專利名稱：改進(jìn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及植物遺傳工程。更具體的，本發(fā)明涉及使植物或其它生物具有耐鹽性的核酸和方法。
背景技術(shù)：
由于鹽濃度造成的環(huán)境應(yīng)力是限制對土壤中高鹽濃度特別敏感的農(nóng)作物產(chǎn)量的最重要因素之一。世界上大量陸地面積都受到對植物生長有害的鹽水平的影響。估計27900萬平方公頃的灌溉土地中有35-45％目前受到鹽濃度的影響。這已將劃分為旱地和沙漠地的區(qū)域排除在外(這些土地占地球總陸地面積的25％)。鹽濃度曾經(jīng)是人類歷史和農(nóng)業(yè)系統(tǒng)壽命中的重要因素。進(jìn)入耕種土壤中的鹽具有不穩(wěn)定性且經(jīng)常破壞遠(yuǎn)古和近代耕種社會。遠(yuǎn)古世界中作為權(quán)利的蘇美爾文明的消逝是由于鹽聚集在幼發(fā)拉底河和底格里斯河流域。由于鹽的聚集和落后的灌溉方式，大面積的印度次大陸已經(jīng)變成了不毛之地。本世紀(jì)中，包括澳洲、歐洲、美國西南部、加拿大草原的廣闊區(qū)域和其它區(qū)域的農(nóng)作物產(chǎn)量也有相當(dāng)大的降低。
盡管可采用工業(yè)技術(shù)來抵御這一問題，如通過排水和供應(yīng)高品質(zhì)的水，但這些措施都非常昂貴。在大多數(shù)情況下，由于對大規(guī)模農(nóng)業(yè)的需求增加，提高灌溉效率或安裝排水系統(tǒng)都不可行。此外，在世界上的干燥和半干燥地區(qū)，水蒸發(fā)超過了降水。這些土壤固有的鹽分高，因此需要大量灌溉才能用于生產(chǎn)。由于灌溉水含有溶解的鹽分和礦物質(zhì)，用水的同時也用鹽，這也構(gòu)成了鹽濃度的問題。
越來越強(qiáng)調(diào)的是對植物進(jìn)行修飾以適應(yīng)鹽濃度造成的限制生長的條件。如果可對重要的經(jīng)濟(jì)作物進(jìn)行操作賦予耐鹽性，則這種土地又可以耕種，從而增加種子的銷售并提高有用農(nóng)作物的產(chǎn)量。長期以來人們已嘗試耐鹽性作物的常規(guī)培育。這些培育方法主要基于以下策略a)在作物和它們更耐鹽的野生親屬之間進(jìn)行廣泛的雜交(Rush和Epstein，J.Amer.Hort.Sci.，106699-704(1981))，b)篩選并選擇特定表型的變體(Norlyn，見Genetic Engineering of Osmoregulation第293-309頁(1980))，c)通過輪回選擇設(shè)計新的表型(Tal，Plant & Soil，89199-226(1985))。未能成功地產(chǎn)生耐受變體(得到很少變體且其耐鹽性有限)(Flowers和Yeo，Aust.J，Plant.Physiol.，22875-884(1995))說明常規(guī)的培育方法是不夠的，為了培育種方法獲得成功應(yīng)該包括設(shè)計轉(zhuǎn)基因作物(Bonhert和Jensen，Aust.J，Plant.Physiol.，23661-667(1996))。
已在不同植物中表征了一些與應(yīng)力耐受性有關(guān)的生化途徑，一些參與這些過程的基因已被鑒定，且在有些情況下，在轉(zhuǎn)基因/過表達(dá)試驗中已經(jīng)研究了蛋白質(zhì)可能的作用。曾經(jīng)提到一些相容的溶質(zhì)在應(yīng)力下的滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。這些相容的溶質(zhì)，包括碳水化合物(Tarcynshi等，Science，259508-510(1995))，氨基酸(Kishor等，Plant Physiol.，1081387-1394(1995))和季氮化合物(Ishtani等，Plant Mol.Biol.，27307-317(1995))已顯示可增加應(yīng)力下的滲透調(diào)節(jié)。同時，通常在種子成熟階段表達(dá)的蛋白質(zhì)(LEA，胚胎起源晚期高豐度蛋白(Late Embriogenesis Abundantproteins))已顯示在水分滯留和在應(yīng)力過程中保護(hù)其它蛋白質(zhì)中發(fā)揮作用。LEA在稻米中過表達(dá)在水應(yīng)力器件對植物提供緩和的益處(Xu等，Plant Physiol，110249-257(1996)，以及Wu和Ho，WO 97/13843)。
已知編碼Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)的一個基因(sod2)可使裂殖酵母具有鈉耐受性(Jia等，EMBO J.，111631-1640(1992)以及Young和Zheng，WO 91/06651)，盡管這種質(zhì)膜結(jié)合蛋白的作用似乎僅限于酵母。使用這種基因來轉(zhuǎn)化植物的一個主要缺點(diǎn)與異源基因表達(dá)中碰到的典型問題有關(guān)，即基因產(chǎn)物錯誤折疊，使蛋白質(zhì)靶向靶膜以及蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)。
具有液泡反向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已在紅甜菜的貯藏組織和多種鹽生植物和耐鹽的產(chǎn)糖(glycophtic)植物種類中被鑒定(Barkla和Pantoja，Ann.Rev.Plant.Physiol.47159(1996)，以及Blumwald和Gelli，Adv.Bot.Res.25401(1997))。近來，稱為AtNHX1的來自擬南芥(Arabadopsis thaliana)的編碼液泡Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因已被分離(Blumwald等，WO 99/47679)。該基因在擬南芥、番茄和蕓苔中的過表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性(Apse等，Science，2851256-1258(1999)，Zhang和Blumwald，Nat.Biotechnol.，19765-768(2001)，和Zhang等，PNAS USA，9812832-12836(2001))。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了通過引入編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的多核苷酸來增強(qiáng)植物耐鹽性的方法，該多核苷酸的表達(dá)可增強(qiáng)植物的耐鹽性。這些多核苷酸中的每一個都具有與SEQ ID NO有至少80％同一性的氨基酸序列，且少于530個氨基酸。
在本發(fā)明的一些方面，所述方法包括引入具有由SEQ ID NO5、7、9、11、13或15構(gòu)成的序列的多核苷酸以使植物具有耐鹽性。
在本發(fā)明的一些方面，所述方法包括引入編碼多肽的多核苷酸以使植物具有耐鹽性，所述多肽具有由SEQ ID NO6、8、10、12或14構(gòu)成的序列。
在本發(fā)明的一些方面，所述方法包括引入長度小于500、或小于475個氨基酸的多肽的編碼多核苷酸以使植物具有耐鹽性。
在另一個實施方案中，所述增強(qiáng)植物耐鹽性的方法包括在植物中引入編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的多核苷酸，它具有與SEQ ID NO有至少80％同一性的氨基酸序列，其中，與SEQ ID NO2中第508位的絲氨酸相對應(yīng)的殘基被Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的賦予增強(qiáng)的耐鹽性的氨基酸替代。
在一些實施方案中，一個中性或極性氨基酸替代了SEQ ID NO2中第508位的絲氨酸。
在一些實施方案中，與SEQ ID NO2中第508位的絲氨酸相對應(yīng)的中性或極性氨基酸是蘇氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
在一些實施方案中，賦予耐鹽性的編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的純化的多核苷酸序列是SEQ ID NOS3。
在一些實施方案中，所述由純化的多核苷酸編碼的Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽序列是SEQID NO4。
本發(fā)明還提供了包含編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)其表達(dá)時可賦予植物增強(qiáng)的耐鹽性；且其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽包含與SEQ ID NO有至少80％同一性的氨基酸序列且小于530個氨基酸。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物包括使植物具有增強(qiáng)的耐鹽性的Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽，它具有與SEQ ID NO有至少80％同一性的氨基酸序列，且與SEQID NO2中的第508位的絲氨酸相對應(yīng)的殘基被賦予增強(qiáng)的耐鹽性的氨基酸所替代。在本發(fā)明的一些方面，所述替換氨基酸是極性或中性氨基酸，如半胱氨酸。
定義術(shù)語″植物″包括整個植株、芽營養(yǎng)器官和/或結(jié)構(gòu)(例如葉、莖和塊莖)、根、花和花的器官(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花藥)、胚珠(包括卵細(xì)胞和中央細(xì)胞)、種子(包括合子、胚、胚乳和種皮)、果實(例如成熟的子房)、幼苗、植物組織(例如維管組織、基本組織等)、細(xì)胞(例如保衛(wèi)細(xì)胞、卵細(xì)胞、毛狀體等)，以及它們的后代?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物的種類通常包括可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等和低等植物，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物和多細(xì)胞藻類。它包括各種倍性水平的植物，包括非整倍體、多倍體、二倍體、單倍體和半合子。
