專(zhuān)利名稱(chēng)：諾卡拉蛋白質(zhì)分離物的顏色淡化的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)參考
依據(jù)35 USC 119(e)，本申請(qǐng)要求2002年6月20日提交的共同未決的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.60/389,957和2002年11月6日提交的60/432,985的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及從卡諾拉種子粗粉中回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
背景技術(shù)：
在美國(guó)專(zhuān)利No.5,844,086和6,005,076(“Murray II”)(已轉(zhuǎn)讓給該發(fā)明的受讓人，其公開(kāi)被引入本文作為參考)中，描述了一種從具有豐富脂肪含量的油性種子粗粉(包括具有如此含量的卡諾拉油性種子粗粉)中分離蛋白質(zhì)分離物地方法。該方法的步驟包括從油性種子粗粉中溶解蛋白質(zhì)物質(zhì)(該步驟也溶解粗粉中的脂肪)，從得到的蛋白質(zhì)水溶液中除去脂肪。蛋白質(zhì)水溶液可以在除去脂肪的步驟之前或之后，與殘余的油性種子粗粉分離。濃縮脫脂的蛋白質(zhì)溶液以增加蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本上恒定，然后可以對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)溶液實(shí)施進(jìn)一步的除脂步驟。隨后稀釋濃縮的蛋白質(zhì)溶液，以形成高度聚集的蛋白質(zhì)分子的云狀團(tuán)塊(mass)，其是微團(tuán)(micellar)形式的離散的蛋白質(zhì)微滴。使蛋白質(zhì)微團(tuán)沉淀，形成聚集的、聯(lián)合的、致密無(wú)定形的、粘性面筋樣蛋白質(zhì)分離物團(tuán)塊，稱(chēng)為“蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)”或PMM，將其從殘余的水相中分離并干燥
蛋白質(zhì)分離物具有至少90％的蛋白質(zhì)含量(用Kjeldahl氮或其它適宜方法N x6.25測(cè)定)，基本上為未變性的(用差式量熱掃描測(cè)定)，具有低殘余脂肪含量。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)含量”是指蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)分離物中的量(以干重表示)。利用該方法獲得的蛋白質(zhì)分離物的產(chǎn)量(以作為干燥蛋白質(zhì)分離物回收的從油料種子粗粉中提取的蛋白質(zhì)的比例表示)一般小于40wt％，典型地在20wt％左右。
上述Murray II專(zhuān)利中描述的方法是對(duì)USP 4,208,323(MurrayIB)中描述的方法(從包括油料種子的多種蛋白質(zhì)來(lái)源的物質(zhì)中形成蛋白質(zhì)分離物)的修改和改進(jìn)。1980年公布USP 4,208,323時(shí)能夠獲得的油料種子粗粉不具有Murray II專(zhuān)利時(shí)能獲得的卡諾拉油料種子粗粉的脂肪污染水平，故此，Murray IB專(zhuān)利的方法不能從所述油料種子粗粉中生產(chǎn)蛋白質(zhì)含量高于90wt％的蛋白質(zhì)物質(zhì)。Murray IB專(zhuān)利中沒(méi)有描述任何采用油菜籽(卡諾拉)粗粉作為原料進(jìn)行實(shí)施的具體實(shí)驗(yàn)。
Murray IB專(zhuān)利自身的目的在于通過(guò)在稀釋前引入濃縮步驟以形成PMM從而改進(jìn)美國(guó)專(zhuān)利No.4,169,090和4,285,862(Murray IA)所描述的方法。Murray IA專(zhuān)利公開(kāi)了包括油菜籽的一個(gè)實(shí)驗(yàn)但未提供產(chǎn)物純度的數(shù)據(jù)。Murray IB專(zhuān)利所描述的濃縮步驟將Murray IA方法的蛋白質(zhì)分離物的產(chǎn)率提高了約20％。
通過(guò)所述現(xiàn)有方法制備的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的缺點(diǎn)是黃色相對(duì)暗和氣味不佳。已有報(bào)道指出酚類(lèi)化合物是導(dǎo)致卡諾拉蛋白質(zhì)產(chǎn)品(包括粗粉)這些問(wèn)題的原因?？ㄖZ拉所含酚類(lèi)化合物的量大約是大豆的十倍，所述酚類(lèi)化合物可能包括芥子堿和縮合鞣質(zhì)。經(jīng)過(guò)氧化，酚類(lèi)化合物能引起暗色的發(fā)生。該問(wèn)題在通過(guò)等電沉淀制備的卡諾拉蛋白質(zhì)產(chǎn)品中特別嚴(yán)重，等電沉淀中的強(qiáng)堿環(huán)境導(dǎo)致酚類(lèi)化合物迅速氧化為醌，其隨即與蛋白質(zhì)反應(yīng)，并賦予蛋白質(zhì)及其溶液暗綠色或暗棕色。其它化合物和反應(yīng)也可能對(duì)顏色的形成產(chǎn)生作用。
發(fā)明概述
本申請(qǐng)人此處提供了對(duì)產(chǎn)生卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法的改進(jìn)，其中處理卡諾拉種子以產(chǎn)生卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉，提取卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉形成蛋白質(zhì)水溶液，濃縮蛋白質(zhì)水溶液，和從蛋白質(zhì)濃縮水溶液中回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
在提取步驟中從卡諾拉粗粉中提取酚類(lèi)化合物，通過(guò)330nm(A330)UV吸光度可得存在的游離酚的量。所述酚類(lèi)化合物易于被氧化為醌，其與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成有色化合物，其易于吸收較高的波長(zhǎng)。測(cè)定420nm(A420)吸光度提供了對(duì)分離物和卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的實(shí)際可見(jiàn)的黃色著色更為直接的檢測(cè)。在本發(fā)明中，在獲得卡諾拉蛋白質(zhì)分離物過(guò)程中，實(shí)施如下步驟，除去酚類(lèi)化合物以使其不能形成可見(jiàn)的著色成分，抑制酚類(lèi)化合物氧化為可見(jiàn)著色化合物和除去其它可見(jiàn)著色成分。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供的改進(jìn)涉及在上述方法中實(shí)施至少一個(gè)最終得到顏色淡化的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的步驟。本發(fā)明人在該方法中采取了多種操作，可采用的一個(gè)或多個(gè)步驟包括
-加工卡諾拉種子
-加工粗粉
-使用特定形式的卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉
-在特定條件下實(shí)施卡諾拉蛋白質(zhì)的提取
-加工提取物
-加工回收的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物
可應(yīng)用兩種或多種所述操作，通常使用所述操作的組合。
當(dāng)實(shí)施對(duì)種子的加工時(shí)，操作至少包括滅活仍在脫殼的種子中的黑芥子酶。使黑芥子酶失活，黑芥子酶對(duì)硫代葡萄糖酸鹽的任何催化作用均導(dǎo)致其裂解為含硫成分(為抗?fàn)I養(yǎng)物，是味覺(jué)和顏色的原因)。共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.＿＿提交的＿＿(轉(zhuǎn)讓給該專(zhuān)利受讓人，其公開(kāi)引入此處作為參考)中更全面地描述了該方法。
對(duì)粗粉的處理可包括用水可混合性有機(jī)溶劑(包括醇，例如乙醇)提取粗粉，以提取酚類(lèi)化合物和/或其它著色成分。
當(dāng)使用特定形式的卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉時(shí)，所述粗粉可以是經(jīng)氣體脫溶劑的粗粉，該粗粉通過(guò)在低于約50℃的溫度下，通常在約15℃～約30℃的室溫下從卡諾拉油料種子粗粉的溶劑提取中除去殘余溶劑而進(jìn)行制備。
此外，特定形式的卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉可以是低溫焙烤的，該粗粉通過(guò)在低于約100℃的升高溫度下從卡諾拉油料種子粗粉的溶劑提取中除去殘余溶劑進(jìn)行制備。
當(dāng)方法步驟包括提取步驟時(shí)，提取步驟可在抑制酚類(lèi)化合物氧化和可見(jiàn)顏色形成的抗氧劑的存在下實(shí)施?？蛇x地或組合地，由提取步驟產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水溶液可用至少一個(gè)著色成分吸收劑進(jìn)行處理。此外，或可選地，用至少一個(gè)著色成分吸收劑處理濃縮步驟中產(chǎn)生的卡諾拉濃縮的蛋白質(zhì)溶液。
當(dāng)方法步驟包括濃縮步驟時(shí)，對(duì)卡諾拉蛋白質(zhì)濃縮水溶液實(shí)施滲濾以便從卡諾拉濃縮的蛋白質(zhì)溶液中洗掉著色物。滲濾可采用包含在滲濾期間抑制酚類(lèi)化合物氧化和可見(jiàn)顏色形成的抗氧劑的水溶液進(jìn)行實(shí)施。
當(dāng)方法步驟包括回收的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物時(shí)，該方法步驟可包括采用醇水溶液，例如乙醇水溶液提取卡諾拉蛋白質(zhì)分離物，以便從卡諾拉蛋白質(zhì)分離物中提取酚類(lèi)化合物和/或可見(jiàn)的著色物。
通過(guò)將濃縮水溶液加入冷水以產(chǎn)生蛋白質(zhì)微膠粒，和從上清液中分離蛋白質(zhì)微膠粒，可以從蛋白質(zhì)濃縮水溶液中分離卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
通過(guò)濃縮上清液，對(duì)濃縮的上清液實(shí)施滲濾以便從濃縮的上清液中除去酚類(lèi)化合物和/或可見(jiàn)的著色物，然后從滲濾的上清液中，例如從干燥滲濾的上清液回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物由此處理上清液以便從中回收更多的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
通過(guò)防止顏色形成和通過(guò)改善卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的顏色，該產(chǎn)品可用于更廣泛的用途。根據(jù)本發(fā)明去除和防止著色物形成被認(rèn)為還能改善卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的氣味。
根據(jù)此處的方法制備的蛋白質(zhì)分離物可用于蛋白質(zhì)分離物的傳統(tǒng)用途中，例如加工食品中的蛋白質(zhì)強(qiáng)化，油的乳化，焙烤品中的成形體和俘獲氣體的產(chǎn)品中的發(fā)泡劑。此外，該蛋白質(zhì)分離物可被制成蛋白質(zhì)纖維(可用于肉類(lèi)似物)，可在將蛋白作為粘合劑的食品中用作蛋白代用品或添加劑?？ㄖZ拉蛋白質(zhì)分離物可用作營(yíng)養(yǎng)添加劑?？ㄖZ拉蛋白質(zhì)分離物的其它用途為寵物食品，動(dòng)物飼料和工業(yè)及化妝品用途和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方面，提供了一種從卡諾拉油料種子粗粉中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，包括(a)通過(guò)使用包含抗氧劑的鹽水溶液提取卡諾拉油料種子粗粉，使卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，產(chǎn)生pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，(b)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，(c)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，產(chǎn)生濃縮的蛋白質(zhì)溶液，(d)將經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，(e)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和(f)從上清中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N x 6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體方面，提供了一種由卡諾拉油料種子粗粉制備卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的方法，包括(a)用醇洗滌所述卡諾拉油料種子粗粉，(b)提取經(jīng)洗滌的卡諾拉油料種子粗粉，使經(jīng)洗滌的卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，產(chǎn)生pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，(c)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，(d)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，產(chǎn)生濃縮的蛋白質(zhì)溶液，(e)將經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，(f)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和(g)從上清中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N x 6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
