述取代基中的一個(gè)可以包含腺苷基團(tuán)，例如雙氧腺苷，優(yōu)選為5’-雙氧腺苷。另一個(gè)取代基可以是上面關(guān)于芳基化的章節(jié)C中所定義的芳基，因此該取代基優(yōu)選可以包含二甲氧苯并咪唑(dimethoxybenzimidazole)。在本發(fā)明用到的底物中，可以出現(xiàn)一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)取代基，因此鈷原子可以具有作為第五和第六取代基的5’-雙氧腺苷和二甲氧苯并咪唑基團(tuán)。與所述底物的優(yōu)選特征相同的優(yōu)選特征適用于所述的反應(yīng)產(chǎn)物。在維生素B12生物合成途徑中的酶的功能之后，下面提供了上述五個(gè)經(jīng)催化的反應(yīng)或生物合成步驟中的底物和產(chǎn)物的表。A(cobA)B(cobU)C(cobS)UroIII→→→→鈷啉醇酰胺→鈷啉醇酰胺-P→維生素B12分子式通用名反應(yīng)/生物合成步驟酶I鈷啉酸↓A酰胺合酶IA鈷啉酸c-酰胺↓A酰胺合酶IB鈷啉酸a，c-二酰胺↓D(腺苷)轉(zhuǎn)移酶IC腺苷鈷啉酸a，c-二酰胺II腺苷鈷啉醇酰胺↓B1(磷酸)轉(zhuǎn)移酶(cobU)IIA腺苷鈷啉醇酰胺磷酸↓B2(核苷酸)轉(zhuǎn)移酶(cobU)IIB腺苷-GDP-鈷胺酰胺↓C(苯并咪唑)轉(zhuǎn)移酶(cobS)IIC腺苷-5，6-二甲基苯并咪唑鈷胺酰胺(維生素B12)優(yōu)選的中間產(chǎn)物或前體包括鈷啉醇酰胺、鈷啉醇酰胺-P(磷酸)或分子式IA、IB、II、IIA、IIB或IIC的化合物。因此，本發(fā)明的方法可以包含下述步驟中的一個(gè)或多個(gè)(用化學(xué)公式闡述)，即分子式I↓(酰胺)合酶(A)(SEQIDNo.2或其變異體等)分子式IA↓(酰胺)合酶(A)(SEQIDNo.2或其變異體等)分子式IB↓酰胺轉(zhuǎn)移酶(D)(SEQIDNo.8或其變異體等)分子式IC分子式II↓(磷酸)轉(zhuǎn)移酶(B1)(SEQIDNo.4或其變異體等)分子式IIA↓(核苷酸)轉(zhuǎn)移酶(B2)(SEQIDNo.4或其變異體等)分子式IIB↓(苯并咪唑)轉(zhuǎn)移酶(C)(SEQIDNo.6或其變異體等)分子式IIC(包括維生素B12)E維生素B12的工業(yè)制備如上所述，本發(fā)明的多肽可被用于進(jìn)行維生素B12制備途徑中的一步或多步生物合成步驟。所述的多肽可與適當(dāng)?shù)牡孜锵嘟佑|，反應(yīng)可以發(fā)生。當(dāng)所述的多肽在(例如宿主)細(xì)胞外時(shí)，換言之所述的多肽與底物例如在體外混合時(shí)，上述反應(yīng)即可得以發(fā)生。然而，使用包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞是更有效得多的，以進(jìn)行維生素B12生物合成途徑中的一步或多步特別想要的步驟，或者，優(yōu)選地，使用該宿主細(xì)胞來生產(chǎn)維生素B12(或其中間產(chǎn)物或前體)。本發(fā)明因此還涉及制備維生素B12(或其前體)的方法，所述的方法包括在允許細(xì)胞生物合成(及由此生產(chǎn))維生素B12(或其前體)的條件下，培養(yǎng)一種或多種本發(fā)明的宿主細(xì)胞。該過程可以進(jìn)行于發(fā)酵罐中。所述的發(fā)酵罐可以是裝備有攪拌設(shè)備的，例如是攪拌器。該發(fā)酵容器還可以裝備有通氣設(shè)備，例如能導(dǎo)致含氧氣體與發(fā)酵罐中的液體相接觸的。所述的液體通常將是由細(xì)胞的水性懸浮液構(gòu)成的培養(yǎng)液。然后發(fā)酵可以被允許發(fā)生。發(fā)酵罐的最小體積可以是10、50、100、或1000升。所述的細(xì)胞可被供應(yīng)一種或多種碳源和/或氮源，例如在發(fā)酵開始以前供應(yīng)，在發(fā)酵起點(diǎn)供應(yīng)，或者在發(fā)酵期間不斷地或連續(xù)地供應(yīng)。在發(fā)酵終點(diǎn)，碳源或氮源的供應(yīng)停止，或者一種或多種上述來源可被耗完。每種碳源和/或氮源可以是復(fù)合來源或者有機(jī)或無機(jī)的化合物。然后可以將上述細(xì)胞移出發(fā)酵罐。在此之前或之后，可以將水(或水性液體)從細(xì)胞中移出。然后可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加熱或巴氏消毒以殺死它們。從微生物細(xì)胞中提取或分離維生素B12的方法是公知的45。例如，(為了能獲得維生素B12)，已生產(chǎn)出該維生素的宿主細(xì)胞優(yōu)選被破碎或者至少被部分地打開，以使得細(xì)胞(包含維生素B12的)的可溶性內(nèi)容的至少一部分被釋放到液體中，例如含有細(xì)胞的液體。人們?nèi)缓罂梢詮?包含維生素B12的)液體中分離打開的或破碎的細(xì)胞，或得到的細(xì)胞殘骸。(含有維生素B12的)微生物細(xì)胞因此可被處理，以導(dǎo)致細(xì)胞膜的瓦解。用于打開細(xì)胞的合適處理包括熱處理，例如巴氏消毒，在高壓滅菌器(autoclave)中加熱，用溶細(xì)菌的酶(例如溶菌酶)處理和/或機(jī)械性地瓦解細(xì)胞(碾碎或使用剪切工具(shearforces))或者化學(xué)試劑處理(以導(dǎo)致細(xì)胞裂解，例如用去垢劑或有機(jī)溶劑)。裂解或其它的膜瓦解的過程能夠產(chǎn)生出溶菌產(chǎn)物(lysate)，溶菌產(chǎn)物然后可被分離成固相和液相。包含細(xì)胞殘骸的溶菌產(chǎn)物的固相可以再(從含有維生素B12的液體中)被分離出來。很多適合的固液分離技術(shù)都是可用的，包括離心和/或過濾。然而，優(yōu)選使用超濾來進(jìn)行固液分離。優(yōu)選地，打開的/破碎的微生物細(xì)胞被洗滌，洗滌物再被合并到或被加入到與細(xì)胞殘骸相分離的(含有維生素B12的)液體中去。合適的洗滌包含滲濾(diafiltration)，適當(dāng)?shù)兀捎萌ルx子水。(含有維生素B12的)滲濾物然后可與(含有維生素B12的)液相合并到一起。含有維生素B12的液體可以再進(jìn)行干燥，例如噴霧干燥、流床干燥、凍干或真空干燥。優(yōu)選地，產(chǎn)生維生素B12的細(xì)胞在打開(裂解)之前被洗滌，因?yàn)檫@樣可以通過除去培養(yǎng)基成分來提高維生素B12在干物質(zhì)中的濃度。這可以采用滲濾來進(jìn)行，優(yōu)選采用去離子水。本發(fā)明一個(gè)方面的優(yōu)選的特征和特性在經(jīng)過適當(dāng)?shù)男薷暮罂捎糜诹硪粋€(gè)方面。現(xiàn)在將結(jié)合下述實(shí)施例來描述本發(fā)明，下述實(shí)施例僅僅用作闡述的目的，而不能用于限制本發(fā)明。實(shí)施例1Propionibacterium載體兩種菌株(P.freudenreichiiLMG16545及P.freudenreichiiLMG16546)被使用，所述菌株都顯示出了2種質(zhì)粒的相同質(zhì)粒特性(profile)。一種質(zhì)粒較大(大小未確定)；另一種則較小，更為富集地存在，其大小為3.6kb。上述來自LMG16545和LMG16546的3.6kb質(zhì)粒被選出來用于載體中的進(jìn)一步使用。來自上述載體的質(zhì)粒已被描述29。Propionibacteria中的表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)域內(nèi)已知30。E.coli/Propionibacterium穿梭載體的構(gòu)建1.7kb的Acc65I片段被插入到Acc65I線性化的pBR322ΔI中29，所述Acc65I片段來自SaccharopolysporaerythraeaNRRL2338紅霉素生物合成簇，并含有紅霉素抗性賦予基因(erythromycinresistanceconferringgene)37，38。新得到的構(gòu)建體被稱為pBRES，再用EcoRV對(duì)其線性化，并將其連接到已經(jīng)過BsaBI消化的p545DNA上。大腸桿菌轉(zhuǎn)化子被發(fā)現(xiàn)包含正確插入的載體，兩種方向的都有。得到的質(zhì)粒載體被命名為pBRESP36B1和pBRESP362B2(見圖2a及2b29)。也可以用在可能的復(fù)制區(qū)域外的其它限制性位點(diǎn)，即在AlwNI位點(diǎn)進(jìn)行線性化的p545DNA來獲得質(zhì)粒載體構(gòu)建體。對(duì)此種構(gòu)建而言，必須為pBRES載體提供合適的克隆位點(diǎn)。銜接體(adaptor)被設(shè)計(jì)出來，必需的寡核苷酸的退火生成了分別具有Acc65I和BglII粘性末端的雙鏈DNA片段，其還可以含有內(nèi)在的SfiI限制性位點(diǎn)，該位點(diǎn)提供了與經(jīng)AlwNI消化的p545質(zhì)粒相容的末端。所述的銜接體被克隆于pBRES中的BglII位點(diǎn)和鄰近的Acc65I位點(diǎn)之間。由此獲得的pBRES-Sfi載體隨后用SfiI消化并被連接到AlwNI消化過的p545上。通過限制性酶分析證實(shí)，對(duì)E.coli的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了有正確載體的轉(zhuǎn)化子。該獲得的載體被命名為pBRESP36A29。用E.coli/Propionibacterium穿梭載體對(duì)Propionibacterium的轉(zhuǎn)化用pBRESP36B1對(duì)Propionibacteriumfreudenreichii菌株ATCC6207的轉(zhuǎn)化將要被描述。在乳酸鈉培養(yǎng)液(sodiumlactatebroth，SLB)39中將所述的細(xì)菌細(xì)胞在30℃下培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)階段，隨后用新鮮的SLB進(jìn)行1∶50的稀釋。在30℃下培養(yǎng)大約20小時(shí)以后，收獲(現(xiàn)處于指數(shù)生長(zhǎng)階段的)細(xì)胞，并在冷的0.5M蔗糖中對(duì)其進(jìn)行洗滌。細(xì)胞隨后在電穿孔緩沖液中洗滌一次，所述電穿孔緩沖液包含0.5M蔗糖，用1mM的醋酸鉀進(jìn)行緩沖，pH5.5；最終將細(xì)胞重新懸浮于原始培養(yǎng)體積的大約1/100的電穿孔緩沖液中。整個(gè)過程中細(xì)胞被置于冰上。為進(jìn)行電穿孔(設(shè)備來自BIORAD)，80-100μl的細(xì)胞懸浮液與±1μg(或更少量的)DNA在冷的1或2mm的電穿孔小管中混合，并對(duì)其發(fā)出電脈沖。最適的脈沖條件被發(fā)現(xiàn)是在200Ω電阻及25μF電容下的25kV/cm。然而，更低的或更高的電壓(也可以在100Ω)也會(huì)產(chǎn)生出轉(zhuǎn)化子。脈沖之后，立即將900μl含有0.5M蔗糖的冷SLB加入到脈沖細(xì)胞懸浮液中，隨后在30℃下培養(yǎng)2.5至3個(gè)小時(shí)，之后將適當(dāng)?shù)南♂屛锿康胶?.5M蔗糖和10μg/ml紅霉素的SLB/瓊脂平板上。無氧條件下在30℃的5至7天的培養(yǎng)期之后，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行探測(cè)。