專利名稱：在芽孢桿菌細(xì)胞的色素缺陷突變體中產(chǎn)生生物物質(zhì)的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在芽孢桿菌(Bacillus)細(xì)胞的色素缺陷突變體中產(chǎn)生異源生物物質(zhì)的方法、獲得芽孢桿菌細(xì)胞的色素缺陷突變體的方法，以及芽孢桿菌細(xì)胞的色素缺陷突變體。
相關(guān)技術(shù)的描述普切明(pulcherrimin)是極美酸(pulcherriminic acid)和鐵離子螯合形成的淺紅色色素。普切明由取代的吡嗪環(huán)構(gòu)成，其在第2和第5位結(jié)合異丁基，但其它結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)略有不同(Kuffer等，1967，Archiv für Mikrobiologic 569-21)。
MacDonald，1967，Canadian Journal of Microbiology1317-20，已經(jīng)描述了將普切明從蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)分離并將其轉(zhuǎn)化成游離酸極美酸。Uffen和Canale-Parola，1972，Journal of Bacteriology 11186-93，描述了通過枯草芽孢桿菌合成極美酸。
芽孢桿菌是非常成熟的產(chǎn)生天然蛋白和重組蛋白或者其它生物物質(zhì)的宿主細(xì)胞系統(tǒng)。然而，具有增加蛋白的表達(dá)和分泌的所需特性的芽孢桿菌宿主可以不必具有對所述細(xì)胞產(chǎn)生的生物物質(zhì)成功地進(jìn)行發(fā)酵、回收和純化所最期望的特性。這些過程可以不是最佳的，因為色素形成需要在目標(biāo)生物物質(zhì)的回收和純化期間除去或者色素可以與生物物質(zhì)共純化。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供改良的芽孢桿菌宿主，其既具有表達(dá)商用量的生物物質(zhì)的能力又具有在紅色色素生成中的缺陷。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及產(chǎn)生異源生物物質(zhì)的方法，包括(a)在適合產(chǎn)生異源生物物質(zhì)的條件中，培養(yǎng)親代芽孢桿菌細(xì)胞的突變體，其中(i)所述突變體細(xì)胞含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指導(dǎo)異源生物物質(zhì)的合成，所述第二核酸序列在參與紅色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一個中包含修飾，且(ii)所述突變體細(xì)胞與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，紅色色素生成有缺陷；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述異源生物物質(zhì)。
本發(fā)明也涉及芽孢桿菌細(xì)胞的紅色色素缺陷突變體和產(chǎn)生芽孢桿菌細(xì)胞的紅色色素缺陷突變體的方法。


圖1A和1B顯示cypX基因的基因組DNA序列和其推斷的氨基酸序列(分別是SEQ ID NOS1和2)。
圖2A和2B顯示yvmA基因的基因組DNA序列和其推斷的氨基酸序列(分別是SEQ ID NOS3和4)。
圖3顯示yvmB基因的基因組DNA序列和其推斷的氨基酸序列(分別是SEQ ID NOS5和6)。
圖4A和4B顯示yvmC基因的基因組DNA序列和其推斷的氨基酸序列(分別是SEQ ID NOS7和8)。
圖5是pMRT084的限制酶圖譜。
圖6是pMRT086的限制酶圖譜。
圖7是pMRT126的限制酶圖譜。
圖8是pMRT128的限制酶圖譜。
圖9是pMRT121的限制酶圖譜。
圖10是pMRT123的限制酶圖譜。
圖11是pMRT124的限制酶圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及產(chǎn)生異源生物物質(zhì)的方法，包括(a)在益于產(chǎn)生異源生物物質(zhì)的條件中培養(yǎng)親代芽孢桿菌細(xì)胞的突變體，其中(i)所述突變體細(xì)胞含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指導(dǎo)異源生物物質(zhì)的合成，所述第二核酸序列在參與紅色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一個中包含修飾，且(ii)所述突變體細(xì)胞與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，紅色色素生成有缺陷；以及(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述異源生物物質(zhì)。。
本發(fā)明的優(yōu)點是在芽孢桿菌發(fā)酵液中消除或減少了紅色色素。紅色色素的消除或減少有利于目標(biāo)生物物質(zhì)的回收和純化。
在本發(fā)明的方法中，據(jù)信紅色色素是普切明，因為當(dāng)將芽孢桿菌培養(yǎng)物的固體或液體培養(yǎng)基在無鐵離子的條件下培養(yǎng)，然后暴露于鐵離子時，培養(yǎng)物和/或細(xì)胞變成了淺紅色。此外，分離的色素溶于堿，不溶于水和有機(jī)溶劑，紫外光-可見光光譜與以前公開的極美酸光譜一致(見，Canale-Parola，1963，Archiv für Midrobiologie 46414-427)。術(shù)語“普切明”在這里定義為極美酸的鐵螯合物或鐵鹽。極美酸是普切明的游離酸，其中普切明由取代的吡嗪環(huán)構(gòu)成，其在第2和第5位結(jié)合異丁基，在其它結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)中略有不同(Kuffer等，1967，同上)。
術(shù)語“修飾”在這里定義為，在基因或者其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件中引入、取代、或除去一個或多個核苷酸；基因破壞；基因轉(zhuǎn)變；基因缺失；或者cypX和yvmC基因中至少一個基因發(fā)生隨機(jī)突變或特異突變。cypX和/或yvmC基因的缺失可以是部分缺失或者是全部缺失。
短語“紅色色素生成有缺陷”在這里定義為，不產(chǎn)生可檢測到的紅色色素的芽孢桿菌突變體細(xì)胞，或者是，與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，突變體細(xì)胞產(chǎn)生的紅色色素優(yōu)選至少少約25％，更優(yōu)選至少少約50％，甚至更優(yōu)選地至少少約75％，最優(yōu)選地至少少約95％?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中公知的方法(見，例如，Kuffer等，1967，同上)測定本發(fā)明的芽孢桿菌突變體細(xì)胞產(chǎn)生的紅色色素的水平。然而，由于無論使用的培養(yǎng)基是復(fù)合培養(yǎng)基還是基本培養(yǎng)基，色素都吸附到細(xì)胞上，因此通過對細(xì)胞進(jìn)行離心就可以觀察到紅色色素的存在或缺乏。在基本培養(yǎng)基中，可以在上清液中觀察到紅色色素，但是隨著培養(yǎng)基組成變得更復(fù)雜以及被培養(yǎng)基組分染色，培養(yǎng)基組分的顏色可以掩蓋細(xì)胞上清液中紅色色素的存在或缺乏。
在本發(fā)明的方法中，親代芽孢桿菌細(xì)胞可以是產(chǎn)生紅色色素的野生型芽孢桿菌細(xì)胞或其突變體。在本發(fā)明實踐中使用的芽孢桿菌細(xì)胞包括，但不限于，嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)胞。在優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的實施方案中，親代芽孢桿菌細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，親代芽孢桿菌細(xì)胞是Bacillus clausii細(xì)胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，親代芽孢桿菌細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，親代芽孢桿菌細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
芽孢桿菌細(xì)胞的紅色色素缺陷突變體可使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法，例如，插入、破壞、替代、或者缺失，通過減少或消除cypX和yvmC基因中至少一個基因的表達(dá)來構(gòu)建?；蛑斜恍揎椈蛘邷缁畹牟糠挚梢允牵?，編碼區(qū)或者表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)控元件。這種調(diào)控或控制序列的實例可以是啟動子序列或其有功能的部分，即，足以影響核酸序列表達(dá)的部分。有可能被修飾的其它控制序列包括，但不限于，前導(dǎo)區(qū)、前肽序列、信號序列、轉(zhuǎn)錄終止子、和轉(zhuǎn)錄激活因子。
芽孢桿菌突變體細(xì)胞可通過用基因缺失技術(shù)消除或減少cypX和yvmC基因中至少一個基因的表達(dá)來構(gòu)建?；蛉笔Ъ夹g(shù)能夠除去該基因的一部分或全部，從而消除它們的表達(dá)。在這種方法中，基因缺失可以用包含所述基因的5’和3’側(cè)鄰接區(qū)的質(zhì)粒通過同源重組完成。所述5’和3’鄰接區(qū)可以在許可溫度引入芽孢桿菌細(xì)胞，例如，引入其溫度敏感質(zhì)粒(如pE194)中，與第二選擇性標(biāo)記結(jié)合，從而使該質(zhì)粒變得在所述細(xì)胞中可以被接受(become established)。接著將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到非許可溫度，選出已將所述質(zhì)粒含有在之一整合到染色體的一個同源側(cè)翼區(qū)中的那些細(xì)胞。對質(zhì)粒整合的選擇通過對第二選擇性標(biāo)記的選擇來實現(xiàn)。整合之后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到許可溫度進(jìn)行幾次傳代，但不進(jìn)行選擇，由此刺激在第二同源側(cè)翼區(qū)發(fā)生重組事件。將細(xì)胞鋪平板以獲得單菌落，檢查這些菌落是否丟失上述兩種選擇性標(biāo)記(見，例如，Perego，1993，在A.L.Sonneshein，J.A.Hoch，和R.Losick所編的Bacillus subtilus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria，Chapter 42，American Society of Microbiology，Washington，D.C.)。
芽孢桿菌突變體細(xì)胞也可通過在基因或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件中引入、取代、或者除去一個或更多個核苷酸來構(gòu)建。例如，可插入或除去核苷酸，以便引入終止密碼子、除去起始密碼子、或者使可讀框發(fā)生移碼?？筛鶕?jù)現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法，通過定點誘變或者PCR誘變完成這種修飾。見，例如，Botstein和Shortle，1985，Science 2294719；Lo等，1985，Proceedings of the National Academy oif Sciences USA 812285；Higuchi等，1988，Nucleic Acids Research 167351；Shimada，1996，Meth. Mol.Biol. 57157；Ho等，1989，Gene 7761；Horton等，1989，Gene 7761；和Sarkar和Sommer，1990，BioTechniqques 8404。
芽孢桿菌突變體細(xì)胞也可通過基因破壞技術(shù)構(gòu)建，即在一個或多個負(fù)責(zé)紅色色素的基因中插入整合質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有與所述基因同源的核酸片段，它將產(chǎn)生雙份同源區(qū)并在所述雙份同源區(qū)之間摻入載體DNA。如果插入的載體將基因的啟動子與編碼區(qū)分離，或者中斷編碼序列以至于產(chǎn)生非功能性基因產(chǎn)物，那么這樣的基因破壞可消除基因表達(dá)。受到破壞的構(gòu)建物可以只是帶有與所述基因同源的5’和3’區(qū)的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記能夠鑒別含有被破壞的基因的轉(zhuǎn)化體。
芽孢桿菌突變體細(xì)胞也可通過基因轉(zhuǎn)變的方法構(gòu)建(見，例如，Iglesias和Trautner，1983，Molecular General Genetics 18973-76)。例如，在基因轉(zhuǎn)變方法中，相應(yīng)于所述基因的核苷酸序列經(jīng)體外誘變產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后將該序列轉(zhuǎn)化到親代芽孢桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，缺陷的核酸序列替代內(nèi)源基因。最好是缺陷的基因或基因片段也編碼可用于選擇含有缺陷基因轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記。例如，可將缺陷基因連同選擇性標(biāo)記引入到非復(fù)制型或溫度敏感型質(zhì)粒上。在不允許質(zhì)粒復(fù)制的條件下，通過對標(biāo)記的選擇完成質(zhì)粒整合的選擇。通過檢查菌落是否喪失選擇性標(biāo)記和是否獲得突變基因，完成導(dǎo)致基因替代的第二重組事件的選擇(見，例如，Perego，1993，同上)?；蛘撸缦滤?，缺陷核酸序列可以含有基因的一個或多個核苷酸的插入、取代、或缺失。
也可通過公認(rèn)的反義技術(shù)，使用與基因的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)建芽孢桿菌突變體細(xì)胞(Parish和Stoker，1997，F(xiàn)EMS Microbiology Letters154151-157)。更具體地，可通過引入與基因的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列減少或消除芽孢桿菌細(xì)胞的基因表達(dá)，該核苷酸序列可在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。在使互補(bǔ)的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，翻譯成蛋白的量因而減少或消除。