根據(jù)本發(fā)明的其它具體方面，提供了一種從卡諾拉油料種子粗粉中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，包括(a)提取卡諾拉油料種子粗粉，使卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，產(chǎn)生pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，(b)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，(c)通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)水溶液實(shí)施超濾而提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，產(chǎn)生濃縮的蛋白質(zhì)溶液，(d)對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)溶液實(shí)施滲濾，(e)將經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，(f)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和(g)從上清中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N x 6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種從卡諾拉油料種子粗粉中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，包括(a)提取卡諾拉油料種子粗粉，使卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，產(chǎn)生pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，(b)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，(c)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，產(chǎn)生濃縮的蛋白質(zhì)溶液，(d)將所述濃縮的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，(e)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，(f)將蛋白質(zhì)微膠粒和上清液分離，(g)干燥蛋白質(zhì)微膠粒，得到以干重(N x 6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％的諾拉蛋白質(zhì)分離物，和(h)用醇水溶液提取所述卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
根據(jù)本發(fā)明的其它具體方面，提供了一種從卡諾拉油料種子粗粉中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，包括(a)提取卡諾拉油料種子粗粉，使卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，產(chǎn)生pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，(b)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，(c)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，產(chǎn)生濃縮的蛋白質(zhì)溶液，(d)對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)溶液實(shí)施巴氏消毒，形成巴氏消毒的蛋白質(zhì)溶液，(e)將巴氏消毒的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，(f)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和(g)從上清液中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N x 6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種從卡諾拉油料種子中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，包括(a)處理卡諾拉油料種子，滅活油料種子所包含的黑芥子酶，制備經(jīng)處理的油料種子，(b)加工所述油料種子，從中除去卡諾拉油，制備卡諾拉油料種子粗粉，(c)提取卡諾拉油料種子，使卡諾拉油料種子中的蛋白質(zhì)溶解，產(chǎn)生pH為約5～約6.8的水溶液，(d)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，(e)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，產(chǎn)生濃縮的蛋白質(zhì)溶液，(f)將濃縮的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，(g)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和(h)從上清液中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N x 6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
卡諾拉也被認(rèn)為是油菜籽或油料種子油菜。
發(fā)明詳述
通過(guò)處理種子可獲得顏色的改進(jìn)。使用蒸汽處理脫殼種子以熱滅活黑芥子酶。然后可通過(guò)常規(guī)方法處理滅活的種子以從種子中回收油和形成卡諾拉油料種子粗粉。
優(yōu)選(根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案)通過(guò)在低于約100℃的升高溫度下焙烤而對(duì)油料種子粗粉脫溶劑，因?yàn)樗龃址垡鸬念伾l(fā)生比采用常規(guī)(更高焙烤溫度)的方法脫溶劑的粗粉少。共同未決的2002年12月9日提交的US專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/314,202(轉(zhuǎn)讓給該專(zhuān)利受讓人，其公開(kāi)引入此處作為參考)中描述了從所述粗粉中形成蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N x 6.25)，優(yōu)選至少約100wt％的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
更優(yōu)選地，將油料種子粗粉在低于約50℃，優(yōu)選約15℃～約30℃的室溫附近的溫度，在氣體中脫溶劑，因?yàn)槠洚a(chǎn)生的顏色甚至比使用存在于提取液中的焙烤的粗粉的情況下更低。共同未決的2002年6月21日提交的US專(zhuān)利申請(qǐng)No.60/390,126和2002年8月8日提交的60/401,712和＿＿提交的＿＿(轉(zhuǎn)讓給該專(zhuān)利受讓人，其公開(kāi)引入此處作為參考)中描述了從所述粗粉中產(chǎn)生蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N x 6.25)，優(yōu)選至少約100wt％的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。從卡諾拉油料種子粗粉中可產(chǎn)生卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。共同未決的2001年5月4日提交的US專(zhuān)利申請(qǐng)No.60/288,415，2001年10月5日提交的60/326,987，2001年11月7日提交的60/331,066，2001年11月26日提交的60/333,494，2002年4月24日提交的60/374,801和2002年5月3日提交的10/137,391(WO 02/089597)(均轉(zhuǎn)讓給該專(zhuān)利受讓人，其公開(kāi)引入此處作為參考)中描述了從卡諾拉油料種子粗粉中產(chǎn)生卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，所述分離物的蛋白質(zhì)含量為至少約100wt％(N x 6.25)。該方法包括多個(gè)方法步驟，其包括通過(guò)使用鹽溶液提取卡諾拉油料種子粗粉，將所得蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，利用選擇性膜技術(shù)將水溶液中蛋白質(zhì)濃度增加至至少約200g/L，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，將所得濃縮的蛋白質(zhì)溶液在冷水中稀釋以產(chǎn)生蛋白質(zhì)微膠粒，使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)(PMM)，和從上清中回收以干重(N x 6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％的蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)。如此處所使用的，以干重測(cè)定蛋白質(zhì)含量。回收的PMM可被干燥。
在上述和US專(zhuān)利Nos.60/326,987，60/331,066，60/333,494，60/374,801和10/137,391具體描述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，處理來(lái)自PMM沉淀步驟的上清液以回收蛋白質(zhì)分離物，其包含干燥來(lái)自潮濕PMM和上清液的蛋白質(zhì)分離物。該方法可通過(guò)首先使用超濾膜濃縮上清液，然后將濃縮的上清液與潮濕的PMM混合，以及干燥混合物來(lái)實(shí)施。所得卡諾拉蛋白質(zhì)分離物具有至少約90wt％蛋白質(zhì)(N x 6.25)，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)(N x 6.25)的高純度。
上述和申請(qǐng)Nos.60/333,494，60/374,801和10/137,391具體描述的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，處理來(lái)自PMM沉淀步驟的上清液以便從上清液中回收蛋白質(zhì)分離物。該方法可通過(guò)首先使用超濾膜濃縮上清液和干燥濃縮物進(jìn)行實(shí)施。所得卡諾拉蛋白質(zhì)分離物具有至少約90wt％蛋白質(zhì)(N x 6.25)，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)(N x 6.25)的高純度。
上述US專(zhuān)利所描述的方法是基本上批量的方法。共同未決的提交于2001年11月20日提交的US專(zhuān)利申請(qǐng)No.60/331,646，2002年5月30日提交的60/383,809和2002年11月19日的10/298,678(WO03/043439)(轉(zhuǎn)讓給該專(zhuān)利受讓人，其公開(kāi)引入此處作為參考)中描述了制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的連續(xù)過(guò)程。根據(jù)該過(guò)程，將卡諾拉油料種子粗粉與鹽溶液持續(xù)混和，將混合物從管中輸送，同時(shí)從卡諾拉油料種子粗粉中提取蛋白質(zhì)，形成蛋白質(zhì)水溶液，將蛋白質(zhì)水溶液與殘余的卡諾拉油料種子粗粉持續(xù)分離，將蛋白質(zhì)水溶液持續(xù)通過(guò)選擇性膜操作以將蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)含量增加到至少約200g/L，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，將所得濃縮的蛋白質(zhì)溶液與冷水持續(xù)混和，產(chǎn)生蛋白質(zhì)微膠粒，持續(xù)沉淀蛋白質(zhì)微膠粒，同時(shí)持續(xù)溢流上清液直至在沉淀器中累積所需量的PMM。從沉淀器中取出PMM，可將其干燥。PMM的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N x 6.25)，優(yōu)選至少約100wt％(N x 6.25)。
如前述US專(zhuān)利Nos.60/326,987，60/331,066，60/333,494，60/333,494，60/374,801和10/137,391中所述，可處理溢流的上清液以從中回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，可開(kāi)始就對(duì)油料種子粗粉實(shí)施溶劑提取以從中除去酚類(lèi)化合物和著色物。所述溶劑萃取可通過(guò)使用酚類(lèi)化合物和/或可見(jiàn)著色物的水溶性有機(jī)溶劑，例如水溶性醇，優(yōu)選乙醇而實(shí)施。
提取可通過(guò)將卡諾拉油料種子粗粉約1∶3～約1∶10，優(yōu)選約1∶5的w/v比例分散在溶劑中而實(shí)施。漿體可在約15℃～約45℃，優(yōu)選約30℃～約35℃的溫度下被攪拌約5～約60分鐘，優(yōu)選約15～約30分鐘。一組適宜的條件是35℃提取30分鐘，可多次重復(fù)所述提取直至不能再提取到酚類(lèi)化合物和/或可見(jiàn)顏色。
在本發(fā)明的方法中，將卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)物質(zhì)溶解。該蛋白質(zhì)物質(zhì)可以是卡諾拉種子中天然存在的蛋白質(zhì)，或是經(jīng)遺傳操作的、但具有天然蛋白質(zhì)的疏水性和極性特征的蛋白質(zhì)物質(zhì)?？ㄖZ拉粗粉可以是通過(guò)熱己烷提取法或冷榨提油法將卡諾拉油從卡諾拉油料種子中除去而得到的、含有多種水平的非變性蛋白質(zhì)的任何卡諾拉粗粉。種子的處理(當(dāng)用于實(shí)施從卡諾拉油料種子中除去卡諾拉油時(shí))通常作為與此處所述本發(fā)明的蛋白質(zhì)分離物回收方法分離的操作實(shí)施。