從E.coliDH5α(Promega)中分離出的DNA得到的轉(zhuǎn)化效率為每μgDNA20-30個(gè)轉(zhuǎn)化子。當(dāng)DNA被分離自E.coliJM110(dam-、dcm-菌株)時(shí)，獲得了10-100倍的更高的效率。對(duì)E.coli的轉(zhuǎn)化是根據(jù)BIORAD的說明書來進(jìn)行的。轉(zhuǎn)化子含有真正的載體，與用于轉(zhuǎn)化ATCC6207的原始的質(zhì)粒DNA無法區(qū)別。這是通過對(duì)轉(zhuǎn)化子中分離出的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶分析顯示出來的，分離是通過前述的小量質(zhì)粒DNA分離工序進(jìn)行的。載體作為自主復(fù)制質(zhì)粒排外性地存在。對(duì)總DNA分離物進(jìn)行Southern印記雜交40顯示，染色體DNA不與用作探針的上述載體DNA雜交，這表明，沒有發(fā)生質(zhì)粒DNA的染色體整合。用載體pBRESP36B2和pBRESP36A進(jìn)行的轉(zhuǎn)化也是成功的，這表明所述載體的功能性獨(dú)立于p545的方向(orientation)或使用的克隆位點(diǎn)。在此情況下的載體真實(shí)性也是經(jīng)過驗(yàn)證的。另外，用從Propionibacterium轉(zhuǎn)化子中分離出的DNA對(duì)P.freudenreichii菌株ATCC6207進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率較之用分離自E.coliDH5α的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化所獲得的轉(zhuǎn)化效率，產(chǎn)生了105-106倍的增加。對(duì)另外一種P.freudenreichii菌株，LMG16545(與獲得p545質(zhì)粒的菌株相同的菌株)的轉(zhuǎn)化，得到了與ATCC菌株相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化效率。我們用SEQIDNos.1、3、5和7中的每一個(gè)重復(fù)了轉(zhuǎn)化，所述的序列可操作地連接到穿梭載體中適合的轉(zhuǎn)錄及翻譯起始信號(hào)上。實(shí)施例2含有酰胺合酶(A)基因的質(zhì)粒載體的構(gòu)建用于增加P.freudenreichii菌株ATCC6207中維生素B12(鈷胺素)的合成水平的質(zhì)粒載體的構(gòu)建和應(yīng)用將被描述。為構(gòu)建基因過量表達(dá)的質(zhì)粒，用到了來自P.freudenreichii的16SrRNA啟動(dòng)子。一種用于檢測(cè)含有啟動(dòng)子的片段的策略是使用啟動(dòng)子-探針載體。用于監(jiān)視啟動(dòng)子活性的報(bào)道基因編碼了易于探測(cè)的酶活性，該活性不存在于野生型菌株中。來自pACYC18417，42的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferase，cat)基因被用于構(gòu)建啟動(dòng)子-探針載體。為分析16SrRNA啟動(dòng)子的活性，該啟動(dòng)子被放置于cat基因的上游。為構(gòu)建所述的啟動(dòng)子-探針載體，通過PCR將無啟動(dòng)子的cat基因克隆到E.coli/Propionibacterium穿梭載體pBRESP36B229中去，得到載體pB2/PoCAT。上游的PCR引物包括序列5’-GGGATCCTCTAGAGCATGCAAGCTTCTCGAGAATCGATAGATCTCTAAGGAAGCTAAAATG-3’，其中最后三個(gè)核苷酸代表cat基因的起始密碼子。通過合成得到的該序列包括多克隆位點(diǎn)(multi-clongingsite，MCS)，含有限制性位點(diǎn)BamHI、XbaI、HindIII、SphI、XhoI、ClaI和BglII。下游PCR引物包括BamHI限制性位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增之后，cat基因作為BamHI片段被克隆到(未恢復(fù)BamHI和BglII位點(diǎn)的)載體的BglII位點(diǎn)。我們獲得了cat基因的兩種定位方向。cat基因在pBR322中與beta內(nèi)酰胺酶基因具有同樣方向的方向被用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。在來自PropionibacteriumfreudenreichiiATCC6207的16SrRNA序列(GenBank登記號(hào)X53217)的基礎(chǔ)上，選出了合適的限制性酶(HindIII)，并設(shè)計(jì)了合適的PCR引物，所述引物能通過反向PCR擴(kuò)增出含有所述啟動(dòng)子的大約3kb的區(qū)域2。從PCR片段中分離出了0.6kb的SphI-HindIII片段，其正好處于16SrRNA編碼序列的上游。該片段被連接到用同樣的酶消化過的pB2/PoCAT上，得到名為pB2/PrRNACAT的質(zhì)粒。對(duì)E.coli轉(zhuǎn)化之后獲得了抗氯霉素的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化之后，僅在含有紅霉素的平板上才獲得了P.freudenreichii菌株ATCC6207的菌落，含氯霉素的平板上則沒有。然而，當(dāng)在含氯霉素的平板上劃線時(shí)，含有pB2/PrRNACAT的轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)，而含有pB2/PoCAT的ATCC6207細(xì)胞則不長(zhǎng)，因此顯示了16SrRNA在P.freudenreichii中的功能性(functionality)。通過將來自載體pB2/PrRNACAT的大約700bp的BamHI-BglII片段連接到pBRESP36B2唯一的BglII位點(diǎn)上，構(gòu)建了含有16SrRNA啟動(dòng)子但是缺乏cat基因的表達(dá)載體，所述BamHI-BglII片段含有來自P.freudenreichii的16S核糖體RNA的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子元件在載體中的兩種可能的方向都被獲得了。當(dāng)該核糖體啟動(dòng)子表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄沒有被正確地終止時(shí)，如果該核糖體啟動(dòng)子定位于朝向Propionibacterium復(fù)制子的兩個(gè)復(fù)制基因的話，通讀(readthrough)可以阻礙上述復(fù)制基因的轉(zhuǎn)錄。因此，所述的啟動(dòng)子在其中以相反方向被克隆的載體，pBRESP36B2p16SH被用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。啟動(dòng)子下游唯一的BglII位點(diǎn)被用于表達(dá)文庫(kù)的克隆。實(shí)施例3腺苷轉(zhuǎn)移酶(D，SEQIDNo.7)的完全編碼序列通過采用適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行PCR來產(chǎn)生。上游PCR引物包括5’延伸，所述延伸包括BglII限制性位點(diǎn)和所述基因起始密碼子上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。下游PCR引物包括5’延伸，所述延伸包括BglII限制性位點(diǎn)。用BglII對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行消化之后，該片段被連接到載體pBRESP36B2p16SH上，用BglII消化，并被去磷酸化以除去5’磷酸基團(tuán)。對(duì)E.coli轉(zhuǎn)化之后，獲得了抗氨芐青霉素的菌落?？寺∑蜗鄬?duì)于載體的兩種方向都被觀察到了。然而，僅有其中16SrRNA啟動(dòng)子正好位于所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游的構(gòu)建體才允許所述腺苷轉(zhuǎn)移酶基因得以表達(dá)。后一種構(gòu)建體按照前文所述被轉(zhuǎn)化到P.freudenreichiiATCC6207中。轉(zhuǎn)化子中維生素B12的合成水平根據(jù)下文所述來測(cè)定。冰凍的Propionibacterium轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物以及僅含有載體質(zhì)粒pBRESP36B2的對(duì)照菌株的培養(yǎng)物，被接種到含有50ml腦心浸液(BrainHeartInfusion，BHI)培養(yǎng)基(Difco)的100ml的瓶(flask)中，在28℃下不予搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。從此預(yù)培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)移4ml到500ml搖瓶中的200ml生產(chǎn)培養(yǎng)基里，所述的培養(yǎng)基由15g/l的Difco酵母提取物、30g/l的乳酸鈉、0.5g/l的KH2PO4、0.01g/l的MnSO4以及0.005g/l的CoCl2組成，接著在NewBrunswick旋轉(zhuǎn)搖床中以200rpm培養(yǎng)48小時(shí)。用HPLC來測(cè)量維生素B12的效價(jià)43，其顯示了比對(duì)照菌株要高的維生素B12產(chǎn)量。所述的過程針對(duì)其它三個(gè)基因中的每一個(gè)都進(jìn)行了重復(fù)，即ASEQIDNo.1，鈷啉酸a，c-二酰胺合酶；BSEQIDNo.3，鈷啉醇酰胺激酶基因；和CSEQIDNo.5，鈷胺素(5’-磷酸)合酶。然后，所述的四個(gè)基因(A、B、C和D)被組合于一個(gè)操縱子，以進(jìn)一步地增加維生素B12的產(chǎn)量。使用已知技術(shù)44在發(fā)酵罐中對(duì)得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞(P.freudenreichiiATCC6207)進(jìn)行培養(yǎng)。為殺死細(xì)胞及引起裂解，培養(yǎng)液在65℃下巴氏消毒30分鐘。然后對(duì)所述的培養(yǎng)液進(jìn)行超濾，獲得粉紅色的含有維生素B12的濾液。加熱導(dǎo)致了細(xì)胞的裂解，并且由此導(dǎo)致胞內(nèi)的維生素B12釋放到培養(yǎng)基中。實(shí)施例4用于Propionibacteria的表達(dá)載體的構(gòu)建以及其在Propionibacteriumfreudenreichii中表達(dá)本發(fā)明的酶和生產(chǎn)維生素B12中的用途除上述表達(dá)系統(tǒng)外29，30，本領(lǐng)域中已知的另外兩套表達(dá)系統(tǒng)可被用來表達(dá)編碼本發(fā)明的新穎的酶的基因，如果期望的話，以多個(gè)拷貝表達(dá)。