也可使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法，通過隨機(jī)或特異誘變的方法進(jìn)一步構(gòu)建芽孢桿菌突變體細(xì)胞，這些方法包括，但不限于，化學(xué)誘變(見，例如，Hopwood，The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology(J.R.Norris和D.W.Ribbons編輯)pp 363-433，Academic Press，New York，1970)和轉(zhuǎn)座(見，例如，Youngman等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA802305-2309)?？赏ㄟ^將親代細(xì)胞進(jìn)行誘變并且篩選基因表達(dá)已經(jīng)減少或消除的突變體細(xì)胞進(jìn)行基因的修飾?？赏ㄟ^，例如，使用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變劑，使用適當(dāng)?shù)墓押塑账?，或者對DNA序列進(jìn)行產(chǎn)生誘變的PCR，進(jìn)行特異的或隨機(jī)的誘變。此外，可通過使用這些誘變方法中的任意組合進(jìn)行誘變。
適于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’-亞硝基胍(NTG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸鈉、甲酸、和核苷酸類似物。當(dāng)使用這類試劑時，經(jīng)典地是通過在適當(dāng)?shù)臈l件下，在存在選擇性誘變劑時，培養(yǎng)將要誘變的親代細(xì)胞，選擇顯示基因表達(dá)減少或無表達(dá)的突變細(xì)胞完成誘變。
如這里所述，在本發(fā)明的方法中，可以修飾紅色色素的產(chǎn)生中所涉及的芽孢桿菌細(xì)胞的cypX基因或yvmC基因，或者兩者。根據(jù)Berka等，2002，Molecular Microbiology 431331-1345的方案，通過芽孢桿菌ORFs微陣列(microarray)分析，鑒定了cypX-yvmC操縱子是在紅色色素形成中所涉及的潛在位點。應(yīng)當(dāng)理解的是，術(shù)語“第二核酸序列”可以包括cypX和yvmC基因之一或兩者。
在一個優(yōu)選的實施方案中，cypX包括與SEQ ID NO1具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少90％，甚至最優(yōu)選至少95％同源性的核酸序列。在最優(yōu)選的實施方案中，cypX包括SEQ ID NO1的核酸序列。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，cypX由SEQID NO1的核酸序列組成。
在優(yōu)選的實施方案中，yvmC包括與SEQ ID NO3具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少90％，甚至最優(yōu)選至少95％同源性的核酸序列。在最優(yōu)選的實施方案中，yvmC包括SEQ ID NO3的核酸序列。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，yvmC由SEQID NO3的核酸序列組成。
為了本發(fā)明的目的，通過Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80726-730)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，用同一性表和下列多重序列對比參數(shù)間隙罰分為10和間隙長度罰分為10，測定兩個核酸序列之間的同源性程度。配對(Pairwise)對比參數(shù)是Ktuple＝3，間隙罰分＝3，窗口＝20。
可使用從其它產(chǎn)生紅色色素的微生物來源的，與這里描述的，在紅色色素的產(chǎn)生中涉及的核酸序列同源或互補(bǔ)的核酸序列，修飾所選芽孢桿菌菌株中的相應(yīng)基因。
在優(yōu)選的實施方案中，在芽孢桿菌突變體細(xì)胞中紅色色素的產(chǎn)生中所涉及基因的修飾不用選擇性標(biāo)記標(biāo)記。
可通過在反選擇(counter-selection)培養(yǎng)基上培養(yǎng)突變體，除去選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因含有其5’和3’末端側(cè)翼的重復(fù)序列，當(dāng)對突變體細(xì)胞進(jìn)行反選擇時，該重復(fù)序列將有利于通過同源重組選擇性標(biāo)記基因的環(huán)出。也可以通過同源重組的方法，通過將含有缺陷基因的5’和3’區(qū)，但缺乏選擇性標(biāo)記基因的核酸片段引入到突變體細(xì)胞中，隨后通過在反選擇培養(yǎng)基上的選擇，除去選擇性標(biāo)記基因。通過同源重組，用缺乏選擇性標(biāo)記基因的核酸片段替換含有選擇性標(biāo)記基因的缺陷基因。也可以使用現(xiàn)有技術(shù)中的其它已知方法。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的方法不限于獲得芽孢桿菌突變體細(xì)胞的特定模式?？稍跇?gòu)建產(chǎn)生生物物質(zhì)的細(xì)胞的任何步驟中，將在紅色色素的產(chǎn)生中所涉及基因的修飾引入到親代細(xì)胞中。優(yōu)選在指導(dǎo)異源生物物質(zhì)合成的基因引入前，已將芽孢桿菌突變體細(xì)胞變成缺乏紅色色素。
在本發(fā)明的另一方面，芽孢桿菌突變體細(xì)胞可另外含有修飾，例如，對生物物質(zhì)的產(chǎn)生、回收或應(yīng)用有害的其它基因的缺失或破壞。在優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞是缺乏蛋白酶的細(xì)胞。在更優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞含有aprE和nprE的破壞或缺失。在另一個優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞不產(chǎn)生孢子。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞含有spoIIAC的破壞或缺失。在另一個優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞含有在表面活性素(surfactin)合成中所涉及基因中的一個基因，例如，srfA，srfB，srfC，和srfD的破壞或缺失。見，例如，美國專利No.5,958,728。其它基因，例如，也可以破壞或缺失對生物物質(zhì)的產(chǎn)生、回收或應(yīng)用有害的amyE基因。
在本發(fā)明的方法中，當(dāng)在相同產(chǎn)生條件下培養(yǎng)時，優(yōu)選芽孢桿菌突變體細(xì)胞至少產(chǎn)生與相應(yīng)親代芽孢桿菌細(xì)胞相同量的生物物質(zhì)。在更優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)在相同產(chǎn)生條件下培養(yǎng)時，突變細(xì)胞比相應(yīng)親代芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生至少高約25％，優(yōu)選至少高約50％，更優(yōu)選至少高約75％，最優(yōu)選至少高約100％的生物物質(zhì)。
使用現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法，在適合產(chǎn)生異源生物物質(zhì)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌突變體細(xì)胞。例如，可在合適的培養(yǎng)基中和在允許生物物質(zhì)表達(dá)和/或分離的條件下，在實驗室或工業(yè)使用的發(fā)酵罐中，通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批(fed-batch)、或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞。使用現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法，在含有碳和氮源以及無機(jī)鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可從商品供應(yīng)商那里買到，或者可根據(jù)已公開的成分(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(the AmericanType Culture Collection)的目錄中公開的成分)制備?？蓮呐囵B(yǎng)基中直接回收分泌的生物物質(zhì)。
可使用現(xiàn)有技術(shù)中對生物物質(zhì)特異的已知方法檢測生物物質(zhì)。這些檢測方法可包括使用特異抗體、高效液相層析、毛細(xì)層析、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如，可使用酶測定的方法測定酶的活性。對于許多酶來說，測定酶活性的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的(見，例如，D.Schomburg和M.Salzmann(編輯)，Enzyme Handbook，Springer-Verlag，NewYork，1990)。
可通過現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法分離得到的生物物質(zhì)。例如，可從培養(yǎng)基中通過常規(guī)方法分離目標(biāo)多肽，這些方法包括，但不限于，離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。接著可進(jìn)一步通過現(xiàn)有技術(shù)中的各種已知方法純化分離的多肽，這些方法包括，但不限于，層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚集、和大小排阻層析)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦(IEF))、差異溶解(例如，硫酸銨沉淀)、或抽提(見，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)。可從培養(yǎng)基中分離目標(biāo)代謝物，例如，通過抽提、沉淀、或差異溶解、或現(xiàn)有技術(shù)中的任何已知方法。接著可使用適合代謝物的方法進(jìn)一步純化分離的代謝物。
異源生物物質(zhì)可以是任何生物聚合物或代謝物。生物物質(zhì)可通過構(gòu)成生物合成或代謝途徑中的單個基因或一系列基因編碼。因此，術(shù)語“指導(dǎo)異源生物物質(zhì)合成的第一核酸序列”應(yīng)當(dāng)被理解為包括在生物物質(zhì)的產(chǎn)生中所涉及的一個或多個基因。術(shù)語“異源生物物質(zhì)”在這里被定義為不是宿主細(xì)胞產(chǎn)生的生物物質(zhì)；天然生物物質(zhì)，其中進(jìn)行結(jié)構(gòu)的修飾改變天然的生物物質(zhì)，例如，改變天然多肽的蛋白序列；或者由于通過重組DNA技術(shù)對宿主細(xì)胞的處理，例如，使用更強(qiáng)的啟動子，導(dǎo)致其表達(dá)量上改變的天然生物物質(zhì)。
在本發(fā)明的方法中，生物聚合物可以是任何一種生物聚合物。術(shù)語“生物聚合物”在這里被定義為具有相同、相似或相異亞單位(單體)的鏈(或聚合物)。生物聚合物可以是，但不限于，核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)、或者多糖。
在優(yōu)選的實施方案中，生物聚合物是多肽。多肽可以是任何具有目標(biāo)生物活性的多肽。術(shù)語“多肽”在這里并不意味著是指特定長度的編碼產(chǎn)物，因此，該術(shù)語包括肽、寡肽以及蛋白。術(shù)語“多肽”也包括兩個或更多結(jié)合起來形成編碼產(chǎn)物的多肽。多肽也包括雜種多肽，其包括從至少兩個不同多肽中獲得的部分或全部多肽序列的組合，其中一個或多個多肽可以與芽孢桿菌細(xì)胞異源。多肽進(jìn)一步包括上述多肽和雜種多肽的天然等位基因變異和基因工程變異。
優(yōu)選地，異源多肽是抗體、抗原、抗菌肽、酶、生長因子、激素、免疫膨脹物(immunodilator)、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、或轉(zhuǎn)錄因子。
在優(yōu)選的實施方案中，異源多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。在更優(yōu)選的實施方案中，多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精、糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖腦苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突變酶、氧化酶、果膠降解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、尿激酶、或木聚糖酶。
在優(yōu)選的實施方案中，生物聚合物是多糖。多糖可以是任何多糖，包括，但不限于，粘多糖(例如，肝素和透明質(zhì)酸)和含氮的多糖(例如，殼多糖)。在更優(yōu)選的實施方案中，多糖是透明質(zhì)酸。
在本發(fā)明的方法中，代謝物可以是任何代謝物。代謝物可被一種或多種基因編碼。術(shù)語“代謝物”包括初級代謝產(chǎn)物和次生代謝物。初級代謝產(chǎn)物是細(xì)胞的初級或一般代謝的產(chǎn)物，其與能量代謝、生長、和結(jié)構(gòu)有關(guān)。次生代謝物是次生代謝的產(chǎn)物(見，例如，R.B.Herbert，The Biosynthesis ofSecondary Metabolites，Chapman和Hall，New York，1981)。
初級代謝物可以是，但不限于，氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯、或維生素。
次生代謝物可以是，但不限于，生物堿、香豆素、黃酮類化合物、聚酮化合物、奎寧、類固醇、或萜。在優(yōu)選的實施方案中，次生代謝物是抗生素、拒食劑、引誘劑、殺菌劑、殺真菌劑、激素、殺蟲劑、或滅鼠劑。
在本發(fā)明的方法中，芽孢桿菌細(xì)胞的突變體是重組細(xì)胞，含有指導(dǎo)異源生物物質(zhì)，例如，多肽，合成的核酸序列，其有利于在生物物質(zhì)的重組產(chǎn)生中使用。優(yōu)選用含有指導(dǎo)異源生物物質(zhì)合成的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，隨后將載體整合到染色體內(nèi)?！稗D(zhuǎn)化”意思是將含有核酸序列的載體引入到宿主細(xì)胞內(nèi)，維持載體成為染色體的組成部分或者成為自我復(fù)制的染色體外載體。整合通常被認(rèn)為是一種優(yōu)勢，因為核酸序列更有可能被穩(wěn)定維持在細(xì)胞內(nèi)。通過同源重組、非同源重組、或轉(zhuǎn)座將載體整合到染色體內(nèi)。
可從任何原核的、真核的、或其它來源，例如，古細(xì)菌中獲得指導(dǎo)異源生物物質(zhì)合成的核酸序列。至于本發(fā)明的目的，這里使用的與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得”意味著生物物質(zhì)是通過來源或通過已將來源的基因插入到其中的細(xì)胞產(chǎn)生的。