術(shù)語″核酸序列″是指從5’到3’末端閱讀的脫氧核糖核酸和核糖核酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。它包括染色體DNA、自復(fù)制質(zhì)粒、DNA或RNA的傳染性聚合物以及起主要結(jié)構(gòu)作用的DNA或RNA。
術(shù)語″異源序列″是指來自外源物種的序列，或者，如果來自相同物種則是來自其原始形式的修飾。例如，操作性連接于異源編碼序列的啟動子是指來自與該啟動子不同來源的種類的編碼序列，或如果來自相同種類，則是與該啟動子非天然相關(guān)的編碼序列(例如，遺傳工程構(gòu)建的編碼序列或來自不同生態(tài)型或變體的等位基因)。
個體植物的“外源”多核苷酸是指通過有性雜交以外的任何方法被引入植物的多核苷酸?？蓪崿F(xiàn)此目的的方法的例子如下所述，且包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、生物射彈法、電穿孔等。含有外源核酸的植物在這里被稱為T1(例如，在擬南芥植物(Arabidopsis)中通過真空滲入)或RO(指由體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的植物)代轉(zhuǎn)基因植物。有性雜交或自交所得的轉(zhuǎn)基因植物是這種植物的后代。
本發(fā)明所述的″NHX1核酸″或″NHX1多核苷酸序列″是亞序列或全長的多核苷酸，它編碼NHX1多肽及其補(bǔ)體，例如SEQ ID NOS1，3，5、7、9、11、13或15。來自擬南芥(Arabadopsis)的NH1基因的一個例子是AtNHX1。本發(fā)明的NHX1基因產(chǎn)物(例如mRNA或多肽)的特征在于能夠提供增強(qiáng)的耐鹽性。本發(fā)明的NHX1多核苷酸通常包括至少約250個核苷酸的編碼序列，其長度約為2000個核苷酸。通常，本發(fā)明的NHX1核酸含有約400-1600個核苷酸。
當(dāng)提到轉(zhuǎn)基因時，精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知道，插入的多核苷酸序列不需要與得到其的基因序列相同或“基本相同”。如下面的實施例所述，該術(shù)語還特別地包括這些變體。
當(dāng)插入的多核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄和翻譯以產(chǎn)生功能性NHX1多肽時，精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識到，由于密碼子簡并性，許多多核苷酸序列將編碼相同的多肽。這些變體特別地包括在術(shù)語″NHX1多核苷酸序列″或″NHX1多核苷酸序列″之內(nèi)。此外，這些術(shù)語還特別地包括那些與NHX1基因序列和保留被編碼的蛋白質(zhì)的功能的編碼蛋白基本相同(用以下方法鑒定)的全長序列。因此，當(dāng)提到擬南芥(Arabadopsis)AtNHX1基因時，上述術(shù)語包括與這里所述序列基本相同的變體多核苷酸序列以及能夠賦予包含該序列的轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性的編碼蛋白。
當(dāng)如下所述對最大一致性(maximum correspondence)進(jìn)行比對時，如果兩個序列中的核苷酸序列或氨基酸殘基分別相同，則兩個多核苷酸或多肽被稱為“相同”。術(shù)語“與……互補(bǔ)”在這里是指互補(bǔ)序列與參考多核苷酸序列的全部或部分相同。
兩個(或多個)多核苷酸或多肽之間的序列比較通常通過比較兩個序列在一個區(qū)段上的序列來進(jìn)行，或通過“比較窗口”來識別并比較序列相似性的局部區(qū)域。用區(qū)段是為了比較至少約20個，通常約50-200個，更通常是約100-150個毗鄰位置，其中，可在兩個序列最佳比對后將一個序列與相同數(shù)量的毗鄰位置的參考序列進(jìn)行比較。
序列的最佳比對可通過以下方法進(jìn)行Smith和Waterman的局部同源算法，Adv.Appl.Math.2482(1981)；Needleman和Wunsch的同源比對算法，J.Mol.Biol.48443(1970)；Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444(1988)；這些算法的計算機(jī)化實現(xiàn)(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wis.)；或檢查?！逍蛄型恍园俜直取迨峭ㄟ^在一個比較窗口上比較兩個最佳比對序列來確定的，其中，比較窗口中的多核苷酸序列部分與參考序列(不包括添加或缺失)相比可包括添加或缺失(即缺口)用于兩個序列的最佳比對。為計算這一比例需要確定在兩個序列中都出現(xiàn)的相同的核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)以得到匹配位置的數(shù)目，將此匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的總位置數(shù)并將結(jié)果乘以100以得到序列同一性的百分比。
術(shù)語多核苷酸序列″基本相同″是指，采用上述程序(優(yōu)選BESTFIT)，采用標(biāo)準(zhǔn)常數(shù)，一個多核苷酸包含與參考序列有至少60％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％序列同一性的序列。精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道，可對這些數(shù)值進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以確定由這兩個核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性，這需要考慮密碼子簡并性、氨基酸類似性、閱讀框定位等。出于這些目的，氨基酸序列基本類似通常是指序列同一性至少為40％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％?！盎绢愃啤钡亩嚯墓灿猩鲜鲂蛄?，但不相同的殘基位置可通過保守性氨基酸變化而不同。保守性氨基酸取代是指具有類似側(cè)鏈的殘基的互換。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含有酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守性氨基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
另一種跡象表面核苷酸序列基本相同，如果兩個分子在嚴(yán)格條件下相互雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴的，且將在不同環(huán)境中不同。通常，嚴(yán)格條件是在確定的離子強(qiáng)度和pH下比特定序列熱解鏈溫度(Tm)低約5℃-約20℃。Tm是(在確定的離子強(qiáng)度和pH下)有50％的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。通常，嚴(yán)格條件是鹽濃度約為0.02摩爾，pH為7，溫度至少約60℃。然而，如果它們編碼的多肽基本相同，則核酸在嚴(yán)格條件下不相互雜交仍是基本相同的。例如，當(dāng)用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并產(chǎn)生核酸的拷貝時便會發(fā)生這種情況。
特定NHX1基因(例如這里所述的擬南芥(Arabadopsis)AtNHX1基因)的同系物是第二基因(在相同種類或不同種類中)，它具有至少50個毗鄰核苷酸的多核苷酸序列，它與第一基因的序列基本相同(用上述方法確定)。通常認(rèn)為同系物具有相同的進(jìn)化途徑。
附圖簡述
圖1顯示，酵母轉(zhuǎn)化測定結(jié)果證實，修飾的AtNHX1增強(qiáng)了耐鹽性。
圖2顯示，酵母轉(zhuǎn)化測定結(jié)果顯示，AtNHX1 C-末端缺失控制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Na+/K+選擇性。
圖3顯示，酵母轉(zhuǎn)化測定結(jié)果證實，修飾的AtNHX1增加Li+耐性。
圖4顯示，酵母轉(zhuǎn)化測定結(jié)果證實，修飾的AtNHX1增加對滲透應(yīng)力的耐性。
圖5顯示了用來表征AtNHX1 N-末端和跨膜結(jié)構(gòu)域活性的酵母轉(zhuǎn)化測定的結(jié)果。
圖6顯示了賦予耐鹽性的AtNHX1的定點(diǎn)誘變和截短的位置。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新的經(jīng)過修飾的分離的核酸分子，它編碼轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子通過細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)，例如從細(xì)胞胞質(zhì)溶膠到液泡，以提供具有耐鹽性的細(xì)胞。
NHX1基因編碼膜結(jié)合Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白利用質(zhì)子電化學(xué)梯度引導(dǎo)Na+通過膜，所述梯度是由例如液泡H+-腺苷三磷酸酶(ATP酶)和H+-無機(jī)焦磷酸酶(PPi酶)產(chǎn)生的。在本發(fā)明中創(chuàng)建了具有增加的轉(zhuǎn)運(yùn)活性的突變和截短形式的NHX1。與完整的蛋白質(zhì)相比，這種修飾的基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))能使鈉離子從胞質(zhì)溶膠更聚集到胞外區(qū)室，例如液泡。通過轉(zhuǎn)化過表達(dá)這種基因的鹽敏感型作物，這些基因可用于耐鹽植物的工程。