第一個(gè)是pRG01，來自Propionibacteriumacidipropionci的質(zhì)粒27。其被用于制造穿梭載體pPK705。上述載體被用于成功攜帶鈷啉酸a，c-二酰胺合酶(A)基因，以及因此轉(zhuǎn)化Propionibacteriumfreudenreichii的亞種shermanii。另一個(gè)所使用的合適的表達(dá)系統(tǒng)使用了已知的穿梭載體pPK70528，該載體能在E.coli和Propionibacterium間穿梭。這使用于Propionibacteria的表達(dá)載體得以構(gòu)建，以及使酶B，鈷啉醇酰胺激酶基因得以整合到Freudenreichii的亞種shermanii中去。這是通過使用鈷啉醇酰胺激酶基因，本發(fā)明的SEQIDNo.3來獲得的。比較實(shí)施例5含有空質(zhì)粒載體的Propionibacterium的搖瓶發(fā)酵實(shí)施例2中已描述了用E.coli/Propionibacterium穿梭載體pBRESP36B2p16SH對(duì)P.freudenreichii菌株ATCC6207的轉(zhuǎn)化。按照前述，在含有紅霉素的瓊脂平板上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，通過限制性分析選出含有真實(shí)質(zhì)粒(authenticplasmid)的轉(zhuǎn)化子。在含有50ml無氧M1培養(yǎng)基的褐色玻璃青霉素瓶中培育轉(zhuǎn)化子，所述的培養(yǎng)基根據(jù)下述來制備。通過在無氧條件下將90ml的B部分加入到810克的A部分中，制備得到900克的M1培養(yǎng)基。紅霉素被加入，終濃度為10毫克/升。810克的A部分由溶于水中的52.2g的MES、12.51g的Difco酵母提取物和0.68g的甲硫氨酸組成。用氫氧化銨將pH調(diào)節(jié)至7，通過抽氣和充氮來去除氧氣。最終在高壓滅菌器中對(duì)A部分滅菌。90ml的B部分由1.5ml的痕量元素溶液、1.5ml經(jīng)過過濾滅菌(filtersterilzed)的CoCl2·6H2O(5g/kg)、0.9ml經(jīng)過過濾滅菌的泛酸鈣(20g/kg)和86.1ml經(jīng)過抽氣滅菌的葡萄糖(440g/kg)組成。1kg的痕量元素溶液含有10g檸檬酸、10ml的H2SO4、1.2g的MnSO4·H2O、300g的MgSO4·7H2O、6g的FeSO4·7H2O以及2.4g的ZnSO4·7H2O，上述物質(zhì)處于水中。所述的溶液經(jīng)過過濾滅菌。用5ml的預(yù)培養(yǎng)物在無氧條件下對(duì)所述的50mlM1培養(yǎng)基進(jìn)行接種，所述的預(yù)培養(yǎng)物由經(jīng)過篩選的pBRESP36Bp16SH轉(zhuǎn)化子組成，所述的轉(zhuǎn)化子已在30℃下于M1培養(yǎng)基中伴隨溫和搖動(dòng)被無氧培育了3天，直至OD630為10左右。所述的50ml培養(yǎng)物在30℃下不加搖動(dòng)培養(yǎng)40小時(shí)。在此時(shí)間點(diǎn)，從培養(yǎng)物中取樣，并測(cè)量樣品的OD630(＝OD-ana)。通過無氧加入NaOH(10％)來調(diào)正所述培養(yǎng)基的pH。所需的NaOH(10％)的微升數(shù)采用如下公式來計(jì)算NaOH(10％)的微升數(shù)＝(19.67×OD-ana)-60。下一步，無氧加入0.5ml的DBI(0.5g/kg)。添加上述物質(zhì)之后，所述的培養(yǎng)物在30℃下伴隨200rpm的搖動(dòng)再培養(yǎng)24小時(shí)。再對(duì)OD630進(jìn)行測(cè)量(＝OD-end)。收集10ml培養(yǎng)物樣品。通過離心收獲所述的細(xì)胞，用1倍體積的滅菌去礦質(zhì)水對(duì)沉淀進(jìn)行一次洗滌。沉淀被貯存于-20℃。解凍的樣品在含有2％的KCN的緩沖液中被加熱至80℃，以打開細(xì)胞和穩(wěn)定維生素B12及前體。采用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)，用HPLC來測(cè)量維生素B12的效價(jià)，以及腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸前體的水平(43)。在質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上確認(rèn)腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸前體的峰。每mlpBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物產(chǎn)生的維生素B12的量被OD-end除。針對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子獲得的比率被用作針對(duì)含有其它質(zhì)粒的P.freudenreichii轉(zhuǎn)化子(例如下個(gè)實(shí)施例)所獲得的該比率的參照。對(duì)產(chǎn)生的腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的量計(jì)算了類似的比率(每OD-end每ml的量)。上述比率被用作針對(duì)含有其它質(zhì)粒的P.freudenreichii轉(zhuǎn)化子中腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸分別所獲得的比率的參照。實(shí)施例6用于PropionibacteriumfreudenreichiicobA/cbiA基因的表達(dá)載體的構(gòu)建以及其在Propionibacteriumfreudenreichii中生產(chǎn)維生素B12及其前體的用途編碼名為hemL46(EMBL登記號(hào)為D12643)的谷氨酸1-半醛氨基變位酶的Propionibacteriumfreudenreichii基因被使用。hemL的轉(zhuǎn)錄終止子跟在該基因編碼區(qū)域的后面。含有hemL基因編碼區(qū)域和hemL終止子的DNA片段按照下述步驟被克隆到pBRESP36B2p16SH中。使用如下引物5’-CAgTAgATCTCgACAAggAggAACCCAtgAg-3’以及5’-CgTAAgATCTCAgTTTCggACATggCAgTg-3’，通過對(duì)分離自P.freudenreichiiATCC6207的染色體DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出所述的DNA片段。兩段引物都含有BglII限制性位點(diǎn)。獲得的PCR片段被連接到pCR-BluntII-TOPO載體(Invitrogen)上來制造pGBPHEL-1。對(duì)E.coli轉(zhuǎn)化后，獲得了抗卡那霉素的菌落。通過限制性分析來檢驗(yàn)因此獲得的構(gòu)建體，并通過序列分析來檢驗(yàn)所述片段的DNA序列。隨后用BglII對(duì)pGBPHEL-1進(jìn)行消化，含有hemL基因的片段被分離出來并被連接到載體pBRESP36B2p16SH上，該載體已先經(jīng)過BglII消化和去磷酸化。對(duì)E.coli轉(zhuǎn)化后，獲得了抗氨芐青霉素的菌落。通過限制性分析篩選出其中的hemL基因轉(zhuǎn)錄自16S啟動(dòng)子的構(gòu)建體。得到的構(gòu)建體被稱為pGBP01HEL-1。編碼名為cobA的尿卟啉原III甲基轉(zhuǎn)移酶的P.freudenreichii基因(EMBL登記號(hào)U13043)被使用47。為了在Propionibacterium中過量表達(dá)cobA基因，該基因按照下述步驟被放置于16SrRNA啟動(dòng)子之后以及在pGBP01HEL-1中存在的hemL終止子之前。使用如下引物5’-CACCACCAACATCgATgAggAAAC-3’和5’-TCCAATTgggACTCAgTggTCgCTg-3’，通過對(duì)分離自P.freudenreichiiATCC6207的染色體DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出含有cobA編碼區(qū)域的DNA片段。第一個(gè)引物含有ClaI限制性位點(diǎn)，第二個(gè)引物含有MfeI限制性位點(diǎn)。獲得的PCR片段被連接到載體pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)上。對(duì)E.coli進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，獲得了抗卡那霉素的菌落。通過序列分析對(duì)克隆片段的DNA序列進(jìn)行檢驗(yàn)。得到的構(gòu)建體被命名為pGBPCOB-1。隨后用ClaI和MfeI對(duì)pGBPCOB-1進(jìn)行消化，含有cobA基因的片段被分離出來，并被連接到分離自pGBP01HEL-1的大載體片段上，該大載體片段已用同樣的酶進(jìn)行了消化。對(duì)E.coli進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，獲得了抗氨芐青霉素的菌落。通過限制性分析來檢驗(yàn)分離自轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，得到的構(gòu)建體被稱為pGBP02COB-1。pGBP02COB-1被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM101中，通過限制性分析來檢驗(yàn)從獲得的轉(zhuǎn)化子中分離出的質(zhì)粒DNA。所述的質(zhì)粒DNA隨后按照前述被轉(zhuǎn)化進(jìn)P.freudenreichiiATCC6207。按照前述在含有紅霉素的瓊脂平板上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。通過限制性分析對(duì)分離自P.freudenreichii轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢驗(yàn)。按照前面的實(shí)施例中所描述的，用M1培養(yǎng)基對(duì)pGBP02COB-1轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定維生素B12、腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的水平。按照前面實(shí)施例中所描述的，計(jì)算每ml培養(yǎng)物產(chǎn)生的維生素B12、腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的量與OD-end的比率。針對(duì)維生素B12獲得的比率比前面實(shí)施例中對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子而言所獲得的比率要低6％。然而，針對(duì)腺苷鈷啉醇酰胺獲得的比率比對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子而言所獲得的要高出227％，針對(duì)腺苷鈷啉醇酰胺磷酸所獲得的比率比對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子而言所獲得的高出200％。