在本發(fā)明的方法中，芽孢桿菌細(xì)胞的突變體可用于重組產(chǎn)生芽孢桿菌細(xì)胞的天然生物物質(zhì)?？赏ㄟ^重組方法產(chǎn)生天然物質(zhì)，例如，通過將指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的基因置于不同啟動子的調(diào)控下提高物質(zhì)的表達(dá)、通過使用，例如，信號序列，加速其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外、或者增加指導(dǎo)芽孢桿菌細(xì)胞正常產(chǎn)生的生物物質(zhì)合成的基因的拷貝數(shù)。因此，在術(shù)語“異源生物物質(zhì)”的范圍內(nèi)，本發(fā)明也包括天然生物物質(zhì)的這樣的重組產(chǎn)生，在某種程度上這樣的表達(dá)包括使用不屬于芽孢桿菌細(xì)胞的遺傳元件，或者使用經(jīng)過操作，以不在宿主細(xì)胞中正常存在的方式起作用的天然元件。
用于分離或克隆指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的核酸序列的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，包括從基因組DNA中分離、從cDNA中制備、或它們的組合。例如，可通過使用公知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，從這樣的基因組DNA中進(jìn)行核酸序列的克隆。見，例如，Innis等，1990，PCR ProtocolsA Guide to Methodsand Applicatio。n，Academic Press，New York?？寺∵^程可包括切除和分離含有指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的核酸序列的期望核酸片段、將該片段插入到載體分子中以及將重組載體摻入到將復(fù)制核酸序列的多拷貝或克隆的芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)。核酸序列可以是基因組序列、cDNA序列、RNA序列、半合成序列、合成起點序列、或它們的任一組合。
在本發(fā)明的方法中，生物物質(zhì)是異源多肽，這種多肽也可包括融合多肽，其中在多肽或其片段的N-末端或C-末端融合另一個多肽。通過將編碼一種多肽的核酸序列(或其部分)融合到編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)上產(chǎn)生融合多肽。現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列，使得它們符合讀框，并且在相同啟動子和終止子的調(diào)控下表達(dá)融合多肽。
“核酸構(gòu)建物”這里定義為核酸分子，單鏈或雙鏈，其從天然存在的基因中分離，或者對其進(jìn)行修飾以含有不同于天然存在方式結(jié)合和并列的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建物含有編碼序列的表達(dá)所需的所有調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建物可以與術(shù)語表達(dá)盒具有相同的含義。術(shù)語“編碼序列”這里定義為當(dāng)將其置于下述調(diào)控序列的調(diào)控下時，被轉(zhuǎn)錄成mRNA并且翻譯成目標(biāo)生物物質(zhì)的序列。通常通過5’-端的翻譯起始密碼子ATG和3’-端的翻譯終止密碼子確定編碼序列的邊界。編碼序列可包括，但不限于，DNA、cDNA、以及重組核酸序列。
可以各種方式操縱指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的分離的核酸序列，為生物物質(zhì)的表達(dá)作準(zhǔn)備。在其插入到載體之前，核酸序列的操作可以是期望的或必須的，這取決于表達(dá)載體或芽孢桿菌宿主細(xì)胞。利用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。
在與調(diào)控序列相容的條件下，可將含有指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的核酸序列的核酸構(gòu)建物，可操作地連接到能夠在芽孢桿菌細(xì)胞突變體中指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的一個或多個調(diào)控序列上。
術(shù)語“調(diào)控序列”這里定義為包括核酸序列的編碼序列的表達(dá)所必需的或有利于表達(dá)的所有元件。每個調(diào)控序列對于指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的核酸序列可以是天然的或是異源的。這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)區(qū)、啟動子、信號序列以及轉(zhuǎn)錄終止子。最小限度，調(diào)控序列包括啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號?？梢詾檎{(diào)控序列提供用于引入特異性限制酶切位點目的的接頭，便于將調(diào)控序列和指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的核酸序列的編碼區(qū)相連。
調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，一種被芽孢桿菌細(xì)胞識別，用于核酸序列表達(dá)的核酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)生物物質(zhì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選芽孢桿菌細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，可從指導(dǎo)細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的生物物質(zhì)合成的基因中獲得，與芽孢桿菌細(xì)胞同源，或異源。指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄的合適的啟動子的實例，具體在芽孢桿菌細(xì)胞中，是那些從大腸桿菌(E.coli)lac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌maltogenic淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、以及原核β-內(nèi)酰胺酶基因中獲得的啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 753727-3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA8021-25)。更多的啟動子描述在Scientific American，1980，24274-94中的“Useful proteins from recombinant bacteria”；和在J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Clonin，A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor，New York中。
調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，一種被芽孢桿菌細(xì)胞識別終止轉(zhuǎn)錄的序列。將終止子序列可操作地連接到指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的核酸序列的3’末端。在本發(fā)明中可使用在所選芽孢桿菌細(xì)胞中起作用的任何終止子。
調(diào)控序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，對通過芽孢桿菌細(xì)胞翻譯很重要的mRNA的非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列被可操作地連接到指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的核酸序列的5’末端。在本發(fā)明中可使用在所選的芽孢桿菌細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)序列。
調(diào)控序列也可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼連接到能指導(dǎo)所表達(dá)多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的多肽氨基末端的氨基酸序列。信號肽編碼區(qū)可以是多肽的天然序列或者可從異源來源中獲得。核酸序列的編碼序列的5’端可以內(nèi)在地含有在翻譯讀框中與編碼所分泌多肽的編碼區(qū)片段天然連接的信號肽編碼區(qū)。或者，編碼序列的5’末端可含有與編碼所分泌多肽的編碼序列部分異源的信號肽編碼區(qū)。由于編碼序列正常不含有信號肽編碼區(qū)，異源信號肽編碼區(qū)可以是必須的?；蛘撸瑸榱颂岣叨嚯南鄬τ谂c編碼序列正常相連的天然信號肽編碼區(qū)的分泌，異源信號肽編碼區(qū)可以僅替換天然信號肽編碼區(qū)。可從芽孢桿菌種的淀粉酶或蛋白酶基因中獲得信號肽編碼區(qū)。然而，在本發(fā)明中可使用能夠指導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入所選芽孢桿菌細(xì)胞分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)。
芽孢桿菌細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從下列基因中獲得的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌NCIB 11837(maltogenic)淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢桿菌prsA基因。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews57109-137描述了更多的信號肽。
在本發(fā)明的方法中，可使用含有核酸序列、啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體用于重組產(chǎn)生多肽或其它生物物質(zhì)?？蓪⑸鲜龈鞣N核酸和調(diào)控序列連接起來制備重組表達(dá)載體，該載體可包括一個或多個適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c，允許指導(dǎo)多肽或生物物質(zhì)合成的核酸序列在這些位點上的插入或者取代?；蛘撸怂嵝蛄锌赏ㄟ^將核酸序列或含有該序列的核酸構(gòu)建物插入到合適的表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)。在產(chǎn)生的表達(dá)載體中，將編碼序列置于載體中，使得編碼序列被可操作地與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列相連，可以導(dǎo)致分泌。
重組表達(dá)載體可以是能方便地進(jìn)行重組DNA過程并且能導(dǎo)致核酸序列表達(dá)的任何載體。載體的選擇總是視載體與將引入載體的芽孢桿菌細(xì)胞之間的相容性而定。載體可以是線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外的實體存在的載體，載體的復(fù)制不受染色體復(fù)制的影響，例如，質(zhì)粒、染色體外的元件、微型染色體、或人工染色體。載體可含有確保自我復(fù)制的任何方法。或者，當(dāng)引入到芽孢桿菌細(xì)胞中時，載體可以是一種被整合到基因組中并且與其整合的染色體一同復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)粒，或者是兩個或多個載體或質(zhì)粒，它們共同含有被引入到芽孢桿菌細(xì)胞基因組中的全部DNA或轉(zhuǎn)座子。
當(dāng)被引入到芽孢桿菌細(xì)胞中時，載體可以被整合到芽孢桿菌細(xì)胞基因組中。對于整合，載體可以依賴指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的核酸序列，或者通過同源重組將載體穩(wěn)定整合到基因組中的載體的任何其它元件?；蛘?，載體可含有通過同源重組指導(dǎo)整合到芽孢桿菌細(xì)胞基因組內(nèi)的額外的核酸序列。該額外的核酸序列能夠使載體在染色體中的精確位置整合到芽孢桿菌細(xì)胞基因組中。為了增加在精確位置上整合的可能性，整合的元件應(yīng)當(dāng)優(yōu)選含有足夠核苷酸數(shù)量的核酸，如100到1,500個堿基對，優(yōu)選400到1,500個堿基對，最優(yōu)選800到1,500個堿基對，它們與對應(yīng)的靶序列高度同源以提高同源重組的可能性。整合的元件可以是與芽孢桿菌細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合的元件可以是非編碼或編碼核酸序列。
為了自主復(fù)制，載體可進(jìn)一步含有使載體在考慮的芽孢桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌(E.coli)中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的復(fù)制起點，以及允許在芽孢桿菌中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1。復(fù)制起點可以是具有突變導(dǎo)致其功能在芽孢桿菌細(xì)胞中是溫度敏感的復(fù)制起點(見，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA751433)。
可將多于一個拷貝的指導(dǎo)目標(biāo)生物物質(zhì)合成的核酸序列引入到芽孢桿菌細(xì)胞中，擴(kuò)大核酸序列的表達(dá)。可使用現(xiàn)有技術(shù)中的公知方法，通過將序列的至少一個額外拷貝整合到芽孢桿菌細(xì)胞基因組中以及選擇轉(zhuǎn)化體從而獲得核酸序列的穩(wěn)定擴(kuò)增。在WO 94/1496中描述了一種獲得基因組DNA序列擴(kuò)增的便利方法。
載體優(yōu)選含有允許方便選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一個和多個選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是一種基因，其產(chǎn)物提供殺蟲劑抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型原養(yǎng)型等特性。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實例是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因、或者賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素或四環(huán)素的標(biāo)記。此外，可通過共轉(zhuǎn)化方式進(jìn)行選擇，例如，如在WO 91/09129中所述，選擇性標(biāo)記是在獨立的載體上。
用于將上述元件連接起來構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的方法(見，例如，Sambrook等，1989，同上)。
