專利名稱：來源于粉紅色蝦的新型組織蛋白酶l樣半胱氨酸蛋白酶的制作方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及從北極甜蝦(Pandalus eous)中抽提的新穎的組織蛋白酶L樣酶、其純化方法、編碼組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶(最近從北極甜蝦中鑒別出的一種新穎的蛋白酶)的多聚核苷酸、由該核苷酸編碼的多肽以及所述多聚核苷酸和多肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶的通稱，它廣泛分布于微生物、植物和動物中。已經(jīng)分離出了許多具有不同的催化基團和底物特異性的蛋白酶。其應(yīng)用范圍也很廣泛，它們可用在如食品、去污劑、化妝品原料、啤酒的澄清劑、皮革的軟化劑以及藥品的改性劑中。
蛋白酶是最重要的酶類之一，它水解蛋白質(zhì)的肽鍵，廣泛地分布于微生物、植物和動物中，參與許多生物學(xué)過程。此外，蛋白酶根據(jù)催化基團主要分為四類天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。對于這些酶的分子作用機制已經(jīng)作了廣泛地研究。巰基蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)具有一個作為活性中心的巰基，包括如菠蘿蛋白酶。屬于所述半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶類的組織蛋白酶，可分為組織蛋白酶L類和組織蛋白酶B類。組織蛋白酶L類包括組織蛋白酶H、L、S、F、V和W，它具有兩個重要的基序即ER(F/W)NIN基序和GNFD基序，均為不連續(xù)基序。組織蛋白酶B類以及組織蛋白酶C、O和X中不存在前一個基序ER(F/W)NIN。
在哺乳動物中，組織蛋白酶L存在于溶酶體中，雖然它不具有外切型蛋白酶活性特征，但是具有較強的內(nèi)切蛋白酶活性。迄今，已從多種動物中鑒別出了組織蛋白酶L和組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶，并且測定了其序列。這些動物列舉如下Bombys mori(家蠶)Yamamoto Y.，Takimoto K.，Izumi S.，Toriyama-Sakurai M.，Kageyama T.，Takahashi S.Y.Molecular cloning and sequencing ofcDNA that encodes cysteine proteinase in the eggs of the silkmoth，Bombyx mori(家蠶卵中編碼半胱氨酸蛋白酶的cDNA的分子克隆和序列測定).J.Biochem.116(6)1330-1335(1994)。
Bos taurus(牛)未公開。
Drosophila melanogaster(果蠅)Tryselius Y.，Hultmark D.Cysteine proteinase 1(CP1)，a cathepsinL-like enzyme expressed in the Drosophila melanogaster haemocyte cellline mbn-2(半胱氨酸蛋白酶1(CP1)——一種組織蛋白酶L樣酶在果蠅紅細胞系mbn-2中的表達).Insect Mol.Biol.6(2)173-181(1997)。
Homo sapiens(人)Joseph L.J.，Chang L.C.，Stamenkovich D.，Sukhatme V.P.Complete nucleotide and deduced amino acid sequences of human andmurine preprocathepsin L.An abundant transcript induced bytransformation of fibroblasts(人和小鼠組織蛋白酶L前原酶的全部核苷酸序列和推測的氨基酸序列纖維原細胞轉(zhuǎn)化引起的豐富的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物).J.Clin.Invest.81(5)1621-1629(1998)。
Homarus americanus(美洲螯龍蝦)Laycock M.V.，Mackay R.M.，Di Fruscio M.，Gallant J.W.Molecular cloning of three cDNAs that encode cysteine proteinases in thedigestive gland of the American lobster(Homarus americanus)(美洲螯龍蝦(Homarus americanus)消化腺中編碼半胱氨酸蛋白酶的三種cDNA的分子克隆).FEBS Lett.292115-120(1991)。
Mus musculus(小鼠)Portnoy D.A.，Erickson A.H.，Kochan J.，Ravetch J.V.，UnkelessJ.C.Cloning and characterization of a mouse cysteine proteinase(小鼠半胱氨酸蛋白酶的克隆和鑒定).J.Biol.Chem.26114697-14703(1986)。
Nephrops norvegicus(挪威海螯蝦)Le Boulay C.，Van Wormhoudt A.，Sellos D.Molecualr cloningand sequencing of two cDNAs encoding cathepsin L-related cysteineproteinases in the nervous system and in the stomach of the Norwaylobster(Nephrops norvegicus)(挪威海龍蝦(Nephrops norvegicus)神經(jīng)系統(tǒng)和胃中編碼組織蛋白酶L相關(guān)半胱氨酸蛋白酶的兩種cDNA的分子克隆和序列測定).Comp.Biochem.Physiol.111353-359(1995)。
Penaeus vannamei(太平洋白對蝦)Le Boulay C.，Van Wormhoudt A.，Sellos D.Cloning andexpression of cathepsin L-like proteinases in the hapatopancreas of theshrimp Penaeus vannamei during the intermoltcycle(蛻皮循環(huán)間期太平洋白對蝦肝胰腺中的組織蛋白酶L樣蛋白酶的克隆和表達).J.Comp.Physiol.B 166310-318(1996)。
Rattus norvegicus(挪威大鼠)Ishidoh K.，Towatari T.，Imajoh S.，Kawasaki H.，Kominami E.，Katunuma N.，Suzuki K.Molecular cloning and sequencing of cDNAfor rat cathepsin L(大鼠組織蛋白酶L cDNA的分子克隆和序列測定).FEBS Lett.22369-73(1987)。
至于組織蛋白酶L的膠原蛋白分解活性，有報道稱大鼠組織蛋白酶L在37℃酸性條件下降解膠原蛋白。Barrett，A.J.and Kirschke，H.，Cathepsin B，Cathepsin H，and Cathepsin L.(組織蛋白酶B、組織蛋白酶H和組織蛋白酶L)，Methods Enzymol.80，535-561.(1981)。
發(fā)明概述上述組織蛋白酶L具有的最適pH在酸性條件下，最適溫度為50-70℃。在上述文獻報道的那些酶中，有些僅對酶的基因進行了克隆，因此對其特性沒有進行研究?？傊袢圆恢朗欠裼性诘蜏?、中性至堿性條件下具有較強活性的組織蛋白酶L。如果發(fā)現(xiàn)在低溫和中性到堿性條件下仍具有較強活性的組織蛋白酶L，則使得對蛋白材料的特性進行改造的同時避免因蛋白質(zhì)變性引起特性退化成為可能，并可提供在食品、去污劑、化妝品和藥物的改性劑應(yīng)用中極為有用的酶。
本發(fā)明人尋找了天然環(huán)境中的甚至能在低溫條件下降解膠原蛋白的蛋白酶。經(jīng)過大量廣泛地篩選，結(jié)果本發(fā)明人意外地成功發(fā)現(xiàn)日本北極甜蝦肝胰腺中的一種甚至在低溫下也具有活性的新穎的蛋白酶。本發(fā)明的蛋白酶為組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶。