因此較之所述的空質(zhì)粒(比較實(shí)施例5)，鈷啉醇酰胺有了2倍的增長(zhǎng)，鈷啉醇酰胺磷酸有了3倍的增長(zhǎng)。實(shí)施例7用于編碼蛋白質(zhì)B(cobU)的Propionibacteriumfreudenreichii基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及其在Propionibacteriumfreudenreichii中生產(chǎn)維生素B12及其前體的用途為在Propionibacterium中過量表達(dá)編碼酶B的基因(SEQIDNo.3)，該基因按照下述步驟被放置于16SrRNA啟動(dòng)子之后以及在pGBP01HEL-1中存在的hemL終止子之前。使用如下引物5’-CTgATATCAATTggAggACATCAgATgACCCgCATCgTC-3’和5’-CTgAATTCggCCACgTCAgATCgCgTCC-3’，通過對(duì)分離自P.freudenreichiiATCC6207的染色體DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出含有B的編碼區(qū)域的DNA片段。第一個(gè)引物含有EcoRV和MfeI限制性位點(diǎn)，第二個(gè)引物含有EcoRI限制性位點(diǎn)。獲得的PCR片段被連接到載體pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)上。對(duì)E.coli進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，獲得了抗卡那霉素的菌落。通過序列分析對(duì)克隆片段的DNA序列進(jìn)行檢驗(yàn)。得到的構(gòu)建體被命名為pGBPCOU-1。隨后用EcoRV和EcoRI對(duì)pGBPCOU-1進(jìn)行消化，含有B的編碼基因的片段被分離出來，并被連接到分離自pGBP01HEL-1的大載體片段上，所述的大載體片段先用ClaI消化，然后用Klenow酶補(bǔ)平末端，最后用MfeI消化。對(duì)E.coli進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，獲得了抗氨芐青霉素的菌落。通過限制性分析來檢驗(yàn)分離自轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，得到的構(gòu)建體被稱為pGBP02COU-1。pGBP02COU-1被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM101中，通過限制性分析來檢驗(yàn)從獲得的轉(zhuǎn)化子中分離出的質(zhì)粒DNA。所述的質(zhì)粒DNA隨后按照前述被轉(zhuǎn)化進(jìn)P.freudenreichiiATCC6207。按照前述在含有紅霉素的瓊脂平板上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。通過限制性分析對(duì)分離自P.freudenreichii轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢驗(yàn)。按照前面所描述的，用M1培養(yǎng)基對(duì)pGBP02COU-1轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定維生素B12、腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的水平。按照前面所描述的，計(jì)算每ml培養(yǎng)物產(chǎn)生的維生素B12、腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的量與OD-end的比率。針對(duì)腺苷鈷啉醇酰胺獲得的比率比對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子而言所獲得的要低96％，而針對(duì)腺苷鈷啉醇酰胺磷酸所獲得的比率比對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子而言所獲得的高出700％。因此較之所述的空質(zhì)粒，中間產(chǎn)物鈷啉醇酰胺磷酸有了7倍的增長(zhǎng)。實(shí)施例8用于編碼蛋白質(zhì)B和C(cobU和cobS)的Propionibacteriumfreudenreichii基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及其在Propionibacteriumfreudenreichii中生產(chǎn)維生素B12及其前體的用途為在Propionibacterium中同時(shí)過量表達(dá)編碼酶B(SEQIDNo.3)和酶C的基因(SEQIDNo.5)，所述的基因按照下述步驟被放置于16SrRNA啟動(dòng)子之后以及在pGBP01HEL-1中存在的hemL終止子之前。這兩個(gè)基因被相鄰放置于P.freudenreichii的基因組上，其來自于(partfrom)同一個(gè)操縱子。使用如下引物5’-CTgATATCAATTggAggACATCAgATgACCCgCATCgTC-3’和5’-CTgAATTCCggCggCTCAggCgAACAATg-3’，通過對(duì)分離自P.freudenreichiiATCC6207的染色體DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出含有兩個(gè)基因的DNA片段。第一個(gè)引物含有EcoRV和MfeI限制性位點(diǎn)，第二個(gè)引物含有EcoRI限制性位點(diǎn)。獲得的PCR片段被連接到載體pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)上。對(duì)E.coli進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，獲得了抗卡那霉素的菌落。通過序列分析對(duì)克隆片段的DNA序列進(jìn)行檢驗(yàn)。得到的構(gòu)建體被命名為pGBPPOB-1。隨后用EcoRV和EcoRI對(duì)pGBPPOB-1進(jìn)行消化，含有編碼B和C的基因的片段被分離出來，并被連接到分離自pGBP01HEL-1的大載體片段上，所述的大載體片段先用ClaI消化，然后用Klenow酶補(bǔ)平末端，最后用MfeI消化。對(duì)E.coli進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，獲得了抗氨芐青霉素的菌落。通過限制性分析來檢驗(yàn)分離自轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，得到的構(gòu)建體被稱為pGBP02POB-1。pGBP02POB-1被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM101中，通過限制性分析來檢驗(yàn)從獲得的轉(zhuǎn)化子中分離出的質(zhì)粒DNA。所述的質(zhì)粒DNA隨后按照前述被轉(zhuǎn)化進(jìn)P.freudenreichiiATCC6207。按照前述在含有紅霉素的瓊脂平板上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。通過限制性分析對(duì)分離自P.freudenreichii轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢驗(yàn)。按照前面所描述的，用M1培養(yǎng)基對(duì)pGBP02POB-1轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定維生素B12、腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的水平。按照前面所描述的，計(jì)算每ml培養(yǎng)物產(chǎn)生的維生素B12、腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的量與OD-end的比率。針對(duì)維生素B12獲得的比率比對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子而言所獲得的要高19％，而針對(duì)腺苷鈷啉醇酰胺所獲得的比率比對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子而言所獲得的低96％，而且在PGBP02POB-1轉(zhuǎn)化子中無法探測(cè)到腺苷鈷啉醇酰胺磷酸。實(shí)施例9用于編碼蛋白質(zhì)B、C和cobA(因此是cobA和cobU和cobS)的Propionibacteriumfreudenreichii基因的表達(dá)載體的構(gòu)建以及其在Propionibacteriumfreudenreichii中生產(chǎn)維生素B12及其前體的用途為在Propionibacterium中同時(shí)過量表達(dá)編碼酶B(SEQIDNo.3)、酶C(SEQIDNo.5)和cobA的基因，所述三個(gè)基因按照下述步驟被放置于16SrRNA啟動(dòng)子之后以及hemL終止子之前。用MfeI和BglII對(duì)pGBP02POB-1進(jìn)行消化，分離到1.6kb的片段。該片段被連接到pGBP02COB-1的9.7kb的載體片段上，該載體片段經(jīng)過了相同的酶的消化。對(duì)E.coli進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，獲得了抗卡那霉素的菌落。通過序列分析對(duì)克隆片段的DNA序列進(jìn)行檢驗(yàn)。得到的構(gòu)建體被命名為pGBPPOE-1。pGBP02POE-1被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM101中，通過限制性分析來檢驗(yàn)從獲得的轉(zhuǎn)化子中分離出的質(zhì)粒DNA。所述的質(zhì)粒DNA隨后按照前述被轉(zhuǎn)化進(jìn)P.freudenreichiiATCC6207。按照前述在含有紅霉素的瓊脂平板上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。通過限制性分析對(duì)分離自P.freudenreichii轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢驗(yàn)。按照前面所描述的，用M1培養(yǎng)基對(duì)pGBP02POE-1轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定維生素B12、腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的水平。按照前面所描述的，計(jì)算每ml培養(yǎng)物產(chǎn)生的維生素B12、腺苷鈷啉醇酰胺和腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的量與OD-end的比率。