本發(fā)明還包括經(jīng)過修飾的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它具有改變的離子選擇性或離子滲透性，這可增加對鹽或干旱或滲透的耐性。
本發(fā)明還涉及對NHX1基因的修飾，它通過使用基于PCR擴(kuò)增的定點(diǎn)誘變和缺失以篩選具有增強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)活性或改變的離子選擇性的經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)形式。
本發(fā)明核酸的分離通常，下面描述的重組DNA技術(shù)中的術(shù)語和試驗方法都是在此領(lǐng)域被熟知且通常使用的方法。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被用于克隆、DNA和RNA的分離、擴(kuò)增和純化。通常，涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等的酶反應(yīng)是按照制造商的說明書進(jìn)行的。這些技術(shù)和各種其它技術(shù)通常是按照Sambrook等，Molecular Cloning-A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology.1-3卷，John Wiley & Sons，Inc.(1994-1998)的描述進(jìn)行的。
用這里提供的序列可用多種技術(shù)來實現(xiàn)NHX1核酸的分離。例如，可用基于這里所述序列的寡核苷酸探針來鑒定cDNA或基因組DNA文庫中所需的基因。為構(gòu)建基因組文庫，通過隨機(jī)斷裂(例如用限制性內(nèi)切酶)產(chǎn)生了基因組DMA的大區(qū)段，并將區(qū)段與載體DNA連接以形成可被包裝入適當(dāng)載體的多聯(lián)體。為制備cDNA文庫，從所需器官如花分離mRNA，并從mRNA制備含有NHX1基因轉(zhuǎn)錄物的cDNA文庫。或者，可從提取自其它表達(dá)AtNHX1基因或同系物的組織的mRNA制備cDNA。
然后可用基于這里所述的克隆的NHX1基因或其片段的探針來篩選cDNA或基因組文庫。探針可用來與基因組DNA或cDNA序列雜交以分離相同或不同植物種類中的同源基因?；蛘?，可用抗NHX1多肽或其片段的抗體來篩選mRNA表達(dá)文庫。
或者，可用擴(kuò)增技術(shù)從核酸樣品擴(kuò)增感興趣的核酸。例如，可用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從基因組DNA、cDNA、基因組文庫或cDNA文庫直接擴(kuò)增NHX1基因的序列。PCR和其它體外擴(kuò)增方法也可用于，例如，克隆對被表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸序列，使核酸被用作探針以檢測樣品中所需mRNA的存在情況，用于核酸測序，或用于其它目的。為對PCR有大概了解可參見PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications.(Innis，M，Gleaned，D.，Sninsky，J.和White，T.編)，Academic Press，San Diego(1990)。
也可用技術(shù)文獻(xiàn)中描述的已知技術(shù)來合成多核苷酸。參見例如，Carruthers等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，47411-418(1982)和ADAMS等，J.Am.Chem.Soc.，105661(1983)。然后可通過合成互補(bǔ)鏈并在合適的條件下將鏈一起退火，或使用DNA聚合物與合適的引物序列加入互補(bǔ)鏈來獲得雙鏈DNA片段。
感興趣的NHX1核酸也可通過檢索核酸數(shù)據(jù)庫如EST數(shù)據(jù)庫并識別與已知NHX1核酸序列有高類似性的序列來鑒定。一旦本發(fā)明的候選NHX1核酸或多核苷酸序列被鑒定，就可用標(biāo)準(zhǔn)方法來確定推定的核酸是否是本發(fā)明的NHX1核酸。測定NHX1活性的方法是此領(lǐng)域已知的，例如可參見實施例1和Apse等，Science.285，1256-1258。
重組載體的制備為將分離的序列用于轉(zhuǎn)化和其它分子生物學(xué)技術(shù)，制備了適合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的重組DNA載體。轉(zhuǎn)化多種高等植物品種的技術(shù)是熟知的，并描述在技術(shù)和科學(xué)文獻(xiàn)中。參見，例如。Weising等，Ann.Rev.Genet.，22421-477(1988)。編碼所需多肽的DNA序列，例如編碼全長蛋白質(zhì)的cDNA序列，優(yōu)選與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)節(jié)序列結(jié)合，這將引導(dǎo)序列從轉(zhuǎn)化植物的預(yù)定組織的基因中轉(zhuǎn)錄。
例如，為了過表達(dá)，可采用植物啟動子片段，它將引導(dǎo)基因在再生植物的所有組織中表達(dá)。這種啟動子在這里被稱為“組成型”啟動子，它在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下具有活性。組成型啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，來自根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumafaciens)T-DNA的1’-或2’-啟動子，以及來自此領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員已知的各種植物基因的其它轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。例如，這種基因包括擬南芥(Arabadopsis)的ACT11(Huang等，Plant Mol.Biol.，33125-139(1996))，擬南芥(Arabadopsis)的Cat3(GenBank NO.U43147，Zhong等，Mol.Gen.Genet.，251196-203(1996))，來自蕓苔屬植物(Brassica napus)的編碼硬脂?；?酰基載體蛋白脫氫酶的基因(Genbank No.X74782，Solocombe等，PlantPhysiol.，1041167-1176(1994))，來自玉米的GPc1(GenBank NO.X15596，Martinez等，J.Mol.Biol，208551-565(1989))，以及來自玉米的Gpc2(GenBank NO.U45855，Manjunath等，Plant Mol.Biol.，3397-112(1997))。
或者，所述植物啟動子可在特定組織、器官或細(xì)胞類型中直接表達(dá)NHX1核酸(即組織特異性啟動子、器官特異性啟動子)，或者在更精確的環(huán)境控制或發(fā)育控制下表達(dá)(即誘導(dǎo)型啟動子)。會影響誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括無氧條件、溫度升高、光照或噴灑化學(xué)物質(zhì)/激素。此領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將知道，器官特異性啟動子可驅(qū)動操作性連接序列在靶器官以外的器官中表達(dá)。因此，在這里使用的器官特異性啟動子是指優(yōu)選驅(qū)動在靶器官中表達(dá)，但也可在其它器官中導(dǎo)致一些表達(dá)。
許多組織特異性啟動子也可用于本發(fā)明。例如，指導(dǎo)根組織核酸表達(dá)的根啟動子對于本發(fā)明特別重要。
如果需要合適的多肽表達(dá)，應(yīng)該包括編碼區(qū)3’-末端的聚腺苷化區(qū)域。所聚腺苷化區(qū)域可衍生自天然基因、許多其它植物基因或T-DNA。
包含本發(fā)明基因序列(例如啟動子或編碼區(qū))的載體通常含有賦予植物細(xì)胞可選擇的表型的標(biāo)記基因。例如，所述標(biāo)記可編碼抗微生物劑抗性，尤其是抗生素抗性，如對卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素的抗性，或除草劑抗性，如對氯磺隆或草銨膦的抗性。
轉(zhuǎn)基因植物的制備可以用各種常規(guī)技術(shù)將本發(fā)明的DNA構(gòu)建物引入所需植物宿主的基因組。例如，可采用植物細(xì)胞原生質(zhì)體的電穿孔和微注射技術(shù)將所述DNA構(gòu)建物直接引入植物細(xì)胞的基因組DNA，或者可采用生物射彈技術(shù)，例如DNA顆粒轟擊，將所述DNA構(gòu)建物直接引入植物組織。
微注射技術(shù)是此領(lǐng)域已知的并詳細(xì)描述在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中。用聚乙二醇沉淀引入DNA構(gòu)建物的方法描述在Paszkowski等，Embo J.，327 17-2722(1984)。電穿孔技術(shù)描述在Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.825824(1985)。生物射彈轉(zhuǎn)化技術(shù)描述在Klein等，Nature，32770-73(1987)。
或者，所述DNA構(gòu)建物可與合適的T-DNA側(cè)翼區(qū)結(jié)合并被引入常規(guī)的根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumafaciens)宿主載體。當(dāng)細(xì)胞被細(xì)菌感染時，根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumafaciens)宿主的毒性功能將指導(dǎo)構(gòu)建物的插入并使標(biāo)記毗鄰植物細(xì)胞DNA。根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumafaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，包括使用或不使用二元載體，詳細(xì)描述在科學(xué)文獻(xiàn)中。參見，例如，Horsch等，Science，233496-498(1984)，以及Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，804803(1983)和《植物的基因轉(zhuǎn)移》(Gene Transfer to Plants)，Potrykus編，(Springer-Verlag，Berlin 1995)。
