專利名稱：基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1介導(dǎo)缺血性心肌病中干細(xì)胞歸巢及組織再生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種缺血性心肌病的組織再生方法，特別涉及心肌梗塞后較長時(shí)間(即多周)的缺血性心肌病的治療方法。
背景技術(shù)：
在西方社會，急性心肌梗塞(MI)仍然是最主要的疾病和死亡原因。盡管近期的治療進(jìn)展主要針對恢復(fù)早期梗塞相關(guān)動脈的灌注，但益處的“最高限度”是存在的，Topol，E.J.Lancet 357，1905-1914(2001)。大多數(shù)情況是由于左心室(LV)重建，即包括心肌變薄、擴(kuò)張、功能降低、最終引起死亡的過程，而使患有急性心肌梗塞(MI)的患者基本上最終發(fā)展為充血性心力衰竭(CHF)。Robbins，M.A.&O’Connell，J.B.，pp.3-13(Lippincott-Raven，Philadelphia，1998).Pfeffer，J.M.，Pfeffer，M.A.，F(xiàn)letcher，P.J.＆Braunwald，E.Am.J.Physiol260，H1406-H1414(1991).Pfeffer，M.A.＆Braunwald，E.Circulation 81，1161-1172(1990)。
治療這種心肌梗塞后過程的一種方法涉及細(xì)胞治療，Penn，M.S.et al.Prog.Cardiovasc.Dis45，21-32(2002)。集中使用不同的細(xì)胞類型包括分化細(xì)胞(例如骨骼肌成肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞)或骨髓來源細(xì)胞來進(jìn)行移植。Koh，G.Y，Klug，M.G，Soonpaa，M.H.&Field，L.J.j.Clin.Invest 92，1548-1554 (1993).Taylor，D.A.et al.Nat.Med.4，929-933(1998).Jain，M.et al.Circulation103，1920-1927(2001).Li，R.K.et al.Ann.Thorac.Surg.62，654-660(1996).Etzion，S.et al.J.Mol.CellCardiol.33，1321-1330(2001).Li，R.K.，Jia，Z.Q.，Weisel，R.D.，Merante，F(xiàn).&Mickle，D.A.J.Mol.Cell Cardiol.31，513-522(1999).Yoo，K.J.et al.Yonsei Med.J.43，296-303(2002).Sakai，T.et al.Ann.Thorac.Surg.68，2074-2080(1999).Sakai，T.et al.J.Torac.Cardiovasc.Surg.118，715-724(1999).Orlic，D.et al.Nature 410，701-705(2001).Tomita，S.et al.J.7horac.Cardiovasc.Surg.123，1132-1140(2002)。
不斷增長的文獻(xiàn)數(shù)量表明干細(xì)胞動員到心臟并分化為心肌細(xì)胞是自然產(chǎn)生的過程。Jackson，K.A.et al.J.Clin.Invest 107，1395-1402(2001).Quaini，F(xiàn).et al.N.Engl.J. Med.346，5-15(2002)。此過程的發(fā)生比率并不足以產(chǎn)生心肌梗塞后左心室功能的有意義的的恢復(fù)。Id.最近研究表明，通過向血流中直接注射干細(xì)胞或通過在心肌梗塞前從骨髓中化學(xué)動員干細(xì)胞來再生損傷的心肌細(xì)胞是可能的。這些研究證明在圍梗塞期干細(xì)胞具有歸巢到梗塞區(qū)域、及這些細(xì)胞隨后能夠分化為心肌細(xì)胞的能力。Kocher，A.A.et al.Nat.Med.7，430-436(2001).Orlic，D.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98，10344-10349(2001).Peled，A.et al.Blood 95，3289-3296(2000).Yong，K.et al.Br.J.Haematol.107，441-449(1999)。至今為止，所有這些研究都集中在干細(xì)胞在心肌梗塞后48小時(shí)內(nèi)再生心肌細(xì)胞的能力上。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及治療梗塞的心肌組織的方法。所述的梗塞組織含有第一濃度的SDF-1蛋白。所述的梗塞組織的外周血含有第一濃度的干細(xì)胞。在此方法中，能夠?qū)⑺龅墓ＨM織中的SDF-1蛋白濃度從第一濃度增加到第二濃度。能夠?qū)⑺龅墓ＨM織外周血中的干細(xì)胞濃度從第一濃度增加到第二濃度。當(dāng)所述的梗塞組織中的SDF-1濃度增加時(shí)，所述的外周血中的干細(xì)胞濃度能夠同時(shí)增加。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的干細(xì)胞的數(shù)量可以通過給予能夠引起干細(xì)胞從骨髓動員到外周血的試劑或注射干細(xì)胞到外周血中來增加。在本發(fā)明優(yōu)選的部分中，所述的引起干細(xì)胞從骨髓動員到外周血中的試劑選自細(xì)胞因子、趨化因子(chemokines)和化療試劑。在更優(yōu)先的部分中，所述的試劑包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，通過誘導(dǎo)表達(dá)載體進(jìn)入所述的梗塞組織中來增加所述的梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度。所述的表達(dá)載體包括編碼SDF-1蛋白的核酸。任意地，所述的表達(dá)載體含有針對心肌組織并優(yōu)選心肌細(xì)胞的組織特異性啟動子。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度通過誘導(dǎo)經(jīng)過體外再回輸(ex vivo)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)入所述的梗塞組織中來增加。所述的經(jīng)過體外再回輸(ex vivo)培養(yǎng)的細(xì)胞包括收集自欲治療的個(gè)體自體同源細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面，所述的被介入到梗塞組織的細(xì)胞能夠在介入所述的梗塞組織之前用表達(dá)載體來轉(zhuǎn)染。所述的表達(dá)載體包含編碼SDF-1蛋白的核酸。