針對(duì)維生素B12獲得的比率比對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子而言所獲得的要高45％，而針對(duì)腺苷鈷啉醇酰胺所獲得的比率比對(duì)pBRESP36B2p16SH轉(zhuǎn)化子而言所獲得的低65％，而且在PGBP02POB-1轉(zhuǎn)化子中無法探測(cè)到腺苷鈷啉醇酰胺磷酸。實(shí)施例總結(jié)下表展示了所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒相對(duì)于所述空質(zhì)粒(對(duì)照株)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(空質(zhì)粒的值被設(shè)定為100％以作參考)。參考文獻(xiàn)1.Sambrooketal.(1989)“MolecularCloningAlaboratorymanual”，2ndEdition，ColdSpringHarborLaboratories，ColdSpringHarbor，NewYork2.Innisetal.(1990)“PCRprotocols，aguidetomethodsandapplications”AcademicPress，SanDiego3.WO-A-99/326174.vanZeijl，C.etal(1998)J.ofBiotechnol.59221-2245.Devereuxetal(1984)NucleicAcidsResearch12，p387-3956.AltschulS.F.(1993)JMolEvol36290-3007.Altschul，S，F(xiàn)etal(1990)JMolBiol215403-108.HenikoffandHenikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-109199.KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-578710.CunninghamandWells，Science，244，1081-1085，198911.deVosetal.(Science，255，306-312，1992)12.Smithetal.(J.Mol.Biol.，224，899-904，1992)13.Wlodaveretal.(FEBSLett.，309，59-64，1992)14.Fordetal，ProteinExpressionandPurification，2，95-107，199115.Goosenetal，“TransformationandGeneManipulationinFilamentousFungianoverview”inHandbookofAppliedMycology，Vol.4(1992)16.Romanosetal，Yeast8423-488(1992)17.R.E.Rose，NucleicAcidsResearch16(1)355(1988)18.WO-A-98/0472619.WO-A-98/3070720.AlenksoandClutterbuck，F(xiàn)ungalGenet.Biol21373-397(1997)21.EP-A-0,635,57422.WO-A-98/4677223.RapperandFennell，TheGenusAspergillus，TheWilliams&WilkinsCompany，Baltimore，pp293-344，196524.B.Cameronetal.，J.Bacteriol171547-557(1989)25.Blancheetal，AngewChem.Int.Ed.Engl.34383-411(1995)26.WO-A-97/4342127.Kiatpapanetal，Applied&EnvironmentalMicrobiology66(11)4688-4695(Nov.2000)28.Kiatpapan&Murooka，Appl.Microbiol.Biotechnol.56144-149(2001)29.WO-A-99/67356(DSMN.V.)30.Joreetal，AppliedandEnvironmentalMicrobiol.67(2)499-503(February2001)31.EP-A-018448332.EP-A-028460333.EP-A-013404834.EP-A-025345535.EP-A-09643036.EP-A-030167037.Bibbetal，Gene38215(1985)38.Thompsonetal，Gene2051(1982)39.deVriesetal，J.Gen.Microbiol.71515(1972)40.Southern，J.Mol.Biol98503(1975)41.Roessneretal，Microbiology1481845-1853(2002)42.Changetal，JournalofBacteriology134(3)1141-1156(June1978)43.Blancheetal，Anal.Biochem.18924(1990)44.Spallaetal，“MicrobialProductionofVitaminB12”inBiotechnologyofvitamins，pigmentsandgrowthfactors，E.J.VanDammeed.，Elsevier，London，NewYork，pages257-28445.WO-A-98/0686846.MurakamiK，HashimotoY，MurookaY.，1993，ApplEnvironMicrobiol.59347-35047.SattlerI，etal.1995，JBacteriol.1771564-1569所有文件通過引用的方式被包括進(jìn)來。序列表<110>帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司<120>生物合成途徑的基因<130>N.84450ASMW<140><141><150>EP02255203.8<151>2002-07-25<160>17<170>PatentInversion3.1<210>1<211>2586<212>DNA<213>費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)<220><221>CDS<222>(1)..(2586)<223><400>1atggtgacggcgacggctcttccgcgggtgctcatcgcggcccccgcg48MetValThrAlaThrAlaLeuProArgValLeuIleAlaAlaProAla151015tccagccagggaaagaccaccgtggccatcggcctgatggcggccctg96SerSerGlnGlyLysThrThrValAlaIleGlyLeuMetAlaAlaLeu202530cgggcctcggggcgcagcgtggccggattcaaggtgggccccgactac144ArgAlaSerGlyArgSerValAlaGlyPheLysValGlyProAspTyr354045atcgatccgggctatcacgcactggcctgcggtcgccccggccgcaac192IleAspProGlyTyrHisAlaLeuAlaCysGlyArgProGlyArgAsn505560ctggatccctatttgtgcgggcccgagcgcattgcgccgttgttcgcc240LeuAspProTyrLeuCysGlyProGluArgIleAlaProLeuPheAla65707580catggcgcgctgcatcccgaacccgcggacatctcggtcgtcgaaggc288HisGlyAlaLeuHisProGluProAlaAspIleSerValValGluGly859095gtgatgggcatgttcgacggcaagctcggcgcgtggcccgacggcacc336ValMetGlyMetPheAspGlyLysLeuGlyAlaTrpProAspGlyThr100105110gatgaccccgccggttttggctcatcggcccatatcgccaggctgctc384AspAspProAlaGlyPheGlySerSerAlaHisIleAlaArgLeuLeu115120125gatgcccccgtgctgctcgtggtcgacggctcacacagtgcccgtacc432AspAlaProValLeuLeuValValAspGlySerHisSerAlaArgThr130135140gccgcagccctgtgccatggcctggccagctacgatccccgcatccat480AlaAlaAlaLeuCysHisGlyLeuAlaSerTyrAspProArgIleHis145150155160gtggccggcgtcatcctcaatcgggtgatgggtgcccgcgtggtcgac528ValAlaGlyValIleLeuAsnArgValMetGlyAlaArgValValAsp165170175gagatcacccggggctgcgcacgtgtcggcctgccggtgctgggggct576GluIleThrArgGlyCysAlaArgValGlyLeuProValLeuGlyAla180185190ctgccgaaaagcacgcgggtggccgtgggctcacgccacctgggactg624LeuProLysSerThrArgValAlaValGlySerArgHisLeuGlyLeu195200205gtcacggccgacgagcagggtgacgcgatcggcatcgtgcagcaggcc672ValThrAlaAspGluGlnGlyAspAlaIleGlyIleValGlnGlnAla210215220ggtgagctcgtcgccgcacacctcgacctcgacgccatcgccacgatc720GlyGluLeuValAlaAlaHisLeuAspLeuAspAlaIleAlaThrIle225230235240gccggtggggcccctgacctggccgtcgatccctgggatcccgccgca768AlaGlyGlyAlaProAspLeuAlaValAspProTrpAspProAlaAla245250255gaggtcgaaccggtaccggggcgtccggtcatcgccatggcctcgggt816GluValGluProValProGlyArgProValIleAlaMetAlaSerGly260265270cccgcattcaccttccggtacaccgaaaccgcagaactgctggaggcg864ProAlaPheThrPheArgTyrThrGluThrAlaGluLeuLeuGluAla275280285gccggctgccgggtgacggccttcgatccgctcaccgcccggggcctt912AlaGlyCysArgValThrAlaPheAspProLeuThrAlaArgGlyLeu290295300ccggccgatgtgtccggcctgtacctggggggtggtttccccgaggag960ProAlaAspValSerGlyLeuTyrLeuGlyGlyGlyPheProGluGlu305310315320cacgccgaggcgctcgccggcaacacctccctgggcgctgaaatcgcc1008HisAlaGluAlaLeuAlaGlyAsnThrSerLeuGlyAlaGluIleAla325330