由于鹽的存在可以促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)從油料種子粗粉中分離，故使用食品級(jí)鹽溶液可以最有效地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)溶解。當(dāng)卡諾拉蛋白質(zhì)分離物意在用于非食品用途時(shí)，可以使用非食品級(jí)的化學(xué)物質(zhì)。鹽通常是氯化鈉，但也可以使用其它鹽，例如，氯化鉀。鹽溶液的離子強(qiáng)度為至少約0.10，優(yōu)選至少約0.15，這可以實(shí)現(xiàn)大量蛋白質(zhì)的溶解。隨著鹽溶液離子強(qiáng)度的增加，油料種子粗粉中蛋白質(zhì)的溶解程度也開(kāi)始增加，直至達(dá)到最大值。再增加離子強(qiáng)度則不能增加溶解的蛋白質(zhì)總量。導(dǎo)致最大蛋白質(zhì)溶解的食品級(jí)鹽溶液的離子強(qiáng)度根據(jù)有關(guān)的鹽和所選擇的油料種子粗粉而改變。食品級(jí)鹽溶液的離子強(qiáng)度為約0.25。
考慮到若增加離子強(qiáng)度，就需要進(jìn)行更大程度的稀釋以形成蛋白質(zhì)沉淀，故一般優(yōu)選使用的離子強(qiáng)度低于約0.8，更優(yōu)選為約0.15～約0.6。
在批量過(guò)程中，蛋白質(zhì)的鹽溶在至少約5℃，優(yōu)選達(dá)約35℃的溫度下實(shí)施，優(yōu)選通過(guò)攪拌來(lái)縮短溶解時(shí)間，溶解時(shí)間通常為約10～約60分鐘。優(yōu)選按照從油料種子粗粉中基本上最大限度地提取蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)施溶解，以便獲得高的總產(chǎn)量。
選擇約5℃的溫度下限是因?yàn)榈陀谶@一溫度會(huì)減緩蛋白質(zhì)的溶解，而選擇約35℃的優(yōu)選溫度的上限是因?yàn)樵诟芨邷囟认逻M(jìn)行批量加工在經(jīng)濟(jì)上不合算。
在連續(xù)過(guò)程中，通過(guò)包含實(shí)施從卡諾拉油料種于粗粉中連續(xù)提取蛋白質(zhì)的任何方法從卡諾拉油料種子粗粉提取蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將卡諾拉油料種子粗粉與食品級(jí)鹽溶液持續(xù)混合，將混合物從管或?qū)Ч苤休斔?，所述管或?qū)Ч艿拈L(zhǎng)度和流量應(yīng)能提供足以按照此處描述的參數(shù)實(shí)施所需提取的停留時(shí)間。在所述連續(xù)過(guò)程中，快速(在約10分鐘的時(shí)間內(nèi))實(shí)施鹽溶解步驟，優(yōu)選實(shí)施溶解以基本上盡可能多地從卡諾拉油料種子粗粉中提取蛋白質(zhì)。連續(xù)過(guò)程中的溶解優(yōu)選在升高溫度下，優(yōu)選高于約35℃，通常達(dá)約65℃或更高的溫度下實(shí)施。
含水的食品級(jí)鹽溶液和卡諾拉油料種子粗粉具有約5～約6.8的天然pH值，該pH值可以使蛋白質(zhì)分離物通過(guò)微膠粒途徑形成，如下文更詳細(xì)的描述。
當(dāng)pH位于和接近pH范圍的上下限時(shí)，只能部分通過(guò)微膠粒途徑形成蛋白質(zhì)分離物，產(chǎn)量比pH位于pH范圍內(nèi)其它位置時(shí)低。由于這些原因，優(yōu)選約5.3～約6.2的弱酸性pH值。
可以根據(jù)需要，使用任何適宜的酸(通常是鹽酸)或堿(通常是氫氧化鈉)將鹽溶液的pH值調(diào)整至用于提取步驟中的約5～6.8之間的值。
在溶解步驟中，油料種子粗粉在食品級(jí)鹽溶液中的濃度可以有很大變化。典型的濃度值為約5％～15％(w/v)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，存在于食品級(jí)鹽溶液中的抗氧劑抑制卡諾拉油料種子粗粉中的酚氧化為能與蛋白質(zhì)反應(yīng)并導(dǎo)致顏色變暗的成分?？梢允褂萌魏嗡璧氖称芳?jí)抗氧劑，例如亞硫酸鈉和維生素C.用于含水的食品級(jí)鹽溶液的抗氧劑的量依賴(lài)于使用的物質(zhì)，并可在約0.01～約1wt％，優(yōu)選約0.05～約0.1wt％之間變化。通過(guò)使用抗氧劑抑制酚類(lèi)化合物的氧化導(dǎo)致提取顏色(420nm吸光度)的降低，而酚類(lèi)化合物的濃度(330nm吸光度)大多保持不變。
在加入亞硫酸鈉時(shí)，即使在0.05M這樣低的鹽濃度，在pH6.3下提取物中的蛋白質(zhì)濃度仍與0.15M無(wú)亞硫酸鈉的鹽相當(dāng)。
經(jīng)過(guò)提取步驟所得到的蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度通常為約5～約40g/L，優(yōu)選約10～約30g/L。
在選擇提取步驟的參數(shù)時(shí)，對(duì)盡可能多地從卡諾拉油料種子粗粉中提取蛋白質(zhì)的需要應(yīng)與對(duì)將所得提取液的顏色最小化的需要相平衡。根據(jù)此處提供的數(shù)據(jù)，30分鐘的提取時(shí)間通常足以在優(yōu)選的pH和鹽摩爾濃度下提取全部蛋白質(zhì)。更高的pH能增加蛋白質(zhì)的提取量并導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液在顏色上視覺(jué)上變暗(按A420吸光度測(cè)定)。
在pH8.0用0.1M的鹽提取10分鐘所提取的蛋白質(zhì)可能與在pH6.3用0.15M的鹽提取30分鐘所提取的蛋白質(zhì)一樣多。當(dāng)與在較低pH下的提取比較時(shí)，pH9.8的提取在A330出現(xiàn)顯著的降低，雖然隨著pH增加顏色在視覺(jué)上降低。對(duì)該現(xiàn)象的一個(gè)解釋可能是酚類(lèi)化合物發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生不能在A330吸收，而在A360和A400之間的更高的值吸收的黃色著色物。由于這些原因，在低于8的pH下實(shí)施卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉提取。
可采用任何適宜的方式，例如通過(guò)使用真空過(guò)濾將從提取步驟中得到的水相與殘余的卡諾拉粗粉分離，隨后通過(guò)離心和/或過(guò)濾而除去殘余的粗粉?？蓪⒎蛛x的殘余卡諾拉粗粉干燥備用。
當(dāng)卡諾拉種子粗粉包含大量脂肪時(shí)(如Murray II專(zhuān)利所述)，則可對(duì)分離的蛋白質(zhì)水溶液和下述蛋白質(zhì)濃縮水溶液實(shí)施此處所述的脫脂步驟。
雖然單獨(dú)使用水從卡諾拉油料種子粗粉中提取的蛋白質(zhì)會(huì)比鹽水溶液少，但作為用鹽水溶液從卡諾拉油料種子粗粉中提取蛋白質(zhì)的可選方案，可單獨(dú)使用水實(shí)施所述提取。當(dāng)使用該可選方案時(shí)，則在分離殘余油料種子粗粉后將鹽(以上述濃度)加入蛋白質(zhì)溶液中，以便在下述濃縮步驟其間保持蛋白質(zhì)。當(dāng)實(shí)施第一除脂步驟時(shí)，鹽通常在所述操作完成后加入。
另一可選的步驟是用食品級(jí)鹽溶液以高于約6.8，通常達(dá)約11的相對(duì)高的pH值提取卡諾拉油料種子粗粉。然而，如上所述，通常要避免在高于約8的pH值下的提取，因?yàn)樵谠損H值時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量可見(jiàn)顏色。通過(guò)使用任何適宜的食品級(jí)堿，例如氫氧化鈉溶液可將食品級(jí)鹽溶液的pH調(diào)整至需要的堿性pH值?？蛇x地，可以采用鹽溶液以低于約5，通常達(dá)約3的相對(duì)低的pH值從卡諾拉油料種子粗粉中提取蛋白質(zhì)。當(dāng)使用該可選方案時(shí)，則可采用任何適宜的方式，例如通過(guò)使用真空過(guò)濾將從卡諾拉油料種子粗粉提取步驟中得到的水相與殘余的卡諾拉粗粉分離，隨后通過(guò)離心和/或過(guò)濾而除去殘余的粗粉。可將分離的殘余卡諾拉粗粉干燥備用。
然后在如下述主要通過(guò)微膠粒途徑進(jìn)一步加工以回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物之前，可將獲自高或低pH提取步驟的蛋白質(zhì)水溶液的pH調(diào)整為約5～約6.8，優(yōu)選約5.3～約6.2(如上述)。這種pH調(diào)整可以使用任何適宜的酸，或堿如氫氧化鈉來(lái)實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，在提取蛋白質(zhì)后，對(duì)蛋白質(zhì)溶液實(shí)施一個(gè)或多個(gè)除色步驟，包括超濾/滲濾以及與吸色劑接觸。在超濾步驟中，蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)含量增加，而鹽濃度保持不變。超濾可通過(guò)采用具有符合能使酚類(lèi)化合物和著色物通過(guò)具有滲透物的膜而留下蛋白質(zhì)的分子量截至值的膜來(lái)實(shí)施，通常超濾膜的截至分子量為約3,000～約50,000道爾頓，優(yōu)選約5000～約10,000道爾頓(根據(jù)不同膜材料和構(gòu)型)。膜可以是中空纖維膜或卷繞膜。對(duì)于連續(xù)操作，可改變膜的尺寸以便能在蛋白質(zhì)水溶液經(jīng)過(guò)膜時(shí)實(shí)現(xiàn)所需的濃縮程度。
通過(guò)超濾步驟將蛋白質(zhì)溶液濃縮約4～約20倍，優(yōu)選經(jīng)實(shí)施濃縮后產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度為至少約200g/L，更優(yōu)選為至少約250g/L的濃縮的蛋白質(zhì)溶液。
然后采用具有與提取液相同摩爾濃度和pH的鹽水溶液對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)溶液實(shí)施滲濾步驟。所述滲濾可通過(guò)采用約2～約20體積的滲濾液，優(yōu)選約5～約10體積的滲濾液來(lái)實(shí)施。在滲濾操作中，通過(guò)經(jīng)過(guò)帶有滲透物的膜從蛋白質(zhì)水溶液中除去更多量的酚類(lèi)化合物和可見(jiàn)顏色。實(shí)施滲濾操作直至滲透物中無(wú)顯著更多量的酚類(lèi)化合物和可見(jiàn)顏色。所述滲濾可通過(guò)采用截至分子量為約3,000～約50,000道爾頓，優(yōu)選約5000～約10,000道爾頓(根據(jù)不同膜材料和構(gòu)型)的膜來(lái)實(shí)施。
根據(jù)本發(fā)明該實(shí)施方案的方面，抗氧劑可存在于至少部分滲濾步驟所使用的滲濾介質(zhì)中?？寡鮿┛梢允侨魏芜m宜的食品級(jí)抗氧劑，例如亞硫酸鈉或維生素C。滲濾介質(zhì)中使用的抗氧劑的量依賴(lài)于所使用的物質(zhì)且可存在約0.01～約1wt％，優(yōu)選約0.05wt％的變化?？寡鮿┯靡砸种拼嬖谟诳ㄖZ拉蛋白質(zhì)分離物濃縮液中酚類(lèi)化合物的氧化。
濃縮步驟和滲濾步驟可在任何適宜的溫度(通常為約20℃～約60℃)實(shí)施一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)所需的濃縮程度。用于某程度的溫度和其它條件依賴(lài)于用于實(shí)現(xiàn)溶液的濃縮和所需蛋白質(zhì)濃度的膜裝置。
在實(shí)施超濾/滲濾操作時(shí)，根據(jù)需要選擇條件以便產(chǎn)生具有最高蛋白質(zhì)濃度和最少顏色的蛋白質(zhì)溶液。根據(jù)下述實(shí)驗(yàn)，超濾/滲濾(UF/DF)步驟能有效降低(根據(jù)pH和鹽含量)約28％～約74％的A330值(酚類(lèi)化合物濃度)。超濾/滲濾操作還具有除去抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用，由此改善了卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的營(yíng)養(yǎng)特性。
在pH8.0和6.3時(shí)UF/DF滲透物的A330值最高。這些高滲透物的A330值可能是由于在未結(jié)合的酚類(lèi)化合物能夠通過(guò)膜進(jìn)入滲透物中，而在pH9.8和pH11.0時(shí)，酚類(lèi)化合物已經(jīng)反應(yīng)生成著色物而不能在A330強(qiáng)烈吸收。
在較高pH和鹽水平的提取的起始A330讀數(shù)最高，在大多數(shù)情況下最終滲余物A330讀數(shù)最低。在較高的pH和鹽水平，滲透物包括較高水平的氮，這提示蛋白質(zhì)丟失。
最終滲余物的A330與蛋白質(zhì)的比例顯示出在pH6.3～8.0的pH時(shí)可得到最佳的比率，這提示通過(guò)UF/DF步驟，A330組分/蛋白質(zhì)比更高的pH試驗(yàn)更低和更有效的去除。在除0M和0.25M鹽濃度外的所有濃度中，pH6.3具有最佳的A330與蛋白質(zhì)的比例。據(jù)此，在用最佳鹽水平0.25M鹽將顏色從蛋白質(zhì)溶液中滲濾出以通過(guò)最高蛋白質(zhì)水平的實(shí)驗(yàn)中，pH6.3表現(xiàn)出最佳的pH水平。
超濾/滲濾操作后，可以用吸色劑進(jìn)行處理。在上述共同未決的US專(zhuān)利Nos.60/288,415，60/326,987，60/331,066，60/333,494，60/374,801和10/137,391(WO 02/089597)中描述了使用粉狀活性炭實(shí)施減色。
如所述申請(qǐng)所述，在濃縮之前對(duì)卡諾拉蛋白質(zhì)溶液實(shí)施所述減色步驟，導(dǎo)致產(chǎn)品卡諾拉蛋白質(zhì)分離物中與無(wú)所述步驟時(shí)相比呈現(xiàn)較亮的顏色和較弱的黃色。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，優(yōu)選對(duì)濃縮和滲濾的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液施用顏色成分吸附物。此處可使用粉狀活性炭以及顆?；钚蕴?GAC)?？勺饔梦珓┝硪晃镔|(zhì)是聚乙烯吡咯烷酮?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，可在超濾和任選的滲濾之前，和/或直接在提取步驟中對(duì)卡諾拉蛋白質(zhì)溶液施用顏色成分吸附物。當(dāng)在超濾步驟之前施用顏色吸附物時(shí)，可省略滲濾，此時(shí)所述滲濾不能除去更多的酚類(lèi)化合物和/或可見(jiàn)顏色。
在下述實(shí)驗(yàn)中，聚乙烯吡咯烷酮和GAC在pH6.3和8.0時(shí)對(duì)A330值的降低要優(yōu)于在pH9.8和11時(shí)，這可能是由于在兩個(gè)較高pH水平醌與蛋白質(zhì)結(jié)合。聚乙烯吡咯烷酮產(chǎn)生了A330的良好降低，而沒(méi)有蛋白質(zhì)的丟失。其它所試驗(yàn)的可能物質(zhì)均不令人滿意，或者導(dǎo)致不能接受的蛋白質(zhì)丟失，或者不能降低溶液的A330。
