專利名稱：制備內(nèi)酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種借助于微生物制備內(nèi)酯的方法，所述內(nèi)酯可用于香料和香精物質(zhì)、藥物中間體等等。
背景技術(shù)：
芳香族物質(zhì)大致分為兩類即，化學(xué)合成的(所謂的“合成芳香族化合物”)；和非化學(xué)合成的(所謂的“天然芳香族化合物”)，根據(jù)其初始材料或其制備方法。近來(lái)，相對(duì)于“合成產(chǎn)物”，消費(fèi)者更趨向于選擇“天然產(chǎn)物”。但是，例如，天然物質(zhì)中僅僅含有非常少量的光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯(R-γ-癸內(nèi)酯或S-γ-癸內(nèi)酯)和δ-癸內(nèi)酯，它們是天然食品香料的重要組分。因此，這些方法，例如高光學(xué)純度的這種光學(xué)活性物質(zhì)的提純或者通過(guò)其它方法將其分離，從技術(shù)和經(jīng)濟(jì)的角度來(lái)考慮是不利的。結(jié)果，目前，通常以低價(jià)供應(yīng)大量合成產(chǎn)物。相反，天然產(chǎn)物的生產(chǎn)規(guī)模很小，這些天然產(chǎn)物通常很昂貴。
希望開(kāi)發(fā)一種制備大量前述天然芳香族化合物的方法，所述方法的成本低至目前在合成芳香族化合物中使用的成本。在這些已經(jīng)提出的提供大量天然產(chǎn)物的方法當(dāng)中，一種基于微生物發(fā)酵技術(shù)的方法引起人們的注意。在這種技術(shù)中，天然R-γ-癸內(nèi)酯由天然材料或其降解產(chǎn)物通過(guò)生物或物理技術(shù)進(jìn)行制備，沒(méi)有使用任何化學(xué)技術(shù)。
例如，日本專利公開(kāi)(Kokai)No.59-82090A(1984)公開(kāi)了一種基于微生物的方法，用于從蓖麻油或其水解產(chǎn)物中制備γ-癸內(nèi)酯。在這種方法中，微生物例如米曲霉、皺褶假絲酵母、Geotrichum klebannii和Yarrowia lipolytica用于制備γ-羥基癸酸，加入鹽酸等等將所得產(chǎn)物進(jìn)行酸化，接著加熱進(jìn)行內(nèi)酯化，由此制得γ-癸內(nèi)酯。日本專利公開(kāi)(Kokai)No.63-56295A(1988)和K.A.Maume等人的報(bào)道(Biocatalysis，vol.5，79-97，1991)公開(kāi)了一種制備γ-癸內(nèi)酯的方法，其中γ-羥基癸酸從蓖麻油酸源中使用Sporobolomyces odorus或粘紅酵母制備，將所得產(chǎn)物同樣進(jìn)行內(nèi)酯化。日本專利公開(kāi)No.2-174685A(1990)公開(kāi)了一種從蓖麻油或蓖麻油酸中制備γ-癸內(nèi)酯的方法，通過(guò)使用微生物例如黑曲霉制備γ-羥基癸酸。日本專利公開(kāi)No.3-117494 A(1991)公開(kāi)了同樣的技術(shù)，使用微生物例如釀酒酵母。在這些技術(shù)公開(kāi)之前，S.Okui等人報(bào)道了在使用念珠菌屬的若干細(xì)胞株氧化和降解蓖麻油酸的方法中，γ-羥基癸酸和γ-癸內(nèi)酯作為中間體(J.Biochem.，vol.54，No.6，536-540，1963)。同樣，EP 997533公開(kāi)了一種使用Yarrowia lipolytica從蓖麻油中制備γ-癸內(nèi)酯的方法，每升蓖麻油獲得12g產(chǎn)物。然而，由于在培養(yǎng)期間需要使用乳化劑或pH調(diào)節(jié)劑，并且少量的初始材料，即蓖麻油需要加入到培養(yǎng)體系中，其低至0.0247kg/L，因此從生產(chǎn)效率的角度考慮，這種生產(chǎn)方法是極其不利的。此外，在這些出版物等等中公開(kāi)的微生物，其不同于在本發(fā)明中所使用的那些微生物物種，由于很難從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離出細(xì)胞株并且從經(jīng)濟(jì)的角度來(lái)說(shuō)生產(chǎn)是不足量的，因此并不總適于實(shí)際使用。
作為選擇，已經(jīng)報(bào)道了一種從糖底物中借助于Sporobolomycesodorus(S.Taquara等人，Agric.Biol.Chem.，vol.36，No.13，2585-2587，1972；N.Jourdain等人，“Top.Flavour Res.，Proc.Int.Conf，”H.Eichhorn，427-441，1985)或梨孢鐮刀菌(J.Sarris等人，Agric.Biol.Chem.，vol.49，No.11，3227-3230，1985)制備γ-癸內(nèi)酯的方法，其是方法的例子，其中一種組分而不是蓖麻油或其水解產(chǎn)物用作碳源。但是，這些技術(shù)不適合工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，因?yàn)閮H僅制得非常少量的γ-癸內(nèi)酯。
因此，希望開(kāi)發(fā)一種有效地制備γ-羥基癸酸和γ-癸內(nèi)酯的方法，所述方法不需要使用乳化劑或pH調(diào)節(jié)劑，并且可以加入高濃縮的初始材料，即蓖麻油和/或其水解產(chǎn)物。
還報(bào)道了在天然存在的γ-癸內(nèi)酯中，R-γ-癸內(nèi)酯對(duì)映體的豐度是過(guò)量的(A.Bernreuther等人，J.Chromatography，481，363，1989)。通過(guò)化學(xué)合成制備這種純光學(xué)活性形式的R-γ-癸內(nèi)酯的方法公開(kāi)在日本專利公開(kāi)No.4-108782A(1992)。
R-γ-癸內(nèi)酯還可以通過(guò)從外消旋混合物中選擇性地分離R-γ-癸內(nèi)酯進(jìn)行制備，其中外消旋混合物從天然物質(zhì)中通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的技術(shù)提取得到。由于在天然物質(zhì)中非常少量的R-γ-癸內(nèi)酯以及從其它揮發(fā)性化合物中分離R-γ-癸內(nèi)酯存在物理困難，因此從天然物質(zhì)中提取并不是成本有效的。為了解決不斷增加的對(duì)上述天然物質(zhì)的需求，需要開(kāi)發(fā)一種有效制備天然R-γ-癸內(nèi)酯的方法，其使用不同于化學(xué)合成或從外消旋混合物中分離的技術(shù)。
現(xiàn)已提出了一種使用微生物制備δ-癸內(nèi)酯的方法，其使用真菌特別是酵母的還原能力。例如，日本專利公開(kāi)No.3-155792 A(1992)公開(kāi)了一種從天然存在的2-癸烯-1，5-內(nèi)酯中通過(guò)利用釀酒酵母來(lái)生產(chǎn)5-癸內(nèi)酯的方法。日本專利公開(kāi)No.6-225781 A(1994)報(bào)道了一種從含相應(yīng)的不飽和內(nèi)酯(即δ-癸烯-2-內(nèi)酯、δ-十二烯-2-內(nèi)酯或其混合物)的底物中，通過(guò)使用酵母例如Saccharomyces delbrueckii進(jìn)行生物氫化，以制備δ-癸內(nèi)酯、δ-十二內(nèi)酯或其混合物的方法。但是，例如由于在高濃度底物上作用存在困難，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能獲得所需物質(zhì)，因此使用酵母的還原能力來(lái)進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化的技術(shù)仍然是存問(wèn)題的。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)要求日本專利申請(qǐng)No.2002-190616的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此被引入。
為了克服上述問(wèn)題，完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用微生物有效制備天然內(nèi)酯的方法，所述的天然內(nèi)酯包括光學(xué)活性內(nèi)酯例如光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯和光學(xué)活性δ-癸內(nèi)酯。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人已經(jīng)從現(xiàn)有細(xì)胞株和自然界中廣泛尋找微生物，其可以在蓖麻油和/或其水解產(chǎn)物作為碳源的培養(yǎng)基中累積高濃度的γ-羥基癸酸。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)，在一種培養(yǎng)基中，使用candidasorbophila以及加入至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的高濃度初始原料，能夠高效地產(chǎn)生和累積γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯，同時(shí)不需要使用乳化劑或pH調(diào)節(jié)劑。此外，他們還發(fā)現(xiàn)通過(guò)在酸性條件下加熱獲得的γ-羥基癸酸，可以很容易地制得光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯。由此制得的光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯可以以非常高的生產(chǎn)率進(jìn)行回收。此外，他們還發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用各種羥基脂肪酸作為碳源，上述candida sorbophila能夠制得各種光學(xué)活性內(nèi)酯。
本發(fā)明是在基于這些發(fā)現(xiàn)下完成的，本發(fā)明將在下面進(jìn)行描述。
(1)一種制備內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)candida sorbophila，然后從培養(yǎng)基中回收生成的內(nèi)酯。
(2)一種制備內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)candida sorbophila，然后對(duì)從培養(yǎng)基中生成的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸進(jìn)行內(nèi)酯化。
(3)根據(jù)(1)或(2)的方法，其中candida sorbophila是至少一種選自candida sorbophila菌株ATCC 74362、candida sorbophila菌株ATCC 60130、candida sorbophila菌株IFO 1583和candidasorbophila菌株FC 58的微生物，它們以登記號(hào)FERM BP-8388保藏。
(4)根據(jù)(1)或(2)的方法，其中內(nèi)酯用下面的通式表示 其中環(huán)A表示一個(gè)內(nèi)酯環(huán)；R1表示氫原子、烴基、取代烴基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；以及R2表示氫原子、烴基或取代烴基；其中環(huán)A和R2可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)。
(5)根據(jù)(1)或(2)的方法，其中內(nèi)酯是光學(xué)活性內(nèi)酯。
(6)根據(jù)(1)或(2)的方法，其中羥基脂肪酸用下面的通式(2)表示 其中R1表示氫原子、烴基、取代烴基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R2表示氫原子、烴基或取代烴基；以及R3表示任選取代的二價(jià)烴基，具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈；其中R2和R3可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)。
(7)根據(jù)(1)或(2)的方法，其中羥基脂肪酸衍生物是羥基脂肪酸烷基酯或羥基脂肪酸甘油酯。
(8)根據(jù)(7)的方法，其中羥基脂肪酸烷基酯用下面通式(3)表示