北極甜蝦是典型的生活在-1.6-5℃低溫環(huán)境中的適冷水生生物，它分布于北太平洋和北大西洋區(qū)域。有幾遍報道證明，與哺乳動物相應(yīng)的酶相比，適冷生物的酶表現(xiàn)出相當(dāng)高的催化效力。例如絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶——一種研究最深入的蛋白酶，有報道稱大麻哈魚胰蛋白酶的催化效力較牛胰蛋白酶高40倍。
在篩選過程中，本發(fā)明人為防止肝胰腺細胞由于冰凍而導(dǎo)致破壞，將肝胰腺從天然的未經(jīng)過冰凍的北極甜蝦中取出。這樣做的目的是使肝胰腺細胞中的酶在抽提時不至于被降解。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)一種從速凍肝胰腺中純化本發(fā)明的組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶的方法。
本發(fā)明的組織蛋白酶L樣蛋白可通過離子交換柱、凝膠過濾柱、吸附柱、鹽沉淀、透析、超濾、離心等方法的適當(dāng)?shù)慕M合從北極甜蝦中純化。例如，將肝胰腺從天然北極甜蝦中切除、均漿、脫脂，然后用硫酸銨沉淀蛋白并重新溶解。上清經(jīng)陰離子交換柱純化、吸附層析分離以及離子交換柱再次純化而制得蛋白?？刹捎玫年庪x子交換層析包括如Q-Sepharose和Mono Q；可采用的吸附層析包括如羥基磷灰石。同樣地，也可用凍融的北極甜蝦肝胰腺進行制備，其方法也是均漿、脫脂，然后離心和沉淀蛋白，重新溶解，透析，最后經(jīng)陰離子交換柱純化透析液、凝膠過濾層析分離以及吸附層析純化。可采用的陰離子交換層析包括如Q-Sepharose和Mono Q；可采用的凝膠過濾層析包括如Superdex；可采用的吸附層析包括如羥基磷灰石。
由此所得北極甜蝦的組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶具有如下特征(1)分子量約為30KDa；(2)最適pH約為7-8；(3)最適溫度約為35℃；(4)具有膠原蛋白分解活性；(5)具有組織蛋白酶L樣活性。此外，本發(fā)明人采用基因工程方法進行了各種研究，結(jié)果成功地克隆了編碼該酶的基因并揭示了該基因的全部堿基序列和推測的氨基酸序列，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明人還成功地克隆了編碼預(yù)測與本發(fā)明酶具有類似構(gòu)型的同工型的基因，并通過在酵母表達系統(tǒng)中表達它們而揭示了其特性。
表達所得的北極甜蝦組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶的同工酶具有以下特征(1)分子量約為30KDa；(2)最適pH約為6-8；(3)最適溫度約為40℃(即使在20℃也具有活性)；(4)具有膠原蛋白分解活性；(5)具有組織蛋白酶L樣活性。
這些來源于北極甜蝦的新型組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶分別命名為北極甜蝦組織蛋白酶L1和北極甜蝦組織蛋白酶L2。此外，北極甜蝦組織蛋白酶L1有時也稱作NSL1或NsCtL，而北極甜蝦組織蛋白酶L2有時也稱作北極甜蝦半胱氨酸蛋白酶、NsCys或Crustapain。
北極甜蝦組織蛋白酶L1或L2可通過基因重組的方法進行生產(chǎn)，其中編碼北極甜蝦組織蛋白酶L1或L2的基因被整合進入適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，然后將所述重組表達載體導(dǎo)入合適的宿主。許多已知載體可用作表達載體。當(dāng)采用大腸桿菌(E.coli)作為宿主時，載體的實施例包括pUR載體、pATH載體和pGEX載體系列。當(dāng)采用動物細胞如COS和CHO作為宿主時，可使用載體如pXM和pDC201。
在采用大腸桿菌(E.coli)的系統(tǒng)中，例如，可將本發(fā)明的基因插入到表達載體如PGEX(Amersham Pharmacia)、pET39b(Novagen)以及pRSET(Invitrogen)中，導(dǎo)入大腸桿菌(E.coli)而誘導(dǎo)其表達。用SDS-PAGE確認所需分子量的基因表達。在采用酵母的系統(tǒng)中，插入有本發(fā)明的基因的酵母表達載體pPICZα通過電穿孔法導(dǎo)入宿主酵母巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)X-33菌株或KM71H菌株中，選擇可在含高濃度(2000μg/ml)zeocin的培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化子?；钚杂妹髂z酶譜法檢驗，并檢測與所需酶相應(yīng)大小的條帶。
本發(fā)明包括上述兩種分離的組織蛋白酶L樣蛋白酶及其天然突變體。本發(fā)明還包括由在北極甜蝦組織蛋白酶L1或L2的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸的缺失、置換或添加的氨基酸序列組成、并具有組織蛋白酶L樣酶活性的蛋白。本發(fā)明還包括這些前原組織蛋白酶L樣酶。本發(fā)明還包括多肽，其中該多肽與所述組織蛋白酶L1或L2全部或部分氨基酸序列80％或以上是相同的。本發(fā)明還包括所述組織蛋白酶L樣酶的信號肽和前肽。所述前肽也用作本發(fā)明組織蛋白酶樣酶的抑制劑。此外，本發(fā)明包括編碼這些酶、其信號肽以及前肽的DNA。
例如，本發(fā)明包括的編碼蛋白的DNA，在嚴(yán)格的條件下，可與由上述北極甜蝦組織蛋白酶L1、北極甜蝦組織蛋白酶L2、或其相應(yīng)的前原酶以及具有組織蛋白酶樣酶活性的互補鏈組成的DNA雜交。
嚴(yán)格條件下的雜交意味著先進行預(yù)雜交，預(yù)雜交是對其上通過120℃20分鐘處理而結(jié)合有DNA的Hybond N+尼龍膜(AmershamPharinacia)，在Church磷酸緩沖液(0.5M Na2HPO4，1mM EDTA，7％SDS)中，于65℃處理5分鐘。雜交是在相同的緩沖液中，加入下述方法制得的探針，于65℃進行17小時。雜交膜于室溫下在含0.1％SDS的2×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液；1×SSC為150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉，pH7.0)中處理20分鐘，然后于65℃下用含0.1％SDS的1×SSC洗滌兩次，每次20分鐘。再一次于65℃下用含0.1％SDS的1×SSC處理膜20分鐘，結(jié)束洗滌。X光片于-80℃下爆光24小時。
在制備探針時，例如用Takara隨機引物DNA標(biāo)記試劑盒第二版(Takara random primer DNA labeling kit Ver.2)(Takara)將由PCR擴增的cDNA片段標(biāo)記上[α32P]-dCTP。然后用離心式過濾器(Millipore)除去未反應(yīng)的同位素。
本發(fā)明還包括編碼北極甜蝦組織蛋白酶L1、北極甜蝦組織蛋白酶L2或由在其前原酶氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸的缺失、置換或添加的氨基酸序列組成并具有組織蛋白酶L樣酶活性的蛋白的DNA，或編碼具有組織蛋白酶L樣酶活性的前原酶的DNA。
本發(fā)明還包括在編碼北極甜蝦組織蛋白酶L1、北極甜蝦組織蛋白酶L2或其前原酶的DNA序列中缺失、置換或添加1-100個，優(yōu)選為1-10個，更優(yōu)選為一至幾個堿基的DNA，其中所述DNA編碼的蛋白具有北極甜蝦組織蛋白酶L1或北極甜蝦組織蛋白酶L2的活性。
本發(fā)明還包括可產(chǎn)生多肽的DNA，所述多肽與北極甜蝦組織蛋白酶L1或L2全部或部分氨基酸序列有80％或以上、優(yōu)選90％或以上、最優(yōu)選95％或以上是相同的。本發(fā)明還包括與編碼組織蛋白酶L或前原組織蛋白酶L的DNA序列的同源性為80％或以上、優(yōu)選90％或以上、最優(yōu)選95％或以上，并且所編碼的蛋白具有組織蛋白酶L樣酶活性或前原組織蛋白酶L樣酶功能的DNA。
本發(fā)明包括用于檢測所述基因的引物，例如，L1或L2堿基序列中15個或以上的連續(xù)的堿基序列，或在所述序列中有一個或多個堿基缺失、置換或添加的堿基序列。