顏色吸附劑處理步驟可在任何適宜的條件下實(shí)施，通常在卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的室溫下。對(duì)于粉狀活性炭，可以使用約0.025％～約5％w/v，優(yōu)選約0.05％～約2％w/v的量。當(dāng)聚乙烯吡咯酮用作吸色劑時(shí)，可使用約0.5～約5w/v，優(yōu)選約2～約3％w/v的量?？赏ㄟ^(guò)任何適宜的方法，例如過(guò)濾從卡諾拉蛋白質(zhì)溶液中除去吸色劑。
吸色劑對(duì)滲濾的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的處理后，處理所得蛋白質(zhì)溶液以從中產(chǎn)生卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。根據(jù)蛋白質(zhì)溶液的參數(shù)，可采用任何適宜的方式實(shí)施卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的回收。
例如，可通過(guò)等電沉淀從堿性溶液中或通過(guò)蛋白質(zhì)微膠粒方法從更為中性的溶液中回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物?？蛇x地，可通過(guò)增加鹽濃度而沉淀蛋白質(zhì)。
處理卡諾拉蛋白質(zhì)溶液以回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法優(yōu)選采用上述US專(zhuān)利所描述的以及下面更詳細(xì)描述的蛋白質(zhì)微膠粒方法來(lái)實(shí)施，因?yàn)槠涮崛H條件能比用于等電沉淀技術(shù)所使用的導(dǎo)致更少的顏色形成。
根據(jù)對(duì)含水卡諾拉蛋白質(zhì)溶液實(shí)施的除色步驟中使用的溫度，可將濃縮的蛋白質(zhì)溶液加熱至至少約20℃，達(dá)約60℃，優(yōu)選約25℃～約40℃的溫度，以降低濃縮的(任選地滲濾的)蛋白質(zhì)溶液的粘度以易于實(shí)施隨后的稀釋步驟和微膠粒形成。濃縮的和任選地滲濾的蛋白質(zhì)溶液不應(yīng)被加熱至的溫度不能超過(guò)在經(jīng)冷水稀釋時(shí)無(wú)法形成微膠粒的濃縮的和任選地滲濾的蛋白質(zhì)溶液的溫度?？蛇M(jìn)一步對(duì)濃縮的和任選地滲濾的蛋白質(zhì)溶實(shí)施如Murray II專(zhuān)利所述的脫脂操作(如有需要)。
可對(duì)得自除色步驟的濃縮的蛋白質(zhì)溶液實(shí)施巴氏消毒以殺死原始粗粉由于儲(chǔ)存而已有的或在提取步驟中從粗粉中被提取至卡諾拉蛋白質(zhì)分離物溶液中的任何細(xì)菌。所述巴氏消毒可在任何需要的巴氏消毒條件下實(shí)施。通常，將濃縮的和任選地滲濾的蛋白質(zhì)溶液加熱至約55℃～約70℃，優(yōu)選約60℃～約65℃的溫度，約10～約15分鐘，優(yōu)選約10分鐘。然后可以冷卻經(jīng)巴氏消毒的濃縮的蛋白質(zhì)溶液以用于下述進(jìn)一步的處理，優(yōu)選冷卻至約25℃～約40℃的溫度。
然后將得自除色步驟和任選的脫脂和巴氏消毒步驟的濃縮的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)采用濃縮的蛋白質(zhì)溶液與具有獲得所需稀釋程度的體積的冷水混合的方法進(jìn)行稀釋而形成微膠粒。根據(jù)需要通過(guò)微膠粒途徑獲得的卡諾拉蛋白質(zhì)的比例和從上清液中的比率，濃縮的蛋白質(zhì)溶液的稀釋程度可有所變化。稀釋水平越高(通常)，水相中保留的卡諾拉蛋白質(zhì)比例就越高。
當(dāng)需要通過(guò)微膠粒途徑得到最大比例的蛋白質(zhì)時(shí)，可將濃縮的蛋白質(zhì)溶液稀釋約15倍或更低，優(yōu)選約10倍或更低。
與濃縮的蛋白質(zhì)溶液混合的冷水的溫度低于約15℃，通常約3℃～約15℃，優(yōu)選低于約10℃，因?yàn)橛眠@些較冷的溫度在所用的稀釋系數(shù)下能得到提高的蛋白質(zhì)微膠粒形式的蛋白質(zhì)分離物的產(chǎn)量。
在批量操作中，將濃縮的蛋白質(zhì)溶液批量加入具有所需體積的靜止的冷水體中(如上述)。濃縮的蛋白質(zhì)溶液稀釋和隨后離強(qiáng)度的降低導(dǎo)致云狀團(tuán)塊的形成，該團(tuán)塊為高度聯(lián)合的蛋白質(zhì)分子，其是微膠粒形式的離散蛋白質(zhì)微滴。在批量過(guò)程中，使蛋白質(zhì)微膠粒在冷水體中沉淀以形成聚集的、并合的、高密度的、無(wú)定形的、粘性的、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)(PMM)?？赏ㄟ^(guò)例如離心輔助沉淀。所述誘導(dǎo)的沉淀降低了蛋白質(zhì)微膠粒的液體含量，由此通常將含水量從微膠粒團(tuán)總重的約70％～約95％(以重量計(jì))降為約50％～約80％(以重量計(jì))。以這種方式降低微膠粒團(tuán)的含水量還降低了微膠粒團(tuán)包含的鹽含量，由此降低了干燥分離物的鹽含量。
可選地，稀釋操作可通過(guò)將濃縮的蛋白質(zhì)溶液連續(xù)通過(guò)T-形管的一個(gè)口而從T-形管的另一入口注入稀釋用的水(使其在管中混合)而得以連續(xù)地實(shí)施。將稀釋用的水以足以獲得所需稀釋程度的速率注入T-形管。
濃縮的蛋白質(zhì)溶液和稀釋用水在管中的混合啟動(dòng)了蛋白質(zhì)微膠粒的形成，將混合物經(jīng)T-形管入口持續(xù)注入沉淀器中，當(dāng)充滿時(shí)，使上清液從其中溢流。優(yōu)選將混合物以能最小化液體中湍流的方式注入沉淀器中的冷水體中。
在連續(xù)過(guò)程中，將蛋白質(zhì)微膠粒在沉淀器中沉淀，形成聚集的、并合的、高密度的、無(wú)定形的、粘性的、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)(PMM)，連續(xù)操作直至在沉淀器底部累積所需量的PMM，由此從沉淀器中取出累積的PMM。
將蛋白質(zhì)溶液濃縮至蛋白質(zhì)含量為至少約200g/L和稀釋率小于約15的加工參數(shù)并用，和上述US專(zhuān)利所描述的本領(lǐng)域已知的任何產(chǎn)生蛋白質(zhì)分離物的方法相比，能產(chǎn)生更高的產(chǎn)量(通常是顯著高的產(chǎn)量，指以蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)形式從原始粗粉提取物中回收的蛋白質(zhì))和更純的分離物(指蛋白質(zhì)含量)。
可以通過(guò)例如將殘余的水相從沉淀物質(zhì)中傾析或離心，使沉淀的分離物與殘余的水相或上清液分離。PMM可以在濕的狀態(tài)下使用，也可以通過(guò)任何適宜的技術(shù)，如噴霧干燥、冷凍干燥或真空轉(zhuǎn)鼓式干燥等加以干燥，形成干燥的PMM。干燥的PMM具有高蛋白質(zhì)含量，超過(guò)約100wt％的蛋白質(zhì)(按N x6.25)，且基本上是非變性的(按差示掃描量熱法測(cè)定)。當(dāng)采用Murray II的方法時(shí)，從含脂肪的油料種子粗粉獲得的干燥PMM分離物中殘留脂肪的含量也較低，低于約1wt％。
從PMM形成和沉淀步驟中產(chǎn)生的上清液中含有大量的、在稀釋步驟中沒(méi)有沉淀的卡諾拉蛋白質(zhì)，對(duì)上清液進(jìn)行處理以從中回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。稀釋步驟中(除去PMM之后)的上清液可以進(jìn)行濃縮，以增加其中的蛋白質(zhì)濃度。這種濃縮使用任何適宜的選擇性膜技術(shù)，如超濾法進(jìn)行，該技術(shù)使用具有適當(dāng)截止分子量(允許低分子量的分子，包括鹽和其他從蛋白質(zhì)原料中提取的非蛋白性低分子量物質(zhì)，通過(guò)膜，而截止溶液中的卡諾拉蛋白質(zhì))的膜而實(shí)施。根據(jù)不同的膜材料和構(gòu)型，可使用截止分子量為約3000～10000道爾頓的超濾膜。通過(guò)這種方式對(duì)上清液的濃縮還減少了干燥(以回收蛋白質(zhì))所需的液體體積。干燥前，上清液通常濃縮至蛋白質(zhì)含量為約100g/L～400g/L的濃度，優(yōu)選約200g/L～300g/L。如上述關(guān)于蛋白質(zhì)溶液濃縮步驟的描述，所述濃縮操作可在任何適宜的批量模式或在連續(xù)操作中實(shí)施。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，在干燥前，用水對(duì)濃縮的上清液實(shí)施滲率步驟。使用約2～約20體積的滲濾液，優(yōu)選約5～約10體積的滲濾液實(shí)施所述滲濾。在滲濾操作中，通過(guò)流經(jīng)具有滲透物的膜可從濃縮的上清液中除去更多量的酚類(lèi)化合物和可見(jiàn)顏色?？梢詫?shí)施滲濾操作直至在滲透物中無(wú)法再將更多量酚類(lèi)化合物和可見(jiàn)顏色除去。所述滲濾可采用分子量截至為約3000～約50,000道爾頓，優(yōu)選約5000～約10,000道爾頓的膜(根據(jù)不同的膜材料合構(gòu)型)來(lái)實(shí)施。
根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方案的一個(gè)方面，滲濾介質(zhì)中可存在抗氧劑?？寡鮿┛梢允侨魏芜m宜的食品級(jí)抗氧劑，例如亞硫酸鈉或維生素C。滲濾介質(zhì)中所使用的抗氧劑的量依賴(lài)于所使用物質(zhì)，且可在約0.01～約1wt％，優(yōu)選約0.05wt％附近變化。抗氧劑能夠抑制卡諾拉蛋白質(zhì)分離物濃縮液中存在的酚類(lèi)化合物的氧化。
濃縮上清液可以濕的形式進(jìn)行使用或可經(jīng)任何適宜的技術(shù)，例如噴霧干燥、凍干或真空轉(zhuǎn)鼓式干燥而被制為干燥形式從而進(jìn)一步提供卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。所述進(jìn)一步的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物具有高蛋白質(zhì)含量，超過(guò)約90wt％，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)(按N x 6.25計(jì)算)且為基本上未變性的(按差示掃描量熱法測(cè)定)。
如果需要，至少可在干燥組合的蛋白質(zhì)流之前通過(guò)任何適宜的技術(shù)將部分濕PMM與至少部分濃縮的上清液混合以提供根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的組合的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物組合物。選擇混合在一起的蛋白質(zhì)物質(zhì)的相對(duì)比率以提供具有2S/7S/12S蛋白質(zhì)所需圖譜的所得卡諾拉蛋白質(zhì)分離物組合物?？蛇x地，干燥的蛋白質(zhì)分離物可按任何所需比例組合以在混合物中提供任何所需特定2S/7S/12S蛋白質(zhì)圖譜。組合的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物組合物具有高蛋白質(zhì)含量，超過(guò)約90wt％，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)(按N x 6.25計(jì)算)且為基本上未變性的(按差示掃描量熱法測(cè)定)。
在另一可選的過(guò)程中(其中僅部分濃縮上清液與僅部分PMM混合并將所得混合物干燥)，濃縮上清液的殘余部分與PMM的任何殘余部分同樣的干燥。此外如上述，干燥的PMM和干燥的上清液還可以任何需要的相對(duì)比例而被混合干燥。
通過(guò)用該方法進(jìn)行操作，可回收大量卡諾拉蛋白質(zhì)分離物，其形式為干燥的PMM，干燥的上清液以及源自PMM的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物與源自上清液的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物以多種重量比的干燥的混合物(重量比通常為約5∶95～約95∶5)，其可以是獲得基于組合物中2S/7S/12S蛋白質(zhì)的不同比例的不同功能特性和營(yíng)養(yǎng)特性所需要的。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，可對(duì)源自PMM的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物和源自上清液的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物進(jìn)行處理以除去其遞送顏色的成分。所述處理可適宜地采用酚類(lèi)化合物和/或可見(jiàn)著色物的水可混合性有機(jī)溶劑與水混合來(lái)實(shí)施。
因?yàn)樗苫旌闲杂袡C(jī)溶劑可以是醇。優(yōu)選醇和水的混合物，其體積比通常為約2∶1～約1∶2，優(yōu)選1∶1.通常在室溫下，將卡諾拉蛋白質(zhì)分離物以約5～約25％w/v，優(yōu)選約8～約23％w/v的量分散于溶劑混合物中。可將卡諾拉蛋白質(zhì)分離物漿體混合約30～約60分鐘，優(yōu)選約30分鐘。提取期后，將漿體沉淀，例如通過(guò)離心，然后回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。重復(fù)提取(如有需要)直至不能再除去其它酚類(lèi)化合物和/或可見(jiàn)的著色物?？蓪⒖ㄖZ拉蛋白質(zhì)分離物分散在醇，例如乙醇中，以便將水和分離物分離，然后將分禮離物分離并干燥。
實(shí)施例
實(shí)施例1
該實(shí)施例顯示了不同參數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)溶液顏色的影響
實(shí)施一系列實(shí)驗(yàn)過(guò)程，其中在20℃下，將37.5g商品化卡諾拉粗粉(AL-016)與包含所需濃度的NaCl的水在所需pH下混合，所得粗粉濃度為7.5％w/v。使用的氯化鈉濃度為0、0.05、0.10、0.15和0.25M，使用的pH值為pH6.3、8.0、9.8和11.0。在60分鐘提取期間，每10分鐘取大約30mL提取物樣品，然后將其以10,000×g離心5分鐘。在提取期結(jié)束時(shí)分析每一樣品的上清液的蛋白質(zhì)濃度。將整個(gè)批料以10,000×g離心15分鐘，采用0.45μM微濾器將上清液真空過(guò)濾。分析過(guò)濾的上清液的蛋白質(zhì)含量和游離酚類(lèi)化合物濃度(330nm吸光度)。