其中R1表示氫原子、烴基、取代烴基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R2表示氫原子、烴基或取代烴基；以及R3表示任選取代的二價(jià)烴基，具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈；以及R4表示烷基；其中R2和R3可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)。
(9)根據(jù)(7)的方法，其中羥基脂肪酸甘油酯用下面通式(4)表示 其中R6-R8每個(gè)獨(dú)立地表示氫原子或下面通式(6)表示的基團(tuán) 其中R1表示氫原子、烴基、取代烴基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R2表示氫原子、烴基或取代烴基；R3表示任選取代的二價(jià)烴基，具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈；以及R4表示烷基；其中R2和R3可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)，條件是R6-R8中至少一個(gè)是上述通式(6)表示的基團(tuán)。
(10)根據(jù)(1)或(2)的方法，其中candida sorbophila在在含至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸、11-羥基棕櫚酸、lesquerolicacid、10-羥基硬脂酸、10-羥基棕櫚酸和11-羥基棕櫚酸乙酯的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
(11)根據(jù)(2)的方法，其中內(nèi)酯前體羥基脂肪酸是具有4個(gè)或更多個(gè)碳原子的羥基脂肪酸，其在4或5位具有一個(gè)羥基。
(12)根據(jù)(1)或(2)的方法，其中內(nèi)酯是選自γ-癸內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、γ-庚內(nèi)酯、γ-辛內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯、γ-十二內(nèi)酯、γ-十三內(nèi)酯、γ-十四內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯、δ-己內(nèi)酯、δ-庚內(nèi)酯、δ-辛內(nèi)酯、δ-壬內(nèi)酯、δ-十一內(nèi)酯、δ-十二內(nèi)酯、δ-十三內(nèi)酯和δ-十四內(nèi)酯的任何一種。
(13)一種制備內(nèi)酯前體羥基脂肪酸的方法，包括在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)candida sorbophila。
(14)一種制備γ-癸內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的介質(zhì)中培養(yǎng)candidasorbophila，然后從介質(zhì)中回收生成的γ-癸內(nèi)酯。
(15)一種制備γ-癸內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的介質(zhì)中培養(yǎng)candidasorbophila，然后對(duì)從介質(zhì)中生成的γ-羥基癸酸進(jìn)行內(nèi)酯化。
(16)根據(jù)(14)或(15)的方法，其中γ-癸內(nèi)酯是光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯。
(17)根據(jù)(14)或(15)的方法，其中至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid是蓖麻油和/或蓖麻油水解產(chǎn)物。
(18)一種制備δ-癸內(nèi)酯的方法，包括在一種含11-羥基棕櫚酸和/或11-羥基棕櫚酸乙酯的介質(zhì)中培養(yǎng)candida sorbophila，然后從介質(zhì)中回收生成的δ-癸內(nèi)酯。
(19)一種制備δ-癸內(nèi)酯的方法，包括在一種含11-羥基棕櫚酸和/或11-羥基棕櫚酸乙酯的介質(zhì)中培養(yǎng)candida sorbophila，然后對(duì)從介質(zhì)中生成的δ-羥基癸酸進(jìn)行內(nèi)酯化。
(20)根據(jù)(18)或(19)的方法，其中δ-癸內(nèi)酯是光學(xué)活性的δ-癸內(nèi)酯。
(21)根據(jù)(14)、(15)、(18)或(19)的方法，其中candida sorbophila是至少一種選自candida sorbophila菌株ATCC 74362、candidasorbophila菌株ATCC 60130、candida sorbophila菌株IFO 1583和candida sorbophila菌株FC 58，以登記號(hào)FERM BP-8388保藏。
(22)candida sorbophila的用途，用于制備內(nèi)酯。
(23)candida sorbophila菌株FERM BP-8388。
本發(fā)明的內(nèi)酯制備方法可以如下進(jìn)行通過(guò)在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的介質(zhì)中培養(yǎng)candida sorbophila，以制備內(nèi)酯，然后將從介質(zhì)中回收內(nèi)酯。
本發(fā)明的內(nèi)酯制備方法還可以如下進(jìn)行通過(guò)在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的介質(zhì)中培養(yǎng)candida sorbophila，以制備內(nèi)酯前體羥基脂肪酸，然后對(duì)內(nèi)酯前體羥基脂肪酸進(jìn)行內(nèi)酯化。
在下文中，將詳細(xì)描述本發(fā)明的內(nèi)酯制備方法。
(1)candida sorbophila在本發(fā)明中使用的candida sorbophila的具體例子包括，但是不限于，candida sorbophila菌株FC 58、candida sorbophila菌株ATCC 74362、candida sorbophila菌株ATCC 60130和candidasorbophila菌株IFO 1583。candida sorbophila菌株FC 58于2002年6月10日保藏在International Patent Organism Depositary of theNational Institute of Advanced Industrial Science andTechnology(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，登錄號(hào)為FERM BP-8388(原始保藏)。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2003年5月28日將原始保藏轉(zhuǎn)移到國(guó)際保藏。
使用常規(guī)技術(shù)，從Kanagawa prefecture，Japan的普通土壤中分離得到上述candida sorbophila菌株FC 58。鑒別其真菌學(xué)性質(zhì)，和根據(jù)分類學(xué)教科書(shū)研究確定的性質(zhì)(Kurtzman，C.P.et al.，″The Yeasts，A Taxonomic Study″4th edition，1998，Elsevier Science B.V.；andBarnett，J.A.et al.，″YeastsCharacteristics and identification″3rded).結(jié)果，Candida sorbophila菌株FC 58被確定是Candidasorbophila屬的一種微生物。因此，將這種從自然界分離的微生物命名為Candida sorbophila菌株FC 58(在下文中被縮寫為″FC 58菌株″)。
可以優(yōu)選在本發(fā)明中使用的FC 58菌株的真菌學(xué)性質(zhì)如下。
(1)在YM液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)在24℃-27℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，形狀主要從球形變?yōu)闄E圓形。
(2)在YM瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)在24℃-27℃下培養(yǎng)2-3天后，菌株的顏色介于白色和奶油色之間，并且菌株被潤(rùn)濕。
(3)形狀球形到橢圓形，由多極芽殖繁殖，當(dāng)它在Adams、Gorodokowa、麥芽、YM、V-8或馬鈴薯葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，沒(méi)有觀察到假菌絲體的形成和子囊孢子的形成。
(4)最佳生長(zhǎng)條件在24℃-27℃，pH5.5-6.0。
(5)生長(zhǎng)的最高溫度在35℃-37℃。
(6)維生素需求它不能生長(zhǎng)在維生素缺乏的培養(yǎng)基。需要生物素、吡哆醇或維生素B1。
(7)發(fā)酵葡萄糖(-)、半乳糖(-)、蔗糖(-)、麥芽糖(-)、乳糖(-)、棉子糖(-)、海藻糖(-)。
(8)可同化性半乳糖(+)、山梨糖(+)、蔗糖(-)、麥芽糖(-)、海藻糖(-)、乳糖(-)、棉子糖(-)、纖維二糖(-)、蜜二糖(-)、松三糖(-)、淀粉(-)、D-木糖(-)、L-阿拉伯糖(-)、D-核糖(-)、D-鼠李糖(-)、D-葡糖胺(-)、N-乙酰基-D-葡糖胺(-)、丙三醇(弱)、赤蘚糖醇(-)、核糖醇(-)、D-甘露糖醇(+)、乳酸(弱)、檸檬酸(-)、肌醇(-)。
上述″ATCC″和″IFO″分別是″美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所″(AmericanType Culture Collection)和″Institution for Fermentation，大阪，日本″的縮寫?！錋TCC″或″IFO″表示每種菌株的編目號(hào)。根據(jù)那些編目號(hào)，由″ATCC″或″IFO″后的數(shù)值表示的上述Candida sorbophila可以從各個(gè)組織處獲得。
當(dāng)本發(fā)明所使用的Candida sorbophila在含羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物和/或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)β-氧化，它可以產(chǎn)生一種內(nèi)酯前體羥基脂肪酸，然后通過(guò)內(nèi)酯化生成的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸，可以制備內(nèi)酯，導(dǎo)致它們?cè)谂囵B(yǎng)基中累積。當(dāng)本發(fā)明所用的Candida sorbophila在一種含羥基脂肪酸衍生物的培養(yǎng)基中在合適的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，這種菌株水解羥基脂肪酸衍生物，然后β-氧化所述的水解產(chǎn)物，生成一種內(nèi)酯前體羥基脂肪酸。然后，產(chǎn)物在培養(yǎng)基中累積。在這種情況下，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和累積的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸的內(nèi)酯化可以導(dǎo)致所需內(nèi)酯的生成。
當(dāng)本發(fā)明所使用的Candida sorbophila在一種例如含蓖麻油的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，它可以水解蓖麻油。此外，在期間培養(yǎng)，通過(guò)β-氧化這種蓖麻油的水解產(chǎn)物，可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和累積γ-羥基癸酸和/或γ-癸內(nèi)酯。
(2)用于制備內(nèi)酯的培養(yǎng)基在本發(fā)明的方法中，使用一種培養(yǎng)基，其含有至少一種作為碳源的選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物和羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的物質(zhì)，并且Candida sorbophila可以生長(zhǎng)在這種培養(yǎng)基中，用于制備內(nèi)酯。