可培養(yǎng)用任何上述轉(zhuǎn)化技術(shù)得到的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以再生完整植株，所得植株具有轉(zhuǎn)化的表型，因此具有如減低的法尼基轉(zhuǎn)移酶活性所需的表型。這種再生技術(shù)取決于組織培養(yǎng)物生長培養(yǎng)基中某些植物激素的操作，典型的是取決于和所需核苷酸序列一起引入的抗微生物劑和/或除草劑標(biāo)記。植物從培養(yǎng)的原生質(zhì)體的再生描述在Evans等，《原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)》(Protoplasts Isolation and Culture)，《植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊》(Handbook of Plant Cell Culture)，124-176頁，MacMillilanPublishing Company，New York，1983；以及Binding，《植物、植物原生質(zhì)體的再生》(Regeneration of Plants，Plant Protoplasts)，21-73頁，CRC Press，BocaRaton，1985。也可從植物的愈傷組織、外植體、器官或其一部分獲得再生。這種再生技術(shù)通常描述在Klee等，Ann.Rev，of Plant Phys.，38467-486(1987)。
本發(fā)明的核酸可被用于在幾乎任何植物上提供所需特性。因此，本發(fā)明可被用于許多植物，包括以下種屬的物種腰果屬(Anacardium)、落花生屬(Arachis)、天門冬屬(Asparagus)、顛茄屬(Atropa)、燕麥屬(Avena)、蕓苔屬(Brassica)、衣藻屬目(Chlamydomonas)、小球藻屬(Chlorella)、柑屬(Citrus)、西瓜屬(Citrullus)、辣椒屬(Capsicum)、紅花屬(Carthamus)、椰子屬(Cocos)、咖啡屬(Coffea)、黃瓜屬(Cucumis)、南瓜屬(Cucurbita)、貫眾屬(Cyrtomium)、胡蘿卜屬(Daucus)、油棕屬(Elaeis)、草莓屬(Fragaria)、大豆屬(Glycine)、棉屬(Gossypium)、向日葵屬(Helianthus)、Heterocallis、大麥屬(Hordeum)、天仙子屬(Hyoseyamus)、萵苣屬(Lactuca)、海帶屬(Laminaria)、亞麻屬(Linum)、黑麥草屬(Lolium)、羽扇豆屬(Lupinus)、番茄屬(Lycopersicon)、巨藻屬(Macrocystis)、蘋果屬(Malus)、木薯屬(Manihot)、墨角綸屬(Majorana)、苜蓿屬(Medicago)、海囊藻屬(Nereocystis)、煙草屬(Nicotiana)、木犀欖屬(Olea)、稻屬(Oryza)、紫萁屬(Osmunda)、黍?qū)?Panieum)、Pannesetum、鱷梨屬(Persea)、菜豆屬(Phaseolus)、黃連木屬(Pistachia)、豌豆屬(Pisum)、梨屬(Pyrus)、多足蕨屬(Polypodium)、李屬(Prunus)、蕨屬(Pteridium)、蘿卜屬(Raphanus)、蓖麻屬(Ricinus)、黑麥屬(Secale)、千里光屬(Senecio)、白芥屬(Sinapis)、茄屬(Solanum)、高梁屬(Sorghum)、可可樹屬(Theobromus)、胡蘆巴屬(Trigonella)、小麥屬(Triticum)、野豆花屬(Vicia)、葡萄屬(Vitis)、豇豆屬(Vigna)和玉米屬(Zea)。
此領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到，表達(dá)盒穩(wěn)定地?fù)饺朕D(zhuǎn)基因植物中并確定可操作后，可通過有性雜交將其引入其它植物。根據(jù)要雜交的物種可采用任何一種標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)。
采用已知方法，精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過檢測轉(zhuǎn)基因植物中NHX1 mRNA或蛋白質(zhì)的增加或減少來篩選本發(fā)明的植物。檢測和定量mRNA或蛋白質(zhì)的方法是此領(lǐng)域熟知的，例如有Northern印跡、Western印跡或活性測定。也可通過檢測所需表型來鑒定本發(fā)明的植物。例如用下述方法來檢測耐鹽性或?qū)Ω珊档哪托浴?br>
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物的檢測可用已經(jīng)建立的分子生物學(xué)技術(shù)，并用對包括耐鹽性在內(nèi)的多種表型進(jìn)行選擇的培養(yǎng)基來監(jiān)測生長速度，可分析含有本發(fā)明多核苷酸的轉(zhuǎn)化的酵母菌株。
或者可對包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行分析。制備含有本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)盒并將其引入植物后，可對所得轉(zhuǎn)基因植物與增加或減少的NHX1表達(dá)有關(guān)的表型特征進(jìn)行測定。例如，將表達(dá)盒引入植物后，可就轉(zhuǎn)基因的存在情況對植物進(jìn)行篩選，并與近交系或雜交系雜交。然后就轉(zhuǎn)基因的存在情況篩選后代植物并進(jìn)行自花授粉。培養(yǎng)自花授粉植物的后代。可測定所得轉(zhuǎn)基因植物提高的耐鹽性和提高的干旱耐性以及降低的對毒素的敏感性。例如，可對轉(zhuǎn)基因植物提高的耐鹽性或干旱耐性進(jìn)行測定。測定提高的耐鹽性的方法是已知的，包括測量在升高的鹽濃度下植物的生長速度、植物的生物量、根/芽比例和組織離子含量。可測量根和下胚軸的生長速度并與不同鹽濃度下生長的植物的組織含水量。測定增加的干旱耐性的方法也是已知的，包括測量轉(zhuǎn)基因植物組織的蒸騰速度、氣孔傳導(dǎo)、分離的葉中水分流失率測定或檢測葉膨壓。例如，蒸騰速度降低的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的干旱耐性。
實施例實施例1定點(diǎn)誘變和截短的AtNHx1的克隆通過RT-PCR得到AtNHX1的全長cDNA并將其克隆入pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)。通過測序完整的開放讀框來確定序列。然后采用BamH1和EcoR1克隆位點(diǎn)將全長cDNA亞克隆入酵母載體pYPGE15。按照QuikChange定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene)的說明進(jìn)行定點(diǎn)誘變。用來產(chǎn)生SM-23的引物如下SM-23-F，ggagacaatttgatgactgcttcatgcgacccgtc；SM-23-R，gacgggtcgcatgaagcagtcatcaaattgtctcc。對于截短的AtNHX1的克隆，通過PCR擴(kuò)增截短的cDNA并將其克隆入pYPGE15載體。截短的AtNHX1克隆的引物如下EXCH-5，agctaggatccggatctagaagaagataacaatgttgg；EXCH-DL-1，agctgaattcctagggtacaaagccacgacctc；EXCH-DL-2，agctgaattcctacaagaagccacgtatactg；EXCH-DL-3，agctgaattcctaagataacatgctcgtggtg。所有序列通過測序鑒定。
實施例2酵母轉(zhuǎn)化和滴凝試驗用醋酸鋰/PEG法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。將酵母細(xì)胞接種到滲出(drop-out)液體培養(yǎng)基中并在30℃培育過夜。通過離心收集細(xì)胞，并懸浮于APG培養(yǎng)基(Rodriguez-Navarro和Ramos，J.Bacteriol.，159940-945(1984))并將OD600調(diào)至1.0。制備一系列10倍稀釋液并將3l細(xì)胞接種到添加有不同鹽分的APG培養(yǎng)基或接種到含有10mg/L潮霉素的YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培養(yǎng)基。
實施例3修飾的AtNHX1賦予了增加的耐鹽性如圖1所示，與對照菌株(enal)相比，缺乏內(nèi)源NHX1Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的酵母突變菌株(enal nhxl)對NaCl以及潮霉素更敏感。AtNHX1在酵母突變體中表達(dá)部分恢復(fù)了突變體的表型，標(biāo)明AtNHX1作為Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以將區(qū)室中的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡的功能。與完整的形式相比，包括SM-23、Dl-1、Dl-2和Dl-3在內(nèi)的修飾的AtNHX1使酵母細(xì)胞對鹽和潮霉素更耐受。這一結(jié)果說明，修飾的AtNHX1具有較高的反向轉(zhuǎn)運(yùn)活性并能將更多的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡。
實施例4修飾的AtNHX1的改變的離子選擇性當(dāng)在不含NaCl的APG培養(yǎng)基上生長時，酵母細(xì)胞的生長同樣地不考慮完整的或修飾的AtNHX1的表達(dá)(圖2)。然而，當(dāng)提高培養(yǎng)基中的K+濃度時，與表達(dá)完整形式AtNHX1的酵母細(xì)胞相比，表達(dá)修飾的AtNHX1的酵母細(xì)胞顯示出較高的對NaCl的耐性。這一結(jié)果說明NHX1基因的C-末端調(diào)控Na+/K+選擇性。