采用Amicon 8400裝置用10,000截至分子量的膜以濃縮系數(shù)4對(duì)取自澄清的上清液的100ml小分實(shí)施超濾。測(cè)定滲余物和集合的滲透物的蛋白質(zhì)濃度和A330吸光度。采用150mL具有與提取所使用的相同鹽濃度和相同pH的溶液，以滲濾體積6對(duì)超濾液實(shí)施滲濾(DF)。在滲濾結(jié)束時(shí)，分析來(lái)自滲濾的滲余物和集合的滲透物的蛋白質(zhì)濃度和A330。
然后將最終滲余物的等分經(jīng)過(guò)包含五種不同吸附劑的柱，再次檢測(cè)所得蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度和A330顏色。吸附劑是AmberliteXAD-16 HP(多聚吸附劑)，Amberlite SF120NA(陽(yáng)離子交換劑)，Polyclar Super R(聚乙烯吡咯烷酮)，Silica gel(28～200目)和顆?；钚蕴?食品級(jí))。
從提取實(shí)驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)顯示30分鐘的提取時(shí)間即足以從粗粉中提取所有可提取的蛋白質(zhì)。超過(guò)30分鐘，在任何檢測(cè)的pH或鹽水平均未見(jiàn)提取出的蛋白質(zhì)的顯著增加。下述表I顯示了在各pH和鹽水平所獲得的提取出的蛋白質(zhì)的量
表I各pH和鹽水水平60分鐘提取出的蛋白質(zhì)(g/L)
下述表II～VI顯示了作為時(shí)間函數(shù)的鹽濃度在多個(gè)pH水平對(duì)提取出的蛋白質(zhì)(量計(jì)為g/L)的影響
表II
表III
表IV
表V
表VI
如這些表中所示，在實(shí)施的試驗(yàn)中，提取在各個(gè)鹽水的pH越高平均產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含量越高，而增高鹽含量超過(guò)0.05M時(shí)未增加蛋白質(zhì)溶解度不再增加。
下述表VII顯示了在各pH和鹽水平提取出的蛋白質(zhì)的330nm吸光度
表VII
如表VII中所示，在0.1M，0.15M和0.25M的提取中，在pH9.8下出現(xiàn)提取的A330顏色的降低。在該pH下，顏色在視覺(jué)上比其它pH值時(shí)的暗，且不存在蛋白質(zhì)含量的相應(yīng)降低。如上述，這些提取的蛋白質(zhì)含量經(jīng)pH9.8和pH11.0而持續(xù)升高。
下述表VIII顯示了超濾后和滲濾前的蛋白質(zhì)的330nm吸光度，而表IX顯示了滲濾后蛋白質(zhì)溶液的330nm吸光度。如這些表所示，在每個(gè)過(guò)程中，滲余物在經(jīng)過(guò)滲濾后的A330較低。
表VIII滲濾前的滲余物A330
表IX滲濾后的滲余物A330
下述表X顯示了采用滲濾獲得的A330降低百分?jǐn)?shù)。
表X經(jīng)滲濾的A330的降低百分?jǐn)?shù)
如表X中所示，UF/DF后，A330值的最大降低在以pH6.3、0.1M的提取中得以實(shí)現(xiàn)。在所測(cè)試的五個(gè)不同的鹽水平中，除其中一個(gè)外pH6.3下的提取獲得最低的A330值。
下述表XI顯示考慮了最終滲余物的不同蛋白質(zhì)濃度的A330/g/L蛋白質(zhì)比例。以這一比例，由數(shù)值低的結(jié)果所示的低A330和高蛋白質(zhì)含量的結(jié)果是最令人期望的。
表XI滲濾后滲余物的A330/g/L
如表XI中所示，在所實(shí)施的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)考慮A330與蛋白質(zhì)的比例時(shí)，對(duì)每一檢測(cè)的pH水平來(lái)說(shuō)，最佳的結(jié)果來(lái)自0.25M鹽水組分，而全部最低的A330/蛋白質(zhì)比例來(lái)自pH8.0的0.25M條件下的提取。
來(lái)自超濾和滲濾的滲透物A330數(shù)據(jù)(未顯示)的檢測(cè)顯示了在比pH9.8和11.0更低的兩個(gè)pH水平能從滲透物中沖洗出更多的A330。
在吸附劑的測(cè)試中，在pH為6.3和8.0時(shí)，Polyclar降低了滲余物的游離酚類(lèi)化合物(A330)而在吸收步驟后蛋白質(zhì)未出現(xiàn)丟失。然而，pH9.8和11.0時(shí)的Polyclar不能回收顯著量的游離酚類(lèi)化合物。Amberlite XAD在大多數(shù)情況下降低了A330(在高pH下實(shí)施)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在幾乎每個(gè)情況下均有丟失。
在測(cè)試的其它吸附劑中，硅膠在大多數(shù)情況下不能降低A330，其基本通常會(huì)使樣品混濁，而導(dǎo)致較高的A330讀數(shù)。Amberlite SF120在較低的pH水平表現(xiàn)出A330的一些降低，但在較高pH水平不能再次表現(xiàn)出有效性，其在多種情況下表現(xiàn)出蛋白質(zhì)的顯著丟失。在通過(guò)吸附劑后，這些樣品也出現(xiàn)一些沉淀。
顆?；钚蕴?GAC)在較低pH水平時(shí)能良好地降低滲余物的A330，但在pH9.8和11.0時(shí)不能有效地降低A330。GAC在大多數(shù)測(cè)試中也表現(xiàn)出一些蛋白質(zhì)丟失。因?yàn)榇嬖跉堄嗵迹室呀?jīng)通過(guò)GAC的樣品在處理后必須用0.45μM濾器進(jìn)行過(guò)濾。
實(shí)施例2
本實(shí)施例舉例說(shuō)明加入抗氧化劑對(duì)提取步驟的影響。
重復(fù)實(shí)施例1的步驟，其中在pH8.0和pH6.3下，于加入維生素C的0.1M鹽中進(jìn)行提取，用氦對(duì)提取介質(zhì)換氣以除去99％的溶解氧。同樣將A420吸光度作為檢測(cè)可見(jiàn)顏色進(jìn)行測(cè)定。
下述表XII顯示了提取數(shù)據(jù)
表XII提取數(shù)據(jù)
如表XII所示，在提取中使用維生素C降低了如A420所示的可見(jiàn)顏色。低水平的維生素C(0.05％)能導(dǎo)致提取A420或可見(jiàn)顏色減少兩倍以上。
下述表XIII顯示了滲濾滲余物A330和A420讀數(shù)
表XIII滲余物A330和A420讀數(shù)
如表XIII所示，在滲濾后仍能反映出提取物中由維生素C導(dǎo)致的A420降低。來(lái)自用維生素C提取的滲余物的A420低于提取中不存在維生素C的滲余物。
表XIV顯示了Polyclar對(duì)滲余物的A330和A420的影響
表XIV
如表XIV中所示，即使是在用吸附劑處理后，仍存在由提取中所使用的維生素C導(dǎo)致的A420降低。Polyclar降低了每個(gè)樣品的A420，但包含維生素C的兩個(gè)樣品低于不含維生素C的對(duì)照。
實(shí)施例3
該實(shí)施例也例示了鹽濃度和pH對(duì)采用抗氧劑的提取的影響。
除了在提取步驟開(kāi)始前將0.5g(0.1％)亞硫酸鈉(Na2SO3)加入卡諾拉油料種子粗粉提取液之外，該實(shí)施例是實(shí)施例1的重復(fù)。除了滲濾體積值為5之外，所有其它使用的參數(shù)與實(shí)施例1中的一樣。
下述表XV.1～XV.5顯示了在每一pH和鹽水平獲得的蛋白質(zhì)的量
表XV.1用0.0M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)實(shí)施的提取率
表XV.2用0.05M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)實(shí)施的提取率
表XV.3用0.10M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)實(shí)施的提取率
表XV.4用0.15M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)實(shí)施的提取率
表XV.5用0.25M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)實(shí)施的提取率
如這些表中所示，提取在大多數(shù)實(shí)施過(guò)程在約30分鐘時(shí)達(dá)到平衡。當(dāng)不加鹽時(shí)，隨著pH升高，提取的蛋白質(zhì)增加。在pH低于8.0時(shí)pH的作用顯著低于超過(guò)9.8的高pH下的作用(表XV.1)。以低水平(低于0.10M)加入鹽能顯著增加在pH6.3和8.0下的蛋白質(zhì)可提取性，但低鹽濃度濃縮在9.8或11.0的較高pH水平無(wú)助于蛋白質(zhì)提取(表XV.2和XV.3)。
下述表XVI顯示了pH和氯化鈉溶液濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取物的游離酚含量(A330吸光度)的影響
表XVI pH和NaCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取物(用Na2SO3)的A330影
響
如表XVII中所示，隨著將pH升高至pH9.8，A330的值顯示出逐漸降低，盡管蛋白質(zhì)濃度在該范圍內(nèi)還在升高。
當(dāng)pH升高時(shí)，提取物的顏色在視覺(jué)上變的較暗。鹽濃度對(duì)顏色僅有次顯著影響。
下述表XVII.1到XVII.4顯示了pH和NaCl濃度對(duì)滲余物(表XVII.1)和來(lái)自超濾的滲透物(表XVII.2)的A330，以及對(duì)滲余物(表XVII.3)和來(lái)自濾液的滲透物(表XVII.4)的A330的影響。
表XVII.1 pH和NaCl濃度對(duì)來(lái)自超濾(用Na2SO3)的滲余物的
A330的影響
表XVII.2 pHClNaCl濃度對(duì)來(lái)自超濾(用Na2SO3)的滲透物的A330
的影響
表XVII.3 pH和NaCl濃度對(duì)來(lái)自滲濾(用Na2SO3)的滲余物的A330
的影響
表XVII.4 pH和NaCl濃度對(duì)來(lái)自滲濾(用Na2SO3)的滲透物的A330
的影響
由于超濾將提取物中的蛋白質(zhì)濃縮了四次，因此滲余物在視覺(jué)上非常暗，且其A330讀數(shù)高于提取物，pH8.0時(shí)0.0 NaCl的情況除外(表XVII.1)，但后者可能是異常的結(jié)果。與UF前初始提取相似的，最小的A330出現(xiàn)在pH9.8時(shí)，其不能得到上述關(guān)于實(shí)際可見(jiàn)顏色暗度的理由的支持。在A330進(jìn)行檢測(cè)，如滲透物中高A330所示，UF從提取物中回收了大量的酚類(lèi)化合物(參見(jiàn)表XVII.2)。
從表XVII.3中，可以看出滲濾滲余物的A330讀數(shù)遠(yuǎn)低于UF滲余物(表XVII.1)。雖然DF滲透物(表XVII.4)的A330度數(shù)不與UF滲透物的一樣高(表XVII.4)，但盡管如此DF能導(dǎo)致大量殘余酚類(lèi)化合物的更進(jìn)一步的除去。通過(guò)滲濾的該進(jìn)一步的除去酚類(lèi)化合物導(dǎo)致DF滲余物的A330(表XVII.3)遠(yuǎn)低于UF滲余物中的A330(表VII.1)。
下述表XVIII.1～XVIII.4顯示了吸附劑和pH對(duì)滲余物A330的影響
表XVIII.1吸附劑和pH對(duì)來(lái)自滲余物(0.05M NaCl和0.1％
Na2SO3)的A330的影響
表XVIII.2吸附劑和pH對(duì)來(lái)自滲余物(0.10M NaCl和0.1％Na2SO3)
的A330的影響
表XVIII.3吸附劑和pH對(duì)來(lái)自滲余物(0.15M NaCl和0.1％Na2SO3)
的A330的影響
表XVIII.4吸附劑和pH對(duì)來(lái)自滲余物(0.25M NaCl和0.1％Na2SO3)
的A330的影響
如表XVIII.1～XVII.4所示，在低pH(＜9.8)時(shí)，Polyclar(在所有測(cè)試的吸附劑中)降低最終滲余物中A330讀數(shù)特別有效。如表XVIII.1所示，降低的A330值可高達(dá)40％。
雖然其它吸附劑也能在pH和鹽濃度的特定條件下降低A330讀數(shù)，但與Polyclar相比，其效果不甚明顯。但使用pH9.8時(shí)，Polyclar降低A330的有用性較小。
下述表XVIII.5～XVIII.8顯示了吸附劑對(duì)滲余物中蛋白質(zhì)濃度(g/L)的影響
表XVIII.5吸附劑和pH對(duì)來(lái)自滲余物(0.05M NaCl和0.1％
Na2SO3)的蛋白質(zhì)濃度的影響
表XVIII.6吸附劑和pH對(duì)來(lái)自滲余物(0.10M NaCl和0.1％Na2SO3)
的蛋白質(zhì)濃度的影響
表XVIII.7吸附劑和pH對(duì)來(lái)自滲余物(0.15MNaCl和0.1％Na2SO3)
的蛋白質(zhì)濃度的影響
表XVIII.8吸附劑和pH對(duì)來(lái)自滲余物(0.25M NaCl和0.1％Na2SO3)
的蛋白質(zhì)濃度的影響
如表XVIII.5～XVIII.8所示，所有測(cè)試的吸附劑在鹽和pH的所有組合下均對(duì)滲余物中的蛋白質(zhì)濃縮具有相當(dāng)?shù)亩栊裕词雇ㄟ^(guò)超濾將蛋白質(zhì)高度濃縮。
實(shí)施例4
該實(shí)施例描速了使用較低水平亞硫酸鈉和凈化提取的影響。
采用Polycla作為吸附劑以較低水平的亞硫酸鈉(0.05wt％Na2SO3)于pH8.0將實(shí)施例3的步驟重復(fù)實(shí)施3次。檢測(cè)A420以及A330。
在另一組實(shí)驗(yàn)中，在提取前和提取其間也用氦氣對(duì)包含0.05wt％Na2SO3的提取液實(shí)施凈化。
下述表XIX.1顯示了這些改變對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響
表XIX.1 pH8.0的條件下蛋白質(zhì)提取(g/L)
如表XIX.1所示，在全部三個(gè)加入鹽的水平，當(dāng)使用降低量的亞硫酸鈉時(shí)，提取物中蛋白質(zhì)濃度增加了約40wt％。較高的鹽濃度導(dǎo)致較高的蛋白質(zhì)濃度。氮凈化對(duì)蛋白質(zhì)提取無(wú)作用。
表XIX.2顯示了這些改變對(duì)A330顏色的影響
表XIX.2提取物在330nm的吸光度
如表XIX.2所示，Na2SO3的降低未顯著影響提取物的A330。雖然氦凈化除去了99％的溶解氧，但提取物的吸光度在330nm或420nm均未增高(下表XIX.3)
表XIX.3提取物在420nm的吸光度
下述表XX顯示膜處理對(duì)滲余物的A330和A420的影響
表XX-膜處理對(duì)滲余物的A330和A420的影響
*采用氦凈化
如表XX所示，滲濾基本上除去了提取物中的有色成分。最終滲余物的A330和A420讀數(shù)均約為原始提取物的讀數(shù)的一半。氦凈化對(duì)A330或A420值無(wú)影響.