本發(fā)明所使用的羥基脂肪酸或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物沒(méi)有特別限制，只要它可以被Candida sorbophila β-氧化，由此產(chǎn)生內(nèi)酯前體羥基脂肪酸。本發(fā)明所使用的羥基脂肪酸衍生物沒(méi)有特別限制，只要它被Candida sorbophila水解，并且內(nèi)酯前體羥基脂肪酸可以由所得的水解產(chǎn)物通過(guò)β-氧化制得。
羥基脂肪酸，其具有6個(gè)或更多個(gè)，優(yōu)選6-25個(gè)，更優(yōu)選6-20個(gè)碳原子，并且至少在6-位上具有一個(gè)羥基，從羧基的碳原子上數(shù)起優(yōu)選在6-到20-位上，優(yōu)選在本發(fā)明中使用。
例如，羥基脂肪酸的一個(gè)具體例子用下面通式(2)表示 其中R1表示氫原子、烴基、取代烴基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R2表示氫原子、烴基或取代的烴基；R3表示任選取代的二價(jià)烴基，其具有一個(gè)4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈；其中R1和R2或R2和R3可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)。
通式(2)中的這些基團(tuán)描述如下。
烴基的例子，例如，包括烷基、具有不飽和鍵的烷基、芳基、芳烷基等等。
烷基可以是線性的、分枝的或環(huán)狀的。例如，烷基具有至少一個(gè)，優(yōu)選1-20個(gè)，更優(yōu)選1-15個(gè)，更進(jìn)一步優(yōu)選1-10個(gè)碳原子。其具體例子包括甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、2-丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、叔戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲丙基、正己基、2-己基、3-己基、叔己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基戊-3-基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
具有不飽和鍵的烷基包括在它的鏈中具有至少一個(gè)不飽和鍵例如雙鍵等等的烷基。其具體例子包括鏈烯基、烷二烯基、烷三烯基等等。
鏈烯基在上述烷基的鏈中具有一個(gè)雙鍵。例如，它可以是線性的、分枝的或環(huán)狀的，并且它可以具有至少2個(gè)，優(yōu)選2-20個(gè)，更優(yōu)選2-15個(gè)，更進(jìn)一步優(yōu)選2-10個(gè)碳原子。其具體例子包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、壬烯基(nonanyl)、癸烯基等等。
烷二烯基在上述烷基的鏈中具有兩個(gè)雙鍵。例如，它可以是線性的、分枝的或環(huán)狀的，并且它可以具有至少4個(gè)，優(yōu)選4-20個(gè)，更優(yōu)選4-15個(gè)，更進(jìn)一步優(yōu)選4-10個(gè)碳原子。其具體例子包括1，3-丁二烯基、2，4-丁二烯基、2，3-二甲基-1，3-丁二烯基等等。
芳基包括具有6-14個(gè)碳原子的那種。其具體例子包括苯基、萘基、蒽基、聯(lián)苯基等等。
芳烷基包括來(lái)源于上述烷基的基團(tuán)，其中烷基的至少一個(gè)氫原子被上述芳基取代。例如，芳烷基優(yōu)選具有7-12個(gè)碳原子。其具體例子包括芐基、2-苯乙基、1-苯丙基、3-萘丙基等等。
雜環(huán)基的例子脂肪族雜環(huán)基和芳香族雜環(huán)基。
脂肪族雜環(huán)基包括，例如，5-到8-元，優(yōu)選5-或6-元的單環(huán)、多環(huán)或稠環(huán)的脂肪族雜環(huán)基，其具有2-14個(gè)碳原子并且含有至少一個(gè)，優(yōu)選1-3個(gè)雜原子，例如氮、氧和硫原子。脂肪族雜環(huán)基的具體例子包括，例如，吡咯烷基-2-酮、哌啶子基、哌嗪基、嗎啉代、四氫呋喃基、四氫吡喃基等等。
芳香族雜環(huán)基例如包括5-到8-元，優(yōu)選5-或6-元的單環(huán)、多環(huán)或稠環(huán)的雜芳基，其具有2-15個(gè)碳原子，并且含有至少一個(gè)，優(yōu)選1-3個(gè)雜原子，例如氮、氧和硫原子。其具體例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基(pyrazyl)、噠嗪基(pyridazyl)、吡唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、異喹啉基、喹喔啉基、phthalazyl、喹唑啉基、naphthylidyl、噌啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基等等。
取代烴基包括取代烷基、具有不飽和鍵的取代烷基、取代芳基和取代芳烷基，其中在上述烴基中，至少一個(gè)氫原子被取代基所取代。
上述取代基包括烴基、取代烴、雜環(huán)基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧羰基、?；?、酰氧基、烷硫基、芳烷硫基、芳硫基、鹵素、亞烷基二氧基、氨基、取代氨基、肼基、氰基、硝基、羥基、被保護(hù)基取代的羥基、羧基、磺酰氨基、磺基、酰胺磷酸酯、取代的甲硅烷基等等。
在它們當(dāng)中，這些由R1表示的基團(tuán)優(yōu)選是烷基或具有不飽和鍵的烷基。
二價(jià)烴基，其可以有一個(gè)取代基并且含有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈，包括具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈的二價(jià)烴基和具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈的二價(jià)取代烴基。具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈的二價(jià)烴基包括亞烷基、具有一個(gè)不飽和鍵的亞烷基、和二價(jià)芳香族基團(tuán)，其具有一條至少4個(gè)碳的鏈。
具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈的亞烷基包括線性的、分枝的或環(huán)狀的亞烷基，具有一條至少4個(gè)，優(yōu)選4到20個(gè)，更優(yōu)選4到15個(gè)碳的鏈。其具體例子包括1，4-亞丁基、1，5-亞戊基、1，6-亞己基、1，7-亞庚基、1，8-亞辛基、1，9-亞壬基、1，10-亞癸基和-(CH2)m-o-C6H10-(CH2)n-等等，其中m和n每個(gè)獨(dú)立地是0或自然數(shù)，并且m+n≥2。
具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈和一個(gè)不飽和鍵等等的亞烷基包括在所述4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈中含有至少一個(gè)不飽和鍵例如雙鍵等等的亞烷基。具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈和一個(gè)不飽和鍵的亞烷基可以具有一條至少4個(gè)，優(yōu)選4到20個(gè)，更優(yōu)選4到15個(gè)碳的鏈，并且它可以是線性的、分枝的或環(huán)狀的。其具體例子包括亞烯基例如亞丁烯基、亞戊烯基和亞己烯基。
具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈的二價(jià)芳香族基團(tuán)含有一條至少4個(gè)，優(yōu)選4到20個(gè)，更優(yōu)選4到15個(gè)碳的鏈的二價(jià)芳香族基團(tuán)。其具體例子包括-(CH2)p-o-C6H4-(CH2)q-，其中p和q每個(gè)獨(dú)立地是0或自然數(shù)，以及p+q≥2等等。
含有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈的二價(jià)取代烴基包括，來(lái)源于含有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈的二價(jià)烴基的二價(jià)取代烴基，其中用上述取代基而不是羥基取代它的至少1個(gè)氫原子。
當(dāng)R1和R2或R2和R3連接在一起形成一個(gè)環(huán)時(shí)，所形成的環(huán)包括脂肪族環(huán)、芳香族環(huán)等等。脂肪族環(huán)包括環(huán)丁烷環(huán)、環(huán)戊烷環(huán)、環(huán)己烷環(huán)、環(huán)己烯環(huán)等等。芳香族環(huán)包括苯環(huán)。
羥基脂肪酸的優(yōu)選例子包括蓖麻油酸、11-羥基棕櫚酸、lesquerolicacid、10羥基硬脂酸和10-羥基棕櫚酸，以及由下式表示的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸。



上述羥基脂肪酸優(yōu)選是蓖麻油酸、11-羥基棕櫚酸、lesquerolicacid、10-羥基硬脂酸、10-羥基棕櫚酸等等。
在本發(fā)明中所使用的羥基脂肪酸衍生物優(yōu)選來(lái)源于上述羥基脂肪酸。這種羥基脂肪酸衍生物的優(yōu)選例子包括羥基脂肪酸的烷基酯、羥基脂肪酸的甘油酯等等。
例如，羥基脂肪酸烷基酯的一個(gè)具體例子用通式(3)表示 其中R4表示烷基，R1-R3如上所定義。
由R4表示的烷基可以是線性的或分枝的。所述烷基包括具有至少一個(gè)，優(yōu)選1-10個(gè)，更優(yōu)選1-6個(gè)，更進(jìn)一步優(yōu)選1-3個(gè)碳原子的烷基。其具體例子包括甲基、乙基、正丙基、2-丙基等等。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的羥基脂肪酸烷基酯是在它的烷基酯部分中具有1-3個(gè)碳原子的那種(例如，甲酯、乙酯和丙酯等等)。其具體例子包括11-羥基棕櫚酸乙酯、蓖麻酸乙酯、ethyl lesquerolate、10-羥基硬脂酸乙酯、10-羥基棕櫚酸乙酯等等。
羥基脂肪酸甘油酯包括羥基脂肪酸單酸甘油酯、羥基脂肪酸二酸甘油酯和羥基脂肪酸三酸甘油酯。例如，其具體例子由通式(4)表示 其中R6-R8每個(gè)獨(dú)立地表示氫原子或一個(gè)由通式(6)表示的基團(tuán) 其中R1-R3如上所定義，條件是R6-R8中的至少一個(gè)獨(dú)立地是由上述通式(6)表示的基團(tuán)。
由上述通式(4)表示的羥基脂肪酸甘油酯包括甘油和由上述通式(2)表示的羥基脂肪酸縮合反應(yīng)得到的那種。
在本發(fā)明中，羥基脂肪酸甘油酯的優(yōu)選例子包括蓖麻油等等。
本發(fā)明所使用的羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物可以由上述羥基脂肪酸衍生物水解制得。例如，這樣的水解產(chǎn)物可以通過(guò)化學(xué)或酶水解制得，例如用水解酶如脂肪酶等等、堿處理或高壓蒸氣對(duì)羥基脂肪酸的甘油酯或烷基酯進(jìn)行處理。羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物包括，但不局限于，蓖麻油水解產(chǎn)物和11-羥基棕櫚酸乙酯的水解產(chǎn)物。
本發(fā)明所使用的羥基脂肪酸和羥基脂肪酸衍生物可以是光學(xué)活性的(R)或(S)形式，或者是一種外消旋體。在本發(fā)明中，例如，當(dāng)光學(xué)活性的羥基脂肪酸由通式(2-1)表示時(shí) 其中*表示手性碳原子，R1-R3如上所定義，用作由通式(2)表示的羥基脂肪酸，所得內(nèi)酯是光學(xué)活性內(nèi)酯。當(dāng)R1與R2相同時(shí)，與R1和R2相連的碳原子不是手性碳原子。
當(dāng)光學(xué)活性羥基脂肪酸衍生物用作羥基脂肪酸衍生物時(shí)，所得內(nèi)酯同樣是一種光學(xué)活性內(nèi)酯。
例如，光學(xué)活性內(nèi)酯可以通過(guò)使用由通式(3-1)表示的光學(xué)活性羥基脂肪酸烷基酯獲得 其中R1-R4以及*如上所定義，當(dāng)由上述通式(3)表示的羥基脂肪酸烷基酯或由通式(4-1)表示的光學(xué)活性的羥基脂肪酸甘油酯
其中R9-R11每個(gè)獨(dú)立地表示氫原子或一個(gè)由通式(6-1)表示的基團(tuán) 其中R1-R3以及*如上所定義，條件是R9-R11中的至少一個(gè)是由通式(6-1)表示的基團(tuán)，當(dāng)羥基脂肪酸甘油酯由上述通式(4)表示。