表25在小麥中不同的CP4EPSPS多核苷酸的表現(xiàn)
實施例13這個實施例目的是展示在轉(zhuǎn)基因植物中不同人工多核苷酸的檢測，特別是CP4EPSPS_AT和CP4EPSPS_ZM。其它的人工多核苷酸OsEPSPS_AT，OsEPSPS_ZM，GmEPSPS_GM，ZmEPSPS_ZM，CTP2_AT，CTP2_ZM，Bar1_AT和Bar1_ZM也可以通過提供DNA擴(kuò)增子或?qū)NA探針與植物樣品雜交的方法來在轉(zhuǎn)基因植物中檢測。DNA檢測領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以很容易的從本發(fā)明提供的人工多核苷酸序列設(shè)計引物分子來使得特異檢測植物樣品中的人工多核苷酸的方法可行。在這里，對于提供針對于此處公開的人工多核苷酸同源或互補(bǔ)的DNA引物或探針的方法或試劑盒的應(yīng)用也是本發(fā)明的一個方面。
一種DNA檢測方法(聚合酶鏈反應(yīng)，PCR)被設(shè)計用于檢測在轉(zhuǎn)基因植物中的該人工CP4EPSPS多核苷酸。在表26中顯示的獨(dú)特的DNA引物組是被設(shè)計用于擴(kuò)增特異性的CP4EPSPS多核苷酸并且來提供不同大小的擴(kuò)增子。這些擴(kuò)增子在多核苷酸長度上在各種CP4EPSPS多核苷酸中具有足夠的不同，這使得可以通過普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離這些擴(kuò)增子?？梢岳枚嘀豍CR方法來檢測在植物中存在的超過一個的人工多核苷酸。
表26.用于檢測在轉(zhuǎn)基因植物中不同的CP4基因所用的引物的序列。
DNA引物對(表26)被用來產(chǎn)生用于診斷在轉(zhuǎn)基因植物中包含的特異的CP4EPSPS多核苷酸的擴(kuò)增子。這些引物對包括，但不局限于對于CP4EPSPS_AT多核苷酸的SEQ ID NO24和SEQ ID NO25；對于CP4EPSPS_ZM的SEQ ID NO26和SEQ ID NO27；對于CP4EPSPS_Nat<p>
實施例8AtNHX1 N-末端和跨膜結(jié)構(gòu)域的鑒定用上面實施例1和2所述的方法鑒定了AtNHX1的游離N-末端和第一個跨膜結(jié)構(gòu)域的功能。產(chǎn)生了三種N-末端缺失形式的AtNHX1并在酵母互補(bǔ)實驗中進(jìn)行分析。AtNHX1的游離N-末端的缺失(NDL-1，缺失前17個氨基酸)使酵母突變菌株(ΔenalΔnhx1)比全長的AtNHX1更耐受潮霉素和NaCl。表達(dá)NDL-1的酵母細(xì)胞的生長比表達(dá)全長AtNHX1的酵母細(xì)胞高約30倍，這說明AtNHX1的游離N-末端是酵母細(xì)胞中反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的負(fù)調(diào)節(jié)物。缺失前兩個跨膜結(jié)構(gòu)域(NDL-2)和缺失前三個跨膜結(jié)構(gòu)域(NDL-3)能在一定程度上取消AtNHX1的功能。這些結(jié)果提供了通過遺傳工程構(gòu)建對鹽更耐受的植物的可能性，這是通過過表達(dá)具有提高的反向運(yùn)轉(zhuǎn)活性的修飾形式的AtNHX1(如NDL-1)實現(xiàn)的。
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序列表SEQ ID NO1野生型AtNHX11 atgttggatt ctctagtgtc gaaactgcct tcgttatcga catctgatca cgcttctgtg61 gttgcgttga atctctttgt tgcacttctt tgtgcttgta ttgttcttgg tcatcttttg121 gaagagaata gatggatgaa cgaatccatc accgccttgt tgattgggct aggcactggt181 gttaccattt tgttgattag taaaggaaaa agctcgcatc ttctcgtctt tagtgaagat241 cttttcttca tatatctttt gccacccatt atattcaatg cagggtttca agtaaaaaag301 aagcagtttt tccgcaattt cgtgactatt atgctttttg gtgctgttgg gactattatt361 tcttgcacaa tcatatctct aggtgtaaca cagttcttta agaagttgga cattggaacc421 tttgacttgg gtgattatct tgctattggt gccatatttg ctgcaacaga ttcagtatgt481 acactgcagg ttctgaatca agacgagaca cctttgcttt acagtcttgt attcggagag541 ggtgttgtga atgatgcaac gtcagttgtg gtcttcaacg cgattcagag ctttgatctc601 actcacctaa accacgaagc tgcttttcat cttcttggaa acttcttgta tttgtttctc661 ctaagtacct tgcttggtgc tgcaaccggt ctgataagtg cgtatgttat caagaagcta721 tactttggaa ggcactcaac tgaccgagag gttgccctta tgatgcttat ggcgtatctt781 tcttatatgc ttgctgagct tttcgacttg agcggtatcc tcactgtgtt tttctgtggt841 attgtgatgt cccattacac atggcacaat gtaacggaga gctcaagaat aacaacaaag901 catacctttg caactttgtc atttcttgcg gagacattta ttttcttgta tgttggaatg961 gatgccttgg acattgacaa gtggagatcc gtgagtgaca caccgggaac atcgatcgca1021 gtgagctcaa tcctaatggg tctggtcatg gttggaagag cagcgttcgt ctttccgtta1081 tcgtttctat ctaacttagc caagaagaat caaagcgaga aaatcaactt taacatgcag1141 gttgtgattt ggtggtctgg tctcatgaga ggtgctgtat ctatggctct tgcatacaac1201 aagtttacaa gggccgggca cacagatgta cgcgggaatg caatcatgat cacgagtacg1261 ataactgtct gtctttttag cacagtggtg tttggtatgc tgaccaaacc actcataagc1321 tacctattac cgcaccagaa cgccaccacg agcatgttat ctgatgacaa caccccaaaa1381 tccatacata tccctttgtt ggaccaagac tcgttcattg agccttcagg gaaccacaat1441 gtgcctcggc ctgacagtat acgtggcttc ttgacacggc ccactcgaac cgtgcattac1501 tactggagac aatttgatga ctccttcatg cgacccgtct ttggaggtcg tggctttgta1561 ccctttgttc caggttctcc aactgagaga aaccctcctg atcttagtaa ggctSEQ ID NO2野生型AtNHX1，蛋白質(zhì)序列MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTTTVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDSFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKASEQ ID NO3
SM-23，S508C，單個核酸變化，cDNA序列atgttggattctctagtgtcgaaactgccttcgttatcgacatctgatcacgcttctgtggttgcgttgaatctctttgttgcacttctttgtgcttgtattgttcttggtcatcttttggaagagaatagatggatgaacgaatccatcaccgccttgttgattgggctaggcactggtgttaccattttgttgattagtaaaggaaaaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagatcttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggtttcaagtaaaaaagaagcagtttttccgcaatttcgtgactattatgctttttggtgctgttgggactattatttcttgcacaatcatatctctaggtgtaacacagttctttaagaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatatttgctgcaacagattcagtatgtacactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtcttgtattcggagagggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactcacctaaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaaacttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgcaaccggtctgataagtgcgtatgttatcaagaagctatactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgcttatggcgtatctttcttatatgcttgctgagcttttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcatttcttgcggagacatttattttcttgtatgttggaatggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacacaccgggaacatcgatcgcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttctatctaacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatgagaggtgctgtatctatggctcttgcatacaacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatcacgagtacgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacctattaccgcaccagaacgccaccacgagcatgttatctgatgacaacaccccaaaatccatacatatccctttgttggaccaagactcgttcattgagccttcagggaaccacaatgtgcctcggcctgacagtatacgtggcttcttgacacggcccactcgaaccgtgcattactactggagacaatttgatgactGcttcatgcgacccgtctttggaggtcgtggctttgtaccctttgttccaggttctccaactgagagaaaccctcctg atcttagtaaggctSEQ ID NO4SM-23，S508C，單個氨基酸取代，蛋白質(zhì)序列
MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFTYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTTTVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDCFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKA SEQ ID NO5DL-1，從C-末端缺失17個氨基酸，cDNA序列ATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAAACTGCCTTCGTTATCGACATCTGATCACGCTTCTGTGGTTGCGTTGAATCTCTTTGTTGCACTTCTTTGTGCTTGTATTGTTCTTGGTCATCTTTTGGAAGAGAATAGATGGATGAACGAATCCATCACCGCCTTGTTGATTGGGCTAGGCACTGGTGTTACCATTTTGTTGATTAGTAAAGGAAAAAGCTCGCATCTTCTCGTCTTTAGTGAAGATCTTTTCTTCATATATCTTTTGCCACCCATTATATTCAATGCAGGGTTTCAAGTAAAAAAGAAGCAGTTTTTCCGCAATTTCGTGACTATTATGCTTTTTGGTGCTGTTGGGACTATTATTTCTTGCACAATCATATCTCTAGGTGTAACACAGTTCTTTAAGAAGTTGGACATTGGAACCTTTGACTTGGGTGATTATCTTGCTATTGGTGCCATATTTGCTGCAACAGATTCAGTATGTACACTGCAGGTTCTGAATCAAGACGAGACACCTTTGCTTTACAGTCTTGTATTCGGAGAGGGTGTTGTGAATGATGCAACGTCAGTTGTGGTCTTCAACGCGATTCAGAGCTTTGATCTCACTCACCTAAACCACGAAGCTGCTTTTCATCTTCTTGGAAACTTCTTGTATTTGTTTCTCCTAAGTACCTTGCTTGGTGCTGCAACCGGTCTGATAAGTGCGTATGTTATCAAGAAGCTATACTTTGGAAGGCACTCAACTGACCGAGAGGTTGCCCTTATGATGCTTATGGCGTATCTTTCTTATATGCTTGCTGAGCTTTTCGACTTGAGCGGTATCCTCACTGTGTTTTTCTGTGGTATTGTGATGTCCCATTACACATGGCACAATGTAACGGAGAGCTCAAGAATAACAACAAAGCATACCTTTGCAACTTTGTCATTTCTTGCGGAGACATTTATTTTCTTGTATGTTGGAATGGATGCCTTGGACATTGACAAGTGGAGATCCGTGAGTGACACACCGGGAACATCGATCGCAGTGAGCTCAATCCTAATGGGTCTGGTCATGGTT
GGAAGAGCAGCGTTCGTCTTTCCGTTATCGTTTCTATCTAACTTAGCCAAGAAGAATCAAAGCGAGAAAATCAACTTTAACATGCAGGTTGTGATTTGGTGGTCTGGTCTCATGAGAGGTGCTGTATCTATGGCTCTTGCATACAACAAGTTTACAAGGGCCGGGCACACAGATGTACGCGGGAATGCAATCATGATCACGAGTACGATAACTGTCTGTCTTTTTAGCACAGTGGTGTTTGGTATGCTGACCAAACCACTCATAAGCTACCTATTACCGCACCAGAACGCCACCACGAGCATGTTATCTGATGACAACACCCCAAAATCCATACATATCCCTTTGTTGGACCAAGACTCGTTCATTGAGCCTTCAGGGAACCACAATGTGCCTCGGCCTGACAGTATACGTGGCTTCTTGACACGGCCCACTCGAACCGTGCATTACTACTGGAGACAATTTGATGACTCCTTCATGCGACCCGTCTTTGGAGGTCGTGGCTTTGTACCCSEQ ID NO6DL-1，從C-末端缺失17個氨基酸，蛋白質(zhì)序列MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDSFMRPVFGGRGFVPSEQ ID NO7DL-2，從C-末端缺失47個氨基酸，cDNA序列
atgttggattctctagtgtcgaaactgccttcgttatcgacatctgatcacgcttctgtggttgcgttgaatctctttgttgcacttctttgtgcttgtattgttcttggtcatcttttggaagagaatagatggatgaacgaatccatcaccgccttgttgattgggctaggcactggtgttaccattttgttgattagtaaaggaaaaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagatcttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggtttcaagtaaaaaagaagcagtttttccgcaatttcgtgactattatgctttttggtgctgttgggactattatttcttgcacaatcatatctctaggtgtaacacagttctttaagaattggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatatttgctgcaacagattcagtatgtacactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtcttgtattcggagagggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactcacctaaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaaacttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgcaaccggtctgataagtgcgtatgttatcaagaagctatactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgcttatggcgtatctttcttatatgcttgcttgctgagcttttcgacttagcggtatatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcatttcttgcggagacatttattttcttgtatgttggaatggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgagtgacacaccgggaacatcgatcgcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttctactaacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatgagaggtgctgtatctatggctcttgcatacaacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatcacgagtacgataactgtctgtcttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacctattaccgcaccagaacgccaccacgagcatgttatctgatgacaacaccccaaaatccatacatatccctttgttggaccaagactcgttcattgagccttcagggaaccacaatgtgcctcggcctgacagtatacgtggcttcttgSEQ ID NO8DL-2，從C-末端缺失47個氨基酸，蛋白質(zhì)序列MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTE
SSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMTSTITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFTEPSGNHNVPRPDSIRGFLSEQ ID NO9DL-3，從C-末端缺失84個氨基酸，cDNA序列atgttggattctctagtgtcgaaactgccttcgttatcgacatctgatcacgcttctgtggttgcgttgaatctctttgttgcacttctttgtgcttgtattgttcttggtcatcttttggaagagaatagatggatgaacgaatccatcaccgccttgttgattgggctaggcactggtgttaccattttgttgattagtaaaggaaaaagctcgcatcatcttctcgtctttagtgaagatcttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggtttcaagtaaaaaagaagcagtttttccgcaatttcgtgactattatgctttttggtgctgttgggactattatttcttgcacaatcatatctctaggtgtaacacagttctttaagaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatttgctgcaacagattcagtatgtacactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtcttgtattcggagagggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactcacctaaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaaacttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgcaaccggtctgataagtgcgtatgttatcaagaagctatactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgcttatggcgtatctttcttatatgcttgctgagcttttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcatttcttgcggagacatttattttcttgtatgttggaatggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacacaccgggaacatcgatcgcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttctatctaacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatgagaggtgctgtatctatggctcttgcatacaacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatcacgagtacgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacctattaccgcaccagaacgccaccacgagcatgttatctSEQ ID NO10
DL-3，從C-末端缺失84個氨基酸，蛋白質(zhì)序列MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSLLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSLMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTTTVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSSEQ ID NO11NDL-1 cDNA 序列atggcttctgtggttgcgttgaatctctttgttgcacttctttgtgcttgtattgttcttggtcatctttggaagagaatagatggatgaacgaatccatcaccgccttgttgattgggctaggcactggtgttaccattttgttgattagtaaaggaaaaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagatcttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggtttcaagtaaaaaagaagcagtttttccgcaatttcgtgtactattatgctttttggtgctgttgggactattatttcttgcacaatcatatctctaggtgtaacacagttctttaagaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatatttgctgcaacagattcagtatgtacactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtcttgtattcggagagggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactcacctaaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaaacttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgcaaccggtctgataagtgcgtatgttatcaagaagctatactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgcttatggcgtatctttcttatatgcttgctgagcttttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcatttcttgcggagacatttattttcttgtatgttggaatggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacaccgggaacatcgatcgcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttctatctaacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatgagaggtgctgtatctatggctcttgcatacaacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatcacgagtacgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacctattaccgcaccagaacgccaccacgagcatgttatctgatgacaacaccccaaaatccatacatatccctttgttggaccaagactcgttcattgagccttcagggaaccacaatgtgcctcggcctgacagtatacgtggcttgacacggcccactcgaaccgtgcattactactggagacaatttgatgactccttcatgcgacccgtctttggaggtcgtggctttgtaccctttgttccaggttctccaactgagagaaaccctcctgatcttagtaaggctSEQ ID NO12NDL-1蛋白質(zhì)序列
MASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVYIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDSFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKASEQ ID NO13NDL-2 cDNA 序列atgaaaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagatcttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggtttcaagtaaaaaagaagcagtttttccgcaatttcgtgactattatgctttttggtgctgttgggactattattcttgcacaatcatattctaggtgtaacacagttctttaagaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatatttgctgcaacagattcagtatgtaactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtcttgtattcggagagggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactcacctaaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaaacttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgcaaccggtctgataagtgcgtatgttatcaagaagctatactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgcttatggcgtatctttcttatatgcttgctgagcttttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcatttcttgcggagacatttattttcttgtatgttggaatggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacacaccgggaacatcgatcgcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttctatctaacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatgagaggtgctgtatctatggctcttgcatacaacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatcacgagtacgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacctattaccgcaccagaacgccaccacgagcatgttatctgatgacaacaccccaaaatccatacatatccctttgttggaccaagactcgttcattgagccttcagggaaccacaatgtgcctcggcctgacagtatacgtggcttcttgacacggcccactcgaaccgtgcattactactggagacaatttgatgactccttcatgcgacccgtctttggaggtcgtggctttgtaccctttgttccaggttctccaactgagagaaaccctcctgatcttagtaaggctSEQ ID NO14NDL-2蛋白質(zhì)序列MKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDSFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKASEQ ID NO15NDL-3 cDNA序列