芽孢桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體可通過下列方法產(chǎn)生，例如，通過原生質(zhì)轉(zhuǎn)化(見，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)、通過使用感受態(tài)細(xì)胞(見，例如，Young和Spizize，1961，Journal ofBacteriology 81823-829，或者Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal ofMolecular Biology 56209-221)、通過電穿孔(見，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)、或者通過接合(見，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695271-5278)。
本發(fā)明也涉及獲得親代芽孢桿菌細(xì)胞突變體的方法，包括(a)將含有在紅色色素的產(chǎn)生中所涉及的cypX和yvmC基因中至少一種的修飾的第一核酸序列引入到芽孢桿菌細(xì)胞中；和(b)從步驟(a)中鑒定含有修飾核酸序列的突變體細(xì)胞，其中突變體細(xì)胞不產(chǎn)生紅色色素。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及親代芽孢桿菌細(xì)胞突變體，含有指導(dǎo)異源生物物質(zhì)合成的第一核酸序列以及包含在紅色色素的產(chǎn)生中所涉及的cypX和yvmC基因中至少一種的修飾的第二核酸序列，其中，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時，突變體細(xì)胞產(chǎn)生比親代芽孢桿菌細(xì)胞更少的紅色色素。
本發(fā)明通過下列實施例進(jìn)一步描述，下列實施例不應(yīng)當(dāng)被解釋為對本實施例所有引物和寡核苷酸都由MWG Biotech，Inc.，High Point，NC提供。
使用Anagnostopoulos和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81741-746描述的方法將枯草芽孢桿菌菌株制備成感受態(tài)。
用ABI 3700測序儀儀(Sequencing)(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行DNA測序。
實施例1使用DNA微陣列鑒定cypX-yvmC和yvmB-yvmA操縱子枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)RB128株是根據(jù)美國專利No.5,891,701的方法獲得的枯草芽孢桿菌A164Δ5株(刪除spoIIAC，aprE，nprE，amyE，和srfC基因的枯草芽孢桿菌ATCC 6051A)?？莶菅挎邨U菌RB128株含有編碼芽孢桿菌麥芽糖生成(maltogenic)淀粉酶的異源基因。根據(jù)下列方案，通過枯草芽孢桿菌RB128株的N-甲基-N’亞硝基胍(NTG)誘變獲得枯草芽孢桿菌BRG1株。用三種分別產(chǎn)生98.2％、99.5％和99.9％殺死率的不同濃度的N-甲基-N’亞硝基胍(NTG)0.26mg/ml、0.53mg/ml和1.06mg/ml處理生長到對數(shù)期的枯草芽孢桿菌RB128株細(xì)胞。在24孔板的1ml孔內(nèi)，每個處理組的100微升細(xì)胞過度生長到6倍。將生長暈在10％甘油中保藏，并在-80℃中凍存。對于每種處理，文庫的大小分別是大約15500、4200和250個突變體。從0.26mg/ml NTG處理的枯草芽孢桿菌RB128株中分離枯草芽孢桿菌BRG1突變體，在40-41℃，pH 7±0.2的1.5升培養(yǎng)基中培養(yǎng)BRG1 48小時，其中每升培養(yǎng)基由50克水解蛋白、6.5克KH2PO4、4.5克Na2HPO4、3.0克(NH4)2SO4、2.0克檸檬酸鈉-2H2O、3.0克MgSO4、0.15毫克生物素、0.5克CaCl2-2H2O、和痕量金屬組成。以每小時每升8克的最大速率向發(fā)酵提供糖。用空氣以每分鐘1到2升的速度向培養(yǎng)物噴射，并以1300rpm的速度攪拌培養(yǎng)物。與枯草芽孢桿菌RB128株整個肉湯的顏色是深褐色的相比，枯草芽孢桿菌BRG1株的整個肉湯的顏色是淡褐色的。在整個枯草芽孢桿菌RB128株肉湯的細(xì)胞沉淀中可以看到紅色色素，而在枯草芽孢桿菌BRG1株的細(xì)胞沉淀中沒有觀察到紅色色素。
從枯草芽孢桿菌RB128和BRG1株的6、12、24、29和46小時發(fā)酵樣品(10ml)中獲取總細(xì)胞RNA。從儲藏在-80℃的發(fā)酵樣品中制備的細(xì)胞沉淀中獲取RNA。為了制備RNA，將冷凍的細(xì)胞沉淀在1ml焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中重懸，使用Fast RNA Blue kit(Bio 101，Inc.，Vista，CA)制備9個復(fù)制品。然后將復(fù)制品匯合到一個試管中用以制備cDNA探針。
制備每個時間點的10個復(fù)制的cDNA靶，并且根據(jù)Berka等，2002，Molecular Microbiology 431331-1345和Kane等，2000，Nucleic AcidsResearch 284552-4557描述的方法，與枯草芽孢桿菌的ORFs PCR片段微陣列雜交。根據(jù)Eisen和Burn，1999，Methods in Enzymology 303179-205的方法，用Cy5(Amersham Corporation，Arlington Heights，IL)標(biāo)記枯草芽孢桿菌RB128株的cDNA，而用Cy3(Amersham Corporation，Arlington Heights，IL)標(biāo)記枯草芽孢桿菌BRG1株的cDNA。分別用在532nm和632nm處工作的固態(tài)激光檢測Cy3(一種綠色熒光染料)和Cy5(紅色熒光染料)報道分子。用QuantArray(PerkinElmer Lifesciences，Inc.，Boston，MA)掃描陣列并格式化用于分析，將數(shù)據(jù)輸入到GeneSpring(Silicon Genetics，Inc.，Redwood City，CA)中進(jìn)行最終分析。用斯坦福大學(xué)(Stanford University)的SAM Exceladd-in(Tusher等，2001，Proceedings of the National Academy of Sciences USA985116-5121)對復(fù)制的載玻片進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)意義分析。cypX-yvmC和yvmB-yvmA操縱子被鑒定為在紅色色素，普切明的形成中涉及的潛在位點(cypX圖1，SEQ ID NOs1和2，登記號BG12580；yvmC圖2，SEQ ID NOs3和4，登記號BG14121；yvmB圖3，SEQ ID NOs5和6，登記號BG11018；以及yvmA圖4，SEQ ID NOs7和8，登記號BG14120)。與枯草芽孢桿菌RB128株相比，在12-46小時時間點，枯草芽孢桿菌BRG1株中的cypX-yvmC和yvmB-yvmA操縱子一致下調(diào)。
使用兩個與枯草芽孢桿菌ORFs寡核苷酸微陣列雜交的復(fù)制cDNA靶，進(jìn)行第二微陣列實驗。寡核苷酸購于Compugen，Inc.，Jamesburg，NJ，并且根據(jù)Berka等，2002，同上描繪的方法，將寡核苷酸以10μM的濃度印在聚L-賴氨酸覆蓋的載玻片上，形成每個載玻片上4個枯草芽孢桿菌基因組的密度。根據(jù)上述方法標(biāo)記枯草芽孢桿菌RB128和BRG1株的cDNAs。使用GenePix 4000B掃描儀和GenePix Pro version 4.1軟件(Axon Instruments，Inc.，Union City，CA)掃描陣列并格式化用于分析。用上述SAM Excel add-in對復(fù)制的基因組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)意義分析，并將經(jīng)鑒定為有意義的基因輸入到GeneSpring version 4.2中。在這種第二微陣列的實驗中，僅cypX-yvmC操縱子被鑒定為在紅色色素形成中所涉及的潛在位點。
實施例2枯草芽孢桿菌MaTa17株的構(gòu)建使用引物1和2，從枯草芽孢桿菌BRG1株中PCR擴(kuò)增cypX-yvmC和yvmB-yvmA操縱子，作為單一片段。
引物15’-CATGGGAGAGACCTTTGG-3’(SEQ ID NO9)引物25’-GTCGGTCTTCCATTTGC-3’(SEQ ID NO10)
擴(kuò)增反應(yīng)(50μl)由下列物質(zhì)構(gòu)成200ng枯草芽孢桿菌BRG1株染色體DNA、引物1和2每種0.4μM、dATP，dCTP，dGTP，和dTTP每種200μM、含有1.5mM MgCl2的1X ExpandTMHigh Fidelity緩沖液、以及2.6單位的ExpandTMHigh Fidelity PCR系統(tǒng)酶混合物(Roche Diagnostic Corporation，Indiabapolis，IN)。根據(jù)生產(chǎn)商的要求(Genomic DNA Handbook，QIAGEN，Inc.，Valencia，CA，1999-2001，pp.38-47)，使用QIAGEN tip-20柱(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)獲得枯草芽孢桿菌BRG1株染色體DNA。在RoboCycler 40熱循環(huán)儀(Stratagene，Inc，La Jolla，CA)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序是1個循環(huán)，95℃3分鐘；10個循環(huán)，每個循環(huán)95℃ 1分鐘，58℃ 1分鐘，以及68℃ 4分鐘；20個循環(huán)，每個循環(huán)95℃ 1分鐘，58℃ 1分鐘，68℃ 4分20秒；隨后1個循環(huán)，72℃ 7分鐘。使用0.8％瓊脂糖-25mM Tris堿-25mM硼酸鹽-0.5mM乙二胺四乙酸二鈉緩沖液(0.5X TBE)凝膠，通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物。
根據(jù)生產(chǎn)商的要求(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)，使用TA-TOPO克隆試劑盒將得到的含有cypX-yvmC和yvmB-yvmA操縱子的片段克隆到pCR2.1中，并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)OneShotTM細(xì)胞中。在每毫升補(bǔ)充了100μg氨芐青霉素的酵母-胰蛋白胨(2X YT)瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。根據(jù)生產(chǎn)商的要求，使用QIAGEN tip-20柱從幾個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用M13(-20)前向引物、M13反向引物以及下列所示引物3-18，通過DNA測序進(jìn)行證實。M13(-20)前向引物和M13反向引物是從Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA獲得。得到的質(zhì)粒稱為pMRT084(圖5)。
引物35’-CGACCACTGTATCTTGG-3’(SEQ ID NO11)引物45’-GAGATGCCAAACAGTGC-3’(SEQ ID NO12)引物55’-CATGTCCATCGTGACG-3’(SEQ ID NO13)引物65’-CAGGAGCATTTGATACG-3’(SEQ ID NO14)引物75’-CCTTCAGATGTGATCC-3’(SEQ ID NO15)引物85’-GTGTTGACGTCAACTGC-3’(SEQ ID NO16)引物95’-GTTCAGCCTTTCCTCTCG-3’(SEQ ID NO17)引物105’-GCTACCTTCTTTCTTAGG-3’(SEQ ID NO18)引物115’-CGTCAATATGATCTGTGC-3’(SEQ ID NO19)引物125’-GGAAAGAAGGTCTGTGC-3’(SEQ ID NO20)
引物135’-CAGCTATCAGCTGACAG-3’(SEQ ID NO21)引物145’-GCTCAGCTATGACATATTCC-3’(SEQ ID NO22)引物155’-GATCGTCTTGATTACCG-3’(SEQ ID NO23)引物165’-AGCTTTATCGGTGACG-3’(SEQ ID NO24)引物175’-TGAGCACGATTGCAGG-3’(SEQ ID NO25)引物185’-CATTGCGGAGACATTGC-3’(SEQ ID NO26)從枯草芽孢桿菌BRG1中擴(kuò)增并克隆到質(zhì)粒pMRT084中的cypX-yvmC和yvmB-yvmA操縱子和已公開的枯草芽孢桿菌168序列(Kunst等，1997，Nature 390249-256)之間的DNA序列比較顯示，這些序列完全相同。為了產(chǎn)生刪除了這些操縱子的枯草芽孢桿菌株，用BsgI消化質(zhì)粒pMRT084以刪除cypX-yvmC和yvmB-yvmA操縱子的大部分，在每端留下約500個堿基。根據(jù)生產(chǎn)商(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)的要求，用T4DNA聚合酶和蝦堿性磷酸酶(SAP)處理消化過的BsgI DNA。用SmaI消化質(zhì)粒pECC1(Youngman等，1984，Plasmid 121-9)。根據(jù)生產(chǎn)商的要求，使用QIAquick DNA提取試劑盒(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)從0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠中分離pMRT084的大約5100bp的片段和含有氯霉素抗性基因(cat)的pECC1的大約1600bp的片段、將這兩個片段連接、并根據(jù)生產(chǎn)商(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)的要求轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)XL1 Blue細(xì)胞。在每毫升補(bǔ)充了100μg氨芐青霉素的2X YT瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。使用引物19和20，通過PCR擴(kuò)增，鑒定帶有刪除了cypX-yvmC和yvmB-yvmA操縱子大部分的正確質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)液由1ng質(zhì)粒DNA、每種引物0.4μM、dATP，dCTP，dGTP，和dTTP每種200μM、含有2.5mM MgCl2的1X PCR緩沖液II(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)、以及2.5單位AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)組成。反應(yīng)在RoboCycler 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行，反應(yīng)程序是95℃ 10分鐘，1個循環(huán)；25個循環(huán)，每個循環(huán)是95℃1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘；以及72℃ 7分鐘，1個循環(huán)。使用0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠顯示PCR產(chǎn)物。這個構(gòu)建物稱為pMRT086(圖6)。