光學(xué)活性的羥基脂肪酸甘油酯包括光學(xué)活性的羥基脂肪酸單酸甘油酯、光學(xué)活性的羥基脂肪酸二酸甘油酯、光學(xué)活性的羥基脂肪酸三酸甘油酯等等。
此外，當(dāng)羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物在本發(fā)明中使用時(shí)，使用光學(xué)活性的羥基脂肪酸衍生物作為羥基脂肪酸衍生物進(jìn)行水解也是同樣正確的。
更具體地說(shuō)，如果羥基連接的碳具有R-構(gòu)型，那么所得光學(xué)活性內(nèi)酯是R-內(nèi)酯。如果羥基連接的碳具有S-構(gòu)型，那么所得光學(xué)活性內(nèi)酯是S-內(nèi)酯。
由通式(2-1)表示的光學(xué)活性羥基脂肪酸的優(yōu)選例子是羥基脂肪酸的旋光體，其以上述羥基脂肪酸的優(yōu)選例子的形式存在。在它們當(dāng)中，光學(xué)活性的蓖麻油酸、光學(xué)活性的11-羥基棕櫚酸、光學(xué)活性的lesquerolic acid、光學(xué)活性的10-羥基硬脂酸、光學(xué)活性的10-羥基棕櫚酸等等是優(yōu)選的。
由通式(3-1)表示的光學(xué)活性的羥基脂肪酸烷基酯的優(yōu)選例子包括光學(xué)活性的11-羥基棕櫚酸乙酯、光學(xué)活性的蓖麻酸乙酯、光學(xué)活性的ethyl lesquerolate、光學(xué)活性的10-羥基硬脂酸乙酯和光學(xué)活性的10-羥基棕櫚酸乙酯等等。
由通式(4-1)表示的光學(xué)活性的羥基脂肪酸甘油酯的優(yōu)選例子例如包括光學(xué)活性的蓖麻油。
為了通過(guò)本發(fā)明的方法制備作為內(nèi)酯的γ-癸內(nèi)酯，至少一種選自，但不限于，蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物質(zhì)優(yōu)選用作羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物。當(dāng)通過(guò)本發(fā)明的方法制備δ-癸內(nèi)酯時(shí)，優(yōu)選使用，但不局限于，11-羥基棕櫚酸和/或11-羥基棕櫚酸乙酯作為羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物。
本發(fā)明所使用的羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物可以是一種商業(yè)產(chǎn)品，或者可以從天然物質(zhì)中提取獲得?；蛘?，它可以視情況而定進(jìn)行制備。為了通過(guò)本發(fā)明的制備方法獲得天然內(nèi)酯，優(yōu)選使用不是化學(xué)合成的方法來(lái)獲得羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物。例如，優(yōu)選可以從球根牽牛(jalap)或甘薯中提取11-羥基棕櫚酸，以便在制備天然δ-癸內(nèi)酯中使用。為了通過(guò)如上所述的本發(fā)明的方法獲得一種光學(xué)活性的內(nèi)酯，優(yōu)選使用光學(xué)活性形式的羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物。
在本發(fā)明中用于制備內(nèi)酯的培養(yǎng)基含有至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物和羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的物質(zhì)，其中在每升培養(yǎng)基中，這些物質(zhì)的量為10％(w/v)-50％(w/v)，優(yōu)選15％(w/v)-25％(w/v)。
在本發(fā)明中用于制備內(nèi)酯的培養(yǎng)基可以如下進(jìn)行制備如果需要，將其它用于細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)組分(例如氮源等等)加入到上述至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物和羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的物質(zhì)中。加入到培養(yǎng)基中的其它組分包括，但不局限于，氮源例如酵母抽提物、脲、玉米漿、硫酸銨和磷酸氫二胺；補(bǔ)充碳源例如麥芽提取物、多種蛋白胨以及糖例如葡萄糖；無(wú)機(jī)鹽例如硫酸錳、氯化鈣、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鎂、氯化鈷、鉬酸鈉、硼酸和碘化鉀；輔酶例如黃素單核苷酸(FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和輔酶A(COA)；核苷酸例如三磷酸腺苷(ATP)；維生素例如L-肉堿；以及無(wú)菌水。輔助因素例如無(wú)機(jī)鹽、輔酶和維生素可以進(jìn)一步增加內(nèi)酯前體羥基脂肪酸和/或制得的內(nèi)酯的數(shù)量，其加入的數(shù)量通?？梢允欠浅Ｐ〉摹１绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以容易地確定這些用于制備培養(yǎng)基的其它組分，其中Candida sorbophila可以生長(zhǎng)在這種培養(yǎng)基中。
(3)使用Candida sorbophila生產(chǎn)光學(xué)活性內(nèi)酯在本發(fā)明中，將如上面(1)中所述的Candida sorbophila在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用于制備如上面(2)中所述的內(nèi)酯，使得Candidasorbophila能夠在培養(yǎng)基中制得一種內(nèi)酯前體羥基脂肪酸和/或內(nèi)酯。
可以將由Candida sorbophila制得的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸通過(guò)內(nèi)酯化作用轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)酯。內(nèi)酯前體羥基脂肪酸可以通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行內(nèi)酯化。例如，內(nèi)酯化可以在酸性條件下通過(guò)加熱處理進(jìn)行。更具體地說(shuō)，這種方法可以通過(guò)在pH3-5和100℃的條件下，加熱含內(nèi)酯前體羥基脂肪酸的培養(yǎng)物20分鐘，由此在培養(yǎng)產(chǎn)物中對(duì)內(nèi)酯前體羥基脂肪酸進(jìn)行內(nèi)酯化。來(lái)源于內(nèi)酯前體羥基脂肪酸的內(nèi)酯化化合物是所述的內(nèi)酯。在本發(fā)明中，內(nèi)酯化可以在沒(méi)有使用pH調(diào)節(jié)劑的情況下進(jìn)行。
通過(guò)內(nèi)酯化由上述方法制得的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸獲得的內(nèi)酯，或由Candida sorbophila制得的內(nèi)酯，可以用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行回收和/或分離和提純。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″內(nèi)酯前體羥基脂肪酸″是指可以被內(nèi)酯化的羥基脂肪酸。根據(jù)本發(fā)明的″內(nèi)酯前體羥基脂肪酸″優(yōu)選是一種羥基脂肪酸，其自羧基的碳原子起，在4-或5-位上具有羥基，并且具有至少4個(gè)、優(yōu)選5-22個(gè)、更優(yōu)選5-17個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選5-12個(gè)碳原子。
所述的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸的一個(gè)具體例子包括由通式(5)表示的羥基脂肪酸 其中R5表示任選取代的二價(jià)烴基，具有一條2個(gè)或3個(gè)碳的鏈；R1和R2如上所定義；以及做為選擇，R2和R5可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)。
R5，任選取代的二價(jià)烴基，包括二價(jià)烴基其具有一條2個(gè)或3個(gè)碳的鏈，和二價(jià)取代烴基其具有一條2個(gè)或3個(gè)碳的鏈。
所述的二價(jià)烴基其具有一條2個(gè)或3個(gè)碳的鏈，包括亞烷基其具有一條2個(gè)或3個(gè)碳的亞乙基或1，3-亞丙基鏈，和亞烯基其具有一條2個(gè)或3個(gè)碳的亞乙烯基或亞丙烯基鏈。
所述的二價(jià)取代烴基，其具有一條2個(gè)或3個(gè)碳的鏈，來(lái)源于上述二價(jià)烴基，其具有一條2個(gè)或3個(gè)碳的鏈，其中用上述取代基而不是羥基取代至少1個(gè)氫原子。二價(jià)取代烴基(具有一條2個(gè)或3個(gè)碳的鏈)的一個(gè)具體例子包括2-亞丙基等等。當(dāng)R2和R5連接在一起形成一個(gè)環(huán)時(shí)，生成的環(huán)包括脂肪族環(huán)和芳香族環(huán)。脂肪族環(huán)包括環(huán)丁烷環(huán)、環(huán)戊環(huán)、環(huán)己環(huán)、環(huán)己烯環(huán)等等。芳香族環(huán)包括苯環(huán)等等。
本發(fā)明所使用的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸由通式(5)表示，其中R5表示烴(具有一條2個(gè)碳的鏈)，的具體例子包括γ-羥基癸酸、由下式表示的羥基脂肪酸等等。

由通式(5)表示的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸，其中R5表示烴(具有一條3個(gè)碳的鏈)，的具體例子包括δ-羥基癸酸和由下式表示的羥基脂肪酸。
當(dāng)羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的光學(xué)活性物質(zhì)在本發(fā)明的方法中使用時(shí)，所得的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸是一種由通式(5-1)表示的光學(xué)活性物質(zhì) 其中R1、R2、R5和*如上所定義。在本發(fā)明中，內(nèi)酯前體羥基脂肪酸優(yōu)選使用光學(xué)活性的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸。
通過(guò)本發(fā)明的制備方法獲得的內(nèi)酯例如用通式(1)表示 其中環(huán)A表示內(nèi)酯環(huán)；R1和R2如上所定義，其中環(huán)A和R2可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)。
在通式(1)中由環(huán)A表示的內(nèi)酯環(huán)包括由下式(7)表示的γ-內(nèi)酯環(huán)和由下式(8)表示的δ-內(nèi)酯環(huán)。環(huán)A也可以具有一個(gè)取代基。
環(huán)A和R2一起形成的環(huán)的具體例子包括由下式表示的環(huán)。

通過(guò)本發(fā)明的制備方法獲得的內(nèi)酯的例子包括，但不局限于，具有4個(gè)或更多個(gè)碳原子的內(nèi)酯。其具體例子包括γ-癸內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、γ-庚內(nèi)酯、γ-辛內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯、γ-十二內(nèi)酯、γ-十三內(nèi)酯、γ-十四內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯、δ-己內(nèi)酯、δ-庚內(nèi)酯、δ-辛內(nèi)酯、δ-壬內(nèi)酯、δ-十一內(nèi)酯、δ-十二內(nèi)酯、δ-十三內(nèi)酯、δ-十四內(nèi)酯、當(dāng)歸內(nèi)酯、whisky內(nèi)酯、γ-jiasmolactone、茉莉內(nèi)酯、順-茉莉酮內(nèi)酯、甲基γ-癸內(nèi)酯、jasmolactone、薄荷內(nèi)酯(menthalactone)、正丁基-2-苯并[c]呋喃酮、丙叉-2-苯并[c]呋喃酮、丁叉-2-苯并[c]呋喃酮、4，6，6，(4，4，6)-三甲基四氫吡喃-2-酮、δ-2-癸烯內(nèi)酯、香豆素、二氫香豆素、環(huán)己基內(nèi)酯、σ-甲基香豆素和由下式表示的內(nèi)酯。

