專利名稱：使用高濃度糖混合物誘導(dǎo)基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于提高來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白的生產(chǎn)的方法。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了能顯著增加蛋白量的培養(yǎng)組分和條件，所述蛋白由在纖維素酶基因啟動(dòng)子序列控制下的基因生成。該改進(jìn)的方法可以用于生產(chǎn)由自然存在的纖維素酶基因編碼的蛋白和來(lái)自不同異源構(gòu)建體的蛋白。
背景技術(shù)：
絲狀真菌和分解纖維素的細(xì)菌能生成胞外纖維素酶，這賦予該生物水解纖維素的β-(1，4)-連接的糖苷鍵生成葡萄糖的能力。這些酶給生物提供了利用纖維素(最豐富的植物多糖)來(lái)生長(zhǎng)的能力。
絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是有效的纖維素酶生產(chǎn)者。所以，已經(jīng)開發(fā)了里氏木霉生產(chǎn)這些酶的能力，這可以用于生產(chǎn)商品，例如燃料乙醇、布料、洗滌劑、纖維和其它產(chǎn)品。
里氏木霉蛋白的分解纖維素的混合物屬于最佳表征的微生物分解纖維素的途徑。將含有這些混合物的纖維素酶分成兩大類內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和纖維二糖水解酶(CBH)。β-葡糖苷酶也是里氏木霉的纖維素酶混合物的一部分。
還已經(jīng)開發(fā)了里氏木霉生產(chǎn)異源蛋白的能力?？刹僮鞯剡B接到里氏木霉的可誘導(dǎo)的cbh1啟動(dòng)子后，編碼目標(biāo)蛋白的基因可以被調(diào)節(jié)。已經(jīng)在里氏木霉中分泌了外源多肽，它是作為與催化域的融合體，且?guī)в衏bh1的連接區(qū)(Nyyssonen等，Bio/technology11591-595，1993)。
包含纖維素酶系統(tǒng)的基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和調(diào)節(jié)。該系統(tǒng)的成員協(xié)同作用，并且如上所述是有效地將纖維素水解成可溶寡糖所必須的。
木霉中的主要纖維素酶基因cbh1、cbh2、egl1和egl2的表達(dá)和生成取決于可獲得的用于生長(zhǎng)的碳源。纖維素酶基因受到葡萄糖的嚴(yán)格抑制，并且能由纖維素或二糖槐糖誘導(dǎo)數(shù)千倍。實(shí)際上，與含有葡萄糖的培養(yǎng)基相比，在含有誘導(dǎo)碳源(例如纖維素或槐糖)的培養(yǎng)基上可以將主要的纖維二糖水解酶1(cbh1)的表達(dá)水平上調(diào)數(shù)千倍(Ilmen等，App.Environ.Microbio.，1298-1306，1997)。
纖維素酶的商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)是通過(guò)固體培養(yǎng)或浸沒(méi)培養(yǎng)，包括分批式、補(bǔ)料分批式和連續(xù)流工藝。工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶的最成問(wèn)題的且昂貴的方面是給木霉提供合適的誘導(dǎo)物。跟實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)的情況一樣，商業(yè)規(guī)模的纖維素酶的生產(chǎn)是通過(guò)使真菌在固體纖維素上生長(zhǎng)來(lái)誘導(dǎo)，或通過(guò)在存在二糖誘導(dǎo)物(例如乳糖)的情況下培養(yǎng)生物來(lái)誘導(dǎo)。不幸的是，這兩種誘導(dǎo)方法在工業(yè)規(guī)模都有缺陷，它們會(huì)導(dǎo)致與纖維素酶的生產(chǎn)相伴隨的高成本。
纖維素酶的合成受到纖維素的誘導(dǎo)和葡萄糖的抑制。這樣，影響在可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下的纖維素酶或異源蛋白的產(chǎn)率的關(guān)鍵因素是維持纖維素底物和葡萄糖濃度之間的適當(dāng)平衡；至關(guān)重要的是合理地商業(yè)化地生產(chǎn)受調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物。盡管纖維素是有效的且不昂貴的誘導(dǎo)物，但是當(dāng)木霉在固體纖維素上生長(zhǎng)時(shí)很難控制葡萄糖的濃度。在低濃度的纖維素時(shí)，葡萄糖的生成會(huì)很少，難以滿足有活性的細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能的代謝需要。另一方面，當(dāng)葡萄糖的生成比消耗更快時(shí)，葡萄糖抑制會(huì)中止纖維素酶的合成。因而，需要昂貴的工藝控制方案來(lái)緩慢地添加底物并監(jiān)視葡萄糖濃度(Ju和Afolabi，Biotechnol.Prog.，91-97，1999)。而且，由于纖維素物質(zhì)的固體性質(zhì)，難以實(shí)現(xiàn)連續(xù)輸送底物。
Allen和Mortensen(Biotechnol.Bioeng.，2641-45，1981)已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)將200IU/ml的來(lái)自海棗曲霉(Aspergillus phoenicis)的純?chǔ)?葡糖苷酶與50％葡萄糖漿一起孵育時(shí)，生成的溶液在用作碳源時(shí)具有誘導(dǎo)生成纖維素酶的能力。β-葡糖苷酶的純化既耗時(shí)又昂貴。另外，與在本工作中所使用的相比，這些作者使用了超過(guò)20倍的β-葡糖苷酶量。