在本發(fā)明的另一方面，所述的梗塞組織含有第一濃度的VEGF。所述的梗塞組織中的VEGF濃度能夠從第一濃度增加到第二濃度。當(dāng)所述的梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度增加時(shí)，所述的梗塞組織中的VEGF濃度能夠同時(shí)增加。
一方面，所述的梗塞組織中的VEGF濃度能夠通過向該梗塞組織中介入編碼VEGF的表達(dá)載體來增加。任意地，所述的表達(dá)載體含有針對心肌組織，并優(yōu)選針對心肌細(xì)胞的組織特異性的啟動子。
另一方面，所述的梗塞組織中的VEGF濃度能夠通過向該梗塞組織中介入轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體的細(xì)胞來增加。該表達(dá)載體含有編碼VEGF的核酸。所述的用含有編碼VEGF核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與介入所述的梗塞組織來增加所述的梗塞組織中的SDF-1濃度的細(xì)胞相同。
本發(fā)明的另一方面涉及心肌梗塞后較長時(shí)間后治療梗塞的心肌組織的方法。所述的梗塞組織能夠含有第一濃度的SDF-1蛋白和第一濃度的VEGF。在此方法中，能夠?qū)⑺龅墓ＨM織中的SDF-1蛋白濃度從第一濃度增加到基本上高于第一濃度的第二濃度。能夠?qū)⑺龅墓ＨM織中的VEGF濃度從第一濃度增加到基本上高于第一濃度的第二濃度。給予引起干細(xì)胞從骨髓動員到所述的梗塞組織外周血的試劑。當(dāng)所述的梗塞組織中的SDF-1和VEGF濃度增加時(shí)，所述的干細(xì)胞能夠同時(shí)從骨髓動員到外周血中。
一方面，所述的梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度通過誘導(dǎo)經(jīng)過體外再回輸培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)入所述的梗塞組織中來增加。所述的被介入到梗塞組織的細(xì)胞在介入所述的梗塞組織之前用表達(dá)載體來轉(zhuǎn)染。所述的表達(dá)載體包含編碼SDF-1蛋白的核酸。
另一方面，所述的梗塞組織中的VEGF濃度能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入所述的梗塞組織中來增加。所述的細(xì)胞能夠在介入所述的梗塞組織之前用表達(dá)載體來轉(zhuǎn)染。所述的表達(dá)載體包含編碼VEGF的核酸。所述的用編碼VEGF的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與介入所述的梗塞組織來增加所述的梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度的細(xì)胞相同。
附圖簡要說明通過閱讀本發(fā)明以下的說明并參考相關(guān)的附圖，本發(fā)明進(jìn)一步的特征對于本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域所屬的技術(shù)人員是顯而易見的

圖1(a和b)所示分別為給予鹽水或G-CSF 4周后(LAD結(jié)扎后12周)梗塞區(qū)域中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量(a)和縮短分?jǐn)?shù)(b)。
圖2(a和b)所示為骨骼肌成肌細(xì)胞(SKMB)移植在細(xì)胞移植4周后(LAD結(jié)扎后12周)對梗塞區(qū)域中BrdU+細(xì)胞計(jì)數(shù)的作用。
圖3(a和b)所示為BrdU給藥5天后針對BrdU染色的骨髓(a)及未處理的心肌(b)的照片。
圖3c所示為通過本發(fā)明治療評價(jià)的梗塞區(qū)域中增加的BrdU+細(xì)胞。
圖4所示為顯示基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)表達(dá)作為心肌梗塞后的時(shí)間函數(shù)的RT-PCR的照片。
圖5(a和b)所示為經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染SDF-1表達(dá)載體的心肌成纖維細(xì)胞在移植4周后、及在心肌成纖維細(xì)胞移植后進(jìn)行或未進(jìn)行5天的G-CSF給藥，梗塞區(qū)域中BrdU+細(xì)胞數(shù)(a)和CD117+細(xì)胞數(shù)(b)。
圖5c所示為經(jīng)SDF-1/G-CSF處理動物CD117+染色的照片。
圖6(a和b)所示為梗塞區(qū)域的免疫組織化學(xué)照片，其顯示LAD結(jié)扎12周后，進(jìn)行(a)SKMB或(b)VEGF-表達(dá)SKMB細(xì)胞移植后，用G-CSF進(jìn)行干細(xì)胞動員之后的BrdU+細(xì)胞和心肌肌球蛋白表達(dá)細(xì)胞。
圖6c所示為相對于沒有VEGF過度表達(dá)的細(xì)胞治療左心室功能的改善。
實(shí)施方案的描述除非有其它定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解相同的含義。分子生物學(xué)術(shù)語的通?？衫斫獾亩x可參見例如Rieger et al.，Glossary of GeneticsClassical and Molecular，5thedition，Springer-VerlagNew York，1991；及Lewin，Genes V. OxfordUniversity PressNew York，1994。
本文描述了包括常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)的方法。此類技術(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員一般通曉的并在方法學(xué)文獻(xiàn)中有詳細(xì)的描述，例如，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；及CurrentProtocols in Molecular Biology，ed.Ausubel et al..Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1992(定期更新)?；瘜W(xué)合成核酸的方法例如Beaucage and Carruthers，Tetra.Letts.221859-1862，1981，及Matteucci etal.，J.Am.Chem.Soc.1033185，1981中所述。核酸的化學(xué)合成可在例如商業(yè)銷售的自動寡核苷酸合成儀中進(jìn)行。免疫學(xué)方法(例如，抗原特異抗體的制備、免疫共沉淀及免疫印記)參見例如Current Protocols inImmunology，ed.Coligan et al.，John Wiley&Sons，New York，1991；及Methods of Immunological Analysis，ed.Masseyeff et al.，John Wiley&Sons，New York，1992所述?；蜣D(zhuǎn)移和基因治療的常規(guī)方法也在本發(fā)明中采用，參見例如Gene TherapyPrinciples and Applications，ed.T.Blackenstein，Springer Verlag，1999；Gene Therapy Protocols(Methods in MolecularMedicine)，ed.P.D.Robbins，Humana Press，1997；及Retro-vectors forHuman Gene Therapy，ed.C.P.Hodgson，Springer Verlag，1996所述。