在上式中，R表示保護(hù)基。
在上述當(dāng)中，具有5-12個(gè)碳的內(nèi)酯，例如γ-癸內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、γ-庚內(nèi)酯、γ-辛內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯、γ-十二內(nèi)酯、γ-十三內(nèi)酯、γ-十四內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯、δ-己內(nèi)酯、δ-庚內(nèi)酯、δ-辛內(nèi)酯、δ-壬內(nèi)酯、δ-十一內(nèi)酯、δ-十二內(nèi)酯、δ-十三內(nèi)酯和δ-十四內(nèi)酯是特別優(yōu)選的。
當(dāng)羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的光學(xué)活性形式在本發(fā)明的制備方法中使用時(shí)，所得內(nèi)酯是光學(xué)活性內(nèi)酯。
例如，光學(xué)活性內(nèi)酯的一個(gè)例子由通式(1-1)表示 其中環(huán)A、R1、R2和*如上所定義。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″光學(xué)活性內(nèi)酯″是指一種內(nèi)酯，其是光學(xué)活性物質(zhì)(例如R或S形式)。通過(guò)本發(fā)明方法制得的光學(xué)活性內(nèi)酯由以下制得使用Candida sorbophila由羥基脂肪酸制得內(nèi)酯前體羥基脂肪酸，然后將這種內(nèi)酯前體羥基脂肪酸內(nèi)酯化?；蛘撸鈱W(xué)活性內(nèi)酯由羥基脂肪酸通過(guò)使用Candida sorbophila制備。
通過(guò)本發(fā)明的制備方法獲得的光學(xué)活性內(nèi)酯包括，但不局限于，具有至少5個(gè)，優(yōu)選5-12個(gè)碳原子的光學(xué)活性內(nèi)酯。例如，可以獲得上面作為具體例子給出的光學(xué)活性形式的內(nèi)酯。其優(yōu)選例子包括光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯、光學(xué)活性的γ-戊內(nèi)酯、光學(xué)活性的γ-己內(nèi)酯、光學(xué)活性的γ-庚內(nèi)酯、光學(xué)活性的γ-辛內(nèi)酯、光學(xué)活性的γ-壬內(nèi)酯、光學(xué)活性的γ-十一內(nèi)酯、光學(xué)活性的γ-十二內(nèi)酯、光學(xué)活性的γ-十三內(nèi)酯、光學(xué)活性的γ-十四內(nèi)酯、光學(xué)活性的δ-癸內(nèi)酯、光學(xué)活性的δ-己內(nèi)酯、光學(xué)活性的δ-庚內(nèi)酯、光學(xué)活性的δ-辛內(nèi)酯、光學(xué)活性的δ-壬內(nèi)酯、光學(xué)活性的δ-十一內(nèi)酯、光學(xué)活性的δ-十二內(nèi)酯、光學(xué)活性的δ-十三內(nèi)酯和光學(xué)活性的δ-十四內(nèi)酯。
(4)通過(guò)本發(fā)明的方法制備光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯通過(guò)使用制備光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯作為例子，本發(fā)明的光學(xué)活性內(nèi)酯的制備方法將在下文中進(jìn)行更詳細(xì)地描述。本發(fā)明的光學(xué)活性內(nèi)酯的制備方法基本上可以與光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯的制備方法相同。
a)培養(yǎng)基，被用來(lái)培養(yǎng)用于制備光學(xué)活性的γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯(主培養(yǎng)物的培養(yǎng)基)根據(jù)本發(fā)明，至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物質(zhì)用作培養(yǎng)基的碳源，當(dāng)進(jìn)行培養(yǎng)，以便制備光學(xué)活性的γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯時(shí)(在實(shí)施例中稱為主培養(yǎng)物)。在本發(fā)明中，蓖麻油水解產(chǎn)物是指通過(guò)化學(xué)或酶水解蓖麻油獲得的混合物。蓖麻油水解產(chǎn)物包括使用脂肪酶水解蓖麻油獲得的水解產(chǎn)物(下文它稱為″脂肪酶處理的水解產(chǎn)物″)。使用通過(guò)水解蓖麻油獲得的水解產(chǎn)物的主要成分是蓖麻油酸。因此，蓖麻油水解產(chǎn)物主要由蓖麻油酸組成，蓖麻油酸是構(gòu)成蓖麻油的一種主要脂肪酸。
任何脂肪酶可以用于水解蓖麻油，沒(méi)有特別的限制，只要它可以從蓖麻油中制得蓖麻油酸。這種脂肪酶的例子，例如，包括脂肪酶OF和脂肪酶MY(Meito Sangyo Co.，Ltd.)；以及Newlase F3G、脂肪酶A″Amano″6、脂肪酶AY″Amano″30G、脂肪酶F-AP 15、脂肪酶G″Amano″50、脂肪酶M″Amano″10和脂肪酶R″Amano″G(Amano Enzyme Inc.)。脂肪酶處理的水解產(chǎn)物可以在下面的條件下獲得其中主要由蓖麻油酸組成的水解產(chǎn)物從蓖麻油，例如，通過(guò)每100g蓖麻油中加入0.5g脂肪酶，在30℃下培養(yǎng)24小時(shí)獲得。這種脂肪酶處理的水解產(chǎn)物可以以混合物的形式直接使用。
當(dāng)蓖麻油水解產(chǎn)物含在本發(fā)明的主要培養(yǎng)基中時(shí)，優(yōu)選將脂肪酶處理的水解產(chǎn)物加入到所述的培養(yǎng)基中。但是，在本發(fā)明的生產(chǎn)方法，由于以下原因，含蓖麻油的培養(yǎng)基在培養(yǎng)后在培養(yǎng)基中產(chǎn)生含脂肪酶處理的水解產(chǎn)物。也就是說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的方法，在本發(fā)明所使用的Candida sorbophila的幫助下，在培養(yǎng)基中由蓖麻油生成水解產(chǎn)物。因此，加入脂肪酶處理的水解產(chǎn)物是一個(gè)任選步驟，如果培養(yǎng)基中含蓖麻油的話。
在本發(fā)明中，可以使用至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物質(zhì)。這些物質(zhì)可以單獨(dú)使用，或者可以視情況任何兩種或多種混合使用。在它們當(dāng)中，蓖麻油和/或蓖麻油水解產(chǎn)物是特別優(yōu)選的。
在每升培養(yǎng)基中，加入到培養(yǎng)基中的至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物質(zhì)的濃度通常約10％-50％(w/v)，優(yōu)選約15％-25％(w/v)。
如果需要，本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有其它組分例如酵母提取物、麥芽提取物、聚胨和葡萄糖。含其它組分的這種培養(yǎng)基可以作為一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基用于生產(chǎn)本發(fā)明的γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯。
酵母抽提物、脲、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二胺等等可以作為氮源加入到上述培養(yǎng)基中。此外，麥芽提取物、聚胨和糖例如葡萄糖等等可以作為補(bǔ)充碳源加入到培養(yǎng)基中。
或者，還可以使用含至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid作為單一碳源的人工培養(yǎng)基。這種人工培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有其它組分例如上述其它氮源或碳源。
通過(guò)向上述培養(yǎng)基中任選加入各種輔助因素，可以進(jìn)一步增加所制備的光學(xué)活性γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯的收率。
輔助因素包括無(wú)機(jī)鹽例如硫酸錳、氯化鈣、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鎂、氯化鈷、鉬酸鈉、硼酸和碘化鉀；輔酶例如黃素單核苷酸(FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和輔酶A(COA)；核苷酸例如三磷酸腺苷(ATP)；維生素例如L-肉堿。輔助因素的加入量可以非常少。
本發(fā)明所使用的主培養(yǎng)基包括通過(guò)向YM培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基或馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中加入至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid制得的培養(yǎng)基，以及通過(guò)向上述培養(yǎng)基中加入任何上述其它組分制得的培養(yǎng)基。
b)通過(guò)主要培養(yǎng)制備光學(xué)活性的γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯在本發(fā)明中，通過(guò)將本發(fā)明的Candida sorbophila在上面a)中所述的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和累積γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯。
本發(fā)明的Candida sorbophila可以直接接種和培養(yǎng)在a)的培養(yǎng)基上。但是，優(yōu)選，將這種Candida sorbophila預(yù)先在一種常規(guī)培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，然后將所得物接種或涂布到培養(yǎng)基a)中進(jìn)行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)的條件可以與用于生產(chǎn)γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯的培養(yǎng)(主培養(yǎng))相同。但是，所述的條件沒(méi)有特別地限制，只要Candidasorbophila菌株可以增殖就行。用于種子培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基可以是固體或液體。它可以含有或不含有至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物質(zhì)。種子培養(yǎng)培養(yǎng)基包括YM斜面瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖斜面瓊脂培養(yǎng)基。加入到進(jìn)行主培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的種子培養(yǎng)產(chǎn)物的數(shù)量并沒(méi)有特別地限制。但是，當(dāng)種子培養(yǎng)產(chǎn)物例如是液體時(shí)，相對(duì)于主培養(yǎng)基的數(shù)量，優(yōu)選加入1％-3％數(shù)量的在610nm(OD 610)具有約30吸光度的培養(yǎng)產(chǎn)物?；蛘撸陬A(yù)培養(yǎng)之前，進(jìn)行種子培養(yǎng)，然后在培養(yǎng)基中a)中進(jìn)行主培養(yǎng)。這種雙階段培養(yǎng)適合于大量生產(chǎn)，特別是可用于工業(yè)生產(chǎn)。預(yù)培養(yǎng)的條件可以與主培養(yǎng)相同。但是，所述條件沒(méi)有特別地限制，只要Candida sorbophila菌株可以增殖就行。種子培養(yǎng)培養(yǎng)基可以含有或不含有至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物質(zhì)。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，培養(yǎng)條件是需氧的。培養(yǎng)溫度視情況進(jìn)行選擇，通常在20℃-35℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選在24℃-30℃的范圍內(nèi)。培養(yǎng)基的pH水平視情況進(jìn)行選擇，通常在5至7之間，優(yōu)選在5.5至6.5之間。例如以振蕩培養(yǎng)的方式在搖瓶或發(fā)酵罐(例如裝有攪拌器和曝氣機(jī)的發(fā)酵罐)中進(jìn)行培養(yǎng)。