通過(guò)使用可溶底物和誘導(dǎo)物(例如乳糖或槐糖)，可以克服與使用纖維素作為誘導(dǎo)底物相伴隨的一些問(wèn)題。提供的乳糖必須是高濃度的，以便起到誘導(dǎo)物和碳源的功能(見Seiboth，等，Mol.Genet.Genomics，124-32，2002.)。龍膽二糖也可以用作誘導(dǎo)物?；碧鞘潜壤w維素更有效的誘導(dǎo)物，但是槐糖價(jià)格昂貴且難以生產(chǎn)。因此，在比固體纖維素更容易處理和控制的同時(shí)，槐糖仍然使生產(chǎn)纖維素酶的成本昂貴得難以接受，因此用于商業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶是不切實(shí)際的。顯然，仍然需要方便的可溶的底物組合物，它還能提供低廉的在絲狀真菌(例如里氏木霉)中誘導(dǎo)纖維素酶的方法。
另外，用低廉的誘導(dǎo)劑來(lái)調(diào)節(jié)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子表達(dá)內(nèi)源基因或外源基因的能力具有巨大的商業(yè)價(jià)值。
發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把全纖維素酶制品(whole cellulasepreparation)加入到濃葡萄糖溶液中、并將組合物在約50℃至約65℃孵育至少2天時(shí)，會(huì)生成含有可觀量的纖維素酶基因表達(dá)的誘導(dǎo)物的糖混合物。令人驚奇的是，得到的復(fù)合混合物無(wú)需進(jìn)一步純化即足以誘導(dǎo)纖維素酶的生成。該發(fā)現(xiàn)是令人驚奇的，因?yàn)槠咸烟鞘抢锸夏久沟睦w維素酶基因的抑制劑。該發(fā)現(xiàn)提供了纖維素酶基因表達(dá)的誘導(dǎo)物，它是乳糖或純化的槐糖的低廉的替代品，也是比用于在里氏木霉中生產(chǎn)纖維素酶的固體纖維素更方便的替代品。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)基因表達(dá)的組合物，所述基因的表達(dá)由纖維素酶基因啟動(dòng)子序列控制，其包括(i)從約5％至約75％(重量/重量)的葡萄糖，優(yōu)選地50％-70％的葡萄糖，和(ii)從約2g/L至約10g/L全纖維素酶制品總蛋白，優(yōu)選地5g/L，其中在用于促進(jìn)組合物中基因表達(dá)的誘導(dǎo)物的形成之前，將該組合物在約50℃至約70℃孵育幾天。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)性補(bǔ)料組合物在使用前在約50℃至約65℃、優(yōu)選地在約55℃孵育48小時(shí)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)性補(bǔ)料組合物在使用前在約50℃至約65℃、優(yōu)選地在約65℃孵育72小時(shí)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從孵育濃葡萄糖溶液和全纖維素酶制品得到的孵育產(chǎn)物是含有槐糖的糖混合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，孵育產(chǎn)物是含有龍膽二糖的糖混合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)蛋白的方法，所述蛋白的基因表達(dá)由可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列控制，其中提供了細(xì)胞培養(yǎng)物，并向培養(yǎng)物中加入了通過(guò)孵育濃葡萄糖溶液和全纖維素酶制品得到的誘導(dǎo)性補(bǔ)料組合物，其量能有效誘導(dǎo)由可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列控制的基因的表達(dá)。
改進(jìn)的方法可以用于生產(chǎn)自然存在的纖維素酶基因編碼的蛋白和來(lái)自不同異源構(gòu)建體的蛋白。這樣的構(gòu)建體包括表達(dá)載體，其中編碼目標(biāo)蛋白的基因可操作地連接到可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子上。在一個(gè)實(shí)施方案中，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是纖維素酶基因啟動(dòng)子。在第二個(gè)實(shí)施方案中，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是槐糖-可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在第三個(gè)實(shí)施方案中，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是龍膽二糖-可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在一個(gè)方面，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是cbh1啟動(dòng)子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法能生產(chǎn)選自下述的蛋白激素、酶、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和抗體。在一個(gè)方面，該方法用于生產(chǎn)的蛋白是天然存在的纖維素酶。在另一個(gè)方面，該方法用于生產(chǎn)的蛋白的表達(dá)不是天然地由纖維素酶基因啟動(dòng)子序列控制。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)蛋白的方法是使用絲狀真菌。在一個(gè)方面，該真菌是木霉屬。在一個(gè)方面，該真菌是里氏木霉。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法使用誘導(dǎo)組合物，該誘導(dǎo)組合物是這樣制備的將全纖維素酶制品加入到纖維二糖溶液中，并將纖維素酶-纖維二糖溶液在50℃至約70℃孵育至少2天以形成誘導(dǎo)性補(bǔ)料組合物。在一個(gè)方面，該溶液是在50℃至約65℃孵育至少2天以形成誘導(dǎo)性補(bǔ)料組合物。該組合物是含有可觀量的纖維素酶基因表達(dá)的誘導(dǎo)物的糖混合物。