引物195’-TAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATA-3’(SEQ ID NO27)引物205’-CCGTCGCTATTGTAACCAGT-3’(SEQ ID NO28)
將質(zhì)粒pMRT086用ScaI線性化，并在每毫升0.2μg氯霉素時轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌RB128感受態(tài)細(xì)胞中。在每毫升含有5μg氯霉素的胰蛋白胨血瓊脂堿(TBAB)平板上選擇轉(zhuǎn)化體，在37℃生長16小時。使用QIAGEN tip-20柱，根據(jù)生產(chǎn)商的要求，從幾個轉(zhuǎn)化體中制備染色體DNA。使用引物3和19、3和20、4和19、以及3和20，通過PCR篩選經(jīng)PCR刪除cypX-yvmC和yvmB-yvmA操縱子的氯霉素抗性菌落。在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)液由200ng染色體DNA、每種引物0.4μM、dATP，dCTP，dGTP，和dTTP每種200μM、含有2.5mM MgCl2的1X PCR緩沖液II、以及2.5單位AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶構(gòu)成。反應(yīng)在RoboCycler 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行，反應(yīng)程序是95℃ 10分鐘，1個循環(huán)；25個循環(huán)，每個循環(huán)是95℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘；以及72℃ 7分鐘，1個循環(huán)。使用0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠顯示PCR產(chǎn)物。所得的刪除了cypX-yvmC和yvmB-yvmA的枯草芽孢桿菌RB128株稱為枯草芽孢桿菌MaTa17。
使用實施例1中所描述的相同的培養(yǎng)基和條件對枯草芽孢桿菌MaTa17進(jìn)行發(fā)酵。48小時后，枯草芽孢桿菌MaTa17株沒有產(chǎn)生可觀測到的紅色色素。此外，在實施例1中的第二DNA微陣列分析鑒定了cypX-yvmC操縱子是紅色色素合成中涉及的唯一操縱子，而下面的實施例3和4顯示cypX或yvmC基因的刪除對于紅色色素的消除是必需的。因此，為了檢驗紅色色素的消除有用，在各種枯草芽孢桿菌株，如枯草芽孢桿菌A164Δ5(美國專利No.5,891,701)、枯草芽孢桿菌RB194和RB194 RB197(WO 03/054163)，以及在這里描述的其它枯草芽孢桿菌株中刪除cypX基因，紅色色素的消除將有益于產(chǎn)物的回收。
實施例3枯草芽孢桿菌A164Δ5ΔcypX株的構(gòu)建為了證明cypX基因在紅色色素合成中所起的作用，從枯草芽孢桿菌A164Δ5(美國專利No.5,891,701)中刪除cypX基因。使用質(zhì)粒pMRT122(WO03/054163)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌A164Δ5感受態(tài)細(xì)胞。在每毫升補(bǔ)充了1μg紅霉素和25μg林可霉素的TBAB-瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體，并將轉(zhuǎn)化體在30℃培養(yǎng)24-48小時。通過坎貝爾型(Campbell-type)整合將刪除的cypX基因引入到枯草芽孢桿菌A164Δ5的染色體中，通過在45℃培養(yǎng)新劃線的枯草芽孢桿菌A164Δ5(pMRT122)細(xì)胞平板16小時，選擇產(chǎn)生枯草芽孢桿菌株A164Δ5::pMRT122的健康生長的菌落。將幾個健康生長的菌落接種到1毫升LB肉湯培養(yǎng)基中并在30℃，250rpm過夜培養(yǎng)。使用10μl的培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)傳代至少3次。最后一次傳代后，將培養(yǎng)的細(xì)胞在LB瓊脂平板上劃線分離，并在37℃培養(yǎng)16小時。挑取單個菌落以復(fù)制的方式接種到LB瓊脂平板和每毫升補(bǔ)充了1μg紅霉素和25μg林可霉素的TBAB平板上，在37℃生長16小時。使用REDextract-N-AmpTMPlant PCR試劑盒(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)，根據(jù)下列步驟分離潛在整合體的染色體DNA將單個芽孢桿菌菌落接種到100μl提取液(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)中，在95℃培養(yǎng)10分鐘，然后用等體積的稀釋液(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)稀釋。根據(jù)生產(chǎn)商的要求，使用4μl提取的DNA以及REDextract-N-AmpPCR反應(yīng)混合物和引物12和21進(jìn)行PCR。在RoboCycler 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序是95℃ 9分鐘，1個循環(huán)；3個循環(huán)，每個循環(huán)是95℃1分鐘，52℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘；27個循環(huán)，每個循環(huán)是95℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃ 1分鐘；以及72℃ 5分鐘，1個循環(huán)。在0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠中顯示PCR產(chǎn)物。所得的菌株稱為枯草芽孢桿菌A164Δ5ΔcypX。在每升補(bǔ)充了0.5％蔗糖、0.15mg生物素、24mg硫酸鐵、9.6mg硫酸錳、3mg硫酸銅、6mg氯化鋅以及0.06％檸檬酸的Spizizen’s基本鹽-瓊脂(SMS)平板(Anagnostopoulos和Spizizen，1961，supra)上顯示枯草芽孢桿菌中紅色色素的存在或喪失。當(dāng)與枯草芽孢桿菌A164Δ5比較時，枯草芽孢桿菌A164Δ5ΔcypX似乎是無色的。
引物215’-CATGGGAGAGACCTTTGG-3’(SEQ ID NO29)實施例4枯草芽孢桿菌A164Δ5ΔyvmC株的構(gòu)建為了驗證cypX和/或yvmC是否負(fù)責(zé)紅色色素的合成，將yvmC基因刪除，留下完整的cypX基因。用EcoRI和HindIII消化質(zhì)粒pMRT074(WO 03/054163)和pMRT084。使用QIAquick DNA純化試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的要求，從2％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠中分離pMRT074的大約4300 bp的片段和pMRT084的大約1700 bp的片段，將這兩個片段連接，并用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168Δ4感受態(tài)細(xì)胞。在每毫升補(bǔ)充了1μg紅霉素和25μg林可霉素的TBAB-瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體，在30℃培養(yǎng)24小時。通過用DraI的限制酶切分析，在0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠上鑒定攜帶正確質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。得到的構(gòu)建物稱為pMRT126(圖7)。
將質(zhì)粒pMRT126用Ecl136II/Eco47III消化以刪除yvmC基因，將消化后的片段連接，并用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌A168Δ4。在每毫升補(bǔ)充了1μg紅霉素和25μg林可霉素的TBAB-瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體，在30℃培養(yǎng)24小時。通過用DraI限制酶切分析，在0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠上鑒定攜帶正確質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。得到的質(zhì)粒稱為pMRT128(圖8)。
將質(zhì)粒pMRT128用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌A164Δ5感受態(tài)細(xì)胞。在每毫升補(bǔ)充了1μg紅霉素和25μg林可霉素的TBAB-瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體，在30℃培養(yǎng)24-48小時。通過坎貝爾型(Campbell-type)整合將刪除的yvmC基因引入到枯草芽孢桿菌164Δ5的染色體中，通過在45℃培養(yǎng)新劃線的枯草芽孢桿菌A164Δ5(pMRT128)細(xì)胞平板16小時，選擇健康生長的菌落。將幾個健康生長的菌落接種到1毫升LB肉湯培養(yǎng)基中，在30℃，250rpm過夜培養(yǎng)。使用10μl培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)傳代至少3次。最后一次傳代后，將培養(yǎng)的細(xì)胞在LB瓊脂平板上劃線分離，并在37℃培養(yǎng)16小時。挑取單個菌落，以復(fù)制的方式接種到LB瓊脂平板、每毫升補(bǔ)充了1μg紅霉素和25μg林可霉素的TBAB平板和含有實施例3中描述的痕量金屬的SMS平板上，在37℃生長16-48小時。如在實施例3中描述的，使用REDextract-N-AmpTMPlant PCR試劑盒(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)分離紅霉素敏感菌落的染色體DNA，使用實施例3中描述的PCR循環(huán)條件，用引物7和10，通過PCR篩選刪除的yvmC基因。在0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠中顯示PCR產(chǎn)物。在含有痕量金屬的Spizizen’s基本鹽-瓊脂(SMS)平板上顯示枯草芽孢桿菌中紅色色素的存在或喪失。當(dāng)與野生型菌株比較時，yvmC缺失的菌株似乎是無色的，該菌株稱為枯草芽孢桿菌A164Δ5ΔyvmC。
實施例5枯草芽孢桿菌菌株的發(fā)酵根據(jù)WO 03/054163中描述的方法構(gòu)建枯草芽孢桿菌RB187、RB194和RB197株，在含有1.5升基本鹽培養(yǎng)基的3升發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，其中基本鹽培養(yǎng)基由每升6.5克KH2PO4、4.5克Na2HPO4、3.0克(NH4)2SO4、2.0克檸檬酸鈉、3.0克MgSO4·7H2O、0.15克生物素、15克糖、0.5克CaCl2·2H2O和痕量元素組成。以每小時每升2克糖的速率向發(fā)酵提供糖。以每分鐘1到2升的速度用空氣向培養(yǎng)物噴射，并以1250rpm的速度攪拌培養(yǎng)物。在pH7.0±0.2和32-37℃溫度下維持發(fā)酵。用枯草芽孢桿菌RB187株進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)過12小時，在整個肉湯培養(yǎng)基上清液和細(xì)胞沉淀中可見紅色色素產(chǎn)物，強(qiáng)化發(fā)酵的剩余物，直到48小時仍然可見紅色色素產(chǎn)物。用枯草芽孢桿菌RB194和RB197株進(jìn)行發(fā)酵，沒有觀察到紅色色素產(chǎn)物。表1總結(jié)了在本發(fā)明中所評價菌株的紅色色素合成的結(jié)果。
表1.所評價菌株紅色色素合成的總結(jié)

實施例6地衣芽孢桿菌SJ1904ΔcypX株的構(gòu)建用引物22和23 PCR擴(kuò)增地衣芽孢桿菌SJ1904的cypX基因(美國專利No.5,733,753)。
引物225’-GAATTCGCAGGAGGAACGAGTATG-3’(SEQ ID NO30)引物235’-AAGCTTGAAGATCAGTGAGGCAGC-3’(SEQ ID NO31)擴(kuò)增反應(yīng)(50μl)由200ng地衣芽孢桿菌SJ1904染色體DNA、引物22和23每種0.4μM、dATP，dCTP，dGTP和dTTP每種200μM、含有1.5mM MgCl2的1X ExpandTM高保真緩沖液、以及2.6單位的ExpandTM高保真PCR系統(tǒng)酶混合物(Roche Diagnostic Corporation，Indianapolis，IN)構(gòu)成。根據(jù)生產(chǎn)商的要求，使用QIAGEN tip-20柱獲得地衣芽孢桿菌SJ1904染色體DNA。擴(kuò)增反應(yīng)在RoboCycler 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行，反應(yīng)程序是94℃ 2分鐘，1個循環(huán)；30個循環(huán)，每個循環(huán)是94℃ 1分鐘，52℃ 1分鐘，68℃ 2分鐘；隨后72℃ 7分鐘，1個循環(huán)。使用0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠，通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)生產(chǎn)商的要求，使用TA-TOPO克隆試劑盒將得到的含有cypX基因的片段(大約1300bp)克隆到pCR2.1中，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)OneShotTM細(xì)胞。在每毫升補(bǔ)充了100μg氨芐青霉素的2X YT瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。根據(jù)生產(chǎn)商的要求，使用QIAGEN tip-20柱分離幾個轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA，用M13(-20)前向引物和M13反向引物，通過DNA測序進(jìn)行檢驗。得到的質(zhì)粒稱為pMRT121(圖21)。
用NruI和PmlI消化質(zhì)粒pMRT121刪除cypX基因，在每一端留下約350bp，將兩個片段連接起來，根據(jù)生產(chǎn)商的要求用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)XL1Blue細(xì)胞。在每毫升補(bǔ)充了100μg氨芐青霉素的2X YT瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體，并在37℃培養(yǎng)16小時。通過用DraI限制酶切分析，在2％瓊脂糖-0.5XTBE凝膠上鑒定攜帶正確質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。得到的構(gòu)建物稱為pMRT123(圖10)。