atgaaaaagaagcagtttttccgcaatttcgtgactattatgcttttggtgctgttgggactattatttcttgcacaatcatatctctaggtgtaacacagttctttaagaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatatttgctgcaacagattcagtatgtacactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtcttgtattcggagagggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactcacctaaaccacgaagctgctttcatccttcttggaaacttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgcaaccggtctgataagtgcgtatgttatcaagaagctatactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgcttatggcgtatctttcttatatgcttgctgagcttttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcatttcttgcggagacatttattttcttgtatgttggaatggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacacaccgggaacatcgatcgcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttctatctaacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatgagaggtgctgtatctatggctcttgcatacaacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatcacgagtacgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacctattaccgcaccagaacgccaccacgagcatgttatctgatgacaacaccccaaaatccatacatatccctttgttggaccaagactcgttcattgagccttcagggaaccacaatgtgcctcggcctgacagtatacgtggcttcttgacacggcccactcgaaccgtgcattactactggagacaatttgatgactccttcatgcgacccgtctttggaggtcgtggctttgtaccctttgttccaggttctccaactgagagaaaccctcctgatcttagtaaggctSEQ ID NO16NDL-3蛋白質(zhì)序列MKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPOGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDSFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKA
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)植物耐鹽性的方法，其特征在于，所述方法包括a.在植物中引入編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的多核苷酸，當(dāng)其表達(dá)時能增加植物的耐鹽性，且其中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽包括i.與SEQ ID NO2有至少80％同一性的氨基酸序列；和ii.少于530個氨基酸；以及b.選擇與未引入該多核苷酸的植物相比耐鹽性增強(qiáng)的植物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是SEQ ID NO5或SEQ IDNO11。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述賦予耐鹽性的多肽是SEQ ID NO6或SEQ ID NO12。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是SEQ ID NO7或SEQID NO13。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述賦予耐鹽性的多肽小于500個氨基酸。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述賦予耐鹽性的多肽是SEQ ID NO8或SEQ ID NO14。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是SEQ ID NO9或SEQID NO15。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述賦予耐鹽性的多肽小于475個氨基酸。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述賦予耐鹽性的多肽是SEQ IDNO10。
10.一種增強(qiáng)植物耐鹽性的方法，其特征在于，所述方法包括a.在植物中引入編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的多核苷酸，當(dāng)其表達(dá)時能增強(qiáng)植物的耐鹽性，且其中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽包括i.與SEQ ID NO2有至少80％同一性的氨基酸序列；和ii.與SEQ ID NO2中第508位的絲氨酸相對應(yīng)的殘基被Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的賦予增強(qiáng)的耐鹽性的氨基酸替代；以及b.選擇與未引入該多核苷酸的植物相比耐鹽性增強(qiáng)的植物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述取代第508位絲氨酸的氨基酸是中性的極性氨基酸。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述取代第508位絲氨酸的氨基酸選自蘇氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述取代第508位絲氨酸的氨基酸是半胱氨酸。
14.一種純化的包含編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的核苷酸序列的多核苷酸，當(dāng)其表達(dá)時能增強(qiáng)植物的耐鹽性，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽包含i.與SEQ ID NO2有至少80％同一性的氨基酸序列；和ii.少于522個氨基酸。
15.如權(quán)利要求14所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列選自SEQ IDNOS5、7、9、11、13和15。
16.如權(quán)利要求14所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列選自SEQ ID NOS6、8、10、12、14和16。
17.如權(quán)利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列是SEQ ID NO3。
18.如權(quán)利要求10所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列是SEQ ID NO4。
19.一種轉(zhuǎn)基因或誘變的植物，其特征在于，它包含編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的多核苷酸，當(dāng)其表達(dá)時能增強(qiáng)植物的耐鹽性；且其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽包含與SEQ IDNO2有至少80％同一性的小于530個氨基酸的氨基酸序列。
20.一種轉(zhuǎn)基因或誘變的植物，其特征在于，它包含編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的多核苷酸，當(dāng)其表達(dá)時能增強(qiáng)植物的耐鹽性；且其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽包含與SEQ IDNO2有至少80％同一性的氨基酸序列；且所述與SEQ ID NO2中第508位的絲氨酸相對應(yīng)的殘基被賦予增強(qiáng)的耐鹽性的氨基酸替代。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及植物遺傳工程。更具體的，本發(fā)明涉及賦予植物或其它生物耐鹽性的核酸和方法。
文檔編號C12N15/82GK1681927SQ03821607
公開日2005年10月12日 申請日期2003年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者H·史, E·布魯沃爾德 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會