本發(fā)明涉及心臟缺血區(qū)域中心肌(或外周血管組織此情況下的骨骼肌)再生的方法。本發(fā)明的方法可用于心肌梗塞較長時(shí)間(即多周)后的缺血性心肌病的治療。
所述的方法包括在哺乳動物個(gè)體中動員和直接遷移多潛能干細(xì)胞到梗塞的心肌中。哺乳動物個(gè)體包括任何哺乳動物，例如人、大鼠、小鼠、貓、狗、綿羊、山羊、馬、猴子、猿、兔子、牛等等。所述哺乳動物個(gè)體可處于任何發(fā)育階段，包括成年、青年動物及新生兒。哺乳動物個(gè)體還可包括胚胎發(fā)育階段的動物。
所述的梗塞的心肌包括梗塞的心肌組織、環(huán)繞所述的梗塞的心肌組織周圍的心肌組織、及同時(shí)包括梗塞的心肌組織和環(huán)繞所述的梗塞的心肌組織周圍的心肌組織。
在距心肌梗塞后較長時(shí)間的某一時(shí)間點(diǎn)上，第一數(shù)量的多潛能干細(xì)胞進(jìn)入所述的梗塞的心肌。能夠增加該第一數(shù)量的干細(xì)胞使得更多數(shù)量的干細(xì)胞進(jìn)入到所述的梗塞的心肌中。通過增加進(jìn)入所述的梗塞的心肌中的干細(xì)胞數(shù)量，由于在所述的梗塞的心肌中將會有更多數(shù)量的多潛能干細(xì)胞，其可分化為能夠進(jìn)行再定居(repopulate)(即植入)及部分或全部恢復(fù)梗塞的心肌正常功能的細(xì)胞，該梗塞的心肌能夠再生。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述的方法包括誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞歸巢到梗塞的心肌來再生梗塞的心肌的步驟。本發(fā)明所述的多潛能干細(xì)胞是能夠誘導(dǎo)分化為另一種細(xì)胞的任何細(xì)胞。一個(gè)例子包括能夠分化為心肌細(xì)胞的造血干細(xì)胞。
通過將所述的梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度從第一濃度增加到第二濃度來使多潛能干細(xì)胞歸巢到梗塞的心肌中。所述的SDF-1蛋白的第一濃度可以為通常發(fā)現(xiàn)的距心肌梗塞后較長時(shí)間點(diǎn)(即多周)的梗塞的心肌中的SDF-1蛋白濃度。所述的SDF-1蛋白的第二濃度基本上高于所述的SDF-1蛋白的第一濃度。通過將SDF-1蛋白的表達(dá)從距心肌梗塞后較長時(shí)間點(diǎn)(即多周)的梗塞的心肌中通常的SDF-1蛋白的表達(dá)量上調(diào)，能夠增加梗塞的心肌中的SDF-1蛋白的濃度。
本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將外周血中干細(xì)胞濃度(即數(shù)量)從第一濃度增加到基本上高于第一濃度的第二濃度的步驟。所述的干細(xì)胞的第一濃度可以為在心肌梗塞后較長的一個(gè)時(shí)間(即多周)的外周血中通常發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞濃度。當(dāng)所述的梗塞的心肌中的SDF-1蛋白濃度增加時(shí)，所述的外周血中的干細(xì)胞濃度能夠同時(shí)增加。所述的外周血中干細(xì)胞濃度能夠在所述的梗塞心肌中的SDF-1蛋白表達(dá)上調(diào)前或后增加。
由梗塞的心肌表達(dá)的SDF-1蛋白誘導(dǎo)所述的外周血干細(xì)胞進(jìn)入梗塞的心肌。被誘導(dǎo)進(jìn)入梗塞的心肌的干細(xì)胞可促進(jìn)心肌再生及本質(zhì)上改進(jìn)左心室的功能。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的方法進(jìn)一步包括將所述的梗塞心肌外周血的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)從第一濃度增加到基本上高于第一濃度的第二濃度的步驟。所述的梗塞心肌中的VEGF第一濃度為在心肌梗塞后較長的一個(gè)時(shí)間(即多周)的梗塞的心肌中通常發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞濃度。通過將VEGF的表達(dá)從心肌梗塞后較長的一個(gè)時(shí)間(即多周)的梗塞的心肌中通常發(fā)現(xiàn)的VEGF的量上調(diào)，能夠增加梗塞的心肌中的VEGF的濃度。
當(dāng)所述的梗塞的心肌中的SDF-1蛋白濃度以及外周血干細(xì)胞濃度增加時(shí)，所述的梗塞的心肌中的VEGF濃度能夠同時(shí)增加。與鹽水對照比較，在梗塞的心肌中增加血管內(nèi)皮生長因子的濃度與增加梗塞的心肌中的SDF-1蛋白濃度以及增加外周血干細(xì)胞濃度聯(lián)合使用可增加梗塞的心肌中血管的密度。此外，這種聯(lián)合能夠?qū)е鹿Ｈ男募〉男募〖∏虻鞍妆磉_(dá)細(xì)胞的再定居及增加左心室的功能(通過縮短分?jǐn)?shù)檢測)。
SDF-1蛋白根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述的在梗塞的心肌中表達(dá)的SDF-1蛋白(或SDF-1多肽)為SDF-1基因的表達(dá)產(chǎn)物。許多或不同哺乳動物SDF-1蛋白的氨基酸序列是已知的，包括人、大鼠、小鼠及貓。所述的SDF-1蛋白具有與上述天然的哺乳動物SDF-1蛋白中的一種相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的SDF-1蛋白也可以是哺乳動物SDF-1蛋白的變體，例如哺乳動物SDF-1蛋白的片段、類似物和衍生物。此種變體包括例如，由天然的SDF-1基因(即編碼天然發(fā)生的哺乳動物SDF-1蛋白的天然發(fā)生的核酸)的自然發(fā)生的等位基因變體編碼的多肽，由天然SDF-1基因可選擇的拼接形式編碼的多肽，由天然SDF-1基因同源序列編碼的多肽，及由天然SDF-1基因非自然發(fā)生的變體編碼的多肽。
SDF-1蛋白變體與天然SDF-1蛋白比較其肽序列中有一個(gè)或多個(gè)不同的氨基酸。此變體的肽序列具有SDF-1蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、添加、或取代的特征。氨基酸插入優(yōu)選為約1-4個(gè)連續(xù)(比鄰)氨基酸，缺失優(yōu)選為約1-10連續(xù)氨基酸。變體SDF-1蛋白基本上保持了天然SDF-1蛋白的功能活性。優(yōu)選的SDF-1蛋白變體通過本發(fā)明中的以沉默或保守的改變?yōu)樘卣鞯暮怂岱肿拥谋磉_(dá)來產(chǎn)生。