主培養(yǎng)的時(shí)間沒(méi)有特別地限制，只要它足夠長(zhǎng)，以便產(chǎn)生光學(xué)活性γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯。優(yōu)選地，以這樣一種方式選擇時(shí)間，以便使產(chǎn)生的光學(xué)活性γ-羥基癸酸和/或光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量達(dá)到最大水平。這樣的時(shí)間隨下面的因素而變例如培養(yǎng)基的組成、至少一種作為底物加入的選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic酸的數(shù)量、以及所使用的培養(yǎng)裝置的通風(fēng)和攪拌效率。例如，在使用搖瓶作為培養(yǎng)裝置進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，培養(yǎng)時(shí)間可以視情況進(jìn)行選擇，通常在1小時(shí)-30天的范圍內(nèi)，優(yōu)選在12小時(shí)-25天的范圍內(nèi)。在使用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，培養(yǎng)時(shí)間可以視情況進(jìn)行選擇，通常在1天-20天的范圍內(nèi)，優(yōu)選在3天-10天的范圍內(nèi)。使用發(fā)酵罐可以在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)完成培養(yǎng)，因此從生產(chǎn)效率的角度來(lái)考慮，它是優(yōu)選的。
進(jìn)行足夠長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，以產(chǎn)生足夠數(shù)量的光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯，培養(yǎng)時(shí)間可以按照下面的方式進(jìn)行測(cè)定。在時(shí)間過(guò)程中，對(duì)在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯進(jìn)行取樣?；蛘?，在時(shí)間過(guò)程中，對(duì)在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的γ-羥基癸酸進(jìn)行取樣，然后進(jìn)行內(nèi)酯化。然后，所得光學(xué)活性Y-癸內(nèi)酯的數(shù)量通過(guò)氣相色譜(GC)、薄層層析(TLC)、或氣相色譜/質(zhì)譜(GC-MS)進(jìn)行確定，如果需要，進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。
c)從光學(xué)活性γ-羥基癸酸制備光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯以上述方式在一種培養(yǎng)基中制得的光學(xué)活性γ-羥基癸酸可以用作藥物中間體等等。但是，在本發(fā)明中，通過(guò)內(nèi)酯化作用，上述γ-羥基癸酸還可以轉(zhuǎn)化為光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯。
可以通過(guò)其任何常規(guī)技術(shù)進(jìn)行內(nèi)酯化。通過(guò)常規(guī)技術(shù)回收在上述培養(yǎng)基中制得的γ-羥基癸酸后，可以進(jìn)行本發(fā)明的光學(xué)活性γ-羥基癸酸的內(nèi)酯化?；蛘?，當(dāng)培養(yǎng)基含有光學(xué)活性的γ-羥基癸酸時(shí)，培養(yǎng)完成后，可以對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行直接內(nèi)酯化。
上述內(nèi)酯化可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，例如在培養(yǎng)液中進(jìn)行內(nèi)酯化。這種方法的一個(gè)具體例子是培養(yǎng)完成后，將酸例如稀鹽酸或稀硫酸加入到培養(yǎng)液中，以酸化所述的培養(yǎng)液。
在本發(fā)明中，內(nèi)酯化優(yōu)選在沒(méi)有對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行酸化的情況下進(jìn)行，以便獲得光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯，這種內(nèi)酯具有與自然態(tài)中的那些盡可能接近的性質(zhì)。在本發(fā)明中，由于培養(yǎng)完成后培養(yǎng)液的pH水平已經(jīng)在3.0至4.5的酸性范圍內(nèi)，不需要進(jìn)一步酸化培養(yǎng)液就可以得到酸性培養(yǎng)液。通常，在沒(méi)有酸化培養(yǎng)液的情況下，通過(guò)將這種酸性培養(yǎng)液加熱約10分鐘-1小時(shí)，優(yōu)選加熱約10分鐘-30分鐘，可以實(shí)現(xiàn)含在培養(yǎng)液中的光學(xué)活性γ-羥基癸酸的內(nèi)酯化。加熱溫度設(shè)定在約70℃-130℃之間，優(yōu)選在約90℃-120℃之間。在本發(fā)明中，當(dāng)進(jìn)行內(nèi)酯化時(shí)，培養(yǎng)基的pH水平在酸性條件內(nèi)是足夠的，優(yōu)選pH在2至5之間。
在本發(fā)明中，這種內(nèi)酯化可以將光學(xué)活性的γ-羥基癸酸轉(zhuǎn)化為光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯。
通過(guò)離心或其它方法從培養(yǎng)液中分離和除去細(xì)胞后，通過(guò)常規(guī)技術(shù)例如溶劑萃取和蒸餾，可以將獲得的光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯從培養(yǎng)液中進(jìn)行回收和提純。
根據(jù)本發(fā)明的制備光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯的方法，可以獲得高光學(xué)純度的R-γ-癸內(nèi)酯。
由本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的內(nèi)酯可以用于調(diào)味劑和香精物質(zhì)、藥物中間體等等。例如，R-γ-癸內(nèi)酯可以用于增加、增強(qiáng)或改善飲料、口香糖、果汁、煙制品、藥物制劑、調(diào)味劑和/或香精制劑、香味產(chǎn)物等等的風(fēng)味作為它的特征，R-γ-癸內(nèi)酯具有一種比S-γ-癸內(nèi)酯更強(qiáng)的香味，并且有利地具有一種更像天然果實(shí)的香味(A.Mosandle et al.，J.Agric.Food Chem.，37，413，1989)。
(5)結(jié)論本發(fā)明生產(chǎn)方法的特點(diǎn)在于使用Candida sorbophila。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以獲得高光學(xué)純度的光學(xué)活性內(nèi)酯例如R-γ-癸內(nèi)酯或R-δ-癸內(nèi)酯。此外，在制備R-γ-癸內(nèi)酯方面，本發(fā)明的制備光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯的方法具有高的效率。由于Candida sorbophila較少地引起在本發(fā)明生產(chǎn)系統(tǒng)中生成的R-γ-癸內(nèi)酯的破壞，因此由本發(fā)明方法提供的這種高生產(chǎn)率是可能的。特別地，據(jù)信Candida sorbophila不會(huì)分解R-γ-癸內(nèi)酯，導(dǎo)致高的生成效率。但是，應(yīng)該指出的是，本發(fā)明的技術(shù)范圍不應(yīng)該限于這種假設(shè)的理論。
本發(fā)明的方法有助于有效制備高純度的光學(xué)活性內(nèi)酯并且在工業(yè)生產(chǎn)中可以改善工作效率。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案參考下面的實(shí)施例，本發(fā)明將在下文中進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明，不過(guò)本發(fā)明的技術(shù)范圍并不受這些實(shí)施例的限制。
在下面的實(shí)施例中，氣相色譜(GC)分析在下列條件下進(jìn)行。
儀器型號(hào)5890，Hewlett Packard色譜柱BC-WAX(0.25mm(直徑)×30m(長(zhǎng)度)，GL Sciences)內(nèi)標(biāo)試樣癸酸乙酯(1.0v/v％)在實(shí)施例中制得的內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)GC分析進(jìn)行測(cè)定(儀器G3000，色譜柱Chirasil-DEX-CB，0.25mm(直徑)×25m(長(zhǎng)度)，Hitachi)。
實(shí)施例1將FC 58菌株接種在YM斜面瓊脂培養(yǎng)基上，在27℃下培養(yǎng)3天以進(jìn)行活化。預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基以下面的方式進(jìn)行制備。首先，將0.09g酵母抽提物、0.09g麥芽提取物、0.15g聚胨和0.3g葡萄糖放在一個(gè)體積為300mL的錐形瓶中，向其中加入蒸餾水，使總體積達(dá)到30mL，pH6。生成物在高壓釜中在121℃下滅菌15分鐘。將由此制得的培養(yǎng)基冷卻，以上述方式活化的FC 58菌株接種在其上，在旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)裝置中，在27℃和150rpm下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，制得一種預(yù)培養(yǎng)液。此外，制備用于隨后主培養(yǎng)的培養(yǎng)基。具體地說(shuō)，將0.3g酵母抽提物、0.3g麥芽提取物和0.5g聚胨放在一個(gè)體積為500mL的坂口瓶中，向其中加入蒸餾水，使總體積達(dá)到100mL，pH6，再向其中加入20g蓖麻油。生成物在高壓釜中在121℃下滅菌15分鐘。隨后，將用于主培養(yǎng)的培養(yǎng)基冷卻，將2ml上述預(yù)培養(yǎng)液接種在其上，通過(guò)振蕩培養(yǎng)在27℃和150rpm下進(jìn)行主培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，沒(méi)有調(diào)節(jié)pH水平。培養(yǎng)后，培養(yǎng)液的pH水平是4.06。開(kāi)始培養(yǎng)3天后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行無(wú)菌取樣，每次5ml，取樣在時(shí)間過(guò)程內(nèi)進(jìn)行，將取得的培養(yǎng)液(樣品)獨(dú)立地加熱到100℃，加熱20分鐘，以對(duì)γ-羥基癸酸進(jìn)行內(nèi)酯化。這種內(nèi)酯化后，樣品用乙酸乙酯萃取，分離的有機(jī)層通過(guò)氣相色譜(GC)分析進(jìn)行定量，使用內(nèi)標(biāo)法(用癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)試樣)。