圖1說(shuō)明了補(bǔ)加本發(fā)明的誘導(dǎo)組合物(□，正方形)與補(bǔ)加葡萄糖組合物(◆，菱形)相比對(duì)野生型里氏木霉(RLP-37)(見Sheir-Neiss和Montenecourt，Appl.Microbio.Biotechnol.，46-53，1984)生產(chǎn)纖維素酶的影響。
圖2說(shuō)明了用固定化酶(□，正方形)生產(chǎn)槐糖與用酶溶液(◆，菱形)相比的不同。最終葡萄糖濃度是約40％。蛋白加料是10g/L。詳見實(shí)施例4。
圖3說(shuō)明了用固定化酶(■，正方形)生產(chǎn)槐糖與用酶溶液(△，三角形)相比的不同。最終葡萄糖濃度是約60％。蛋白加料是3.2g/L。詳見實(shí)施例4。
圖4對(duì)比了圖2和3中使用相同的固定化酶的第二批實(shí)驗(yàn)和第一批實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果。第一批實(shí)驗(yàn)后回收的固定化酶在第二批實(shí)驗(yàn)中保留了活性。標(biāo)識(shí)是□(正方形)，第一批10g/L實(shí)驗(yàn)；◆(菱形)，第二批10g/L實(shí)驗(yàn)；△(三角形)，第一批3.2g/L實(shí)驗(yàn)；×，第二批3.2g/L實(shí)驗(yàn)。
圖5顯示了在25％纖維二糖中與在25％葡萄糖中相比的槐糖生產(chǎn)。在25％纖維二糖(□；正方形)或葡萄糖溶液(重量/重量)(●；圓點(diǎn))中的槐糖生產(chǎn)。
圖6顯示了在不同全纖維素酶加樣的情況下在60％葡萄糖溶液(重量/重量)中的槐糖生產(chǎn)?！?三角形)，2.5g/L，□(正方形)，5.0g/L，◆(菱形)，7.5g/L，×，10g/L全纖維素酶。
發(fā)明詳述絲狀真菌里氏木霉是被最廣泛地研究了的分解纖維素的生物之一(參見，例如Nevalainen和Penttila，Mycota，303-319，1995)。工業(yè)上，木霉屬的纖維素分解酶用于多種目的，包括生產(chǎn)燃料乙醇、紙、人造絲、玻璃紙、洗滌劑和纖維。纖維素酶還用于提高動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，促進(jìn)從植物細(xì)胞中提取有價(jià)值的組分(Mandels，Biochem.Soc.Trans.，414-16.1985)。因此，這些酶在許多有用產(chǎn)品的生產(chǎn)中起重要作用。
木霉屬中的纖維素酶的生成取決于可獲得的碳源。纖維素、乳糖和二糖槐糖會(huì)誘導(dǎo)里氏木霉合成纖維素酶。相反地，葡萄糖的存在會(huì)嚴(yán)格抑制纖維素酶基因的表達(dá)。提供用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的合適的誘導(dǎo)物是造成纖維素酶的高生產(chǎn)成本的主要問(wèn)題因素。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把全纖維素酶制品加入到濃葡萄糖溶液中、并將組合物在約50℃至約75℃、優(yōu)選地在約50℃至約65℃孵育至少2天時(shí)，會(huì)生成含有可觀量的纖維素酶基因表達(dá)的誘導(dǎo)物的糖混合物，即誘導(dǎo)性補(bǔ)料組合物。該誘導(dǎo)性補(bǔ)料組合物含有約2～25g/L槐糖。另外，該誘導(dǎo)性補(bǔ)料組合物含有約35～60g/L龍膽二糖。令人驚奇的是，得到的混合物無(wú)需任何進(jìn)一步純化。它原樣即可誘導(dǎo)纖維素酶的生成。該發(fā)現(xiàn)提供了工業(yè)上需要的乳糖或純化槐糖的低廉的替代品，和比用于在絲狀真菌中生產(chǎn)由可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子調(diào)控的蛋白的固體纖維素更方便的替代品。更具體的觀點(diǎn)是，本發(fā)明的組合物可用于木霉屬的纖維素酶生產(chǎn)。
在生產(chǎn)誘導(dǎo)性補(bǔ)料組合物的一個(gè)替代方法中，可以將最終發(fā)酵液(全纖維素酶+細(xì)胞)加入到葡萄糖溶液(例如20％)中。細(xì)胞的存在不會(huì)影響槐糖的形成。這樣，就無(wú)需使用回收的纖維素酶(即從細(xì)胞中分離出的纖維素酶制品)?？梢允褂迷诎l(fā)酵結(jié)束時(shí)存在的酶混合物，盡管還存在細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含濃葡萄糖溶液和全纖維素酶制品的組合物，它可以用作通過(guò)絲狀真菌生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)補(bǔ)料。在一個(gè)方面，目標(biāo)蛋白是纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，目標(biāo)蛋白是異源蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)補(bǔ)料會(huì)誘導(dǎo)里氏木霉生成纖維素酶。令人驚奇的是，該溶液能有效地誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá)，因?yàn)橐阎w維素酶基因會(huì)被存在的葡萄糖所抑制。