用EcoRI和HindIII消化質(zhì)粒pMRT074和pMRT123。根據(jù)生產(chǎn)商的要求，使用QIAquick DNA純化試劑盒從0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠中分離pMRT123的大約700bp的片段和pMRT074的大約4300bp的片段，將兩個片段連接，用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌A168Δ4感受態(tài)細(xì)胞。在每毫升補(bǔ)充了1μg紅霉素和25μg林可霉素的TBAB-瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體，在30℃培養(yǎng)24小時。通過用DraI限制酶切分析，在2％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠上鑒定攜帶正確質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。得到的構(gòu)建物稱為pMRT124(圖11)。
根據(jù)Xue等，1999，Journal of Microbiological Methods 34183-191描述的方法，使用質(zhì)粒pMRT124轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904電感受態(tài)(electrocompetent)細(xì)胞。電穿孔后，在補(bǔ)充了0.2μg/ml紅霉素的LBSM培養(yǎng)基(含有0.5M山梨糖和0.38M甘露醇的Luria-Bertani)中培養(yǎng)細(xì)胞2.5到3小時，將細(xì)胞鋪于每毫升補(bǔ)充了1μg紅霉素和25μg林可霉素的TBAB-瓊脂平板上，在30°培養(yǎng)24-48小時。通過坎貝爾型(Campbell-type)整合將質(zhì)粒pMRT124中的刪除的cyp基因引入到地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)SJ1904染色體中，通過在50℃培養(yǎng)新劃線的地衣芽孢桿菌A164Δ5(pMRT124)細(xì)胞平板16小時，選擇健康生長的菌落。將幾個健康生長的菌落接種到1毫升LB肉湯培養(yǎng)基中，在30℃，250rpm過夜培養(yǎng)。使用10μl培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)傳代至少3次。最后一次傳代后，將培養(yǎng)的細(xì)胞在LB瓊脂平板上劃線分離，并在37℃培養(yǎng)16小時。挑取單個菌落，以復(fù)制的方式接種到LB瓊脂平板和每毫升補(bǔ)充了1μg紅霉素和25μg林可霉素的TBAB平板上，在37℃生長16小時。如在實施例3中描述的，使用REDextract-N-AmpTMPlant PCR試劑盒分離紅霉素敏感菌落的染色體DNA，使用實施例3中描述的PCR循環(huán)條件，用引物22和23，通過PCR篩選刪除的cypX基因。在0.8％瓊脂糖-0.5X TBE凝膠中顯示PCR產(chǎn)物。得到的菌株稱為地衣芽孢桿菌SJ1904ΔcypX。通過將地衣芽孢桿菌SJ1904和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)SJ1904ΔcypX補(bǔ)充了痕量金屬的Spizizen’s基本鹽-瓊脂(SMS)平板上(實施例3)一起劃線，顯示地衣芽孢桿菌所形成的紅色色素的存在或喪失。平板在37℃培養(yǎng)48小時。當(dāng)與對照菌株比較時，cypX缺失的菌株似乎是無色的，提示紅色色素形成的喪失是通過刪除cypX基因完成的。
實施例7從RB187上清液中分離紅色色素通過用6N HCl將40ml上清液的pH調(diào)整到1.5，分離枯草芽孢桿菌RB187株的肉湯培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的紅色色素。將酸化的肉湯培養(yǎng)基在94℃培養(yǎng)30分鐘，通過在SORVALL 6000B離心機(jī)(SORVALL，Inc.，Newtown，CT)中以2500rpm，4℃離心20分鐘，沉淀色素。將紅色色素用20ml HPLC級水離心洗滌3次，溶于10ml堿性甲醇中，并根據(jù)Canale-Parola，1963，Archiv fürMikrobiologie 46414-427描述的方法，在過量氯化鐵存在的情況下通過酸化將pH調(diào)整到1.5，回收紅色色素。在2M NaOH中紅色色素從600nm到200nm的光譜分析產(chǎn)生了在242nm、280nm和242nm處出現(xiàn)高峰的吸收光譜。這種純化色素的紫外可見光譜與Canale-Parola發(fā)現(xiàn)的普切明吸收光譜相似。溶于堿性甲醇、不溶于酸、以及特有的吸收光譜共同強(qiáng)烈地提示紅色色素就是普切明。
本發(fā)明在這里的描述和要求不應(yīng)當(dāng)被限于這里所公開的具體的實施方案的范圍內(nèi)，因為這些實施方案只是本發(fā)明幾個方面的實例。任何等同的實施方案應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。甚至，對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，除了那些這里所顯示和描述的之外，本發(fā)明的各種改進(jìn)相對于前面的描述將是顯而易見的。這樣的改進(jìn)也應(yīng)當(dāng)落入附加的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。至于沖突，包括定義的本發(fā)明的公開將會控制。
這里引用各種參考，其公開的全部內(nèi)容一并參考。
序列表<110>諾維信生物技術(shù)公司(NOVOZYMES BIOTECH，INC.)<120>在缺乏色素的芽孢桿菌細(xì)胞突變體中生產(chǎn)生物物質(zhì)的方法<130>10302.200-W0<150>US 60/398,853<151>2002-07-26<160>31<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1215<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>1atgagccaat cgattaaatt gtttagtgtg ctttctgatc aatttcaaaa caatccatat 60gcttattttt cacaactgcg ggaggaagat ccggttcatt atgaagagtc gatagacagt120tattttatca gccgctatca tgatgtccgc tatatccttc agcatccgga tatcttcacg180acgaaatcac ttgttgagcg tgccgaacca gtcatgcgag gccctgtgct ggcccaaatg240catggaaaag aacactctgc caaaagaaga attgtagtga gaagctttat cggtgacgca300ctggatcatc tgtctccatt gattaaacaa aatgcagaaa acttgttagc gccttatctt360gaaagaggga aaagtgatct cgtcaatgat tttggaaaga cgtttgcggt gtgcgtcacg420atggacatgc tcgggctgga taaaagagac catgaaaaaa tctctgagtg gcacagcgga480gttgccgatt ttatcacgag tatctctcaa tctcctgaag cgcgggcaca ttcgttatgg540tgcagcgaac agctttccca atacttgatg ccggtcatta aagaacgtcg cgtcaatccg600ggatcagatt taatttcgat cctatgtact tctgaatatg aaggcatggc gctgtcggac660aaggatatac tcgcactgat tcttaatgtg ctgttagccg caacggaacc ggctgataag720acgctggcac tgatgatcta ccatttgctc aacaatcctg agcagatgaa tgatgttttg780gctgaccgtt cgttagttcc gagagccatt gcggagacat tgcgttataa accgccggtt840cagctgattc cgcggcagct gtcccaagat acagtggtcg gcggtatgga aatcaaaaaa900gatacgattg ttttttgtat gatcggtgcg gctaaccggg accctgaagc atttgaacag960cctgacgtgt ttaatattca tcgggaagat cttggtatca agagcgcttt tagcggcgcc 1020gcccggcatc tcgctttcgg atccggcatt cataactgtg taggagcagc ttttgccaaa 1080aacgaaatcg aaattgtagc taatattgtg ctggataaga tgcggaatat cagattagag 1140gaagattttt gttatgctga gtccggtctg tatacacgcg gacctgtttc acttctcgtt 1200gcgtttgacg gggca1215
<210>2<211>405<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>2Met Ser Gln Ser Ile Lys Leu Phe Ser Val Leu Ser Asp Gln Phe Gln1 5 10 15Asn Asn Pro Tyr Ala Tyr Phe Ser Gln Leu Arg Glu Glu Asp Pro Val20 25 30His Tyr Glu Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Phe Ile Ser Arg Tyr His Asp35 40 45Val Arg Tyr Ile Leu Gln His Pro Asp Ile Phe Thr Thr Lys Ser Leu50 55 60Val Glu Arg Ala Glu Pro Val Met Arg Gly Pro Val Leu Ala Gln Met65 70 75 80His Gly Lys Glu His Ser Ala Lys Arg Arg Ile Val Val Arg Ser Phe85 90 95Ile Gly Asp Ala Leu Asp His Leu Ser Pro Leu Ile Lys Gln Asn Ala100 105 110Glu Asn Leu Leu Ala Pro Tyr Leu Glu Arg Gly Lys Ser Asp Leu Val115 120 125Asn Asp Phe Gly Lys Thr Phe Ala Val Cys Val Thr Met Asp Met Leu130 135 140Gly Leu Asp Lys Arg Asp His Glu Lys Ile Ser Glu Trp His Ser Gly145 150 155 160Val Ala Asp Phe Ile Thr Ser Ile Ser Gln Ser Pro Glu Ala Arg Ala165 170 175His Ser Leu Trp Cys Ser Glu Gln Leu Ser Gln Tyr Leu Met Pro Val180 185 190Ile Lys Glu Arg Arg Val Asn Pro Gly Ser Asp Leu Ile Ser Ile Leu195 200 205Cys Thr Ser Glu Tyr Glu Gly Met Ala Leu Ser Asp Lys Asp Ile Leu
210 215 220Ala Leu Ile Leu Asn Val Leu Leu Ala Ala Thr Glu Pro Ala Asp Lys225 230 235 240Thr Leu Ala Leu Met Ile Tyr His Leu Leu Asn Asn Pro Glu Gln Met245 250 255Asn Asp Val Leu Ala Asp Arg Ser Leu Val Pro Arg Ala Ile Ala Glu260 265 270Thr Leu Arg Tyr Lys Pro Pro Val Gln Leu Ile Pro Arg Gln Leu Ser275 280 285Gln Asp Thr Val Val Gly Gly Met Glu Ile Lys Lys Asp Thr Ile Val290 295 300Phe Cys Met Ile Gly Ala Ala Asn Arg Asp Pro Glu Ala Phe Glu Gln305 310 315 320Pro Asp Val Phe Asn Ile His Arg Glu Asp Leu Gly Ile Lys Ser Ala325 330 335Phe Ser Gly Ala Ala Arg His Leu Ala Phe Gly Ser Gly Ile His Asn340 345 350Cys Val Gly Ala Ala Phe Ala Lys Asn Glu Ile Glu Ile Val Ala Asn355 360 365Ile Val Leu Asp Lys Met Arg Asn Ile Arg Leu Glu Glu Asp Phe Cys370 375 380Tyr Ala Glu Ser Gly Leu Tyr Thr Arg Gly Pro Val Ser Leu Leu Val385 390 395 400Ala Phe Asp Gly Ala405<210>3<211>1218<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>3gtgtacactt tggctcatac aaaatcaaag gcagtattga tcttatacac tgtttgcttc60agtgcatttt ttgcatcttt aagccagaac atttattcac ctattcttcc gatcattaaa120gaatcattcc atgtttccac agctatggtg aacctgtcag tctcagtttt tatgattgtg180