結(jié)果，在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)14天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是8.41g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例2除使用20g蓖麻油酸(80％的純度或更高，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)而不是20g蓖麻油外，以與實(shí)施例1相同的方式制備R-γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)20天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是21.89g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例3除向主培養(yǎng)基中加入1.7mg硫酸錳(MnSO4·H2O)、0.55mg氯化鈣(CaCl2·H2O)、0.375mg氯化鐵(FeCl3·H2O)、2.2mg硫酸鋅(ZnSO4·H2O)、0.4mg硫酸銅(CuSO4·H2O)、5.9mg硫酸鎂(MgSO4·H2O)、0.28mg氯化鈷(CoCl2·H2O)、0.26mg鉬酸鈉(Na2MoO4·H2O)、0.4mg硼酸(H3BO3)和0.06mg碘化鉀(KI)外，以與實(shí)施例2中相同的方式制備R-γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)20天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是27.37g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例4將FC 58菌株接種在YM斜面瓊脂培養(yǎng)基上，在27℃下培養(yǎng)3天以進(jìn)行活化。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基以下面的方式進(jìn)行制備。首先，將0.3g酵母抽提物、0.3g麥芽提取物、0.5g聚胨和1.0g葡萄糖放在一個(gè)體積為500mL的坂口瓶中，向其中加入蒸餾水，使總體積達(dá)到100mL，pH6。生成物在高壓釜中在121℃下滅菌15分鐘。將由此制得的培養(yǎng)基冷卻，以上述方式活化的FC 58菌株接種在其上，在旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)裝置中，在27℃和150rpm下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，制得一種預(yù)培養(yǎng)液。此外，制備一種用于隨后主培養(yǎng)的培養(yǎng)基。具體地說(shuō)，6.0g酵母抽提物、6.0g麥芽提取物、10.0g聚胨、34mg硫酸錳(MnSO4·H2O)、11mg氯化鈣(CaCl2·H2O)、7.5mg氯化鐵(FeCl3·H2O)、44mg硫酸鋅(ZnSO4H2O)、8.0mg硫酸銅(CuSO4·H2O)、118mg硫酸鎂(MgSO4·H2O)、5.6mg氯化鈷(CoCl2·H2O)、5.2mg鉬酸鈉(Na2MoO4·H2O)、8.0mg硼酸(H3BO3)和1.2mg碘化鉀(KI)放入一個(gè)體積為5L的小型發(fā)酵罐中，向其中加入蒸餾水，使總體積達(dá)到2,000ml，pH6，向其中再加入400g蓖麻油酸(80％的純度或更高，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。生成物在高壓釜中在121℃下滅菌15分鐘。隨后，將用于主培養(yǎng)的培養(yǎng)基冷卻，40ml上述預(yù)培養(yǎng)液接種在其上，在600rpm的攪拌速率下，1,000ml/mm的曝氣速率和27℃下，進(jìn)行主培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，沒(méi)有調(diào)節(jié)pH水平。培養(yǎng)后，培養(yǎng)液的pH水平是4.75。開(kāi)始培養(yǎng)3天后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行無(wú)菌取樣，每次5ml，取樣在時(shí)間過(guò)程內(nèi)進(jìn)行，將取得的培養(yǎng)液(樣品)獨(dú)立地加熱到100℃，加熱20分鐘，以對(duì)γ-羥基癸酸進(jìn)行內(nèi)酯化。這樣進(jìn)行內(nèi)酯化后，樣品用乙酸乙酯萃取，分離的有機(jī)層通過(guò)氣相色譜(GC)分析進(jìn)行定量，使用內(nèi)標(biāo)法(用癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)試樣)。結(jié)果，在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)10天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是49.94g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例5除使用用脂肪酶(脂肪酶OF，Meito Sangyo Co.，Ltd.)處理600g蓖麻油獲得的水解產(chǎn)物而不是400g蓖麻油酸(80％的純度或更高，WakoPure Chemical Industries，Ltd.)外，以與實(shí)施例4相同的方式制備R-γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)5天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是40.50g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例6除使用Candida sorbophila菌株ATCC 74362、Candidasorbophila菌株ATCC 60130或Candida sorbophila菌株IFO 1583而不是Candida sorbophila菌株FC 58外，以與實(shí)施例2相同的方式制備光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，對(duì)于每一種上述細(xì)胞株，在培養(yǎng)液中制得的γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量分別在開(kāi)始培養(yǎng)19天、11天和11天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量分別是13.75g、12.97g和12.97。
實(shí)施例7除取樣得到的培養(yǎng)液(取樣)不通過(guò)加熱進(jìn)行內(nèi)酯化以外，以與實(shí)施例1相同的方式制備R-γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)14天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是8.41g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例8除取樣得到的培養(yǎng)液(樣品)不通過(guò)加熱進(jìn)行內(nèi)酯化以外，以與實(shí)施例2相同的方式制備R-γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)20天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是21.89g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例9除取樣得到的培養(yǎng)液(樣品)不通過(guò)加熱進(jìn)行內(nèi)酯化以外，以與實(shí)施例3相同的方式制備R-γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)20天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是27.37g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例10除取樣得到的培養(yǎng)液(樣品)不通過(guò)加熱進(jìn)行內(nèi)酯化以外，以與實(shí)施例4相同的方式制備R-γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)10天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是49.94g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例11除取樣得到的培養(yǎng)液(樣品)不通過(guò)加熱進(jìn)行內(nèi)酯化以外，以與實(shí)施例5相同的方式制備R-γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)5天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量是40.50g。其光學(xué)純度是99％ee或更高。
實(shí)施例12除取樣得到的培養(yǎng)液(樣品)不通過(guò)加熱進(jìn)行內(nèi)酯化以外，以與實(shí)施例6相同的方式制備R-γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，對(duì)于每一種上述細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中制得的R-γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量分別在開(kāi)始培養(yǎng)19天、11天和11天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，R-γ-癸內(nèi)酯的量分別是13.75g、12.97g和12.97g。
實(shí)施例13將FC 58菌株接種在YM斜面瓊脂培養(yǎng)基上，在27℃下培養(yǎng)3天以進(jìn)行活化。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基以下面的方式進(jìn)行制備。首先，將0.09g酵母抽提物、0.09g麥芽提取物、0.15g聚胨和0.3g葡萄糖放在一個(gè)體積為300ml的錐形瓶中，向其中加入蒸餾水，使總體積達(dá)到30ml，pH6。生成物在高壓釜中在121℃下滅菌15分鐘。將由此制得的培養(yǎng)基冷卻，以上述方式活化的FC 58菌株接種在其上，在旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)裝置中，在27℃和150rpm下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，制得一種預(yù)培養(yǎng)液。
此外，制備一種用于隨后主培養(yǎng)的培養(yǎng)基。具體地說(shuō)，0.09g酵母抽提物、0.09g麥芽提取物、0.1g聚胨、0.51mg硫酸錳(MnSO4·H2O)、0.17mg氯化鈣(CaCl2·H2O)、0.11mg氯化鐵(FeCl3·H2O)、0.66mg硫酸鋅(ZnSO4·H2O)、0.12mg硫酸銅(CuSO4·H2O)、1.77mg硫酸鎂(MgSO4·H2O)、0.08mg氯化鈷(CoCl2·H2O)、0.08mg鉬酸鈉(Na2MoO4·H2O)、0.12mg硼酸(H3BO3)和0.02mg碘化鉀(KI)放入一個(gè)體積為300mL的坂口瓶中，向其中加入蒸餾水，使總體積達(dá)到30ml，pH6，向其中再加入0.13g 11-羥基棕櫚酸乙酯。生成物在高壓釜中在121℃下滅菌15分鐘。隨后，將用于主培養(yǎng)的培養(yǎng)基冷卻，將2ml上述預(yù)培養(yǎng)液接種在其上，在中振蕩培養(yǎng)在27℃和150rpm下進(jìn)行主培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，沒(méi)有調(diào)節(jié)pH水平。開(kāi)始培養(yǎng)3天后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行無(wú)菌取樣，每次5ml，取樣在時(shí)間過(guò)程內(nèi)進(jìn)行，將取得的培養(yǎng)液(樣品)獨(dú)立地加熱到100℃，加熱20分鐘，以對(duì)δ-羥基癸酸進(jìn)行內(nèi)酯化。這樣進(jìn)行內(nèi)酯化后，樣品用乙酸乙酯萃取，分離的有機(jī)層通過(guò)GC分析進(jìn)行定量，使用內(nèi)標(biāo)法(用癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)試樣)。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中制得的S-δ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)11天后達(dá)到最大。這樣，每30mL主培養(yǎng)基中，S-δ-癸內(nèi)酯的量是0.019g。其光學(xué)純度是96％ee或更高。