在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)補(bǔ)料是通過(guò)制備無(wú)菌的5％-75％(重量/重量)葡萄糖溶液來(lái)制作的。將來(lái)自里氏木霉的全纖維素酶制品加入到無(wú)菌葡萄糖溶液中，至終濃度為2g～20g總蛋白/L。最終的蛋白濃度可以是低至0.5g/L，高至50g/L。在一個(gè)方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性高于1.5IU/ml。在一個(gè)方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性低于200IU/ml。在另一個(gè)方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在1.5IU/ml至200IU/ml之間。在另一個(gè)方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在1.9IU/ml至200IU/ml之間。在另一個(gè)方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在9.3IU/ml至200IU/ml之間。在另一個(gè)方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在1.5IU/ml至180IU/ml之間。在另一個(gè)方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在9.3IU/ml至180IU/ml之間。該溶液是在50℃-75℃、優(yōu)選地在約50℃-65℃孵育。溶液是在攪拌下孵育8小時(shí)至7天。在一個(gè)實(shí)施方案中，孵育時(shí)間超過(guò)2天。在第二個(gè)實(shí)施方案中，孵育時(shí)間是2天。在第三個(gè)實(shí)施方案中，孵育時(shí)間是3天。收集最終無(wú)菌溶液，用于發(fā)酵補(bǔ)料。在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)補(bǔ)料是用60％(重量/重量)葡萄糖溶液制備的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)補(bǔ)料是通過(guò)將全纖維素酶制品加入到葡萄糖溶液中至終濃度為2g總蛋白/L來(lái)制備的。
在這里，本發(fā)明的另一個(gè)目的是使宿主絲狀真菌表達(dá)和分泌與所述宿主絲狀真菌異源的目標(biāo)蛋白。通過(guò)誘導(dǎo)基因(其表達(dá)由可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列控制)生成的蛋白包括自然產(chǎn)生的纖維素酶蛋白以及多種異源蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列控制下表達(dá)的蛋白是激素、酶、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或抗體。
多種絲狀真菌可以用作表達(dá)宿主，包括下述的屬曲霉屬(Aspergillus)，木霉屬(Trichoderma)，鏈孢霉屬(Neurospora)，青霉屬(Penicillium)，頭孢屬(Cephalosporium)，綿霉屬(Achlya)，束柄霉屬(Podospora)，疫病霉屬(Endothia)，毛霉屬(Mucor)，旋孢腔菌屬(Cochliobolus)和梨孢屬(Pyricularia)。具體的表達(dá)宿主包括里氏木霉，例如NRRL15709、ATCC13631、56764、56765、56466、56767，綠色木霉(Trichoderma viride)，例如ATCC32098和32086構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)，(Yelton，M.，等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1470-1474；Mullaney，E.J.等(1985)Mol.Gen.Genet.199，37-45；John，M.A.和J.F.Peberdy(1984)Enzyme Microb.Technol.6，386-389；Tilburn，等(1982)Gene 26，205-221；Ballance，D.J.等，(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.112，284-289；Johnston，I.L.等(1985)EMBO J.4，1307-1311)黑曲霉(A.niger)，(KELLY，J.M.和M.Hynes(1985)EMBO 4，475-479)泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，例如NRRL3112、ATCC22342、ATCC44733、ATCC14331和菌株UVK143f，米曲霉(Aspergillusoryzae)，例如ATCC11490，和粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)(Case，M.E.等(1979)Proc.Natl.Acad.Scie.USA，76，5259-5263；Lambowitz美國(guó)專利號(hào)4,486,553；Kinsey，J.A.和J.A.Rambosek(1984)Molecular and Cellular Biology 4，117-122；Bull，J.H.和J.C.Wooton(1984)Nature 310，701-704)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物宿主是木霉屬、腐質(zhì)霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、鏈霉屬、熱單孢屬、芽孢桿菌屬或纖維單孢菌屬的成員。