335tcacgcgtgtccgagggcctgccgacggtggccgagtgtgcggggctg1056serArgValSerGluGlyLeuProThrValAlaGluCysAlaGlyLeu340345350ctctacctgtgccgcagcctggatggactggcgatggccggggtggtc1104LeuTyrLeuCysArgSerLeuAspGlyLeuAlaMetAlaGlyValVal355360365gacgccgactcgtccatgacgccgcgcctgaccatcggctaccaccac1152AspAlaAspSerSerMetThrProArgLeuThrIleGlyTyrHisHis370375380gcccgcgccgccaacgacagcttcctgatgcgcgccggggagcgctat1200AlaArgAlaAlaAsnAspSerPheLeuMetArgAlaGlyGluArgTyr385390395400cgggcccatgagttccaccgcaccaccctggacacgcccccctacgac1248ArgAlaHisGluPheHisArgThrThrLeuAspThrProProTyrAsp405410415cgcgaccccggaccacaacggctgggcgaccaacggttggcgtgggac1296ArgAspProGlyProGlnArgLeuGlyAspGlnArgLeuAlaTrpAsp420425430gtggagaccccgacggggggcaaccgacccgagggggtgctggtcgcc1344ValGluThrProThrGlyGlyAsnArgProGluGlyValLeuValAla435440445ccgacccccggttccgcgcccagcgtccacgcctcctaccagcacctg1392ProThrProGlySerAlaProSerValHisAlaSerTyrGlnHisLeu450455460cactgggcagggagtccggtactggcgcaacgcttcgcccgggcggcg1440HisTrpAlaGlySerProValLeuAlaGlnArgPheAlaArgAlaAla465470475480agcgaatatgggcacaccggccatcactccccccggcctgccgccacg1488SerGluTyrGlyHisThrGlyHisHisSerProArgProAlaAlaThr485490495acgccgggagatgcgttgtccgcagcgcccgacctcacccatcacggg1536ThrProGlyAspAlaLeuSerAlaAlaProAspLeuThrHisHisGly500505510gatcgcgatgtgctgcccggcctggtcgacttggcggtgaacgtgcgc1584AspArgAspValLeuProGlyLeuValAspLeuAlaValAsnValArg515520525gatgtgcgacctccggcctggctcgtggagcgcatcgtcgcctccagc1632AspValArgProProAlaTrpLeuValGluArgIleValAlaSerSer530535540gaccagtgggcccactaccccgatcagcgcgaagcgacccgtgcggtg1680AspGlnTrpAlaHisTyrProAspGlnArgGluAlaThrArgAlaVal545550555560gcactgcgccatggcgtcaaccccgaccaggtactgctcacggccggg1728AlaLeuArgHisGlyValAsnProAspGlnValLeuLeuThrAlaGly565570575tcctcggaggcgttcagcctgatcgcccacgggttctccccgcgctgg1776SerSerGluAlaPheSerLeuIleAlaHisGlyPheSerProArgTrp580585590gcggtcgtggtgcatccccagttcaccgaaccagaggtggccctgcgc1824AlaValValValHisProGlnPheThrGluProGluValAlaLeuArg595600605aacgccgggcgcccggtcggccgcctggtgctccatgcctcggatggc1872AsnAlaGlyArgProValGlyArgLeuValLeuHisAlaSerAspGly610615620ttccagttcgatcacgaactgctggaccccagggccgacatggtggtc1920PheGlnPheAspHisGluLeuLeuAspProArgAlaAspMetValVal625630635640atcggcaatccgaccaatcccaccggcgtgctgcattcggcggcgagc1968IleGlyAsnProThrAsnProThrGlyValLeuHisSerAlaAlaSer645650655ctgcgcgcgttgtgccggcccggacgcgtggtggtggttgacgaggca2016LeuArgAlaLeuCysArgProGlyArgValValValValAspGluAla660665670ttcatggacgccgtgccgggcgagcccgagagcctcatcggggcacgc2064PheMetAspAlaValProGlyGluProGluSerLeuIleGlyAlaArg675680685atggatggcctgttggtcacccgctcgttcacgaagacttggagcgtc2112MetAspGlyLeuLeuValThrArgSerPheThrLysThrTrpSerVal690695700ccggggctgcggatcggatatgtggtcggggatcccgcgctcattcgc2160ProGlyLeuArgIleGlyTyrValValGlyAspProAlaLeuIleArg705710715720gtcctggcgcacgaacagccctgttggcccatctccacccccgccctg2208ValLeuAlaHisGluGlnProCysTrpProIleSerThrProAlaLeu725730735gtcaccgcccgcgaatgctccacgccacgcgccgtggagcaggccacc2256ValThrAlaArgGluCysSerThrProArgAlaValGluGlnAlaThr740745750tcagatgcccgacaggcggcgcaggaccgccgacacctggtggcccgc2304SerAspAlaArgGlnAlaAlaGlnAspArgArgHisLeuValAlaArg755760765ctggccgggatcggcatccagaccgtcggggaggccagggcccccttc2352LeuAlaGlyIleGlyIleGlnThrValGlyGluAlaArgAlaPrcPhe770775780gtcctagtcgacctgcgcgcccacccgcccggtgggcttcgtgcggga2400ValLeuValAspLeuArgAlaHisProProGlyGlyLeuArgAlaGly785790795800ttgcggacgctcggcttcaccgtgcgcagcggcgagagcttccccggc2448LeuArgThrLeuGlyPheThrValArgSerGlyGluSerPheProGly805810815ctgggcgcgggctggttgcggctcgcggttcgccacccggacatcagc2496LeuGlyAlaGlyTrpLeuArgLeuAlaValArgHisProAspIleSer820825830gacgcgttcgtcgctgccctggcccgcaccatcgacgcactggacaca2544AspAlaPheValAlaAlaLeuAlaArgThrIleAspAlaLeuAspThr835840845gcgcagcaccccatgcgaccaccacaaggagacatcagatga2586AlaGlnHisProMetArgProProGlnGlyAspIleArg850855860<210>2<211>861<212>PRT<213>費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)<400>2MetValThrAlaThrAlaLeuProArgValLeuIleAlaAlaProAla151015SerSerGlnGlyLysThrThrValAlaIleGlyLeuMetAlaAlaLeu202530ArgAlaSerGlyArgSerValAlaGlyPheLysValGlyProAspTyr354045IleAspProGlyTyrHisAlaLeuAlaCysGlyArgProGlyArgAsn505560LeuAspProTyrLeuCysGlyProGluArgIleAlaProLeuPheAla65707580HisGlyAlaLeuHisProGluProAlaAspIleSerValValGluGly859095ValMetGlyMetPheAspGlyLysLeuGlyAlaTrpProAspGlyThr100105110AspAspProAlaGlyPheGlySerSerAlaHisIleAlaArgLeuLeu115120125AspAlaProValLeuLeuValValAspGlySerHisSerAlaArgThr130135140AlaAlaAlaLeuCysHisGlyLeuAlaSerTyrAspProArgIleHis145150155160ValAlaGlyValIleLeuAsnArgValMetGlyAlaArgValValAsp165170175GluIleThrArgGlyCysAlaArgValGlyLeuProValLeuGlyAla180185190LeuProLysSerThrArgValAlaValGlySerArgHisLeuGlyLeu195200205ValThrAlaAspGluGlnGlyAspAlaIleGlyIleValGlnGlnAla210215220GlyGluLeuValAlaAlaHisLeuAspLeuAspAlaIleAlaThrIle225230235240AlaGlyGlyAlaProAspLeuAlaValAspProTrpAspProAlaAla245250255GluValGluProValProGlyArgProValIleAlaMetAlaSerGly260265270ProAlaPheThrPheArgTyrThrGluThrAlaGluLeuLeuGluAla275280285AlaGlyCysArgValThrAlaPheAspProLeuThrAlaArgGlyLeu290295300ProAlaAspValSerGlyLeuTyrLeuGlyGlyGlyPheProGluGlu305310315320HisAlaGluAlaLeuAlaGlyAsnThrSerLeuGlyAlaGluIleAla325330335SerArgValSerGluGlyLeuProThrValAlaGluCysAlaGlyLeu340345350LeuTyrLeuCysArgSerLeuAspGlyLeuAlaMetAlaGlyValVal355360365AspAlaAspSerSerMetThrProArgLeuThrIleGlyTyrHisHis370375380AlaArgAlaAlaAsnAspSerPheLeuMetArgAlaGlyGluArgTyr385390395400ArgAlaHisGluPheHisArgThrThrLeuAspThrProProTyrAsp405410415ArgAspProGlyProGlnArgLeuGlyAspGlnArgLeuAlaTrpAsp420425430ValGluThrProThrGlyGlyAsnArgProGluGlyValLeuValAla435440445ProThrProGlySerAlaProSerValHisAlaSerTyrGlnHisLeu450455460HisTrpAlaGlySerProValLeuAlaGlnArgPheAlaArgAlaAla465470475480SerGluTyrGlyHisThrGlyHisHisSerProArgProAlaAlaThr485490495ThrProGlyAspAlaLeuSerAlaAlaProAspLeuThrHisHisGly500505510AspArgAspValLeuProGlyLeuValAspLeuAlaValAsnValArg515520525AspValArgProProAlaTrpLeuValGluArgIleValAlaSerSer530535540AspGlnTrpAlaHisTyrProAspGlnArgGluAlaThrArgAlaVal545550555560AlaLeuArgHisGlyValAsnProAspGlnValLeuLeuThrAlaGly565570575SerSerGluAlaPheSerLeuIleAlaHisGlyPheSerProArgTrp580585590AlaValValValHisProGlnPheThrGluProGluValAlaLeuArg595600605AsnAlaGlyArgProValGlyArgLeuValLeuHisAlaSerAspGly610615620PheGlnPheAspHisGluLeuLeuAspProArgAlaAspMetValVal625630635640IleGlyAsnProThrAsnProThrGlyValLeuHisSerAlaAlaSer645650655LeuArgAlaLeuCysArgProGlyArgValValValValAspGluAla660665670PheMetAspAlaValProGlyGluProGluSerLeuIleGlyAlaArg675680685MetAspGlyLeuLeuValThrArgSerPheThrLysThrTrpSerVal690695700ProGlyLeuArgIleGlyTyrValValGlyAspProAlaLeuIleArg705710715720ValLeuAlaHisGluGlnProCysTrpProIleSerThrProAlaLeu725730735ValThrAlaArgGluCysSerThrProArgAlaValGluGlnAlaThr740745750SerAspAlaArgGlnAlaAlaGlnAspArgArgHisLeuValAlaArg755760765LeuAlaGlyIleGlyIleGlnThrValGlyGluAlaArgAlaProPhe770775780ValLeuValAspLeuArgAlaHisProProGlyGlyLeuArgAlaGly785790795800LeuArgThrLeuGlyPheThrValArgSerGlyGluSerPheProGly805810815LeuGlyAlaGlyTrpLeuArgLeuAlaValArgHisProAspIleSer820825830AspAlaPheValAlaAlaLeuAlaArgThrIleAspAlaLeuAspThr835840845AlaGlnHisProMetArgProProGlnGlyAspIleArg850855860<210>3<211>657<212>DNA<213>費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)<220><221>CDS<222>(1)..(657)<223><400>3atggacgttcctgacagtcccgagtcccgaaggctgctcgatcagctg48MetAspValProAspSerProGluSerArgArgLeuLeuAspGlnLeu151015tcaggcctcggtgcccggcaacgtccggcacgaaccctcgtcaccggg96SerGlyLeuGlyAlaArgGlnArgProAlaArgThrLeuValThrGly202530ggcgcccggagcgggaagtccagctatgccgaggcgctgctggggtcg144GlyAlaArgSerGlyLysSerSerTyrAlaGluAlaLeuLeuGlySer354045ttcgaccacgtcgactacatcgccacctcgcaacgcaaccctgacgac192PheAspHisValAspTyrIleAlaThrSerGlnArgAsnProAspAsp505560cccgagtggatggcccgcatcgccgcccacgtcgcgcgccgcccgaag240ProGluTrpMetAlaArgIleAlaAlaHisValAlaArgArgProLys65707580agctggaacaccgtggagacccttgacgtggcgcaggtgctgtccgac288SerTrpAsnThrValGluThrLeuAspValAlaGlnValLeuSerAsp859095gacggctcccccgccctggtcgattgcctgggcgtgtggctcacccgc336AspGlySerProAlaLeuValAspCysLeuGlyValTrpLeuThrArg100105110gagctggacgtcaccgacgcctggcagcacccggagcaggcccgcccc384GluLeuAspVelThrAspAlaTrpGlnHisProGluGlnAlaArgPro115120125gagctgcagcaccgcatcgatgagttggccactgcggtcgccggctcc432GluLeuGlnHisArgIleAspGluLeuAlaThrAlaValAlaGlySer130135140ccgcgcc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AlaMetAlaAlaAlaGly100105110tgggcccacgtgcgcaccctgctcgccgcacagacccaccggctctac384TrpAlaHisValArgThrLeuLeuAlaAlaGlnThrHisArgLeuTyr115120125atcctcgacgaattcgcccatgtgctcaacaagggatggctggatgtc432IleLeuAspGluPheAlaHisValLeuAsnLysGlyTrpLeuAspVal130135140gacgaggtcgctgacgacctggcacatcgtcccggcacgcaacatgtg480AspGluValAlaAspAspLeuAlaHisArgProGlyThrGlnHisVal145150155160gtgatcaccggacgcaactgccccgccggaatcatcgggatcgccgac528ValIleThrGlyArgAsnCysProAlaGlyIleIleGlyIleAlaAsp165170175atcgtcacgtccatggacaacgtcaaacatccctttggcaagggagaa576IleValThrSerMetAspAsnValLysHisProPheGlyLysGlyGlu180185190cgaggacaggcgggtatcgaatggtga603ArgGlyGlnAlaGlyIleGluTrp195200<210>8<211>200<212>PRT<213>費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)<400>8MetSerGlySerAlaProGlnArgThrGluProThrThrAlaGluLeu151015ArgHisArgProArgLeuIleValAsnThrGlyAsnGlyLysGlyLys202530SerThrAlaAlaPheGlyMetGlyLeuArgAlaTrpAlaGlnGlyTrp354045SerIleGlyValPheGlnPheIleLysSerGlyArgTrpHisThrGly505560GluGlnGlnAlaTyrAlaGlnLeuAspGlnAlaHisArgThrThrGly65707580ValGlyGlyProValGluTrpGlnSerLeuGlySerGlyTrpSerTrp859095LeuArgAlaThrGluGlyThrAspGlnAlaAlaMetAlaAlaAlaGly100105110TrpAlaHisValArgThrLeuLeuAlaAlaGlnThrHisArgLeuTyr115120125IleLeuAspGluPheAlaHisValLeuAsnLysGlyTrpLeuAspVal130135140AspGluValAlaAspAspLeuAlaHisArgProGlyThrGlnHisVal145150155160ValIleThrGlyArgAsnCysProAlaGlyIleIleGlyIleAlaAsp165170175IleValThrSerMetAspAsnValLysHisProPheGlyLysGlyGlu180185190ArgGlyGlnAlaGlyIleGluTrp195200<210>9<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9GGGATCCTCTAGAGCATGCAAGCTTCTCGAGAATCGATAGATCTCTAAGGAAGCTAAAAT60G61<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10CAGTAGATCTCGACAAGGAGGAACCCATGAG31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11CGTAAGATCTCAGTTTCGGACATGGCAGTG30<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12CACCACCAACATCGATGAGGAAAC24<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13TCCAATTGGGACTCAGTGGTCGCTG25<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14CTGATATCAATTGGAGGACATCAGATGACCCGCATCGTC39<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15CTGAATTCGGCCACGTCAGATCGCGTCC28<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16CTGATATCAATTGGAGGACATCAGATGACCCGCATCGTC39<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17CTGAATTCCGGCGGCTCAGGCGAACAATG29權(quán)利要求1.一種多肽，所述的多肽是可以從Mycobacteriaceae科的細(xì)菌，例如Propionibacterium屬的細(xì)菌獲得的合酶或轉(zhuǎn)移酶。2.