對應(yīng)一個(gè)或更多基序的和/或功能域、或?qū)?yīng)人工序列大小的SDF-1蛋白片段屬于本發(fā)明的范圍?？赏ㄟ^篩選編碼此肽的核酸的對應(yīng)片段重組產(chǎn)生的肽來獲得SDF-1蛋白的分離的肽基部分(peptidyl portions)。此外，可利用本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的技術(shù)來化學(xué)合成片段，例如常規(guī)的Merrifield固相(solid phase)f-Moc或t-Boc化學(xué)。例如，本發(fā)明的SDF-1蛋白可任意地分為沒有片段重疊的所希望的長度，或優(yōu)選分為所希望長度的重疊片段?？芍亟M產(chǎn)生所述的片段并檢測鑒定那些具有天然SDF-1蛋白激動劑功能的肽基片段。
SDF-1蛋白的變體還能包括SDF-1蛋白的重組形式。除SDF-1蛋白外，本發(fā)明優(yōu)選的重組多肽由核酸編碼，該核酸與編碼哺乳動物SDF-1蛋白基因的核酸序列至少有85％序列同一性。
SDF-1蛋白變體可包括組成性表達(dá)天然SDF-1蛋白的功能活性的蛋白的激動劑形式。其它SDF-1蛋白變體可包括那些對蛋白降解分裂具有抗性的，例如，由于突變而改變蛋白酶作用的靶序列。肽的氨基酸序列改變是否可產(chǎn)生具有天然SDF-1蛋白的一個(gè)或多個(gè)功能活性的變體可通過檢測變體的天然SDF-1蛋白功能活性來較容易地確定。
核酸本發(fā)明的另一方面涉及編碼SDF-1蛋白的核酸分子和編碼SDF-1蛋白的非天然的核酸。這些核酸分子可以是RNA或DNA的形式(例如，cDNA、基因組DNA及合成的DNA)。DNA可以是雙鏈或單鏈的，并且單鏈可以是編碼(有義)鏈或非編碼(反義)鏈。該編碼SDF-1蛋白的編碼序列可以與GenBank登錄號No.AF189724、GenBank登錄號No.AF209976、GenBank登錄號No.L120029及GenBank登錄號No.NM022177的核酸序列相同。作為遺傳密碼的冗余和簡并結(jié)果，其還可以是不同的編碼序列，編碼與該多聚核苷酸編碼的相同的多肽。
本發(fā)明中其它的編碼SDF-1的核酸分子為天然SDF-1的變體，例如，編碼天然SDF-1蛋白的片段、類似物及衍生物的那些核酸。此變體可以是例如自然發(fā)生的天然SDF-1基因的等位基因變體，天然SDF-1基因的同源物、或天然SDF-1基因的非自然發(fā)生的變體。這些變體與天然SDF-1基因比較，其核苷酸序列具有一個(gè)或多個(gè)堿基差異。例如，此變體的核苷酸序列具有天然SDF-1基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、添加、或取代的特征。核酸插入優(yōu)選為約1-10個(gè)連續(xù)(比鄰)核苷酸，缺失優(yōu)選為約1-10個(gè)連續(xù)核苷酸的缺失。
在其它應(yīng)用中，可通過核苷酸的取代(該取代不引起編碼的多肽的保守改變)來產(chǎn)生表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)性變化的變體SDF-1蛋白。此核苷酸取代的例子為引起(a)多肽骨架結(jié)構(gòu)改變；(b)多肽電荷或疏水性改變；或(c)氨基酸側(cè)鏈大小的改變的那些取代。通常希望能夠產(chǎn)生蛋白特性的最大變化的核苷酸的取代是那些引起密碼子非保守性改變的取代。可能引起蛋白結(jié)構(gòu)較大變化的密碼子改變的例子為引起(a)親水殘基(例如絲氨酸或蘇氨酸)由(或被)疏水殘基(例如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸)所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸由(或被)任何其它殘基所取代；(c)具有正電側(cè)鏈的殘基(例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)由(或被)負(fù)電性殘基(例如谷氨酸或天冬氨酸)所取代；或(d)具有側(cè)鏈的殘基(例如苯丙氨酸)由(或被)沒有側(cè)鏈的殘基(例如甘氨酸)所取代的那些密碼子。
本發(fā)明的天然SDF-1基因的自然發(fā)生的等位基因變體為分離自哺乳動物組織中的核酸，其與天然SDF-1基因具有至少75％序列同一性，并編碼與天然SDF-1蛋白具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。本發(fā)明的天然SDF-1基因的同源序列為分離自其它種群的核酸，其與所述的天然基因具有至少75％的序列同一性，并編碼與天然SDF-1蛋白具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。可搜尋公共和/或?qū)Ｓ械暮怂釘?shù)據(jù)庫來確定與天然SDF-1基因具有較高百分比(例如，70％或更多)序列同一性的其它核酸分子。
非自然發(fā)生的SDF-1基因變體為自然界中沒有出現(xiàn)的核酸(例如，由人工制造)，與天然SDF-1基因具有至少75％的序列同一性，并編碼與天然SDF-1蛋白具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。非自然發(fā)生的SDF-1基因變體的例子為編碼天然SDF-1蛋白片段的那些變體、或在嚴(yán)格條件下與天然SDF-1基因雜交或與天然SDF-1基因互補(bǔ)的那些變體、與天然SDF-1基因或天然SDF-1基因互補(bǔ)序列具有至少65％序列同一性的那些變體、以及編碼SDF-1融合蛋白的那些變體。
本發(fā)明中的編碼天然SDF-1蛋白片段的核酸為編碼天然SDF-1蛋白殘基的那些核酸。編碼核酸(編碼天然SDF-1蛋白片段)或與之雜交的較短的寡核苷酸能夠用作探針、引物或反義分子。編碼核酸(編碼天然SDF-1蛋白片段)或與之雜交的較長的多聚核苷酸也能夠用于本發(fā)明的多個(gè)方面。編碼天然SDF-1片段的核酸可通過對全長天然SDF-1基因或其變體的酶切(例如，使用限制性內(nèi)切酶)或化學(xué)降解來獲得。
在嚴(yán)格條件下與上述核酸中的一種雜交的核酸也可用于本發(fā)明。例如，此核酸能夠是在較低的嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、或較高的嚴(yán)格條件下與上述核酸中的一種雜交的核酸，其也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
編碼SDF-1融合蛋白的核酸分子也可用于本發(fā)明。此種核酸可通過制備當(dāng)其介入適合的靶細(xì)胞中時(shí)表達(dá)SDF-1融合蛋白的構(gòu)建(例如，表達(dá)載體)來獲得。例如，此種構(gòu)建能夠通過將融合在框架內(nèi)的編碼的SDF-1蛋白的第一多聚核苷酸與編碼另一種蛋白的第二多聚核苷酸連接，使得該構(gòu)建在適合的表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)生一種融合蛋白來制備此構(gòu)建。