下述表XXI顯示了Polyclar對(duì)滲余物的A330和A420的影響
表XXI Polyclar對(duì)A330和A420的影響
*括號(hào)內(nèi)的數(shù)字是降低百分?jǐn)?shù)
**采用氦凈化
實(shí)施例5
該實(shí)施例例示采用抗氧劑和滲濾從商業(yè)化卡諾拉粗粉中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
在16℃下，將150kg商品化卡諾拉粗粉(高溫焙烤粗粉)加入包含0.5kg(0.05wt％)維生素C的1000L 0.15M NaCl溶液中，攪拌30分鐘以形成蛋白質(zhì)含量為20.2g/L的蛋白質(zhì)水溶液。移出卡諾拉粗粉殘?jiān)⒃谡婵者^(guò)濾帶上清洗。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)離心使之澄清，產(chǎn)生1040L蛋白質(zhì)含量為14.6g/L的澄清蛋白質(zhì)溶液。
利用截止分子量為5000道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)濃縮使蛋白質(zhì)提取液體積減小至45L。然后采用截止分子量為5000道爾頓的膜以包含0.05wt％維生素C的450L 0.15M NaCl溶液對(duì)蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行滲濾使其終體積為44L，蛋白質(zhì)含量為225g/L。
將30℃的濃編和滲濾的溶液以1∶10稀釋到4℃的水中。立即形成白色云狀蛋白質(zhì)微膠粒，并使其沉淀。移去上層的稀釋用水，從容器的底部回收沉淀的、粘稠的、粘性的團(tuán)塊物質(zhì)(PMM)，將其干燥。干燥的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為103.2wt％(N x 6.25)d.b。
利用截止分子量為5000道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)將620L來(lái)自微膠粒形成的上清液的體積減小至30L。然后利用截止分子量為5000道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)用100L水對(duì)濃縮的上清液進(jìn)行滲濾，使其終體積為27L，蛋白質(zhì)含量為121.8g/L。
將濃縮的和滲濾的溶液干燥。干燥的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為100.8wt％(N x 6.25)d.b。
采用Minolta(CR-310)比色儀評(píng)價(jià)源自PMM的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物(CPI)樣品和源自上清液的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物樣品的亮度(L)和色度。在實(shí)驗(yàn)室空間內(nèi)，其值在0～100之間移動(dòng)，100表示白色而0表示黑色。色品坐標(biāo)(a和b)均具有最大值+60和-60，+a為紅色方向，-a為綠色方向，+b為黃色方向而-b為藍(lán)色方向。
下述表XXII顯示了所得結(jié)果
表XXII
與采用本方法但省略了加入維生素C(作為抗氧劑)和滲濾步驟(數(shù)據(jù)未給出)而制備的分離物相比，卡諾拉蛋白質(zhì)分離物表現(xiàn)出較亮(L)和較淺的黃色(b)。
實(shí)施例6
該實(shí)施例例示溫度對(duì)來(lái)自低溫焙烤的粗粉和其它脫溶劑的粗粉的蛋白質(zhì)提取物的顏色的影響。
將75g(a)在低溫100℃焙烤的(LT粗粉)或(b)已經(jīng)在20℃氣體脫溶劑的(Marc粗粉)卡諾拉油料種子粗粉樣品在室溫或室溫(RT)、55℃、60℃和65℃下加入500mL 0.15M NaCl溶液的樣品中，攪拌30分鐘，同時(shí)保持溫度基本上恒定，產(chǎn)生蛋白質(zhì)水溶液。在5、10、15、20和30分鐘取蛋白質(zhì)水溶液的樣品進(jìn)行分析。通過(guò)10,000×g離心5分鐘分離粗粉淤渣并將其凍干。
測(cè)定各種蛋白質(zhì)溶液樣品的A330和A420吸光度。如上所述，A330UV吸光度是溶液中酚類(lèi)化合物濃度的指示物，而A420吸光度是對(duì)試劑顏色更直接的檢測(cè)。下述表XXIII和XXIV中列出了各種樣品的數(shù)據(jù)
表XXIII-低溫粗粉的提取物的吸光度讀數(shù)
表XXIV-Marc粗粉的提取物的吸光度讀數(shù)
如表XXIII和XXIV所示，對(duì)每一測(cè)試的粗粉類(lèi)型來(lái)說(shuō)，提高提取溫度對(duì)提取的蛋白質(zhì)溶液的A330沒(méi)有顯著的影響，但在較高溫度時(shí)出現(xiàn)A420讀數(shù)的輕微增加。
實(shí)施例7
該實(shí)施例顯示了特定參數(shù)對(duì)來(lái)自特定卡諾拉油料種子粗粉蛋白質(zhì)提取物的顏色的影響。
在第一組實(shí)驗(yàn)中，將50g卡諾拉油料種子粗粉樣品，該粗粉已經(jīng)(a)在低溫100℃焙烤(LT粗粉)，或(b)已經(jīng)在20℃氣體脫溶劑(Marc粗粉)在室溫(20℃)下加入500mL 0.05 M或0.10M NaCl溶液的樣品中，攪拌15分鐘。5000×g離心漿體10分鐘以除去過(guò)剩的粗粉淤渣。
在第二組實(shí)驗(yàn)中，首先將未加鹽的500mL水在電熱板攪拌器上加熱至60℃。然后加入50g卡諾拉油料種子粗粉樣品，該粗粉已經(jīng)(a)在低溫100℃焙烤(LT粗粉)或(b)已經(jīng)在20℃氣體脫溶劑(Marc粗粉)，攪拌15分鐘，同時(shí)保持溫度。5000×g離心10分鐘將提取物與粗粉淤渣分離。
測(cè)定各種蛋白質(zhì)溶液A330和A420的吸光度和蛋白質(zhì)濃度。下述表XXV.1和XXV.2列出所得結(jié)果
表XXV.1提取物的吸光度讀數(shù)
如表XXV.1和XXV.2中所得結(jié)果所示，蛋白質(zhì)濃度增加，A330值增加，而顏色亮度(如A420所示)不隨蛋白質(zhì)濃度發(fā)生顯著改變，這與可見(jiàn)觀測(cè)結(jié)果一致。這些結(jié)果顯示，隨著較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)率與比低溫焙烤粗粉相比，預(yù)期氣體脫溶劑的粗粉中得到更亮的產(chǎn)物。
實(shí)施例8
該實(shí)施例顯示了卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的溶劑提取對(duì)產(chǎn)物顏色的影響。
從三個(gè)分離過(guò)程中產(chǎn)生源自PMM的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的混合物，所述源自PMM的分離物為D29-02A C300(57.9wt％)，D24-02AC300(34.7wt％)和D11-02A C300(7.4wt％)(復(fù)合物6)。此外，從三個(gè)分離過(guò)程中產(chǎn)生源自上清液的分離物的混合物，所述源自上清液的分離物為E29-02A C200(18.7wt％)，D29-02A C200(40.1wt％)和E14-02A C200(41.2wt％)(復(fù)合物7)。
制備各卡諾拉蛋白質(zhì)分離物所使用的的具體過(guò)程如下
在室溫下，“a”kg商品化卡諾拉粗粉加入“b”L 0.15M NaCl溶液中，攪拌30分鐘以形成蛋白質(zhì)含量為“c”g/L的蛋白質(zhì)水溶液。移出卡諾拉粗粉殘?jiān)⒃谡婵者^(guò)濾帶上清洗。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)離心使之澄清，產(chǎn)生“d”L的蛋白質(zhì)含量為“e”g/L的澄清蛋白質(zhì)溶液。
利用截止分子量為“h”道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)的濃縮將“f”L等分的蛋白質(zhì)提取液的體積減小至“g”L。產(chǎn)生的濃縮蛋白質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)的含量為“i”“g/L。
溫度為“j”℃的濃縮溶液用4℃的水稀釋“k”倍。白色云狀的蛋白質(zhì)微膠粒會(huì)立即形成，并使其沉淀。移出上層稀釋用水，從容器的底部回收沉淀的、粘稠的、粘性的團(tuán)塊物質(zhì)(PMM)，提取的蛋白質(zhì)產(chǎn)量為“1”wt％。干燥的PMM來(lái)源的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為“m”％(Nx6.25)d.b。將產(chǎn)物命名為“n”。
下述表XXVI中列出了參數(shù)“a”至“m”的值
表XXVI
利用截止分子量為“o”道爾頓的膜，通過(guò)超濾將移取的稀釋用水的體積減小，使其蛋白質(zhì)濃度為“p”g/L。將濃縮液干燥。從上清液中回收更多的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)總回收率為提取的蛋白質(zhì)的“q”wt％。形成的干燥蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為“r”％(Nx6.25)d.b。
將產(chǎn)物命名為“s”。下述表XXVII中列出了參數(shù)“0”至“r”的值
表XXVII
將1.4kg復(fù)合物6分散在3L乙醇的混合物中(變性的85％ 乙醇/15％甲醇，VWR Canlab D和3L反滲透(RO)純水)。采用頂置式攪拌器將混合物攪拌30分鐘。通過(guò)將樣品批量以8000g離心5分鐘而從大量液體中分離出固體物質(zhì)。
然后將片狀沉淀物在另外的3L乙醇和3L RO水中攪拌30分鐘而被再次分散和提取。再次離心(8000g/5min。)，收集固體樣品。然后將片狀沉淀物在4L乙醇中分散以便從樣品中除去水。通過(guò)離心(8000g/5min。)收集固體物質(zhì)然后再次分散在4L新乙醇中。
再次離心(8000g/5min。)，收集固體樣品。打碎片狀沉淀物，在焙烤片上展開(kāi)，置于通風(fēng)櫥中干燥。
使用分散于4.2L乙醇和1.8L反滲透純水的混合物中的1.4kg復(fù)合物7重復(fù)該過(guò)程。將片狀沉淀物分散于4.2L乙醇和1.8L反滲透純水的新的混合物中。
通過(guò)HPLC分析所得蛋白質(zhì)粗粉末和溶劑提取樣品的總蛋白質(zhì)含量。還分析了蛋白質(zhì)粗粉末的含水量。還采用分光光度計(jì)對(duì)溶劑提取樣品進(jìn)行檢測(cè)，以給出其酚含量(330nm吸光度)和可見(jiàn)顏色(420nm吸光度)的指示。Minolta CR-310顏色計(jì)量器評(píng)估干燥的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的顏色。
乙醇/水提取的復(fù)合物6的回收率為86wt％，而復(fù)合物7的回收率為80wt％。產(chǎn)物的損失是由于在提取溶劑中的溶解性，而下述表XXVIII給出溶劑提取物的蛋白質(zhì)含量。
表XXVIII溶劑提取物的蛋白質(zhì)含量
其它損失是由于處理樣品時(shí)的材料丟失。
下述表XXIX中列出了所得的顏色讀數(shù)
表XXIX提取前和提取后復(fù)合物樣品的顏色讀數(shù)
如表XXIX中的數(shù)據(jù)所示，對(duì)復(fù)合物6和復(fù)合物7來(lái)說(shuō)，卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的提取導(dǎo)致亮度(L)增加，“a”值降低和“b”值降低。L值增加意味著產(chǎn)物更白和黑色更少?！癮”值降低對(duì)應(yīng)于顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，而“b”值的降低對(duì)應(yīng)于顏色由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。樣品紅色和黃色的減少指示了酚類(lèi)化合物和/或其反應(yīng)產(chǎn)物的除去。
下述表XXX中通過(guò)了溶劑提取的吸光度讀數(shù)
表XXXI-溶劑提取的吸光度讀數(shù)
如表XXX所示，提取物帶有輕微的顏色，這提示從蛋白質(zhì)分離物中提取出著色物。
表XXHI顯示了溶劑提取的蛋白質(zhì)分離物蛋白質(zhì)含量(Nx6.25.采用Leco FP52D氮測(cè)定儀測(cè)定的氮百分?jǐn)?shù)值)和含水量
表XXXI-溶劑提取的蛋白質(zhì)分離物的特性
如表XXXI所示，溶劑提取的產(chǎn)物的濕度低且具有能使產(chǎn)物被分類(lèi)為分離物的足夠高的蛋白質(zhì)含量。
實(shí)施例9
該實(shí)施例例示抗氧劑和吸附劑在卡諾拉蛋白質(zhì)分離物制備中的使用。
將150kg已經(jīng)過(guò)低溫(100℃)脫溶劑的商品化卡諾拉油料種子粗粉加入1000L 0.15M NaCl溶液中，在21℃室溫下攪拌30分鐘?；旌?5分鐘后，在漿體中加入0.05wt％(500g)維生素C作為抗氧劑。
移出卡諾拉粗粉殘?jiān)⒃谡婵者^(guò)濾帶上清洗。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)離心使之澄清，產(chǎn)生953.5L蛋白質(zhì)含量為23.9g/L的澄清蛋白質(zhì)溶液。該溶液的330nm UV吸光度為61.2。
將21.2kg(2.2wt％)Polyclar Super R加入953.5L的蛋白質(zhì)溶液，使其在室溫下混合1小時(shí)。隨后，通過(guò)將蛋白質(zhì)溶液分別通過(guò)除渣離心機(jī)，和然后的包含20和0.2μM濾片的壓濾器而除去Polyclar。除去Polyclar后，收集842L卡諾拉蛋白質(zhì)溶液，其蛋白質(zhì)含量為19.9g/L，A330吸光度為33.2。因此可獲得A330吸光度的顯著下降，和蛋白質(zhì)非常少的丟失。
然后利用截止分子量為5000道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)將澄清溶液的體積濃縮至30L，其蛋白質(zhì)含量為338.4g/L，A330為20.4。然后采用截止分子量為5000道爾頓的膜以包含0.05wt％維生素C的300L0.15M NaCl溶液對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行滲濾。產(chǎn)生的29.0L濃縮和滲濾的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)含量為299.7g/L，A330為25.6。