I.定義“抗體”是指包含來(lái)自免疫球蛋白基因或其片段的構(gòu)架區(qū)的多肽，它能特異性地結(jié)合和識(shí)別抗原。識(shí)別出的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，它們按順序分別定義了免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型地，抗體或其功能等同物的抗原結(jié)合區(qū)對(duì)于結(jié)合的特異性和親合力是最重要的。見，Paul，F(xiàn)undamental Immunology。
示例性的免疫球蛋白(抗體)的結(jié)構(gòu)單元包含四聚物。每個(gè)四聚物由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，每一對(duì)具有一個(gè)“輕鏈”(約25kD)和一個(gè)“重鏈”(約50-70kD)。每條鏈的N-端定義了約100～110個(gè)或更多氨基酸的可變區(qū)，它主要負(fù)責(zé)抗原的識(shí)別。術(shù)語(yǔ)“可變輕鏈”(VL)和“可變重鏈”(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈。
“纖維素酶”或“纖維素分解酶”指細(xì)菌的或真菌的外切葡聚糖酶或外切纖維二糖水解酶，和/或內(nèi)切葡聚糖酶，和/或β-葡糖苷酶。這三種不同類型的纖維素酶協(xié)同地將纖維素和其衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰?br> 許多微生物能生成水解纖維素的酶，包括腐木真菌木霉屬、堆肥細(xì)菌熱單胞菌(現(xiàn)在稱作Thermobifida)屬、芽孢桿菌屬和纖維單孢菌屬；鏈霉屬和真菌腐質(zhì)霉屬；曲霉屬和鐮刀菌屬。這些微生物生成的酶是具有三類功能(用于將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖)的蛋白的混合物內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、纖維二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)。
如這里所使用的，短語(yǔ)“全纖維素酶制品”和“全纖維素酶組合物”可互換地使用，指自然存在的和非自然存在的組合物。“自然存在的”組合物是通過(guò)自然存在的來(lái)源制備的，其包含一種或多種纖維二糖水解酶類、一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶類和一種或多種β-葡糖苷酶組分，其中這些組分中的每一種都與在所述來(lái)源中的比例相同。自然存在的組合物是由未針對(duì)纖維素分解酶進(jìn)行修飾的生物生成的，所以該組分酶的比例相對(duì)于天然生物生成的沒(méi)有變化。
“非自然存在的”組合物包括通過(guò)下述方法生成的那些組合物(1)以自然比例或非自然(即改變的)比例將組分纖維素分解酶混合；或(2)修飾生物，使之過(guò)表達(dá)或次表達(dá)(underexpress)一種或多種纖維素分解酶；或(3)修飾生物，使之缺失至少一種纖維素分解酶。
用于本發(fā)明的全纖維素酶混合物可以缺失各EG和/或CBH中的一種或多種。例如，可以單獨(dú)缺少EG1，或者與其它EG和/或CBH一起缺少。BG可以相對(duì)于天然水平過(guò)表達(dá)。本文中也包括BG的異源表達(dá)。
“碳限制”是一種狀態(tài)，其中微生物僅僅具有足夠的碳來(lái)生成目標(biāo)蛋白產(chǎn)物，但是沒(méi)有足夠的碳來(lái)完全滿足生物的需要，例如支持生長(zhǎng)。因此，最大量的碳用于蛋白生成。
如這里所使用的，“啟動(dòng)子”和“纖維素酶啟動(dòng)子”是指核酸序列，其功能是指導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄，它們?cè)诒疚闹锌苫Q地使用。啟動(dòng)子通常適用于要表達(dá)目標(biāo)基因的宿主細(xì)胞。啟動(dòng)子和其它轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸序列(也稱作“調(diào)控序列”)是表達(dá)給定基因所必須的。通常，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列包括但不限于啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合部位、轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列、翻譯起始序列和終止序列、和增強(qiáng)子或活化劑序列。在一個(gè)方面，啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在另一個(gè)方面，啟動(dòng)子是可以通過(guò)選自龍膽二糖、纖維素和槐糖的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的。在一個(gè)方面，啟動(dòng)子是里氏木霉cbh1啟動(dòng)子，它保藏在GenBank中，登記號(hào)為D86235。在另一個(gè)方面，啟動(dòng)子是來(lái)自里氏木霉的cbhII或木聚糖酶啟動(dòng)子。