本發(fā)明的寡核苷酸為DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修飾體，其可為單鏈或雙鏈的。能夠?qū)Υ斯押塑账岬膲A基部分、糖部分或磷酸骨架進(jìn)行修飾，例如改進(jìn)該分子的穩(wěn)定性、雜交等等。本發(fā)明的寡核苷酸可另外含有其它的附加的基團(tuán)，諸如肽(例如，用于在體靶定靶細(xì)胞受體)，或促進(jìn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、雜交-促發(fā)裂解(hybridization-triggeredcleavage)的試劑。為此，該寡核苷酸應(yīng)連接到另外的分子上，例如肽、雜交促發(fā)交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)試劑、雜交促發(fā)裂解劑等等。
SDF-1表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的另一方面，通過移植生物匹配的細(xì)胞到梗塞的心肌組織中能夠上調(diào)梗塞的心肌中SDF-1的表達(dá)。將細(xì)胞移植到梗塞的心肌中來上調(diào)梗塞的心肌中SDF-1蛋白的表達(dá)。從細(xì)胞移植到該心肌后約1小時(shí)到移植后不多于約7天內(nèi)觀測到所述的梗塞的心肌中SDF-1蛋白的上調(diào)。
能夠移植到梗塞的心肌的細(xì)胞類型的例子包括培養(yǎng)的心肌細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及骨髓來源細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選從欲治療的個(gè)體中獲得(即自體同源細(xì)胞)并在移植前進(jìn)行培養(yǎng)。為增加用于移植的細(xì)胞的生物匹配性并最小化排斥的可能性，因此優(yōu)選自體同源細(xì)胞。
用于移植到梗塞的心肌的優(yōu)選細(xì)胞為骨骼肌成肌細(xì)胞。成肌細(xì)胞保持骨骼肌的再生潛能，在應(yīng)激時(shí)能夠增殖和分化為肌管，最終形成具有收縮能力的肌纖維。移植進(jìn)入心肌的成肌細(xì)胞進(jìn)行肌管的形成，從細(xì)胞周期中撤出，并保持活力。功能研究表明移植成肌細(xì)胞到所述的心肌后可改善區(qū)域的收縮性和順應(yīng)性。
在肌纖維的基膜下可容易獲得骨骼肌成肌細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增該細(xì)胞系，并隨后移植到梗塞的心肌中。例如，在鼠類個(gè)體中，可從該個(gè)體的后肢獲得骨骼肌成肌細(xì)胞，培養(yǎng)并隨后移植到該個(gè)體梗塞的心肌中。
可通過本領(lǐng)域公知的細(xì)胞移植技術(shù)將所述培養(yǎng)細(xì)胞移植到所述的梗塞的心肌中。例如，利用結(jié)核菌素注射器可將培養(yǎng)細(xì)胞的懸浮液注射到所述的梗塞組織中。
可選擇地，通過向靶細(xì)胞中介入增加SDF-1蛋白表達(dá)的試劑可上調(diào)SDF-1蛋白的表達(dá)。所述的靶細(xì)胞包括梗塞心肌中的細(xì)胞或體外培養(yǎng)再回輸?shù)募?xì)胞(例如從該個(gè)體獲得的自體同源骨骼肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)。
根據(jù)本發(fā)明和以上所述，所述的試劑包括被連接到重組核酸構(gòu)建(典型的為DNA構(gòu)建)中的天然和合成的核酸，其能夠被介入并在細(xì)胞中復(fù)制。此構(gòu)建優(yōu)選包括能夠在給定的靶細(xì)胞中進(jìn)行多肽編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的復(fù)制系統(tǒng)和序列。
也能夠?qū)⑵渌噭┙槿氲桨屑?xì)胞中來增加靶組織中SDF-1蛋白水平。例如，增加編碼SDF-1蛋白基因轉(zhuǎn)錄的試劑可增加編碼SDF-1蛋白的mRNA的翻譯，和/或降低SDF-1蛋白的mRNA的降解的試劑能夠用于增加SDF-1蛋白水平。通過在該編碼SDF-1蛋白基因的上游誘導(dǎo)外源性啟動子可實(shí)現(xiàn)增加細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄率。也可使用促進(jìn)異源性基因表達(dá)的增強(qiáng)子元件。
將所述的試劑介入到靶細(xì)胞的優(yōu)選的方法包括基因治療?；蛑委熤赣糜隗w內(nèi)或體外在細(xì)胞中表達(dá)治療產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的基因治療可用于體內(nèi)體外在靶細(xì)胞中表達(dá)SDF-1蛋白。
基因治療的一種方法使用含有編碼SDF-1蛋白的核苷酸載體?！拜d體”(有時(shí)指基因傳輸或基因轉(zhuǎn)移“載體”)指包括體內(nèi)或體外欲傳輸?shù)桨屑?xì)胞的多聚核苷酸的大分子或分子復(fù)合物。所述的欲傳輸?shù)亩嗑酆塑账峥梢园ɑ蛑委熤懈信d趣的編碼序列。載體包括，例如，病毒載體(諸如腺病毒(Ad)、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)及逆轉(zhuǎn)錄病毒)、脂質(zhì)體及含有脂質(zhì)的絡(luò)合物、以及能夠介導(dǎo)多聚核苷酸釋放到靶細(xì)胞的其它大分子絡(luò)合物。
載體還包括進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因釋放和/或基因表達(dá)的其它成分或功能物，或另外對靶細(xì)胞提供有益特性的物質(zhì)。這些其它的成分包括例如，影響對細(xì)胞結(jié)合或靶定的成分(包括介導(dǎo)細(xì)胞類型或組織特異結(jié)合的成分)；影響細(xì)胞對載體核酸攝取的成分；在攝取后影響細(xì)胞中多聚核苷酸定位的成分(例如介導(dǎo)核定位試劑)；及影響多聚核苷酸表達(dá)的成分。此成分還可包括標(biāo)志，例如可檢測和/或選擇性標(biāo)志，其可用于檢測或選擇已經(jīng)攝取并表達(dá)由載體釋放的核酸的細(xì)胞。此成分以載體的天然特征來提供(例如具有調(diào)節(jié)結(jié)合和攝取的成分和功能物的某種病毒載體的使用)，或通過修飾載體來提供此功能物。
選擇性標(biāo)志能夠是陽性、陰性或雙功能性的。陽性選擇性標(biāo)志能對攜帶此標(biāo)志的細(xì)胞進(jìn)行選擇，而陰性選擇性標(biāo)志可對攜帶此標(biāo)志的細(xì)胞進(jìn)行選擇性排除。已有多種此類標(biāo)志基因，包括雙功能(即陽性/陰性)標(biāo)志的描述(參見例如，Lupton，S.，WO 92/08796，May 29，1992公布；及Lupton，S.，WO 94/28143，Dec.8，1994公布)。此標(biāo)志基因可提供控制的附加方法，其在治療方案中具有優(yōu)越性。此載體的大多數(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的且是常規(guī)可獲得的。