與實(shí)施例1-3和5所示的結(jié)果相反，滲濾對(duì)A330的影響很小，這可能是因?yàn)樵跐饪s步驟之前Polyclar已經(jīng)從卡諾拉蛋白質(zhì)溶液中除去了大部分游離酚。
將31℃的濃縮和滲濾的溶液稀釋到15體積6.4℃的水中。立即形成白色云狀蛋白質(zhì)微膠粒，使其沉淀2小時(shí)。移去上層的稀釋用水，從容器的底部回收沉淀的、粘稠的、粘性的團(tuán)塊物質(zhì)(PMM)(40.6kg)，將其噴霧干燥。干燥的蛋白質(zhì)分離物的蛋白質(zhì)含量為98.8wt％(N x 6.25)d.b。
利用截止分子量為5000道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)濃縮將440L來(lái)自微膠粒形成的、蛋白質(zhì)含量為13.3g/L上清液的體積減小至30L。然后利用截止分子量為5000道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)用5體積的水對(duì)濃縮的上清液進(jìn)行滲濾。所得溶液的蛋白質(zhì)含量為161.0g/L，A330為10.8。
將濃縮的和滲濾的溶液干燥，干燥的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為95.6wt％(N x 6.25)d.b。
采用Mimolta R-310比色儀分析源自PMM的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物(CPI)樣品和源自上清液的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物樣品的亮度(L)和色度(a和b)下述表XLI顯示了所得結(jié)果
下述表XXXII顯示了所得結(jié)果
表XXXII
實(shí)施例10
該實(shí)施例例示抗氧劑和吸附劑在提取步驟中的應(yīng)用。
Bench scale實(shí)驗(yàn)，其中將已在100℃下脫溶劑的商業(yè)化卡諾拉油料種子粗粉的樣品用0.15M NaCl以15wt％的濃度提取30分鐘。在以多種水平(即0.5wt％、1.0wt％、1.5wt％、2.0wt％、2.5wt％、3.0wt％、4.0wt％和5.0wt％)加入和不加入Polyclar Super R以及加入和不加入0.5wt％維生素C的情況下實(shí)施提取。提取后，離心溶液，然后分析酚類(lèi)化合物含量(A330吸光度)，可見(jiàn)顏色(A420吸光度)和蛋白質(zhì)含量。
存在和不存在維生素C的情況下所獲得的結(jié)果分別示于表XXXIII和XXXIV中
表XXXIII
表XXXIV
如表XXXIII和XXXTV所列結(jié)果所示，存在Polyclar時(shí)，在存在和不存在維生素C的情況下均可獲得A330和A420二者的降低。當(dāng)在提取中不加入維生素C時(shí)，2.5％w/v濃度的Polyclar能實(shí)現(xiàn)在對(duì)照中檢測(cè)到A330降低25％而A420降低11％。較高水平的Polyclar能進(jìn)一步降低A330和A420值。提取期間存在維生素C，則當(dāng)使用2.5％w/v Polyclar時(shí)可檢測(cè)到A330降低12％而A420降低34％。存在或不存在Polyclar對(duì)溶液的蛋白質(zhì)含量沒(méi)有影響。
實(shí)施例11
該實(shí)施例例示乙醇沖洗卡諾拉油料種子粗粉對(duì)顏色的影響。
將10g脫殼卡諾拉油料種子粗粉的樣品與100mL乙醇混合，使其在45℃，40℃和室溫(用循環(huán)式水浴和加套管調(diào)節(jié))下混合30分鐘。
混合30分鐘后，將粗粉/溶劑漿體經(jīng)過(guò)濾器傾倒以分開(kāi)粗粉和提取物。重復(fù)該步驟直至不能再除去顏色或直至A330和A420吸光度讀數(shù)開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期。將來(lái)自每一溶劑沖洗/提取步驟的粗粉干燥，然后在室溫下用0.15M NaCl蛋白質(zhì)提取30分鐘。
對(duì)每一提取樣品檢測(cè)提取液的UV吸光度。表XXXV，XXXVI和XXXVII顯示了分別室溫，40℃和45℃下完成的提取的A330和A420值
表XXXV
表XXXVI
表XXXVII
如該數(shù)據(jù)所示，較低溫度下的溶劑不能除去與在40℃～45℃之間的溫度一樣度的顏色和酚類(lèi)化合物，室溫提取僅在6次提取后就停止了除去著色物，而較高溫度下每一提取均能除去著色物直至第10次提取。
測(cè)定蛋白質(zhì)提取液的蛋白質(zhì)含量和330nm和420nm的吸光度，結(jié)果示于下述表XXXVIII中
表XXXVIII
如該表所示，通過(guò)用乙醇在40℃的預(yù)提取避免了蛋白質(zhì)丟失同時(shí)除去了大約40％的酚類(lèi)化合物和30％的A420吸收物質(zhì)。
實(shí)施例12
該實(shí)施例例示采用乙醇粗粉提取來(lái)制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
對(duì)11個(gè)600g等分的脫殼油料種子粗粉以粗粉和乙醇w/v比例為1∶5實(shí)施四次3L乙醇提取。提取在35℃下經(jīng)30分鐘完成。
混合30分鐘后，使?jié){體沉淀，傾出上清液。對(duì)每一提取測(cè)定A330和A420的UV吸光度，檢測(cè)對(duì)被提取粗粉的第一等分的第一次提取的蛋白質(zhì)含量。
在第四次提取后，將粗粉在通風(fēng)櫥中于淺盤(pán)中展開(kāi)，使其干燥過(guò)夜。在5.4kg干燥的經(jīng)提取的粗粉用于50L批量提取之前，將整批經(jīng)沖洗的粗粉在通風(fēng)櫥中經(jīng)過(guò)超過(guò)一夜的時(shí)間進(jìn)行脫溶劑。
隨著對(duì)樣品的每次提取，上清液的顏色發(fā)生漸進(jìn)性變淺，而A330和A420降低。平均起來(lái)，可以發(fā)現(xiàn)A330降低了5倍而A420降低了6倍。下述表XXXIX和XL分別顯示了不同提取的A420和A330的吸光度值
表XXXIXA420吸光度
表XLA330吸光度
將5kg經(jīng)乙醇提取的粗粉加入50L 0.15M NaCl溶液中，在20℃室溫下攪拌30分鐘，15分鐘后加入0.05wt％維生素C作為抗氧劑。
移出卡諾拉粗粉殘?jiān)⒃谡婵者^(guò)濾帶上清洗。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)20μm袋濾器過(guò)濾，然后6500rpm離心5分鐘使之澄清，產(chǎn)生39.6L蛋白質(zhì)含量為23.7g/L的澄清蛋白質(zhì)溶液。
然后利用截止分子量為10,000道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)將37.55L澄清蛋白質(zhì)溶液的體積濃縮至3L。然后采用截止分子量為10,000道爾頓的膜以包含0.05wt％維生素C的24L(＝8滲余物體積)0.15M NaCl溶液對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行滲濾。產(chǎn)生的3L濃縮和滲濾的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)含量為184g/L。
將30℃的濃縮和滲濾的溶液稀釋到30體積4℃的水中。立即形成白色云狀蛋白質(zhì)微膠粒，使其沉淀。移去上清液，從容器的底部回收沉淀的、粘稠的、粘性的團(tuán)塊物質(zhì)(PMM)(5.78kg)，將其噴霧干燥。干燥的蛋白質(zhì)分離物的蛋白質(zhì)含量為101.2wt％(N x 6.25)d.b。
利用截止分子量為10,000道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)濃縮將26L來(lái)自微膠粒形成的上清液的體積減小至3L。然后利用截止分子量為10,000道爾頓的膜，通過(guò)超濾系統(tǒng)用6L的水對(duì)濃縮的上清液進(jìn)行滲濾。
將濃縮的和滲濾的溶液干燥，干燥的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為101.3wt％(N x 6.25)d.b。
采用Minolta R-310比色儀分析源自PMM的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物(CPI)樣品和源自上清液的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物樣品的亮度(L)和色度(a和b)下述表XLI顯示了所得結(jié)果
表XLI
這些產(chǎn)物的“a”和“b”值非常小，這提示紅色和黃色水平相對(duì)較低。
總結(jié)
綜上所述，本發(fā)明提供了通過(guò)在通過(guò)在分離制備期間實(shí)施目的在于除去能引起著色的組分，抑制能引起著色的組分的氧化和除去著色物的一個(gè)或多個(gè)步驟來(lái)回收顏色淡化的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。在本發(fā)明的范圍之內(nèi)可以進(jìn)行修改。
權(quán)利要求
1.一種制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，其中
處理卡諾拉種子，產(chǎn)生卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉，
提取卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉，產(chǎn)生蛋白質(zhì)水溶液，
濃縮蛋白質(zhì)水溶液，和
從濃縮的蛋白質(zhì)水溶液中回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物，其改進(jìn)在于在所述方法中實(shí)施至少一個(gè)最終得到顏色淡化的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的加工步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)加工步驟包括加工所述種子。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述種子的加工包括所述種子中黑芥子酶的失活。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)加工步驟包括提取步驟。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述提取步驟采用下述的至少一種提取，即抗氧劑存在下的卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉的提取，低溫脫溶劑的粗粉的提取，氣體脫溶劑的粗粉的提取，以及用至少一種著色成分吸收劑處理卡諾拉蛋白溶液來(lái)實(shí)施。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)加工步驟包括濃縮步驟。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在濃縮步驟之后是濃縮的蛋白質(zhì)水溶液的滲濾。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)加工步驟包括碾碎。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述卡諾拉蛋白質(zhì)粗粉經(jīng)溶劑提取。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)加工步驟包括回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述卡諾拉蛋白質(zhì)分離物經(jīng)溶劑提取。
12.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)將濃縮的含水溶液加至冷水中形成蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，再?gòu)纳锨逡褐蟹蛛x蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，來(lái)從濃縮的蛋白質(zhì)水溶液中回收所述卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)濃縮上清液，對(duì)濃縮的上清液實(shí)施滲濾，再?gòu)慕?jīng)滲濾的上清液中回收卡諾拉蛋白質(zhì)分離物，由此加工所述上清液以從中回收另外的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
14.一種從卡諾拉油料種子粗粉中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，該方法包括
(a)通過(guò)使用含抗氧劑的鹽水溶液提取卡諾拉油料種子粗粉，使卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，形成pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，
(b)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，
(c)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，由此提供濃縮的蛋白質(zhì)溶液，
(d)將經(jīng)濃縮的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，
(e)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和
(f)從上清中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N×6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗氧劑是亞硫酸鈉或維生素C。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗氧劑存在于所述鹽水溶液中，抗氧劑的量為約0.01～約1wt％。
17.權(quán)利要求14的方法，其中卡諾拉油料種子粗粉是已經(jīng)在低于約50℃的溫度下經(jīng)過(guò)氣體脫溶劑除去殘余的油提取劑的卡諾拉油料種子粗粉。
18.權(quán)利要求14的方法，其中卡諾拉油料種子是已經(jīng)在低于約100℃的升高溫度下經(jīng)過(guò)脫溶劑除去殘余的油提取劑的卡諾拉油料種子粗粉。