如這里所使用的，“啟動(dòng)子序列”是能被用于表達(dá)目的的特定絲狀真菌所識(shí)別的DNA序列?！皢?dòng)子”定義為一列核酸調(diào)控序列，它指導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn)錄。如這里所使用的，啟動(dòng)子包括臨近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的必需核酸序列，例如，在聚合酶II類啟動(dòng)子的情況下，是TATA元件?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子?！翱烧T導(dǎo)的”啟動(dòng)子是在環(huán)境的和發(fā)育的調(diào)節(jié)下有活性的啟動(dòng)子。用于本發(fā)明的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子例子是里氏木霉cbh1啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指核酸表達(dá)調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位陣列)和第二種核酸序列之間的功能連接，其中表達(dá)調(diào)控序列指導(dǎo)與第二種序列相對(duì)應(yīng)的核酸的轉(zhuǎn)錄。
實(shí)例包括來(lái)自下述的啟動(dòng)子泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg，J.H.等(1984)Mol.cell.Biol.4，2306-2315；Boel，E.等(1984)EMBO J.3，1581-1585)，這里的米赫毛霉(Mucormiehei)羧基蛋白酶基因，里氏木霉纖維二糖水解酶I基因(Shoemaker，S.P.等(1984)歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎PO 0137280 A1)，構(gòu)巢曲霉trpC基因(Yelton，M.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，1470-1474；Mullaney，E.J.等(1985)Mol.Gen.genet.199，37-45)，構(gòu)巢曲霉alcA基因(Lockington，R.A.等(1986)Gene 33，137-149)，構(gòu)巢曲霉tpiA基因(McKnight，G.L.等(1986)Cell 46，143-147)，構(gòu)巢曲霉amdS基因(Hynes，M.J.等(1983)Mol.cellBiol.3，1430-1439)，里氏木霉xln1基因，里氏木霉cbh2基因，里氏木霉eg1基因，里氏木霉eg2基因，里氏木霉eg3基因，和高等真核生物啟動(dòng)子，例如SV40早期啟動(dòng)子(Barclay，S.L.和E.Meller(1983)Molecular and Cellular Biology 3，2117-2130)。
當(dāng)核酸與另一個(gè)核酸序列建立了功能關(guān)系時(shí)，它是“可操作地連接的”。例如，如果它能表達(dá)為參與多肽分泌的蛋白原(preprotein)，則編碼分泌前導(dǎo)序列(即信號(hào)肽)的DNA是可操作地連接到了多肽的DNA；如果能影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子或增強(qiáng)子是可操作地連接到了編碼序列；或者，如果能促進(jìn)翻譯，則核糖體結(jié)合部位是可操作地連接到了編碼序列。通常，“可操作地連接”是指連接的DNA序列是鄰接的，在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是鄰接的且處于閱讀相。但是，增強(qiáng)子不是必須鄰接的。連接是通過(guò)在方便的限制位點(diǎn)的拼接實(shí)現(xiàn)的。如果不存在這樣的位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸接頭或連接物。
如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“基因”指參與生成多肽鏈的DNA片段，它們包含或不包含在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，例如5′未翻譯的(5′UTR)或“前導(dǎo)”序列和3′UTR或“尾”序列，以及在各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
基因可以編碼治療上有意義的蛋白或肽，例如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、配體、受體和抑制劑，以及疫苗和抗體?；蚩梢跃幋a商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白或肽，例如酶，例如蛋白酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、纖維素酶、氧化酶和脂肪酶。目標(biāo)基因可以是自然存在的基因、突變的基因或合成的基因。
當(dāng)提及(例如)細(xì)胞、核酸、蛋白或載體時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)“重組的”表示，已經(jīng)通過(guò)導(dǎo)入外源的核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白修飾了的細(xì)胞、核酸、蛋白或載體，或者該細(xì)胞是源自這樣修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞能表達(dá)在細(xì)胞的天然(非重組的)形式中不存在的基因，或者能表達(dá)否則會(huì)被異常表達(dá)、次表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。
術(shù)語(yǔ)“分泌信號(hào)序列”是指編碼多肽(“分泌肽”)的DNA序列，它作為更大的多肽的組分，指導(dǎo)更大的多肽穿過(guò)細(xì)胞的分泌途徑(它是在其中合成的)。通常在穿過(guò)分泌途徑的過(guò)程中，剪切更大的多肽除去該分泌肽。