acagcaataa tgcaaattat attaggagcg atcattgatt ttaaaggcgc tcggatcgtc240ttgattaccg gtattctggc aacggcagca gccagcatcg gctgtgcggt gactactgac300tttaccttgt ttctgatatt cagaatgata caggcagccg gttccgcagc actgcctctt360attgctgcca caacgatcgg acagctgttt acaggaaatg aacgcgggag tgcaatggga420acgtatcaaa tgctcctgtc tgtcgcaccg gctattgctc cagttctagg aggattcata480ggcggagcag ccggatacga agggattttt tggatacttg cggccatctc tatcgttttg540ctggtgacaa acagcatcac ctttcctaaa gattctccaa ctgaatctat gcagcaagcc600aaaggcaatg tgttcgctca ttataaatca atatttacaa atcgaacagg gaacgtcatt660ttgactttaa gttttgttct ctttttcatt tattttgcag taattgtcta cctcccaata720ttgctgacag agcattacca tatagatgtg ggtatagcag gactgttata tttgccgctg780gcgctgagca cgattgcagg tacgtttctg tttaaaagaa tacaggcaaa aatcgggctg840cacaccttgt ttatcggaag caatgtgatt gccgcctgca gcatcatttt atttgctgtt900acacattccg tttctctcgt tctcatggct ctgacgctgg cactgtttgg catctcgatg960ggggttattc ctcccttgta ctctacaatg attactaatg aatttgagca caacagaggg 1020agtgcaatcg gaatgtttaa ctttatccga tatacaggca tggcagcagg tccgatggta 1080tctgcctact tgctcacaat gatgccgtct gccatgtcct ttagcctcct aggccttgga 1140tttgccgcat tgagcttttg ccttcttccg ccaatgtttt cgccgcagaa gcgcacgaaa 1200caaaaaaagc accacatg 1218<210>4<211>406<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>4Met Tyr Thr Leu Ala His Thr Lys Ser Lys Ala Val Leu Ile Leu Tyr1 5 10 15Thr Val Cys Phe Ser Ala Phe Phe Ala Ser Leu Ser Gln Asn Ile Tyr20 25 30Ser Pro Ile Leu Pro Ile Ile Lys Glu Ser Phe His Val Ser Thr Ala35 40 45Met Val Asn Leu Ser Val Ser Val Phe Met Ile Val Thr Ala Ile Met50 55 60Gln Ile Ile Leu Gly Ala Ile Ile Asp Phe Lys Gly Ala Arg Ile Val65 70 75 80
Leu Ile Thr Gly Ile Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ile Gly Cys Ala85 90 95Val Thr Thr Asp Phe Thr Leu Phe Leu Ile Phe Arg Met Ile Gln Ala100 105 110Ala Gly Ser Ala Ala Leu Pro Leu Ile Ala Ala Thr Thr Ile Gly Gln115 120 125Leu Phe Thr Gly Asn Glu Arg Gly Ser Ala Met Gly Thr Tyr Gln Met130 135 140Leu Leu Ser Val Ala Pro Ala Ile Ala Pro Val Leu Gly Gly Phe Ile145 150 155 160Gly Gly Ala Ala Gly Tyr Glu Gly Ile Phe Trp Ile Leu Ala Ala Ile165 170 175Ser Ile Val Leu Leu Val Thr Asn Ser Ile Thr Phe Pro Lys Asp Ser180 185 190Pro Thr Glu Ser Met Gln Gln Ala Lys Gly Asn Val Phe Ala His Tyr195 200 205Lys Ser Ile Phe Thr Asn Arg Thr Gly Asn Val Ile Leu Thr Leu Ser210 215 220Phe Val Leu Phe Phe Ile Tyr Phe Ala Val Ile Val Tyr Leu Pro Ile225 230 235 240Leu Leu Thr Glu His Tyr His Ile Asp Val Gly Ile Ala Gly Leu Leu245 250 255Tyr Leu Pro Leu Ala Leu Ser Thr Ile Ala Gly Thr Phe Leu Phe Lys260 265 270Arg Ile Gln Ala Lys Ile Gly Leu His Thr Leu Phe Ile Gly Ser Asn275 280 285Val Ile Ala Ala Cys Ser Ile Ile Leu Phe Ala Val Thr His Ser Val290 295 300Ser Leu Val Leu Met Ala Leu Thr Leu Ala Leu Phe Gly Ile Ser Met305 310 315 320Gly Val Ile Pro Pro Leu Tyr Ser Thr Met Ile Thr Asn Glu Phe Glu325 330 335
His Asn Arg Gly Ser Ala Ile Gly Met Phe Asn Phe Ile Arg Tyr Thr340 345 350Gly Met Ala Ala Gly Pro Met Val Ser Ala Tyr Leu Leu Thr Met Met355 360 365Pro Ser Ala Met Ser Phe Ser Leu Leu Gly Leu Gly Phe Ala Ala Leu370 375 380Ser Phe Cys Leu Leu Pro Pro Met Phe Ser Pro Gln Lys Arg Thr Lys385 390 395 400Gln Lys Lys His His Met405<210>5<211>507<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>5atgtctgatt tgacaaaaca gatgatatac gacatatacg tgagactgct gcaccttaat 60gaacaaaaag cgaacacttc acttcagcaa ttttttaagg aggccgcaga agaggatgta120gctgaaattc ccaaaaatat gacaagcatt cacgtcattg actgcatcgg ccagcatgaa180cccattaata atgccggaat tgccagaaaa atgaacttat cgaaagcgaa tgtaacgaaa240atcagcacaa aactgatcaa ggaagaattc attaacagct atcagctgac agataacaaa300aaagaagttt attttaaatt aacccgtaaa ggcagacgga ttttcgactt acatgagaaa360ctgcataaaa aaaaggagct ggctttttac caattcctcg attcattttc acaagaagaa420caaaaggctg tattgaagtt tctagagcag ttgacgtcaa cacttgaagc agaacaaacc480gatgggactc cagacaaacc tgtaaag507<210>6<211>169<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>6Met Ser Asp Leu Thr Lys Gln Met Ile Tyr Asp Ile Tyr Val Arg Leu1 5 10 15Leu His Leu Asn Glu Gln Lys Ala Asn Thr Ser Leu Gln Gln Phe Phe20 25 30Lys Glu Ala Ala Glu Glu Asp Val Ala Glu Ile Pro Lys Asn Met Thr
35 40 45Ser Ile His Val Ile Asp Cys Ile Gly Gln His Glu Pro Ile Asn Asn50 55 60Ala Gly Ile Ala Arg Lys Met Asn Leu Ser Lys Ala Asn Val Thr Lys65 70 75 80Ile Ser Thr Lys Leu Ile Lys Glu Glu Phe Ile Asn Ser Tyr Gln Leu85 90 95Thr Asp Asn Lys Lys Glu Val Tyr Phe Lys Leu Thr Arg Lys Gly Arg100 105 110Arg Ile Phe Asp Leu His Glu Lys Leu His Lys Lys Lys Glu Leu Ala115 120 125Phe Tyr Gln Phe Leu Asp Ser Phe Ser Gln Glu Glu Gln Lys Ala Val130 135 140Leu Lys Phe Leu Glu Gln Leu Thr Ser Thr Leu Glu Ala Glu Gln Thr145 150 155 160Asp Gly Thr Pro Asp Lys Pro Val Lys165<210>7<211>753<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>7gtgaatgaga tgaccggaat ggtaacggaa agaaggtctg tgcattttat tgctgaggca 60ttaacagaaa actgcagaga aatatttgaa cggcgcaggc atgttttggt ggggatcagc120ccatttaaca gcaggttttc agaggattat atttacagat taattggatg ggcgaaagct180caatttaaaa gcgtttcagt tttacttgca gggcatgagg cggctaatct tctagaagcg240cttggaactc cgagaggaaa ggctgaacga aaagtaagga aagaggtatc acgaaacagg300agatttgcag aaagagccct tgtggctcat ggcggggatc cgaaggcgat tcatacattt360tctgatttta tagataacaa agcctaccag ctgttgagac aagaagttga acatgcattt420tttgagcagc ctcattttcg acatgcttgt ttggacatgt ctcgtgaagc gataatcggg480cgtgcgcggg gcgtcagttt gatgatggaa gaagtcagtg aggatatgct gaatttggct540gtggaatatg tcatagctga gctgccgttt tttatcggag ctccggatat tttagaggtg600gaagagacac tccttgctta tcatcgtccg tggaagctgg gtgagaagat cagtaaccat660
gaattttcta tttgtatgcg gccgaatcaa gggtatctca ttgtacagga aatggcgcag720atgctttctg agaaacggat cacatctgaa gga 753<210>8<211>251<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>8Met Asn Glu Met Thr Gly Met Val Thr Glu Arg Arg Ser Val His Phe1 5 10 15Ile Ala Glu Ala Leu Thr Glu Asn Cys Arg Glu Ile Phe Glu Arg Arg20 25 30Arg His Val Leu Val Gly Ile Ser Pro Phe Asn Ser Arg Phe Ser Glu35 40 45Asp Tyr Ile Tyr Arg Leu Ile Gly Trp Ala Lys Ala Gln Phe Lys Ser50 55 60Val Ser Val Leu Leu Ala Gly His Glu Ala Ala Asn Leu Leu Glu Ala65 70 75 80Leu Gly Thr Pro Arg Gly Lys Ala Glu Arg Lys Val Arg Lys Glu Val85 90 95Ser Arg Asn Arg Arg Phe Ala Glu Arg Ala Leu Val Ala His Gly Gly100 105 110Asp Pro Lys Ala Ile His Thr Phe Ser Asp Phe Ile Asp Asn Lys Ala115 120 125Tyr Gln Leu Leu Arg Gln Glu Val Glu His Ala Phe Phe Glu Gln Pro130 135 140His Phe Arg His Ala Cys Leu Asp Met Ser Arg Glu Ala Ile Ile Gly145 150 155 160Arg Ala Arg Gly Val Ser Leu Met Met Glu Glu Val Ser Glu Asp Met165 170 175Leu Asn Leu Ala Val Glu Tyr Val Ile Ala Glu Leu Pro Phe Phe Ile180 185 190Gly Ala Pro Asp Ile Leu Glu Val Glu Glu Thr Leu Leu Ala Tyr His195 200 205