本發(fā)明使用的載體包括病毒載體、脂質(zhì)為基礎(chǔ)的載體及其它能夠釋放本發(fā)明的核酸到靶細(xì)胞中的載體。此載體可以是靶向載體，特別是優(yōu)選結(jié)合到心肌細(xì)胞的靶向載體。本發(fā)明使用的優(yōu)選的病毒載體為對靶細(xì)胞低毒性并以組織特異性方式誘導(dǎo)治療性作用量的SDF-1蛋白的產(chǎn)生。
目前優(yōu)選的病毒載體衍生自腺病毒(Ad)或腺病毒相關(guān)病毒(AAV)?？墒褂萌撕头侨瞬《据d體但優(yōu)選的重組病毒載體在人中復(fù)制缺陷(replication-defective)。當(dāng)載體為腺病毒時(shí)，優(yōu)選包括多聚核酸，該多聚核酸具有可操作地連接到編碼SDF-1蛋白基因的啟動子并在人類中復(fù)制缺陷。
本發(fā)明優(yōu)選使用腺病毒載體，其原因是它們(1)在靶細(xì)胞中具有高效基因表達(dá)的能力，及(2)對較大量異源性(非病毒)DNA具有適應(yīng)性。重組腺病毒的優(yōu)選形式為“空殼(gutless)”、“高容量(high-capacity)”、或“輔助依賴性”(helper-dependent)腺病毒載體。此載體的特征為，例如，(1)所有或大部分病毒編碼序列(編碼病毒蛋白的序列)的缺失，(2)病毒DNA復(fù)制所必需的病毒反向(inverted)末端重復(fù)序列(ITRs)，(3)多達(dá)28-32 kb的“外源性”或“異源性”序列(例如，編碼SDF-1蛋白的序列)，及(4)病毒DNA包裝序列，其在病毒基因組進(jìn)入感染性衣殼的包裝中是必需的。對特異的心肌細(xì)胞，此重組腺病毒載體的優(yōu)選變體含有可操作地連接到SDF-1基因的組織特異性的(例如，心肌細(xì)胞)增強(qiáng)子和啟動子。
AAV為基礎(chǔ)的載體是有優(yōu)勢的，因其表現(xiàn)高度的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并能夠以位點(diǎn)特異性方式整合到靶基因組中。重組AAV載體的使用詳見Tal，J.，J. Biomed.Sci.7279-291，2000；及Monahan and Samulski，GeneTherapy 724-30，2000所述。優(yōu)選的AAV載體包含一對AAV反向末端重復(fù)序列，其側(cè)翼連接至少一個(gè)盒(cassette)，該盒含有可操作地連接到SDF-1核酸的組織(例如心肌)或細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞)特異啟動子。該AAV載體的DNA序列，包括所述ITRs、所述啟動子及SDF-1基因可整合到靶基因組中。
根據(jù)本發(fā)明可使用的其它病毒載體包括單純皰疹病毒(herpes simplexvirus，HSV)為基礎(chǔ)的載體。缺失了一個(gè)或多個(gè)瞬時(shí)早期基因(IE)的HSV載體是有優(yōu)勢的，因其通常是非毒性的，在靶細(xì)胞中保持類似于潛伏期的狀態(tài)，并提供有效的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。重組HSV載體可連接約30 kb的異源核酸。優(yōu)選HSV載體為一種(1)來自HSV I型的工程型(engineered)，(2)具有其IE基因缺失，及(3)含有可操作地連接到SDF-1核酸的組織特異性(例如心肌)啟動子。HSV擴(kuò)增子載體也可用于本發(fā)明的不同方法中。通常，HSV擴(kuò)增子載體約15kb長，具有病毒來源的復(fù)制和包裝序列。
諸如C-型反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒(lentiviruses)中的反轉(zhuǎn)錄病毒也可在本發(fā)明中使用。例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以小鼠白血病病毒(MLV)為基礎(chǔ)。參見例如，Hu and Pathak，Pharmacol.Rev.52493-511，2000及Fong etal.，Crit.Rev.Ther Drug Carrier Syst.171-60，2000。MLV-為基礎(chǔ)的載體可含有取代病毒基因的約8kb的異源(治療性)DNA。此異源性DNA可包含組織特異性啟動子和SDF-1核酸。在向梗塞心肌傳輸?shù)姆椒ㄖ?，其也可編碼心肌特異受體的配體。
其它的可使用的反轉(zhuǎn)錄病毒載體為復(fù)制缺陷慢病毒為基礎(chǔ)的載體，包括人免疫缺陷病毒(HIV)為基礎(chǔ)的載體。參見例如，Vigna and Naldini，J.Gene Med.5308-316，2000及Miyoshi et al.，J.Virol.728150-8157，1998。慢病毒載體的優(yōu)勢為，其對活動分化和非分化細(xì)胞均具有感染的能力。其對轉(zhuǎn)導(dǎo)人上皮細(xì)胞也具有高效性。
用于本發(fā)明的慢病毒載體可以是人源和非人源性(包括SIV)慢病毒。優(yōu)選的慢病毒載體包括載體繁殖所需的核酸序列以及可操作地連接到SDF-1基因的組織特異性(例如，心肌)啟動子。此前者可包括所述的病毒LTRs，引物結(jié)合位點(diǎn)，多聚鳥苷嘌呤系統(tǒng)(tract)，att位點(diǎn)，及衣殼包裝(encapsidation)位點(diǎn)。
慢病毒載體可包裝到任意適合的慢病毒衣殼中。一種顆粒蛋白被不同病毒的另一種顆粒蛋白的取代指“假型(pseudotyping)”。該載體衣殼可含有來自其它病毒的病毒外膜蛋白，包括小鼠白血病病毒(MLV)或水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)。VSV G-蛋白的使用可產(chǎn)生高載體滴度并導(dǎo)致載體病毒顆粒更高的穩(wěn)定性。
甲病毒(Alphavirus)為基礎(chǔ)的載體，例如產(chǎn)生自塞姆利基(semliki)森林病毒(SFV)和辛德畢斯(sindbis)病毒(SIN)的載體也可用于本發(fā)明中。甲病毒的使用如Lundstrom，K.，Intervirology 43247-257，2000及Perri et al.，Journal of Virology 749802-9807，2000所述。甲病毒載體通常以已知的復(fù)制子(replicon)的形式構(gòu)建。復(fù)制子可包括(1)RNA復(fù)制必需的甲病毒遺傳元件，及(2)諸如一種編碼SDF-1核酸的異源核酸。在甲病毒復(fù)制子中，所述的異源核酸可操作地連接到組織特異性(例如，心肌)啟動子或增強(qiáng)子上。