本發(fā)明的北極甜蝦組織蛋白酶L1或L2的S2袋主要是疏水性的，它由對應(yīng)于成熟木瓜蛋白酶的氨基酸序列的67、68、157、160和205號氨基酸組成(編碼根據(jù)文獻Schechter，I.and Berger，A.(1967)On the size of the active site in proteinases，I.Papain(關(guān)于蛋白酶活性部位的大小I.木瓜蛋白酶).Biochem.Biophys.Res.Commun.27，157-162)。對于北極甜蝦組織蛋白酶L1，成熟木瓜蛋白酶的氨基酸序列中的67和68號氨基酸為Val，133號為Cys，157號為Ile，160號為Ala，205號為Gln。對于北極甜蝦組織蛋白酶L2，成熟木瓜蛋白酶的氨基酸序列中的67號氨基酸為Trp，68號為Pro，133號為Cys，157號為Ala，160號為Ala，205號為Tyr。
本發(fā)明包括由在北極甜蝦組織蛋白酶L1或L2的氨基酸序列中有一個或多個氨基酸的缺失、置換或添加的氨基酸序列組成、并具有與北極甜蝦組織蛋白酶L1或L2具有相同的底物特異性的組織蛋白酶L樣酶活性的蛋白。所述蛋白的特征為成熟木瓜蛋白酶氨基酸序列中的(1)67和68號氨基酸為Val，133號為Cys，157號為Ile，160號為Ala，205號為Gln或(2)67號氨基酸為Trp，68號為Pro，133號為Cys，157號為Ala，160號為Ala，205號為Tyr，從而保留北極甜蝦組織蛋白酶L1或L2的S2袋。
圖表簡述

圖1顯示北極甜蝦組織蛋白酶L1的堿基序列以及推測的氨基酸序列；圖2顯示北極甜蝦組織蛋白酶L2的堿基序列以及推測的氨基酸序列；圖3顯示北極甜蝦組織蛋白酶L1的SDS-PAGE泳道1分子量標(biāo)記，泳道2北極甜蝦組織蛋白酶L1(10μg)；圖4顯示北極甜蝦組織蛋白酶L1的膠原蛋白分解圖泳道1分子量標(biāo)記，泳道2膠原蛋白，泳道3無反應(yīng)，泳道425℃反應(yīng)30分鐘；圖5顯示北極甜蝦組織蛋白酶L1的最適pH；圖6顯示北極甜蝦組織蛋白酶L1的最適溫度；
圖7顯示北極甜蝦組織蛋白酶L1的熱穩(wěn)定性；圖8顯示北極甜蝦組織蛋白酶L1和L2、其它甲殼類動物的組織蛋白酶L、大鼠組織蛋白酶L以及木瓜蛋白酶氨基酸序列之間的序列比較位置編號基于木瓜蛋白酶的位置編號。相同的殘基以點表示，并插入間隔符以獲得最大的匹配。形成三個二硫鍵的半胱氨酸以灰色表示，而活性中心的Cys、His、Asp反轉(zhuǎn)印刷。北極甜蝦組織蛋白酶L1和L2分別對應(yīng)于北極甜蝦1和2；圖9(A)顯示屬于木瓜蛋白酶類的組織蛋白酶的系統(tǒng)發(fā)生譜系，而(B)顯示氨基酸序列之間的同源性系統(tǒng)發(fā)生譜系基于成熟酶序列的平行排列，采用鄰接法繪制。圖8中出現(xiàn)過的序列用黑體表示。分枝點處的數(shù)字代表自引值(％)。北極甜蝦組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶L1和L2(分別縮寫為NSL1和NSL2)與木瓜蛋白酶、大鼠組織蛋白酶B、H、K、S和L(分別縮寫為RCB、RCH、RCK、RCS和RCL)、美洲螯龍蝦(Homarus america)半胱氨酸蛋白酶1、2和3(分別縮寫為LCP1、LCP2和LCP3)、挪威海龍蝦(Nephrops norvegicus)神經(jīng)系統(tǒng)和胃中的組織蛋白酶L(分別縮寫為NCP1和NCP2)和白對蝦(Penaeus vannamei)組織蛋白酶L1和L2(分別縮寫為PCP1和PCP2)；圖10顯示丙烯酰胺中北極甜蝦組織蛋白酶L1的PAS(過碘酸希夫氏，Periodic Acid Schiff)染色泳道1分子量標(biāo)記泳道2北極甜蝦組織蛋白酶L1(10μg)泳道3轉(zhuǎn)鐵蛋白(10μg)；圖11“采用二肽或三肽熒光底物分析北極甜蝦組織蛋白酶L1的底物特異性。使用的二肽或三肽熒光MCA底物用Z-Xaa-Xaa-Arg-MCA(Xaa表示一個不同的氨基酸，也可用單字母氨基酸字符表示)表示?！眻D中，F(xiàn)R代表Z-Phe-Arg-MCA，RR代表Z-Arg-Arg-MCA，PR代表Z-Pro-Arg-MCA，VVR代表Z-Val-Val-Arg-MCA，LLR代表Z-Leu-Leu-Arg-MCA，F(xiàn)VR代表Z-Phe-Val-Arg-MCA；圖12顯示由酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)的北極甜蝦組織蛋白酶L2的SDS-PAGE(圖12A)和明膠酶譜(圖12B)泳道1顯示包含北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)的前肽，泳道2顯示成熟的北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)；圖13顯示北極甜蝦組織蛋白酶L2活性的pH圖和pH穩(wěn)定性A關(guān)于在準(zhǔn)一級反應(yīng)條件下測量Z-Pro-Arg-MCA和Z-Phe-Arg-MCA的水解，北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)的pH依賴性二級反應(yīng)常數(shù)(Kcat/Km)分別表示于左軸和右軸。
B在不同pH的緩沖液中處理30分鐘后，pH6.0時對Z-Pro-Arg-MCA的殘留活性。每一pH下的數(shù)據(jù)以相對于未處理樣品的百分率表示；圖14顯示北極甜蝦組織蛋白酶L2的熱穩(wěn)定性；圖15顯示北極甜蝦組織蛋白酶L2的底物特異性；所用的二肽或三肽熒光MCA底物以Z-Xaa-Xaa-Arg-MCA(Xaa指一個不同的氨基酸，它用三字母氨基酸字符表示)表示。
在圖15中，F(xiàn)R代表Z-Phe-Arg-MCA，RR代表Z-Arg-Arg-MCA，PR代表Z-Pro-Arg-MCA，VVR代表Z-Val-Val-Arg-MCA，LLR代表Z-Leu-Leu-Arg-MCA；圖16顯示北極甜蝦組織蛋白酶L2對高血糖素的降解A峰顯示的是用反相HPLC對由北極甜蝦組織蛋白酶L2降解高血糖素所產(chǎn)生的片段(用數(shù)字表示)進行分離的結(jié)果B反相HPLC分離所得片段(峰數(shù))的氨基酸序列測定。
高血糖素的氨基酸序列列示于圖下方。每一切割位點的敏感性由色譜峰的高度來估算。主要切割位點用粗箭頭表示，一般切割位點用細箭頭表示，次要切割位點用不連續(xù)線條表示，同時標(biāo)出的是大鼠組織蛋白酶L的切割位點。
該圖很好地顯示了與其它組織蛋白酶L對比在切割位點上的不同；圖17是顯示北極甜蝦組織蛋白酶L2對I型膠原蛋白降解的結(jié)果的SDS-PAGE。
優(yōu)選實施方案的詳細描述實施例僅用來舉例說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明構(gòu)成限制。
從北極甜蝦分離和純化組織蛋白酶L樣酶<北極甜蝦組織蛋白酶L1的純化>
活的北極甜蝦購自漁業(yè)合作協(xié)會，解剖以獲得肝胰腺。向該肝胰腺中加入兩倍體積的50mM Tris-HCl(pH7.5)，均漿。然后加入1/5體積的四氯甲烷，于4℃攪拌1小時脫脂，離心(18,000g，4℃，30min)。對所得上清進行硫酸銨分級分離。將用17.6-47.2％(w/v)硫酸銨沉淀所得的沉淀物溶解于含5mM CaCl2和0.02％NaN3的20mM Tris-HCl(pH7.5，緩沖液A)中，透析，然后加到用緩沖液A平衡的Q-Sepharose柱(Amersham Pharmacia)上。用緩沖液A洗下未結(jié)合部分，然后用緩沖液A和含0.6M NaCl的緩沖液A的線性梯度進行洗脫。
收集活性部分，對10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.9)透析，上樣于用相同緩沖液平衡的羥基磷灰石(Bio-Rad)柱，用相同緩沖液和400mM磷酸鉀緩沖液(pH6.9)的線性梯度進行洗脫。然后將活性部分加到Mono Q柱上。用緩沖液A和含1M NaCl的緩沖液A的線性梯度進行洗脫。北極甜蝦組織蛋白酶L1用上述的方法純化。用合成的底物測量得的每一純化步驟的相對活性如表1和2所示。
<酶活性的測量方法>
在pH7.5和25℃下反應(yīng)30分鐘后，由SDS-PAGE確認每一純化步驟中的活性部分以及純化酶的膠原蛋白分解活性，所用底物為酸溶性I型膠原蛋白(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(圖4)。
此外，純化過程中的酶活性可通過采用下述合成底物的方法進行定量監(jiān)測。
DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(Peptide Institute，Inc)(下文稱作DNP-肽)用作測量膠原蛋白酶樣酶活性的底物。將DNP-肽溶解于含150mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，使?jié)舛葹?mM，制成底物溶液。將相同體積的來自每一活性部份的酶溶液加入到100ml底物溶液中，于25℃下反應(yīng)10分鐘。加入1N HCl 0.5ml中止反應(yīng)。加入乙酸乙酯和正丁醇(1∶0.15)的混合物，劇烈振蕩。然后，在離心后于365nm波長處測量上清的吸光度。一個單位定義為每分鐘水解1μmol底物的酶量。