如權(quán)利要求1所述的多肽，所述的多肽(a)作為酰胺合酶或者磷酸轉(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶或芳基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用；或(b)具有EC6.3.1-、EC2.7.7-、EC2.7.8-或EC2.5.1.17中的活性；和/或(c)可以從Propionibacterineae亞目的微生物或Propionibacteriafreudenreichii的微生物中獲得。3.如權(quán)利要求1或2所述的合酶多肽，所述多肽包含(i)SEQIDNo.2、4、6或8的氨基酸序列；或(ii)(i)的變異體，所述變異體是合酶或轉(zhuǎn)移酶；或(iii)(i)或(ii)的片段，所述片段是合酶或轉(zhuǎn)移酶。4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中，(ii)中的變異體與SEQIDNo.2、4、6或8的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％或85％的同一性(例如，與SEQIDNo.8具有至少85％的同一性)，和/或(iii)中的片段長(zhǎng)度為至少150個(gè)氨基酸。5.如前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽，可以從革蘭氏陽性細(xì)菌中獲得，和/或所述的多肽是鈷啉酸a，c-二酰胺合酶、鈷啉醇酰胺激酶、鈷啉醇酰胺磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶、鈷胺素(5’-磷酸)合酶或腺苷轉(zhuǎn)移酶。6.一種多核苷酸，其中包含(a)SEQIDNo.1、3、5或7的核酸序列或編碼如前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽的序列；(b)互補(bǔ)于或可雜交到(a)所定義的序列的序列；(c)(a)或(b)中的序列的片段；(d)與(a)、(b)或(c)所定義的序列具有至少60％同一性的序列；或(e)按照遺傳密碼與(a)至(d)中所定義的任意序列簡(jiǎn)并的序列。7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的序列，其中在(b)中所述的雜交是嚴(yán)謹(jǐn)條件下的，(c)中所述的片段長(zhǎng)度為至少20個(gè)堿基(例如對(duì)SEQIDNo.7的片段而言，至少510個(gè)堿基)和/或(d)中所述的同一性為至少70％或80％(例如對(duì)SEQIDNo.7而言至少85％)。8.如權(quán)利要求6或7所述的多核苷酸，其中包含(a)編碼具有合酶或轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的序列，所述的序列是(1)SEQIDNo.1、3、5或7的編碼序列；(2)選擇性雜交到(1)中定義的序列的互補(bǔ)序列上的序列；或(3)按照遺傳密碼與(1)或(2)中定義的序列簡(jiǎn)并的序列；或(b)與(a)中定義的多核苷酸互補(bǔ)的序列。9.如權(quán)利要求6至8中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸，所述的多核苷酸是DNA序列。10.一種載體，所述載體包含一條或多條如權(quán)利要求6至9中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸序列。11.如權(quán)利要求10所述的載體，所述載體是表達(dá)載體，例如其中，如權(quán)利要求9所述的DNA序列被可操作地連接到調(diào)控序列上去。12.一種宿主細(xì)胞，其中包含至少一個(gè)如權(quán)利要求6至9中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸，或者具有所述多核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的多拷貝。13.一種宿主細(xì)胞，其中包含如權(quán)利要求6至9中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸，所述的多核苷酸是外源序列。14.一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞是經(jīng)過如權(quán)利要求6至9中任意一項(xiàng)所述的DNA序列或權(quán)利要求10所述的載體的轉(zhuǎn)化的，所述的宿主細(xì)胞可以是原核的。15.一種方法，用于生產(chǎn)或合成如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的多肽或維生素B12或其前體，所述的方法包括在提供了所述多肽的表達(dá)的條件下或提供了維生素B12或其前體的合成的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求12至14中任意一項(xiàng)所定義的宿主細(xì)胞。16.一種組合物，其中包含如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的多肽。17.一種用于制備胺的方法，所述的方法包括將底物與如下物質(zhì)相互作用來自Propionibacteria的酰胺合酶，或包含SEQIDNo.2的多肽，或如權(quán)利要求3所定義的其變異體或片段，或如權(quán)利要求12至14中任意一項(xiàng)所定義的宿主細(xì)胞。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中(a)所述的方法在谷氨酰胺存在的情況下進(jìn)行，所述的谷氨酰胺可以被轉(zhuǎn)化成谷氨酸；(b)羧基被酰胺化，以形成羧基酰胺基團(tuán)；(c)所述的底物是鈷啉酸或鈷啉酸c-二酰胺(分子式I或IA)和/或所述方法的產(chǎn)物是鈷啉酸c-二酰胺或鈷啉酸a，c-二酰胺(分別是分子式IA或IB)；和/或(d)所述的方法包括對(duì)底物進(jìn)行酰胺化。19.用于制備含磷酸化合物的方法，所述的方法包括將底物與如下物質(zhì)相互作用來自Propionibacteria的磷酸轉(zhuǎn)移酶，包含SEQIDNo.4或如權(quán)利要求3所定義的其變異體或片段的多肽，或如權(quán)利要求12至14中任意一項(xiàng)所定義的宿主細(xì)胞。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中(a)所述的方法在三磷酸核苷，例如ATP存在的情況下進(jìn)行；(b)所述的底物包含腺苷；(c)所述的方法包括磷酸化，可選地，羥基的磷酸化；和(d)所述底物包含腺苷鈷啉醇酰胺(分子式II)和/或所述反應(yīng)的產(chǎn)物是腺苷鈷啉醇酰胺磷酸(分子式IIA)。21.用于制備含核苷酸化合物的方法，所述的方法包括將底物與如下物質(zhì)相互作用來自Propionibacteria的核苷酸轉(zhuǎn)移酶，包含SEQIDNo.4或如權(quán)利要求3所定義的其變異體或片段的多肽，或如權(quán)利要求12至14中任意一項(xiàng)所定義的宿主細(xì)胞。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中(a)所述的方法包括對(duì)底物進(jìn)行鳥苷酸化；(b)所述的方法包括對(duì)磷酸基團(tuán)進(jìn)行核苷酸化；(c)所述的方法在三磷酸核苷例如GTP存在的情況下進(jìn)行；和/或(d)所述的底物包含腺苷鈷啉醇酰胺磷酸(分子式IIA)和/或所述反應(yīng)的產(chǎn)物是腺苷-GDP-鈷胺酰胺(分子式IIB)。23.用于制備含芳基化合物的方法，所述的方法包括將底物與如下物質(zhì)相互作用來自Propionibacteria的芳基轉(zhuǎn)移酶，或包含SEQIDNo.6或如權(quán)利要求3所定義的其變異體或片段的多肽，或如權(quán)利要求12至14中任意一項(xiàng)所定義的宿主細(xì)胞。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中(a)所述的芳基部分包含一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的芳香環(huán)系統(tǒng)，所述的芳香環(huán)系統(tǒng)可以被1至4個(gè)C1-8的烷基取代，以及可以被0、1或2個(gè)雜原子取代，所述的芳香環(huán)可以是苯并咪唑。(b)所述反應(yīng)的產(chǎn)物具有芳香基團(tuán)，所述的芳香基團(tuán)與過渡金屬例如鈷結(jié)合，并且與碳原子結(jié)合，可選地，還結(jié)合到核糖基團(tuán)上；(c)所述的方法在苯并咪唑存在的情況下進(jìn)行；和/或(d)所述的底物包含腺苷-GDP-鈷胺酰胺(分子式IIB)和/或所述的產(chǎn)物包含腺苷-5，6-二甲基苯并咪唑鈷胺酰胺(維生素B12，分子式IIC)。25.用于制備含腺苷化合物的方法，所述的方法包括將底物與如下物質(zhì)相互作用來自Propionibacteria的腺苷轉(zhuǎn)移酶，或包含SEQIDNo.8或如權(quán)利要求3所定義的其變異體或片段的多肽，或如權(quán)利要求12至14中任意一項(xiàng)所定義的宿主細(xì)胞。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中(a)所述的方法包括對(duì)底物進(jìn)行腺苷化，或包括腺苷的轉(zhuǎn)移；(b)所述的方法涉及將腺苷結(jié)合到金屬原子上，所述金屬原子可以是過渡系列的金屬，例如鈷；(c)所述的方法在(三)磷酸核苷例如ATP存在的情況下進(jìn)行；和/或(d)所述的底物包含鈷啉酸a，c-二酰胺(分子式IB)和/或所述的產(chǎn)物包含腺苷鈷啉酸a，c-二酰胺(分子式IC)。27.用于制備維生素B12或其前體的方法，所述的方法包括在使維生素B12或其前體得以產(chǎn)生或合成的條件下(例如通過細(xì)胞)，對(duì)如權(quán)利要求12至14中任意一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或發(fā)酵。28.下述物質(zhì)在制造或合成維生素B12或其前體中的用途如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的多肽、如權(quán)利要求6至9中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸、如權(quán)利要求10或11中任意一項(xiàng)所述的載體或如權(quán)利要求12至11中任意一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開了四個(gè)新基因及其編碼的酶，它們存在于Propionibacteriumfreudenreichii中，并與維生素B文檔編號(hào)C12N1/15GK1671838SQ03817858公開日2005年9月21日申請(qǐng)日期2003年7月25日優(yōu)先權(quán)日2002年7月25日發(fā)明者赫爾曼·揚(yáng)·佩爾,西爾維婭·霍珀申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司