重組、復(fù)制缺陷甲病毒載體是有優(yōu)勢的，因其具有高水平異源(治療)基因表達(dá)能力，并可感染較廣泛范圍的靶細(xì)胞。甲病毒復(fù)制子可通過在其病毒體表面上展現(xiàn)功能異源配體或結(jié)合功能域(其可選擇性地與表達(dá)同類結(jié)合伴侶的靶細(xì)胞結(jié)合)來被靶定在特異細(xì)胞類型(例如，心肌細(xì)胞)上。甲病毒復(fù)制子可具有潛伏期，并因此可在靶細(xì)胞中進(jìn)行長期異源核酸的表達(dá)。該復(fù)制子還可在靶細(xì)胞中表現(xiàn)瞬時(shí)的異源核酸表達(dá)。優(yōu)選的甲病毒載體或復(fù)制子為非細(xì)胞變性的。
在適用于本發(fā)明方法的多種病毒載體中可包括多于一種的啟動子，該啟動子允許載體表達(dá)多于一種的異源性基因。此外，該載體可含有編碼信號肽的序列或促進(jìn)SDF-1基因產(chǎn)物從靶細(xì)胞中分泌的其它部分。
結(jié)合兩種病毒載體系統(tǒng)的優(yōu)越性，可使用雜交的病毒載體來向靶組織(例如，心肌)中傳輸SDF-1核酸。構(gòu)建此雜交載體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的。此技術(shù)，例如參見Sambrook.et al..In MolecularCloningA laboratory manual.Cold Spring Harbor，N.Y.或任何討論重組DNA技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室手冊。腺病毒衣殼中的含有AVV和腺病毒ITRs組合的雙鏈AAV基因組可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在另一種變體中，可將AAV載體放入“空殼”、“輔助依賴性”或“高容量”腺病毒載體中。腺病毒/AAV雜交載體如Lieber et al.，J.Virol.739314-9324，1999所述。反轉(zhuǎn)錄病毒/腺病毒雜交載體如Zheng et al.，Nature Biotechnol.18176-186，2000所述。其中含有腺病毒的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組可整合到靶細(xì)胞基因組內(nèi)并對SDF-1基因的穩(wěn)定表達(dá)發(fā)揮作用。
也可考慮其它促進(jìn)SDF-1基因表達(dá)及載體的克隆的核酸序列元件。例如啟動子上游增強(qiáng)子或編碼區(qū)下游終止子的存在可例如促進(jìn)表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面，組織特異性啟動子(例如左心室肌球蛋白輕鏈-2(MLC2v)或肌球蛋白重鏈(MHC)的組織特異性轉(zhuǎn)錄控制序列)可融合到SDF-1基因上。通過將此組織特異性啟動子融合到腺病毒構(gòu)建中，使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限定在心室心肌細(xì)胞中。組織特異性啟動子提供的基因表達(dá)的效率和特異性程度可使用本發(fā)明的重組腺病毒系統(tǒng)來測定。心肌特異(例如，心肌組織特異)表達(dá)是本領(lǐng)域公知的(J Biol.Chem.，26715875-15885，1992)。也可使用其它的啟動子，諸如肌鈣蛋白(troponin)-C啟動子。
當(dāng)在體傳輸SDF-1基因時(shí)，單獨(dú)針對心肌細(xì)胞(即在心臟中不在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中伴隨表達(dá))的組織特異性啟動子的使用可提供治療性處理的SDF-1蛋白的充分表達(dá)。對心肌的限定性表達(dá)也可具有關(guān)于CHF治療的基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。此外心肌細(xì)胞似乎可提供最長的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，因該細(xì)胞不進(jìn)行快速的周轉(zhuǎn)；表達(dá)因此不會如內(nèi)皮細(xì)胞那樣因細(xì)胞分化和死亡而減少。用于此目的的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子也是容易獲得的(Lee，et al.，J.Biol.Chem.，26510446-10450，1990)。
除病毒載體為基礎(chǔ)的方法外，非病毒方法也可用于將SDF-1基因介入到靶細(xì)胞中。基因傳輸?shù)姆遣《痉椒ǖ木C述參見Nishikawa and Huang，Human Gene Ther.12861-870，2001。本發(fā)明的優(yōu)選的非病毒基因傳輸方法是利用質(zhì)粒DNA來介導(dǎo)SDF-1核酸進(jìn)入細(xì)胞。質(zhì)粒為基礎(chǔ)的基因傳輸方法是本領(lǐng)域所公知的。
合成基因的轉(zhuǎn)移分子可設(shè)計(jì)為質(zhì)粒DNA的多分子集合multimolecular aggregates (例如，錨定可操作地連接到心肌-特異啟動子的SDF-1編碼序列)。這些集合可設(shè)計(jì)用于結(jié)合靶細(xì)胞(例如，心肌細(xì)胞)。
陽離子兩性物(包括脂多胺類(lipopolyamines)和陽離子脂質(zhì))可用于提供受體依賴的SDF-1核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)入靶細(xì)胞中(例如，心肌細(xì)胞)。此外，使用的陽離子脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)可與質(zhì)粒DNA混合形成細(xì)胞轉(zhuǎn)染復(fù)合物。有陽離子脂質(zhì)制劑參與的方法參見Feigner et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.772126-139，1995和Lasic and Templeton，Adv. Drug Delivery Rev.20221-266，1996的綜述。對于基因的傳輸，也可將DNA結(jié)合到兩性陽離子肽上(Fominaya et al.，J.Gene Med.2455-464，2000)。
本發(fā)明也可使用同時(shí)包括病毒和非病毒為基礎(chǔ)的成分的方法。例如，用于治療性基因傳輸?shù)腅pstein Barr病毒(EBV)為基礎(chǔ)的質(zhì)粒，如Cui et al.，Gene therapy 81508-1513，2001所述。此外，包括將DNA/配體/多陽離子附屬物結(jié)合到腺病毒的方法如Curiel，D.T.，Nat.Immun.13141-164，1994所述。
編碼SDF-1表達(dá)的載體能夠以注射制劑的形式傳輸?shù)桨屑?xì)胞中，如果需要該制劑可含有藥物可接受的載體(諸如鹽)。根據(jù)本發(fā)明也使用其它藥物載體、制劑和劑型。