用于測量胰蛋白酶樣酶和彈性蛋白酶樣酶活性的底物包括Bz-DL-Arg-pNA(BAPA)、Suc-(Ala)3-pNA(STANA)(Peptide Institute，Inc)、Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA(AAPR)和Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA(AAPL)(BACHEM)(Bz代表苯甲?；?，pNA代表對硝基苯胺，Suc代表琥珀?；?。胰蛋白酶樣酶活性的存在可由BAPA的降解來測定，而彈性蛋白酶樣酶活性的存在可由STANA的降解來測定。AAPL和AAPR為來源于螃蟹的絲氨酸膠原蛋白酶作用的底物。濃度為50mM的底物溶液用二甲基亞砜來制備。來自每一活性部分的酶溶液加入到含150mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，預(yù)熱，然后加入底物溶液至終濃度為0.5mM，于25℃下反應(yīng)5分鐘，于405nm波長處比色測定釋放的對硝基苯胺。一個單位定義為每分鐘水解1μmol底物的酶量。
每一活性部分中的蛋白量用Bradford法進行定量，用BSA作標(biāo)準(zhǔn)品。
表1
用DNP-肽分析的每一純化步驟中的相對活性

表2

純化的北極甜蝦組織蛋白酶L1能較好地作用于合成的膠原蛋白酶底物(表1)。它一點都不作用于BAPA，而很好地作用于P2位具有脯氨酸的底物(AAPL，AAPR)(表2)。
進一步用Z-Phe-Arg-MCA作為測定組織蛋白酶L樣活性的底物來測量活性。用二甲基亞砜來配制濃度為20mM的底物溶液。酶溶液加入到含150mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，預(yù)熱，然后加入底物溶液至終濃度為50μM，于25℃下反應(yīng)5分鐘，在380nm激發(fā)波長處及460nm發(fā)射波長處測量游離的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的熒光強度。用AMC(Peptide Institute，Inc)來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并定量。一個單位U定義為每分鐘水解1μmol底物的酶量。在最終純化步驟中觀測到的活性為10.2U/mg。
北極甜蝦組織蛋白酶L1的膠原蛋白分解圖如圖4所示。正如圖中所示，本發(fā)明的酶在25℃30分鐘的反應(yīng)中能較好地降解膠原蛋白。
北極甜蝦組織蛋白酶L1的SDS-PAGE圖如圖3所示。約30kDa處的單一條帶即是獲得的組織蛋白酶。
PAS染色按如下進行。
SDS-PAGE凝膠浸泡于12.5％三氯乙酸中30分鐘，用蒸餾水洗滌30秒鐘，浸泡于0.5％過碘酸溶液(用于PAS染色)(Wako PureChemical Industries，Ltd.)中50分鐘，用蒸餾水充分洗滌，共6次，每次10分鐘，用Cold Schiffs Reagent(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)處理50分鐘，用含0.5％亞硫酸氫鈉的0.05N HCl洗滌10分鐘×3次，用蒸餾水洗滌，然后浸泡于5％乙酸中。結(jié)果表明北極甜蝦組織蛋白酶L1具有糖鏈(圖10)。
<最適pH>
在25℃ Britton-Robinson緩沖液(pH4-13)中用DNP-肽進行活性測量。最終反應(yīng)溶液為200μl，DNP-肽和酶的最終濃度分別為0.5mM和1.5μg/ml。本發(fā)明酶的最適pH約為7-8(圖5)。
<最適溫度>
1mM DNP-肽和含150mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)在不同的溫度下預(yù)熱5分鐘，然后加入酶測量活性。最終反應(yīng)溶液為200μl，DNP-肽和酶的最終濃度分別為0.5mM和1.5μg/ml。本發(fā)明酶的最適溫度約為35℃(圖6)。
<熱穩(wěn)定性>
將本發(fā)明酶(300ng)加入到含150mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，在不同的溫度下(20℃-70℃)保溫30分鐘和60分鐘，然后立即在冰上冷卻。用DNP-肽作底物于25℃測量殘留活性。最終反應(yīng)溶液為200μl，DNP-肽和酶的最終濃度分別為0.5mM和1.5μg/ml。本發(fā)明酶在25℃下保溫1小時以及在30℃下保溫30分鐘是穩(wěn)定的，在50℃保溫1小時以及在60℃保溫30分鐘可被滅活(圖7)。
<N末端氨基酸序列分析>
將純化的北極甜蝦組織蛋白酶L1進行電泳，然后將其從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。切下相應(yīng)的條帶并進行蛋白測序。本發(fā)明酶的N末端氨基酸序列為DTVDWRDKGAVTPVKDQGQ。根據(jù)同源性檢索的結(jié)果，它與活性半胱氨酸蛋白酶的N末端鄰近區(qū)域相符。
<組織蛋白酶L的克隆>
參考測得的N末端氨基酸部分序列——DWRDKGA，制備寡核苷酸。制備的引物為5′-GAY TGG CGN GAY AAR GGN GC-3′(RA/G，YC/T，NA/G/C/T)。
用ISOGEN(Nippon Gene Co.，Ltd.)從北極甜蝦肝胰腺中制備總RNA。然后用3′RACE System(GIBCO BRL)合成單鏈cDNA。以單鏈cDNA為模板，用上述的引物以及3′RACE System的AUAP進行PCR(30循環(huán)；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分鐘)，得到約900bp的PCR產(chǎn)物。這此片段被插入到pGEM-T Easy Vector(Promega)中，亞克隆并測定3′末端的堿基序列。結(jié)果獲得了兩種序列，在這些序列的基礎(chǔ)上制備反義鏈的引物，如表3所示。采用類似的方法對用5′RACE System(GIBCO BRL)獲得的PCR片段進行亞克隆并且測定其5′末端的堿基序列。
表3
用于5′RACE的引物

此外，表4中所列引物是由5′末端制備，而編碼北極甜蝦組織蛋白酶L1和L2的全長cDNA分離自上述的單鏈cDNA。
表4用于克隆全長cDNA的引物

北極甜蝦組織蛋白酶L1和L2的測定的堿基序列和推測的氨基酸序列分別如圖1(SEQ ID1和2)和圖2(SEQ ID3和4)所示。除估計的信號序列(1-15位殘基Met至Ala)和前序列(16-105Ser至Ala)外，北極甜蝦組織蛋白酶L1的N末端部分與純化酶的氨基酸序列完全一致。編碼北極甜蝦組織蛋白酶L1信號序列的堿基為SEQ ID1中的29-73位。編碼前序列的堿基為SEQ ID1和圖1中74-343位。此外，估計的組織蛋白酶L2信號序列為Met至Val1-14殘基，估計的前序列為Ser至Met15-106殘基。編碼這些序列的堿基分別為SEQ ID3中13-54位以及55-330位。
北極甜蝦組織蛋白酶L1和L2酶原以及其它生物的組織蛋白酶L之間的氨基酸序列的同源性如表5所示。
從圖8中可以清楚地看出，北極甜蝦組織蛋白酶L1和L2的催化基團Cys、His和Asn是保守的，它們同屬于木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶。二硫鍵的位置也是保守的。從用鄰接法創(chuàng)建的系統(tǒng)發(fā)生譜系(圖9)也可看出L1和L2同為組織蛋白酶L樣酶。
表5與其它生物組織蛋白酶L的比較

北極甜蝦組織蛋白酶L1酶原與美洲螯龍蝦的半胱氨酸蛋白酶2具有最大同源性(57％)(表5)。北極甜蝦組織蛋白酶L2酶原與美洲螯龍蝦的半胱氨酸蛋白酶1具有最大同源性(57％)(表5)。
從冰凍北極甜蝦樣品中分離和純化組織蛋白酶L樣酶<北極甜蝦組織蛋白酶L1的粗抽提物>
所有純化步驟在4℃下進行。將凍存于-80℃的肝胰腺部分融化，加入兩倍體積的50mM Tris-Hcl(pH7.5，含有150mM NaCl和3mM NaN3)，用Polytron Homogenizer均漿器均漿5分鐘。然后，邊緩慢攪拌邊加入1/5體積的四氯甲烷，離心(19,000g，30分鐘)，脂被抽提到下層四氯甲烷中。脫脂的上清用作粗抽提物。
<北極甜蝦組織蛋白酶L樣蛋白酶的純化>