19.一種由卡諾拉油料種子粗粉制備卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的方法，包括
(a)用醇洗滌所述卡諾拉油料種子粗粉，
(b)提取經(jīng)洗滌的卡諾拉油料種子粗粉，使經(jīng)洗滌的卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，產(chǎn)生pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，
(c)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，
(d)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中的蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，以提供濃縮的蛋白質(zhì)溶溶液，
(e)將經(jīng)濃縮的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，
(f)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和
(g)從上清中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N×6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述的醇是乙醇。
21.權(quán)利要求19的方法，其中的洗滌步驟是通過(guò)下述方式實(shí)施的，即將卡諾拉油料種子粗粉以約1∶3～約1∶10w/v比例分散在溶劑中，在約15℃～約45℃的溫度下將所得漿體混合約5～約60分鐘，然后從漿體中分離洗滌的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述漿液在約30～約75℃的溫度下攪拌約15～約30分鐘。
23.權(quán)利要求19的方法，其中實(shí)施多次所述洗滌直至無(wú)法再回收道酚類(lèi)和/或無(wú)形著色劑。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述卡諾拉油料種子粗粉是已經(jīng)在低于約50℃的溫度下經(jīng)過(guò)氣體脫溶劑除去殘余的油提取劑的卡諾拉油料種子粗粉。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述卡諾拉油料種子粗粉是已經(jīng)在低于約100℃的升高溫度下經(jīng)過(guò)脫溶劑除去殘余的油提取劑的卡諾拉油料種子粗粉。
26.一種從卡諾拉油料種子粗粉中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，包括
(a)提取卡諾拉油料種子粗粉，使卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，形成pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，
(b)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，
(c)通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)水溶液實(shí)施超濾提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，提供濃縮的蛋白質(zhì)溶液，
(d)對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)溶液實(shí)施滲濾，
(e)將經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，
(f)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和
(g)從上清中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N×6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
27.權(quán)利要求26的方法，其中使用約2～約20體積的滲濾液實(shí)施所述滲濾。
28.權(quán)利要求28的方法，其中使用約5～約10體積的滲濾液實(shí)施所述滲濾。
29.權(quán)利要求27的方法，其中使用pH為約5～約6.8的鹽水溶液實(shí)施所述提取步驟，所述滲濾液是具有與所述提取步驟中所用溶液相同濃度和pH的鹽水溶液。
30.權(quán)利要求27的方法，其中通過(guò)使用截留分子量為約3000～約50,000道爾頓的膜實(shí)施所述滲濾。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述膜的截留分子量為約5000～約10,000道爾頓。
32.權(quán)利要求27的方法，其中在至少部分所述滲濾步驟中，所述滲濾液包含抗氧劑。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗氧劑是亞硫酸鈉或維生素C。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述抗氧劑的使用量為約0.01～約1wt％。
35.權(quán)利要求26的方法，其中使用pH為約5～約6.8且包含抗氧劑的鹽水溶液實(shí)施所述提取步驟。
36.權(quán)利要求26的方法，其中用醇洗滌所述卡諾拉油料種子粗粉。
37.權(quán)利要求26的方法，其中干燥所述蛋白質(zhì)微膠粒，用醇水溶液提取干燥的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
38.權(quán)利要求36的方法，其中通過(guò)超濾上清液對(duì)上清液進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生濃縮的上清液，并對(duì)經(jīng)濃縮的上清液實(shí)施滲濾。
39.權(quán)利要求38的方法，其中使用約2～約20體積的滲濾液實(shí)施所述滲濾。
40.權(quán)利要求39的方法，其中使用約5～約10體積的水實(shí)施所述滲濾。
41.權(quán)利要求39的方法，其中通過(guò)使用截留分子量為約3000～約50,000道爾頓的膜實(shí)施所述滲濾。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述膜的分子量為約5000～約10,000道爾頓。
43.權(quán)利要求39的方法，其中在至少部分所述滲濾步驟中，所述滲濾液包含抗氧劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗氧劑是亞硫酸鈉或維生素C。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述抗氧劑的使用量為約0.01～約1wt％。
46.權(quán)利要求26的方法，其中在所述稀釋步驟前將所述經(jīng)滲濾蛋白質(zhì)溶液與吸色劑接觸。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述吸色劑是聚乙烯吡咯酮。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述聚乙烯吡咯酮的使用量為約0.5～約6wt％。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述聚乙烯吡咯酮的使用量為約2～約3wt％。
50.權(quán)利要求26的方法，其中卡諾拉油料種子粗粉的制備通過(guò)滅活卡諾拉油料種子中的黑芥子酶和從經(jīng)處理的油料種子中回收卡諾拉油以形成卡諾拉油料種子粗粉。
51.權(quán)利要求40的方法，其中將卡諾拉油料種子粗粉在低于約50℃的溫度下經(jīng)過(guò)氣體脫溶劑除去殘余的油提取劑。
52.權(quán)利要求50的方法，其中將卡諾拉油料種子在低于約100℃的升高溫度下經(jīng)過(guò)脫溶劑除去殘余的油提取劑。
53.權(quán)利要求26的方法，其中在所述稀釋步驟前，對(duì)所述經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)溶液實(shí)施巴氏消毒步驟。
54.權(quán)利要求53的方法，其中通過(guò)在約55℃～約70℃的溫度加熱經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)溶液約10～約15分鐘實(shí)施所述巴氏消毒步驟。
55.一種從卡諾拉油料種子粗粉中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，包括
(a)提取卡諾拉油料種子粗粉，使卡諾拉油料種于粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，產(chǎn)生pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，
(b)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，
(c)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，形成濃縮的蛋白質(zhì)溶液，
(d)將所述濃縮的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，
(e)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，
(f)將蛋白質(zhì)微膠粒和上清液分離，
(g)干燥蛋白質(zhì)微膠粒，得到以干重(N×6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％的諾拉蛋白質(zhì)分離物，和
(h)用醇水溶液提取所述卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述醇水溶液是乙醇水溶液，其中乙醇∶水體積比為約2∶1～約1∶2。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述提取步驟是通過(guò)下述方式進(jìn)行的，即將量為約5～約25wt％的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物分散在醇水溶液中，將所得漿體混合約30～約60分鐘，然后從漿體中分離提取的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
58.權(quán)利要求55的方法，其中重復(fù)所述提取步驟直至從卡諾拉蛋白質(zhì)分離物中無(wú)法再除去酚類(lèi)和/或無(wú)形著色劑。
59.一種從卡諾拉油料種子粗粉中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，包括
(a)提取卡諾拉油料種子粗粉，使卡諾拉油料種子粗粉中的蛋白質(zhì)溶解，產(chǎn)生pH為約5～約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，
(b)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，
(c)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，形成濃縮的蛋白質(zhì)溶液，
(d)對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)溶液實(shí)施巴氏消毒，形成巴氏消毒的蛋白質(zhì)溶液，
(e)將巴氏消毒的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，
(f)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和
(g)從上清液中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N×6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
60.權(quán)利要求59的方法，其中通過(guò)在約55℃～約70℃的溫度加熱濃縮的蛋白質(zhì)溶液約10～約15分鐘實(shí)施所述巴氏消毒。
61.權(quán)利要求60的方法，其中在約60℃～約65℃的溫度加熱所述濃縮的蛋白質(zhì)溶液約10分鐘。
62.一種從卡諾拉油料種子中制備卡諾拉蛋白質(zhì)分離物的方法，包括
(a)加工卡諾拉油料種子，滅活油料種子所包含的黑芥子酶以制備經(jīng)加工的油料種子，
(b)加工所述油料種子，從中除去卡諾拉油以制備卡諾拉油料種子粗粉，
(c)提取卡諾拉油料種子，使卡諾拉油料種子中的蛋白質(zhì)溶解，形成pH為約5～約6.8的水溶液，
(d)將蛋白質(zhì)水溶液和殘余的油料種子粗粉分離，
(e)利用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)保持離子強(qiáng)度基本恒定，提供經(jīng)濃縮的蛋白質(zhì)溶液，
(f)將濃縮的蛋白質(zhì)溶液在溫度低于約15℃的冷水中稀釋?zhuān)谒嘀行纬呻x散的蛋白質(zhì)微膠粒，
(g)使蛋白質(zhì)微膠粒沉淀形成無(wú)定形的、粘性的、凝膠狀、面筋樣蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，和
(h)從上清液中回收蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)，以干重(N×6.25)計(jì)，蛋白質(zhì)微膠粒團(tuán)的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％。
63.權(quán)利要求62的方法，其中在所述提取步驟之前將卡諾拉油料種子粗粉在低于約50℃的溫度下經(jīng)過(guò)氣體脫溶劑除去殘余的油提取劑。
64.權(quán)利要求62的方法，其中在所述提取步驟之前將卡諾拉油料種子在低于約100℃的升高溫度下經(jīng)過(guò)脫溶劑除去殘余的油提取劑。
全文摘要
在從卡諾拉油料種子回收蛋白質(zhì)分離物過(guò)程中，實(shí)施抑制著色化合物，降低易于形成著色成分的物質(zhì)的存在的步驟，獲得較亮和較淺黃色的卡諾拉蛋白質(zhì)分離物。
文檔編號(hào)A23J1/14GK1688205SQ0381986
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
發(fā)明者B·E·格林, L·徐, R·米拉諾瓦, K·I·塞加爾 申請(qǐng)人:伯康營(yíng)養(yǎng)科學(xué)(Mb)公司