實(shí)施例14除取樣得到的培養(yǎng)液(樣品)不通過(guò)加熱進(jìn)行內(nèi)酯化以外，以與實(shí)施例13相同的方式制備S-δ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中制得的S-δ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)11天后達(dá)到最大。這樣，每30mL主培養(yǎng)基中，S-δ-癸內(nèi)酯的量是0.019g。其光學(xué)純度是96％ee或更高。
參考實(shí)施例1除使用Yarrowia lipolytica菌株IFO 0717(其已知具有強(qiáng)的制備γ-癸內(nèi)酯能力)代替FC 58菌株外，以與實(shí)施例2的相同方式制備γ-癸內(nèi)酯。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中制得的γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在開(kāi)始培養(yǎng)6天后達(dá)到最大。這樣，每升主培養(yǎng)基中，γ-癸內(nèi)酯的量是4.90g。其后，所制得的γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量在時(shí)間過(guò)程內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這顯示開(kāi)始培養(yǎng)6天后，每升主培養(yǎng)基所制得的γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量開(kāi)始下降。開(kāi)始培養(yǎng)23天后，每升主培養(yǎng)基所制得的γ-癸內(nèi)酯的數(shù)量是3.17g。
在此引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖苏麄€(gè)引入作為參考。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可以容易地生產(chǎn)率高的獲得一種內(nèi)酯，例如一種光學(xué)活性內(nèi)酯包括光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯(例如，R-γ-癸內(nèi)酯)和光學(xué)活性的δ-癸內(nèi)酯。此外，當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明生產(chǎn)方法的時(shí)候，在中間步驟中，可以有效地制備內(nèi)酯前體羥基脂肪酸，例如γ-羥基癸酸或δ-羥基癸酸。在本發(fā)明的制備方法中，不需要向培養(yǎng)基中加入乳化劑或pH調(diào)節(jié)劑，以及碳源，例如，羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物和/或羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物可以以大規(guī)模生產(chǎn)所需的足夠高的濃度加入到培養(yǎng)基中。因此，本發(fā)明的方法在工業(yè)生產(chǎn)中非常有用。
權(quán)利要求
1.一種制備內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)candida sorbophila，然后從培養(yǎng)基中回收生成的內(nèi)酯。
2.一種制備內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)candida sorbophila，然后對(duì)從培養(yǎng)基中生成的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸進(jìn)行內(nèi)酯化。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中candida sorbophila是至少一種選自candida sorbophila菌株ATCC 74362、candida sorbophila菌株ATCC 60130、candida sorbophila菌株IFO 1583和candidasorbophila菌株FC 58的微生物，它們以登記號(hào)FERM BP-8388保藏。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)酯用下面的通式(1)表示 其中環(huán)A表示一個(gè)內(nèi)酯環(huán)；R1表示氫原子、烴基、取代烴基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；以及R2表示氫原子、烴基或取代烴基；其中環(huán)A和R2可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)酯是光學(xué)活性內(nèi)酯。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中羥基脂肪酸用下面的通式(2)表示 其中R1表示氫原子、烴基、取代烴基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R2表示氫原子、烴基或取代烴基；以及R3表示任選取代的二價(jià)烴基，具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈；其中R2和R3可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中羥基脂肪酸衍生物是羥基脂肪酸烷基酯或羥基脂肪酸甘油酯。
8.權(quán)利要求7的方法，其中羥基脂肪酸烷基酯用下面通式(3)表示 其中R1表示氫原子、烴基、取代烴基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R2表示氫原子、烴基或取代烴基；以及R3表示任選取代的二價(jià)烴基，具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈；以及R4表示烷基；其中R2和R3可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中羥基脂肪酸甘油酯用下面通式(4)表示 其中R6-R8每個(gè)獨(dú)立地表示氫原子或下面通式(6)表示的基團(tuán) 其中R1表示氫原子、烴基、取代烴基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R2表示氫原子、烴基或取代烴基；R3表示任選取代的二價(jià)烴基，具有一條4個(gè)或更多個(gè)碳的鏈；以及R4表示烷基；其中R2和R3可以連接在一起形成一個(gè)環(huán)，條件是R6-R8中至少一個(gè)是上述通式(6)表示的基團(tuán)。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中candida sorbophila在含至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸、11-羥基棕櫚酸、lesquerolicacid、10-羥基硬脂酸、10-羥基棕櫚酸和11-羥基棕櫚酸乙酯的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
11.權(quán)利要求2的方法，其中內(nèi)酯前體羥基脂肪酸是具有4個(gè)或更多個(gè)碳原子的羥基脂肪酸，其在4或5位具有一個(gè)羥基。
12.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)酯是選自γ-癸內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、γ-庚內(nèi)酯、γ-辛內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯、γ-十二內(nèi)酯、γ-十三內(nèi)酯、γ-十四內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯、δ-己內(nèi)酯、δ-庚內(nèi)酯、δ-辛內(nèi)酯、δ-壬內(nèi)酯、δ-十一內(nèi)酯、δ-十二內(nèi)酯、δ-十三內(nèi)酯和δ-十四內(nèi)酯的任何一種。
13.一種制備內(nèi)酯前體羥基脂肪酸的方法，包括在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)candida sorbophila。
14.一種制備γ-癸內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的介質(zhì)中培養(yǎng)candidasorbophila，然后從介質(zhì)中回收生成的γ-癸內(nèi)酯。
15.一種制備γ-癸內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的介質(zhì)中培養(yǎng)candidasorbophila，然后對(duì)從介質(zhì)中生成的γ-羥基癸酸進(jìn)行內(nèi)酯化。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中γ-癸內(nèi)酯是光學(xué)活性γ-癸內(nèi)酯。
17.權(quán)利要求14或15的方法，其中至少一種選自蓖麻油、蓖麻油水解產(chǎn)物、蓖麻油酸和lesquerolic acid是蓖麻油和/或蓖麻油水解產(chǎn)物。
18.一種制備δ-癸內(nèi)酯的方法，包括在一種含11-羥基棕櫚酸和/或11-羥基棕櫚酸乙酯的介質(zhì)中培養(yǎng)candida sorbophila，然后從介質(zhì)中回收生成的δ-癸內(nèi)酯。
19.一種制備δ-癸內(nèi)酯的方法，包括在一種含11-羥基棕櫚酸和/或11-羥基棕櫚酸乙酯的介質(zhì)中培養(yǎng)candida sorbophila，然后對(duì)從介質(zhì)中生成的δ-羥基癸酸進(jìn)行內(nèi)酯化。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中δ-癸內(nèi)酯是光學(xué)活性δ-癸內(nèi)酯。
21.權(quán)利要求14、15、18或19的方法，其中candida sorbophila是至少一種選自candida sorbophila菌株ATCC 74362、candidasorbophila菌株ATCC 60130、candida sorbophila菌株IFO 1583和candida sorbophila菌株FC 58，以登記號(hào)FERM BP-8388保藏。
22.candida sorbophila的用途，用于制備內(nèi)酯。
23.candida sorbophila菌株FERM BP-8388。
全文摘要
一種制備內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)candida sorbophila，然后從培養(yǎng)基中回收生成的內(nèi)酯。本發(fā)明還提供一種制備內(nèi)酯的方法，包括在含至少一種選自羥基脂肪酸、羥基脂肪酸衍生物、羥基脂肪酸衍生物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)candida sorbophila，然后對(duì)從培養(yǎng)基中生成的內(nèi)酯前體羥基脂肪酸進(jìn)行內(nèi)酯化。
文檔編號(hào)C12P17/02GK1675370SQ0381964
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者三橋勝久, 飯森真人 申請(qǐng)人:高砂香料工業(yè)株式會(huì)社