粗抽提物用25-70％(v/v)的冷丙酮進行分級分離，19,000×g離心15分鐘。所得沉淀重新溶解于50mM Tris-HCl(pH7.5，含有50mMNaCl)(緩沖液1)中，對相同的緩沖液1透析過夜。透析液用0.45μm濾器過濾，加到用相同的緩沖液1平衡的Q-Sepharose離子交換柱(1.6×40cm Amersham Pharmacia Biotech)上。用相同的緩沖液洗柱，結(jié)合的蛋白用0-0.5M范圍的NaCl線性梯度進行洗脫。
活性部分的蛋白水解活性用Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA以及明膠酶譜來進行測量。
收集對Z-Phe-Arg-MCA具有高度活性而對Z-Arg-Arg-MCA幾乎無活性的部分，對50mM Tris-HCl(pH7.5，含150mM NaCl)(緩沖液2)透析，然后用Biomax-5K Ultrafree(Millipore)進行超濾濃縮。將收集得的濃縮部分上樣于用緩沖液2平衡的Superdex 75pg凝膠過濾柱(1.6×100cm，Amersham Pharmacia Biotech)，以0.4ml/min的流速進行洗脫。
收集對Z-Phe-Arg-MCA具有活性的部分，對10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.8)透析。透析液上樣于用相同緩沖液平衡的Bio-Scale CHT10-I羥基磷灰石(1.2×8.8cm，Bio-Rad)柱。洗下非特異性結(jié)合的蛋白，結(jié)合的蛋白用10-400mM線性梯度的磷酸鉀緩沖液(pH6.8)進行洗脫。
鑒定N末端氨基酸序列，該蛋白被確認為L1。
<組織蛋白酶L樣酶分析>
于25℃，在含100mM乙酸鈉、100mM NaCl、2mM DTT、2mMEDTA和0.01％Brij-35的緩沖液(pH6.0)中，用分子內(nèi)猝滅MCA(甲基香豆酰胺)底物分析酶的活性。底物溶液用二甲亞砜配制，濃度為20mM。加入用相同緩沖液稀釋的酶，開始水解。酶活性通過在380nm激發(fā)波長處及460nm發(fā)射波長處測量游離的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的熒光強度而進行測定。
<底物特異性分析>
在準(zhǔn)一級反應(yīng)條件(本說明書中所用的準(zhǔn)一級反應(yīng)是指所用底物濃度遠低于預(yù)計的Km的條件，其中初始反應(yīng)率v0與kcat/Km值直接成正比)下，用各種二肽MCA或三肽MCA底物測量S2亞位的底物特異性。結(jié)果如圖11所示。
用以下熒光肽底物作底物Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA、Z-Pro-Arg-MCA、Z-Val-Val-Arg-MCA、Z-Leu-Leu-Arg-MCA、Z-Phe-Val-Arg-MCA、H-Arg-MCA and Z-Arg-MCA。
從圖11可以看出，北極甜蝦組織蛋白酶L1高特異性地切割P2位(采用的編碼見Schechter and Berger，1967，On the size of the activesite in proteinases，I.Papain.Biochem.Biophys.Res.Commun.27，157-162)上具有非芳族疏水殘基的合成底物。該特異性與組織蛋白酶K和S類似，而這兩種組織蛋白酶在此位對Leu比Phe更特異。在另一方面，組織蛋白酶L對Phe比Leu更特異。
然而，與組織蛋白酶K和S不同的是，在P2位上，北極甜蝦組織蛋白酶L1選擇性地接受Val而不是Phe。
<抑制劑作用>
在緩沖液(含有100mM乙酸鈉、2mM DTT、2mM EDTA和0.05％Triton X-100)中，用E64(L-順式-環(huán)氧琥珀酰-亮氨酰-鯡精胺)、Z-Phe-Phe-CHN2、Z-Phe-Tyr(t-Bu)-CHN2、亮抑酶肽、抗蛋白酶、PMSF(苯甲基磺酰氟)和1，10-鄰二氮雜菲中任一種抑制劑對酶溶液進行預(yù)處理。然后用熒光底物Z-Phe-Arg-MCA測量殘留酶活性。酶和底物的終濃度分別為1nM和100μM。用上述方法測量殘留酶活性。
結(jié)果如表6所示。
表6

如表6所示，北極甜蝦組織蛋白酶L1表現(xiàn)出典型的半胱氨酸蛋白酶抑制方式。北極甜蝦組織蛋白酶L1可被甚至0.1μM濃度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64強烈抑制。L1還可被同為半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑的亮抑酶肽和抗蛋白酶強烈抑制。
雖然Z-Phe-Phe-CHN2是有效的組織蛋白酶L抑制劑，但是已知它也輕微地抑制組織蛋白酶B和S。此外，Z-Phe-Tyr(t-Bu)-CHN2是組織蛋白酶L特異性的抑制劑。
然而，Z-Phe-Phe-CHN2和Z-Phe-Tyr(t-Bu)-CHN2并不在很大程度上抑制本發(fā)明酶。絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶特異性的抑制劑對其也沒有抑制活性。
由上可以得出如下結(jié)論本發(fā)明的北極甜蝦組織蛋白酶L1與通常所知的組織蛋白酶L樣蛋白水解酶相比，在其特異性和抑制劑的抑制作用兩個方面都不同。還可得出它是一種全新的酶的結(jié)論。
北極甜蝦組織蛋白酶L2的表達可用EasySelectTMEcho-AdaptedTM畢赤酵母表達試劑盒(Invitrogen)在甲基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中異源表達編碼北極甜蝦組織蛋白酶L2(北極甜蝦半胱氨酸蛋白酶NsCys)的基因。
編碼全長北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)(不包括其信號肽)的924bp cDNA用PCR進行擴增，并根據(jù)試劑盒的方案將其克隆入試劑盒中的pUniD/V5-His-TOPO載體。所得載體通過Cre重組酶進行質(zhì)粒融合而重組入巴斯德畢赤酵母穿梭載體pPICZα-E中，使北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)的cDNA置于酵母α-結(jié)合因子分泌信號的下游。
融合質(zhì)粒載體用限制性酶Pme I線性化，然后通過電穿孔(GenePulser，Bio-Rad)轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母KM71H菌株(arg4aoxlARG4)。其中整合有多個拷貝北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)的陽性轉(zhuǎn)化子，通過提高培養(yǎng)基(YPDS，含酵母抽提物、蛋白胨抽提物和山梨醇)中的zeocin濃度至2000μg/ml而進行選擇。選擇具有高產(chǎn)量克隆的單菌落用于重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，并僅用一步凝膠過濾層析從濃縮的培養(yǎng)基中獲得北極甜蝦組織蛋白酶L2(北極甜蝦半胱氨酸蛋白酶，NsCys)的純制品。
在誘導(dǎo)表達前，將巴斯德畢赤酵母克隆接種于1L GCM(甘油復(fù)合培養(yǎng)基)，于30℃有氧條件下培養(yǎng)4天。在室溫下，3000×g離心5分鐘收集細胞。于100ml ofBMM培養(yǎng)基(緩沖甲醇基礎(chǔ)培養(yǎng)基)或MM培養(yǎng)基(甲醇基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中誘導(dǎo)表達。每天加入甲醇使終濃度為0.75％，以避免由于蒸發(fā)導(dǎo)致培養(yǎng)基甲醇損失。為證實表達，每天收集樣品，于4℃ 12000×g離心20分鐘，對上清用4-20％梯度的聚丙烯酰胺凝膠板進行SDS-PAGE分析。
<重組蛋白的純化>
于4℃，用YM-10濾器(Amicon)將不含細胞的培養(yǎng)基上清超濾濃縮至約10ml。將濃縮液對50mM Tri-HCl(含150mM NaCl)透析。對透析液用相同緩沖液平衡的Superdex 75pg柱(1.6×100cm)進行凝膠過濾層析。用FPLC系統(tǒng)以0.3ml/min的流速洗脫蛋白。用Z-Phe-Arg-MCA測量各部分的酶活性，具有最高活性的部分進一步用SDS-PAGE和酶譜法進行分析以確定純化度的一致性。采用的明膠酶譜法為稍做改進的Heussen及Dowdle法。
于4℃，用含0.1％明膠的15％的聚丙烯酰胺凝膠板進行電泳。電泳后，在2.5％Triton-X中洗滌兩次，每次30分鐘以除去SDS。于室溫下，將凝膠在酶反應(yīng)溶液(100mM乙酸鈉，pH5.5，100mMNaCl、2mM DTT、2mM EDTA和0.01％Brij)中保溫3小時。用考馬斯亮藍R250染色，用10％乙酸脫色。