Arg Pro Trp Lys Leu Gly Glu Lys Ile Ser Asn His Glu Phe Ser Ile210 215 220Cys Met Arg Pro Asn Gln Gly Tyr Leu Ile Val Gln Glu Met Ala Gln225 230 235 240Met Leu Ser Glu Lys Arg Ile Thr Ser Glu Gly245 250<210>9<211>18<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>9catgggagag acctttgg18<210>10<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>10gtcggtcttc catttgc 17<210>11<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>11cgaccactgt atcttgg 17<210>12<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>12gagatgccaa acagtgc 17<210>13<211>16<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>13catgtccatc gtgacg 16<210>14<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>14caggagcatt tgatacg 17<210>15<211>16<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>15ccttcagatg tgatcc16<210>16<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>16gtgttgacgt caactgc 17<210>17<211>18<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>17gttcagcctt tcctctcg 18<210>18<211>18<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>18gctaccttct ttcttagg 18<210>19<211>18<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>19cgtcaatatg atctgtgc 18<210>20<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>20ggaaagaagg tctgtgc 17<210>21<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>21cagctatcag ctgacag17<210>22<211>20<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>22gctcagctat gacatattcc 20<210>23<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>23gatcgtcttg attaccg17<210>24<211>16<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>24agctttatcg gtgacg 16<210>25<211>16<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>25tgagcacgat tgcagg 16<210>26<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>26cattgcggag acattgc17<210>27<211>26<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>27tagacaattg gaagagaaaa gagata 26<210>28<211>20<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>28ccgtcgctat tgtaaccagt 20<210>29<211>18<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>29catgggagag acctttgg 18<210>30<211>24<212>DNA<213>地衣形芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<400>30gaattcgcag gaggaacgag tatg 24<210>31<211>24<212>DNA<213>地衣形芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<400>31aagcttgaag atcagtgagg cagc 2權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生異源生物物質(zhì)的方法，包括(a)在適合產(chǎn)生異源生物物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親代芽孢桿菌細(xì)胞的突變體，其中(i)所述突變體細(xì)胞含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指導(dǎo)異源生物物質(zhì)的合成，所述第二核酸序列在參與紅色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一個中包含修飾，且(ii)所述突變體細(xì)胞與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，紅色色素生成有缺陷；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述異源生物物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中第二核酸序列的至少一個基因是cypX。
3.權(quán)利要求1的方法，其中第二核酸序列的至少一個基因是yvmC。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項的方法，其中第一核酸序列編碼的生物物質(zhì)是生物聚合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中生物聚合物選自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。
6.權(quán)利要求5的方法，其中多肽是選自抗原、酶、生長因子、激素、免疫膨脹物、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、或轉(zhuǎn)錄因子。
7.權(quán)利要求6的方法，其中酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。
8.權(quán)利要求5的方法，其中多糖是殼多糖、肝素、玻璃酸(hyaluronan)、或透明質(zhì)酸。
9.權(quán)利要求1-3中任意一項的方法，其中第一核酸序列編碼的生物物質(zhì)是代謝物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中第一核酸序列包含生物合成途徑或代謝途徑。
11.權(quán)利要求1-10中任意一項的方法，其中突變體細(xì)胞含有指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的第一核酸序列的至少兩個拷貝。
12.權(quán)利要求1-11中任意一項的方法，其中芽孢桿菌細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1-11中任意一項的方法，其中芽孢桿菌細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1-11中任意一項的方法，其中芽孢桿菌細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1-14中任意一項的方法，其中突變體細(xì)胞產(chǎn)生的紅色色素比在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的紅色色素至少少約25％。
16.權(quán)利要求1-14中任意一項的方法，其中與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，突變體細(xì)胞不產(chǎn)生可檢測到的紅色色素。
17.權(quán)利要求1-16中任意一項的方法，其中突變體細(xì)胞進(jìn)一步在一或多種編碼蛋白酶的基因中包含修飾。
18.權(quán)利要求17的方法，其中基因是nprE和/或aprE。
19.權(quán)利要求1-18中任意一項的方法，其中突變體細(xì)胞進(jìn)一步在一或多種選自spoIIAC、srfA、srfB、srfC、srfD、或amyE的基因中包含修飾。
20.親代芽孢桿菌細(xì)胞的突變體，含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指導(dǎo)異源生物物質(zhì)的合成，所述第二核酸序列在參與紅色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一個中包含修飾，其中突變體細(xì)胞與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，紅色色素生成有缺陷。
21.權(quán)利要求20的突變體細(xì)胞，其中第二核酸序列的至少一個基因是cypX。
22.權(quán)利要求20的突變體細(xì)胞，其中第二核酸序列的至少一個基因是yvmC。
23.權(quán)利要求20-22中任意一項的突變體細(xì)胞，其中第一核酸序列編碼的生物物質(zhì)是生物聚合物。
24.權(quán)利要求23的突變體細(xì)胞，其中生物聚合物選自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。
25.權(quán)利要求24的突變體細(xì)胞，其中多肽是選自抗原、酶、生長因子、激素、免疫膨脹物、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、或轉(zhuǎn)錄因子。
26.權(quán)利要求25的突變體細(xì)胞，其中酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。
27.權(quán)利要求24的突變體細(xì)胞，其中多糖是殼多糖、肝素、玻璃酸、或透明質(zhì)酸。
28.權(quán)利要求20-22中任意一項的突變體細(xì)胞，其中第一核酸序列編碼的生物物質(zhì)是代謝物。
29.權(quán)利要求20的突變體細(xì)胞，其中第一核酸序列包含生物合成途徑或代謝途徑。
30.權(quán)利要求20-29中任意一項的突變體細(xì)胞，其含有指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的第一核酸序列的至少兩個拷貝。
31.權(quán)利要求20-30中任意一項的突變體細(xì)胞，其中芽孢桿菌細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillusclausii、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
32.權(quán)利要求20-30中任意一項的突變體細(xì)胞，其是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
33.權(quán)利要求20-30中任意一項的突變體細(xì)胞，其是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。
34.權(quán)利要求20-33中任意一項的突變體細(xì)胞，與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，突變體細(xì)胞產(chǎn)生的紅色色素至少少約25％。
35.權(quán)利要求20-33中任意一項的突變體細(xì)胞，與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，突變體細(xì)胞不產(chǎn)生可檢測到的紅色色素。
36.權(quán)利要求20-35中任意一項的突變體細(xì)胞，其進(jìn)一步在一或多種編碼蛋白酶的基因中包含修飾。
37.權(quán)利要求36的突變體細(xì)胞，其中所述基因是nprE和/或aprE。
38.權(quán)利要求20-37中任意一項的突變體細(xì)胞，其進(jìn)一步在一或多種選自spoIIAC、srfA、srfB、srfC、srfD、或amyE的基因中包含修飾。
39.獲得親代芽孢桿菌細(xì)胞的突變體的方法，包括(a)將第一核酸序列和第二核酸序列引入親代芽孢桿菌細(xì)胞中，所述第一核酸序列指導(dǎo)異源生物物質(zhì)的合成，所述第二核酸序列在參與紅色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一個中包含修飾；和(b)鑒定來自步驟(a)的含有修飾核酸序列的突變體細(xì)胞，其中突變體細(xì)胞與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，紅色色素生成有缺陷。
40.權(quán)利要求39的方法，其中第二核酸序列的至少一個基因是cypX。
41.權(quán)利要求39的方法，其中第二核酸序列的至少一個基因是yvmC。
42.權(quán)利要求39-41中任意一項的方法，其中第一核酸序列編碼的生物物質(zhì)是生物聚合物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中生物聚合物選自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。
44.權(quán)利要求43的方法，其中多肽是選自抗原、酶、生長因子、激素、免疫膨脹物、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、或轉(zhuǎn)錄因子。
45.權(quán)利要求44的方法，其中酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。
46.權(quán)利要求43的方法，其中多糖是殼多糖、肝素、玻璃酸、或透明質(zhì)酸。
47.權(quán)利要求39-41中任意一項的方法，其中第一核酸序列編碼的生物物質(zhì)是代謝物。
48.權(quán)利要求39的方法，其中第一核酸序列包含生物合成途徑或代謝途徑。
49.權(quán)利要求39-48中任意一項的方法，其中突變體細(xì)胞含有指導(dǎo)生物物質(zhì)合成的第一核酸序列的至少兩個拷貝。
50.權(quán)利要求39-49中任意一項的方法，其中芽孢桿菌細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
51.權(quán)利要求39-49中任意一項的方法，其中芽孢桿菌細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
52.權(quán)利要求39-49中任意一項的方法，其中芽孢桿菌細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。
53.權(quán)利要求39-52中任意一項的方法，其中突變體細(xì)胞產(chǎn)生的紅色色素比在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的紅色色素至少少約25％。
54.權(quán)利要求39-52中任意一項的方法，其中與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，突變體細(xì)胞不產(chǎn)生可檢測到的紅色色素。
55.權(quán)利要求39-54中任意一項的方法，其中突變體細(xì)胞進(jìn)一步在一或多種編碼蛋白酶的基因中包含修飾。
56.權(quán)利要求55的方法，其中基因是nprE和/或aprE。
57.權(quán)利要求39-56中任意一項的方法，其中突變體細(xì)胞進(jìn)一步在一或多種選自spoIIAC、srfA、srfB、srfC、srfD、或amyE的基因中包含修飾。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生異源生物物質(zhì)的方法，包括(a)在有益于異源生物物質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)親代芽孢桿菌細(xì)胞的突變體，其中(i)突變體細(xì)胞含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指導(dǎo)異源生物物質(zhì)合成，所述第二核酸序列在參與紅色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一個中包含修飾，和(ii)突變體細(xì)胞與在相同條件下培養(yǎng)的親代芽孢桿菌細(xì)胞相比，紅色色素生成有缺陷；和(b)從培養(yǎng)基中回收異源生物物質(zhì)。本發(fā)明也涉及芽孢桿菌細(xì)胞的突變體和產(chǎn)生該突變體的方法。
文檔編號C12N1/21GK1685057SQ03823208
公開日2005年10月19日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月26日
發(fā)明者瑪麗亞·唐, 艾倫·斯洛馬, 戴維·斯滕伯格, 賴金·貝爾 申請人:諾維信生物技術(shù)公司