“誘導(dǎo)”是指用存在的“誘導(dǎo)物”增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致細(xì)胞或生物以顯著提高的速度合成目標(biāo)蛋白。為了檢測(cè)對(duì)目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)，將用潛在的誘導(dǎo)物處理的細(xì)胞與沒(méi)有誘導(dǎo)物的對(duì)照樣品相對(duì)比。將對(duì)照樣品(未用誘導(dǎo)物處理)指定了相對(duì)蛋白活性值100％。當(dāng)相對(duì)于對(duì)照組(未用誘導(dǎo)物處理)的活性值大于100％、大于110％、更優(yōu)選地150％、更優(yōu)選地200-500％(即相對(duì)于對(duì)照組高出了2-5倍)或更優(yōu)選地高出了1000-3000％時(shí)，即實(shí)現(xiàn)了多肽的誘導(dǎo)。
本發(fā)明的“絲狀真菌”是真核微生物，包括真菌門亞門的所有絲狀形式(見Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，NewYorkWiley)。這些真菌的特征在于營(yíng)養(yǎng)菌絲體，其細(xì)胞壁由幾丁質(zhì)、纖維素和其它復(fù)合多糖組成。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)上、生理學(xué)上和遺傳上與酵母區(qū)別開。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲伸長(zhǎng)，且碳分解代謝是好氧的。相反，酵母(例如釀酒酵母)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽，且碳分解代謝可以是發(fā)酵的。釀酒酵母(s.cerevisiae)具有突出的非常穩(wěn)定的二倍期，然而二倍期僅僅在絲狀真菌(例如曲霉菌屬和鏈孢霉屬)的減數(shù)分裂前短時(shí)間地存在。釀酒酵母具有17個(gè)染色體，這與構(gòu)巢曲霉和粗糙鏈孢霉分別有8和7個(gè)染色體不同。關(guān)于釀酒酵母和絲狀真菌之間的區(qū)別的新的說(shuō)明包括釀酒酵母不能處理曲霉和木霉的內(nèi)含子，也不能識(shí)別絲狀真菌的許多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(Innis，M.A.等(1985)Science，228，21-26)。
“葡糖苷酶”指其終產(chǎn)物是葡萄糖的任何酶。
在提及核酸部分時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)“異源的”是指，該核酸包含兩個(gè)或多個(gè)亞序列，它們?cè)谔烊磺闆r下通常彼此不存在這樣的關(guān)系。例如，該核酸典型地是重組生成的，其具有兩個(gè)或多個(gè)例如來(lái)自無(wú)關(guān)基因的序列以制作新的功能核酸，例如啟動(dòng)子是來(lái)自一個(gè)來(lái)源，編碼區(qū)來(lái)自另一個(gè)來(lái)源。類似地，異源蛋白一般是指兩個(gè)或多個(gè)亞序列，它們?cè)谔烊磺闆r下通常彼此不存在這樣的關(guān)系(例如融合蛋白)。
“孵育產(chǎn)物”是指在高溫下保持或孵育特定時(shí)間段后的溶液。
“誘導(dǎo)物”是能使細(xì)胞比在沒(méi)有該誘導(dǎo)物存在時(shí)生成更大量的酶或其它物質(zhì)的任何化合物。
“誘導(dǎo)補(bǔ)料”是指補(bǔ)充給微生物的溶液，它會(huì)造成或誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的生成。
如這里使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”或“純化的”是指從至少一種天然地與其伴隨的組分中分離出的核酸或氨基酸。
II.目標(biāo)蛋白或所需蛋白術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)蛋白”和“所需蛋白”在這里可以互換地使用。本發(fā)明特別適用于增強(qiáng)蛋白的胞內(nèi)和/或胞外生產(chǎn)。蛋白可以是同源的或異源的。可以通過(guò)本發(fā)明生產(chǎn)的蛋白包括但不限于激素、酶、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、抗體等。
激素包括但不限于促卵泡激素、促黃體激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、促生長(zhǎng)素抑制素、促性腺激素、血管加壓素、催產(chǎn)素、促紅細(xì)胞生成素、胰島素等。
生長(zhǎng)因子是能結(jié)合到細(xì)胞表面受體上的蛋白，其主要結(jié)果是激活細(xì)胞的增殖和/或分化。生長(zhǎng)因子包括但不限于血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等。
細(xì)胞因子是一個(gè)獨(dú)特的生長(zhǎng)因子家族。細(xì)胞因子主要從白細(xì)胞分泌，可以刺激體液的和細(xì)胞的免疫反應(yīng)，以及激活吞噬細(xì)胞。細(xì)胞因子包括但不限于集落刺激因子、白細(xì)胞介素(IL-1(α和β)，IL-2至IL-13)和干擾素(α、β和γ)。
人白細(xì)胞介素-3(IL-3)是15kDa的蛋白，含有133個(gè)氨基酸殘基。IL-3是種屬特異性的集落刺激因子，它能刺激來(lái)自骨髓培養(yǎng)物的巨核細(xì)胞、中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的菌落形成。