結(jié)果如圖12所示(對照1，圖5)。
對圖12A(泳道2)中的30KDa蛋白的N末端氨基酸序列進行鑒定。它與由堿基序列推測的成熟的北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)的N末端氨基酸序列一致。
<蛋白濃度的測定>
純化的重組北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)的濃度用Bradford法進行測量，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。為研究蝦蛋白酶的動力學(xué)，酶的摩爾量采用Barrett及Kirschke法，通過用E-64滴定活性位點來進行測量。
<酶活性>
酶活性的測量按實施例4進行。
<活性和穩(wěn)定性的pH和熱依賴性>
按上述方法，在準(zhǔn)一級反應(yīng)條件下，用濃度為10μM的底物測量重組北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)的pH活性曲線。
所用緩沖液如下100mM檸檬酸鈉緩沖液，pH3.0-6.0；100mM磷酸鈉緩沖液，pH6.0-8.0；和100mM硼酸鈉緩沖液，pH8.0-11.0。每種pH緩沖液還含有2mM DTT、2mM EDTA和300mM NaCl。
于25℃，將酶在這些緩沖液中保溫30分鐘以測定pH穩(wěn)定性。殘留活性用上述熒光底物測量。
結(jié)果如圖13所示。在堿性范圍，哺乳動物的組織蛋白酶L被完全滅活或僅有極低的活性，但是本發(fā)明的北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)即使是在pH8.5時也保留約80％的活性。
為測量溫度對北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)水解Z-Pro-Arg-MCA的活性的影響，將含底物的緩沖液置于不同的溫度下預(yù)熱10分鐘，然后加入酶液。反應(yīng)5分鐘，按上述方法記錄下熒光變化。為考察熱穩(wěn)定性，于30-60℃處理酶溶液，按某一時間間隔收集樣品，迅速于冰上冷卻，于25℃測量對Z-Pro-Arg-MCA的殘留活性。
結(jié)果如圖14所示。
<底物特異性分析>
按實施例4中的方法測量底物特異性。
結(jié)果如圖15所示。
一般來說，組織蛋白酶L和S適宜于作用帶Phe和Leu并具有大的疏水側(cè)鏈的底物，而不適宜于作用帶Val并在P2位具有小的β-枝鏈的底物。相反，北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)對Leu與Val的偏好次序正好相反。此外，與已知的其它組織蛋白酶不同的是，北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)對Phe的親和性比對Pro的高10倍。哺乳動物組織蛋白酶也偏好于P2位Pro，但是不同的是，它同樣接受Leu為P2位殘基并對Phe也有很高的親和性。
<高血糖素的降解>
1μM高血糖素樣品于25℃在含100mM NaCl、2mM DTT和0.01％Brij-35的100mM乙酸鈉緩沖液(pH6.0)中，用12.5nM重組北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)降解4小時。樣品用15％乙酸酸化，所得肽片段立即用反相HPLC(ODS-120A柱(25×0.4cm，Tosoh))分離。用含0.1％三氟乙酸的水洗柱至215nm處的吸光度到達基線，用含0.1％三氟乙酸的95％乙腈，以0-60％線性梯度和1.0ml/min的流速進行洗脫。
收集215nm處的每一個吸收峰所對應(yīng)的洗脫液，真空干燥，用Applied Biosystems公司生產(chǎn)的476A型蛋白測序儀(Protein SequencerModel 476A)進行分析。
結(jié)果如圖16所示。
雖然高血糖素中不含Pro，但結(jié)果與合成底物的降解結(jié)果相符。P2位殘基的偏好順序為Val、Thr和Ala。不存在P2中具有Leu的片段的事實表明它對Leu的親和性極低。
<對膠原蛋白的消化>
對含有大量Pro的I型膠原蛋白的降解進行了試驗。
豬皮酸溶性I型膠原蛋白用100mM乙酸鈉緩沖液(pH6.0，含150mMNaCl、2mMDTT和2mMEDTA)稀釋至濃度為2.5μM，并在有或無10μM E-64的存在下，用125nM北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)處理。
按預(yù)先設(shè)定的時間間隔收集樣品，立即加入到SDS-PAGE樣品緩沖液中，煮沸5分鐘。用4-20％梯度膠(TEFCO)通過考馬斯藍染色來證實膠原蛋白的水解。
結(jié)果如圖17所示。
結(jié)果與已知的半胱氨酸蛋白酶進行了比較。我們發(fā)現(xiàn)北極甜蝦組織蛋白酶L2(NsCys)對I型膠原蛋白降解極強。
本發(fā)明提供來源于北極甜蝦的新穎的水解膠原蛋白的組織蛋白酶L樣酶。本發(fā)明酶可從北極甜蝦的肝胰腺中獲得，或者通過培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入編碼本發(fā)明酶基因的宿主細胞來獲得。本發(fā)明可用于廣泛的領(lǐng)域如食品、化妝品和藥品。
本申請要求2002年6月17日提交到日本專利廳的日本專利申請(Shutsugan)2002-175773以及2003年5月20日提交到美國專利商標(biāo)局的美國臨時申請60/471733的優(yōu)先權(quán)。這兩個申請的內(nèi)容被本發(fā)明通過引用結(jié)合到本說明書中。
序列表<110>Nichirei Corporation<120>來源于北極甜蝦(Pandalus eous)的新型降解膠原的組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶、其生產(chǎn)方法<130>PH-1804US<150>JP 2002-175773<151>2002-06-17<150>US 60/471,733<151>2003-05-20<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1246<212>DNA<213>北極甜蝦(Pandalus eous)<400>1tgagtcagtt ctgctcaact ctgatacgat gaaggttctt cttttcctgt gtggtctggc 60catagtcgcc gctagtgaat gggaaaactt caagttgacc catgctaaag tttacaccca 120tggcaaggaa gatctttaca ggaggtccat ctttgagaac aaccagaagg ttgtcgagga 180acacaatgaa cgattccgtc agggacttgt caccttcgac ctcaagatga acagattcgg 240agatatgacg acagaggagt ttgtatccca gatgaccggg ctcaacaaag tagagaggac 300cgttggtaag gtgttcgctc actaccctga agtagaaagg gctgacactg ttgactggag 360agacaaagga gctgtgaccc cagttaagga tcagggtcag tgtggatcat gctgggcctt 420ctctaccact ggagctctgg aaggagcaca tttcctgaaa cacggcgatt tagtcagtct 480gtccgaacaa aatctggtcg attgctcaac tgagaacagt ggctgtaacg gcggtgtggt 540ccaatgggcc tacgactaca tcaagtccaa caacggaatt gatactgaat cttcataccc 600
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100 105 110Lys Gly Ala Val Thr Pro Val Lys Asp Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys115 120 125Trp Ala Phe Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Gly Ala His Phe Leu Lys130 135 140His Gly Asp Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser145 150 155 160Thr Glu Asn Ser Gly Cys Asn Gly Gly Val Val Gln Trp Ala Tyr Asp165 170 175Tyr Ile Lys Ser Asn Asn Gly Ile Asp Thr Glu Ser Ser Tyr Pro Tyr180 185 190Glu Ala Gln Asp Leu Thr Cys Arg Phe Asp Ala Ala His Val Gly Ala195 200 205Thr Val Thr Gly Tyr Ala Asp Ile Pro Tyr Ala Asp Glu Val Thr Gln210 215 220Ala Ser Ala Val His Asp Asp Gly Pro Val Ser Val Cys Ile Asp Ala225 230 235 240Gly His Asn Ser Phe Gln Leu Tyr Ser Ser Gly Val Tyr Tyr Glu Pro245 250 255Asn Cys Asn Pro Ser Ser Ile Asn His Ala Val Leu Pro Val Gly Tyr260 265 270Gly Thr Glu Glu Gly Ser Asp Tyr Trp Leu Ile Lys Asn Ser Trp Gly275 280 285Thr Gly Trp Gly Leu Ser Gly Tyr Met Lys Leu Thr Arg Asn Lys Ser290 295 300
Asn His Cys Gly Val Ala Thr Gln Ser Cys Tyr Pro Asn Val305 310 315<210>3<211>1242<212>DNA<213>北極甜蝦(Pandalus eous)<400>3cactttagca agatgaggtc tctgtttctt atccttctcg ggctggctgc ggtctccgcc 60attggagaat gggaaaactt caagacgaag tttggcaaga agtatgccaa ctcagaagag 120gagagtcaca gaatgtctgt tttcatggac aaactgaagt tcattcagga gcacaatgaa 180cgatacgata agggagaagt cacttattgg ctgaaaatca acaacttctc cgatttgacc 240cacgaagagg tcttggccac caagactgga atgaccagga gacgacaccc tctttccgta 300ttgcccaaat ctgccccaac cacaccaatg gccgcagacg ttgactggag gaataagggg 360gctgtcaccc ccgtcaagga tcagggacaa tgcggatcat gctgggcttt ctcagctgtc 420gccgccttgg aaggagcgca cttcctgaag accggagatt tggtcagcct gtctgaacag 480aatttggttg actgctcttc gtcttacggt aaccaaggat gtaatggtgg atggccatac 540caagcttatc aatacatcat tgccaatcgt ggcattgaca ccgaatcgtc atacccttac 600aaggcaattg atgacaattg ccgatatgat gccggaaaca tcggcgccac cgtcagcagt 660tatgtcgaac cagcttcagg agatgagtcc gcacttcagc atgctgtcca gaatgaagga 720cccgtcagcg tctgcattga tgctggtcaa tcatctttcg gtagttacgg aggaggtgtt 780tactatgaac caaactgcga ttcctggtac gccaaccatg ccgtgacagc cgtcggctac 840ggcaccgacg ccaacggagg agattactgg atcgtcaaga actcgtgggg tgcatggtgg 900ggagagagtg gctacatcaa gatggccaga aacagggaca acaactgtgc cattgctacc 960tatagtgtct accctgttgt ttaagatctt ttattgacac tcacaatgat tttctttcca 1020tcatttatca ttggggaact tttaatattc atttggggtt ttcatttgat attttgtgta 1080agtctcagtc aatcccatta gacatgtttt gttacggtgg attcttaagt caacctttga 1140atcaaacact tttgtcaaat tacaatgaac acatccaaca gatgatgata catatgaaaa 1200taaagataca acagataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa1242<210>4<211>323<212>PRT<213>北極甜蝦(Pandalus eous)
<400>4Met Arg Ser Leu Phe Leu Ile Leu Leu Gly Leu Ala Ala Val Ser Ala1 5 10 15Ile Gly Glu Trp Glu Asn Phe Lys Thr Lys Phe Gly Lys Lys Tyr Ala20 25 30Asn Ser Glu Glu Glu Ser His Arg Met Ser Val Phe Met Asp Lys Leu35 40 45Lys Phe Ile Gln Glu His Asn Glu Arg Tyr Asp Lys Gly Glu Val Thr50 55 60Tyr Trp Leu Lys Ile Asn Asn Phe Ser Asp Leu Thr His Glu Glu Val65 70 75 80Leu Ala Thr Lys Thr Gly Met Thr Arg Arg Arg His Pro Leu Ser Val85 90 95Leu Pro Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Met Ala Ala Asp Val Asp Trp100 105 110Arg Asn Lys Gly Ala Val Thr Pro Val Lys Asp Gln Gly Gln Cys Gly115 120 125Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Val Ala Ala Leu Glu Gly Ala His Phe130 135 140Leu Lys Thr Gly Asp Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp145 150 155 160Cys Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Gln Gly Cys Asn Gly Gly Trp Pro Tyr165 170 175Gln Ala Tyr Gln Tyr Ile Ile Ala Asn Arg Gly Ile Asp Thr Glu Ser180 185 190Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Ile Asp Asp Asn Cys Arg Tyr Asp Ala Gly
195 200 205Asn Ile Gly Ala Thr Val Ser Ser Tyr Val Glu Pro Ala Ser Gly Asp210 215 220Glu Ser Ala Leu Gln His Ala Val Gln Asn Glu Gly Pro Val Ser Val225 230 235 240Cys Ile Asp Ala Gly Gln Ser Ser Phe Gly Ser Tyr Gly Gly Gly Val245 250 255Tyr Tyr Glu Pro Asn Cys Asp Ser Trp Tyr Ala Asn His Ala Val Thr260 265 270Ala Val Gly Tyr Gly Thr Asp Ala Asn Gly Gly Asp Tyr Trp Ile Val275 280 285Lys Asn Ser Trp Gly Ala Trp Trp Gly Glu Ser Gly Tyr Ile Lys Met290 295 300Ala Arg Asn Arg Asp Asn Asn Cys Ala Ile Ala Thr Tyr Ser Val Tyr305 310 315 320Pro Val Val<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5gcatcaatac agacgctgac 20<210>6<211>21<212>DNA