抗體包括但不限于來(lái)自任何種屬(要從中大量生產(chǎn))的免疫球蛋白。特別優(yōu)選的抗體是人抗體。免疫球蛋白可以來(lái)自任何種類，即G、A、M、E或D。
另外，“目標(biāo)蛋白”或“目標(biāo)多肽”是指要由宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌的蛋白。目標(biāo)蛋白可以是直到現(xiàn)在已知能在原核生物中表達(dá)的任何蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)和分泌的目標(biāo)蛋白包括含有信號(hào)肽的蛋白。目標(biāo)蛋白可以是與宿主同源的或異源的。因此，目標(biāo)蛋白可以是分泌的多肽，更具體地是選自下述的酶淀粉分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶和植物壁降解酶。這些酶的實(shí)例包括淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角質(zhì)酶(cutinase)、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、過(guò)氧化酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果膠酶、葡糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶和幾丁質(zhì)酶。分泌的多肽還可以是激素、生長(zhǎng)因子、受體、疫苗、抗體等。在一個(gè)實(shí)施方案中，分泌的多肽是纖維素分解酶。
III.分子生物學(xué)在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在里氏木霉的纖維素酶基因啟動(dòng)子控制下的異源基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明依賴于重組遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。公開了在本發(fā)明中使用的一般方法的基礎(chǔ)文章包括Sambrook等，Molecular cloning，A Laboratory Manual(第2版，1989)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA LaboratoryManual(1990)；和Ausubel等，編，Current Protocols inMolecular Biology(1994))。
在轉(zhuǎn)化至里氏木霉細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和/或表達(dá)之前，典型地將含有絲狀真菌的纖維素酶基因啟動(dòng)子序列的異源基因克隆到中間載體中。這些中間載體典型地是原核生物載體，例如質(zhì)?；虼┧筝d體。
為了高水平地表達(dá)克隆的基因，異源基因離啟動(dòng)子的距離優(yōu)選地與在自然存在的纖維素酶基因中的大致相同。但是，如本領(lǐng)域已知的，可以對(duì)該距離作一些變化而不損害啟動(dòng)子的功能。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到，可以通過(guò)替換、取代、添加或消除一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)修飾天然啟動(dòng)子而不改變其功能。本發(fā)明的實(shí)踐包括但不限于啟動(dòng)子的這些改變。
表達(dá)載體/構(gòu)建體典型地含有轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒，其含有表達(dá)異源序列所需的所有其它元件。因而，典型的表達(dá)盒含有可操作地連接到異源核酸序列和有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的聚腺苷酸化作用所需的信號(hào)上的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合部位和翻譯終止區(qū)。該盒的其它元件可以包括增強(qiáng)子，在將基因組DNA用作結(jié)構(gòu)基因時(shí)，還包括具有功能拼接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子。
本發(fā)明的實(shí)踐不受在遺傳重構(gòu)體中選擇的啟動(dòng)子的限制。但是，示例性的啟動(dòng)子是里氏木霉cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2啟動(dòng)子除了啟動(dòng)子序列外，表達(dá)盒還應(yīng)當(dāng)包含位于結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，以提供有效的終止。終止區(qū)可以與啟動(dòng)子序列得自相同的基因，或者從不同的基因得到。
盡管似乎所有真菌終止子都可以在本發(fā)明中起作用，優(yōu)選的終止子包括來(lái)自構(gòu)巢曲霉trpC基因(Yelton，M.等(1984)PNAS USA 811470-1474，Mullaney，E.J.等(1985)MGG 19937-45)、泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg，J.H.等(1984)Mol.CellBiol.42306，Boel，E.等(1984)EMBO J.31581-1585)和米赫毛霉羧基蛋白酶基因(歐洲專利局
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