<213>人工序列<223>引物<400>6catcagcata agggatatct g 21<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>引物<400>7aacgtgtgca gcgtcgaatc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>引物<400>8gtctcatctc cttcggttac20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>引物<400>9accttgaatg gtggcaccga20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列
<223>引物<400>10cgcacttgtc atcaacagca 20<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>引物<400>11tgagtcagtt ctgctcaact ctgatacg28<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>引物<400>12cactttagca agatgaggtc tctg2權(quán)利要求
1.一種來源于北極甜蝦的純化組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶，其中所述蛋白酶具有如下特征(1)分子量約為30KDa；(2)最適pH約為7-8；(3)最適溫度約為35℃；(4)膠原蛋白分解活性；以及(5)組織蛋白酶L樣活性。
2.權(quán)利要求1的組織蛋白酶L樣蛋白，其中所述蛋白的N末端氨基酸序列為DTVDWRDKGAVTPVKDQGQ。
3.一種選自下列蛋白(a)或(b)的蛋白，其中所述蛋白為(a)包含SEQ ID2中106位殘基或更多殘基的氨基酸序列或包含SEQ ID4中107位殘基或更多殘基的氨基酸序列的蛋白；或(b)包含在蛋白(a)氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸的缺失、置換或添加的氨基酸序列并且具有組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶活性的蛋白。
4.權(quán)利要求3的選自下列蛋白(a)或(b)的蛋白，其中所述蛋白為(a)由SEQ ID2中106位殘基的氨基酸序列或包含SEQ ID4中序列位號等于或大于107的氨基酸的序列組成的蛋白；或(b)由蛋白(a)的氨基酸序列中一個或多個氨基酸缺失、置換或添加形成的氨基酸序列組成并且具有組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶活性的蛋白。
5.一個編碼權(quán)利要求3-4任一項的蛋白的DNA。
6.一種選自下列DNA(a)或(b)的DNA，其中所述DNA為(a)由SEQ ID1的344-982位或SEQ ID3的331-981位組成的DNA；或(b)在嚴(yán)格條件下可與由(a)的互補堿基序列組成的DNA雜交并且編碼具有組織蛋白酶L樣酶活性的蛋白的DNA。
7.權(quán)利要求6的選自下列DNA(a)或(b)的DNA，其中所述DNA為(a)包含SEQ ID1的344-982位或SEQ ID3的331-981位的DNA；或(b)在嚴(yán)格條件下可與由(a)的互補堿基序列組成的DNA雜交并且編碼具有組織蛋白酶L樣酶活性的蛋白的DNA。
8.一種選自下列蛋白(a)或(b)的前原組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶蛋白，其中所述蛋白為(a)SEQ ID2或4的氨基酸序列組成的蛋白；(b)由在蛋白(a)的氨基酸序列中一個或多個氨基酸缺失、置換或添加形成的氨基酸序列組成并且具有組織蛋白酶L樣酶活性的前原蛋白。
9.一種編碼權(quán)利要求8的前原組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶的DNA。
10.一種選自下列DNA(a)或(b)的DNA，其中所述DNA為(a)具有SEQ ID1或3所示序列的DNA；(b)在嚴(yán)格條件下可與由DNA(a)的互補堿基序列組成的DNA雜交并且編碼具有組織蛋白酶L樣酶活性的前原蛋白的DNA。
11.一種能產(chǎn)生與權(quán)利要求4或8的氨基酸序列的全部或部分有80％或80％以上相同的多肽的DNA。
12.一種包含權(quán)利要求5-6或9-11任一項的DNA的載體。
13.一種用權(quán)利要求12的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其中所述宿主細胞能表達組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶。
14.一種生產(chǎn)組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶蛋白的方法，其中所述組織蛋白酶L樣蛋白在權(quán)利要求13的宿主細胞中表達，然后進行收集。
15.一種選自下列肽(a)或(b)的組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶信號肽，其中所述肽為(a)由SEQ ID2的1-15位(Met至Ala)或SEQ ID4的1-14位(Met至Val)的氨基酸序列組成的肽；(b)由肽(a)的氨基酸序列中一個或多個氨基酸缺失、置換或添加形成的氨基酸序列組成并且具有組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶信號肽功能的肽。
16.一種編碼權(quán)利要求15的組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶信號肽的DNA。
17.一種選自下列DNA(a)或(b)的DNA，其中所述DNA為(a)由SEQ ID1的29-73位或SEQ ID3的13-54位組成的DNA；(b)在嚴(yán)格條件下可與由DNA(a)的互補堿基序列組成的DNA雜交并且編碼組織蛋白酶L樣酶信號肽的DNA。
18.一種選自下列前肽(a)或(b)的組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶前肽，其中所述前肽為(a)由SEQ ID2中16-105位(Ser至Ala)或SEQ ID4中15-106位(Ser至Met)的氨基酸序列組成的肽；(b)由肽(a)的氨基酸序列中一個或多個氨基酸缺失、置換或添加形成并且具有組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶前肽功能的肽。
19.一種編碼權(quán)利要求18的組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶前肽的DNA。
20.一種選自下列DNA(a)或(b)的DNA，其中所述DNA為(a)由SEQ ID1的74-343位或SEQ ID3的55-330位組成的DNA；(b)在嚴(yán)格條件下可與由DNA(a)的互補堿基序列組成的DNA雜交并且編碼組織蛋白酶L樣酶前肽的DNA。
21.一種用于檢測組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶基因的引物，所述引物由權(quán)利要求4-5或7-8任一項的DNA的15個或更多個的連續(xù)堿基或其互補鏈組成。
全文摘要
本發(fā)明的目的是尋找和生產(chǎn)在低溫區(qū)及中性至堿性條件下仍然保持高活性的組織蛋白酶L。在生長在日本的粉紅色蝦(Pandaluseous)的肝胰腺中成功地發(fā)現(xiàn)了一種新穎的在低溫區(qū)保持其活性的組織蛋白酶L。此外，該新穎組織蛋白酶L的基因序列也已測定，這使得采用基因重組方法生產(chǎn)所述酶成為可能。
文檔編號C12N1/21GK1675358SQ03819490
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月17日
發(fā)明者青木仁史, 渡部終五, M·N·阿桑 申請人:株式會社日冷