當(dāng)靶細(xì)胞包括梗塞的心肌細(xì)胞時(shí)，在熒光鏡的指引下可使用結(jié)核菌素注射器并以足夠表達(dá)SDF-1蛋白至能夠產(chǎn)生較高療效的量直接進(jìn)行冠狀動脈內(nèi)注射來傳輸所述載體。通過將該載體直接注射到梗塞心肌組織，有可能更有效地靶向該基因并將該重組載體的丟失降低到最小。
這種形式的注射能夠在受影響的心肌中實(shí)現(xiàn)所希望數(shù)量的細(xì)胞(特別是心肌細(xì)胞)的局部轉(zhuǎn)染，因此最大化基因轉(zhuǎn)移的治療效率并最小化病毒蛋白引起炎癥反應(yīng)的可能性?？墒褂眯募〖?xì)胞特異性啟動子，例如用來確保限于心肌細(xì)胞的表達(dá)的。因此在這種情況下轉(zhuǎn)基因的傳輸可導(dǎo)致靶定基因在例如左心室細(xì)胞中的表達(dá)。本領(lǐng)域其它公知的技術(shù)也可用于將所述載體移植到梗塞的心肌的靶細(xì)胞中。
當(dāng)靶細(xì)胞為所培養(yǎng)的隨后將被移植到梗塞的心肌的細(xì)胞時(shí)，所述的載體可通過直接注射到培養(yǎng)液中來傳輸。轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的SDF-1核酸能夠可操作地連接到任何適合的調(diào)控序列，包括心肌特異啟動子和增強(qiáng)子。
通過本領(lǐng)域公知的移植技術(shù)，例如使用結(jié)核菌素注射器直接進(jìn)行冠狀動脈內(nèi)注射，來隨后將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞移植到梗塞的心肌中。與對梗塞的心肌進(jìn)行載體的直接注射比較，通過首先進(jìn)行離體的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染，然后將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞移植到梗塞的心肌中，將最小化梗塞的心肌中炎癥反應(yīng)的可能性。
在靶細(xì)胞中，本發(fā)明的SDF-1核酸可表達(dá)任意長度的時(shí)間，包括瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定、長期表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的SDF-1核酸可以以有效的劑量在適合并規(guī)定的時(shí)間長度內(nèi)表達(dá)。
有效劑量為能夠在所治療的動物或人中產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上所希望的治療效果的劑量。如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所公知的，任何動物或人的劑量將依靠多種因素來決定，包括個(gè)體的大小、體表面積、年齡、欲給藥的具體組合物、性別、給藥時(shí)間和途徑、一般健康情況及其它同時(shí)給予的藥物。對本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員來講，利用以下所述的實(shí)驗(yàn)方法可容易地確定蛋白、核酸或其它小分子的特定劑量。
當(dāng)沒有用SDF-1蛋白編碼載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被移植到所述梗塞的心肌中時(shí)，所述的SDF-1表達(dá)可以是瞬時(shí)的?？蛇x擇地，當(dāng)利用SDF-1蛋白編碼載體對梗塞的心肌進(jìn)行轉(zhuǎn)染或?qū)嵤┝薙DF-1蛋白編碼載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被移植到該梗塞的心肌時(shí)，SDF-1蛋白表達(dá)可以是長期的。
長期SDF-1表達(dá)是有優(yōu)勢的，因其能通過動員劑(例如G-CSF或一些其它因子)在手術(shù)或移植細(xì)胞步驟一段時(shí)間后來增加干細(xì)胞的濃度。當(dāng)G-CSF為動員劑時(shí)，嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)會顯著增加，其可引起圍手術(shù)期的副作用，而不在多天或多周后。此外，長期或慢性的SDF-1蛋白表達(dá)上調(diào)可使產(chǎn)生多啟動的干細(xì)胞動員。此外慢性SDF-1蛋白表達(dá)上調(diào)不需要干細(xì)胞的動員即可引起干細(xì)胞從外周血中長期歸巢到梗塞的心肌組織中。
干細(xì)胞動員根據(jù)本發(fā)明的另一方面，能夠通過給予誘導(dǎo)個(gè)體干細(xì)胞動員到外周血的試劑來增加個(gè)體外周血中干細(xì)胞的濃度。利用一些試劑可將個(gè)體干細(xì)胞動員到外周血中來增加個(gè)體外周血的干細(xì)胞濃度。例如，為了增加哺乳動物外周血中干細(xì)胞的數(shù)量，可對個(gè)體進(jìn)行能夠引起多潛能干細(xì)胞從骨髓動員到外周血的試劑的給藥。一些這種試劑是公知的并包括細(xì)胞因子(諸如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-7、IL-3、IL-12、干細(xì)胞因子(SCF)及flt-3配體)，趨化因子(諸如IL-8、Mip-1α及Groβ)以及環(huán)磷酰胺(Cy)和紫杉醇(paclitaxel)的化療試劑。這些試劑在實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞動員、干細(xì)胞動員類型及效率的時(shí)間結(jié)構(gòu)(time frame)上有所差異。
可將動員劑直接注射到所述的個(gè)體來進(jìn)行動員劑的給藥。優(yōu)選地，所述的動員劑在梗塞的心肌中SDF-1表達(dá)上調(diào)后給藥。然而，所述的動員劑也可在SDF-表達(dá)上調(diào)之前給藥。
優(yōu)選的動員劑為集落刺激因子，例如G-CSF。在小鼠個(gè)體中G-CSF的常規(guī)劑量約為每天125μg/kg，給藥約5-10天。在sDF-表達(dá)上調(diào)后給予G-CSF試劑。
可選擇地，如本領(lǐng)域公知的，可通過將特異化的干細(xì)胞注射到外周血中(即MAPC′s)來增加外周血中干細(xì)胞的濃度。
VEGF根據(jù)本發(fā)明的另一方面，表達(dá)在梗塞的心肌中的VEGF為血管內(nèi)皮生長因子家族成員之一，其可誘導(dǎo)新的側(cè)枝血管(collateral blood vessels)的生長。VEGF為特異性促血管生長因子，其具有血管通透性并幾乎無例外地作用在內(nèi)皮細(xì)胞上。
在梗塞的心肌中表達(dá)的VEGF可以是VEGF基因的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明使用的優(yōu)選的VEGF包括VEGF-1(也稱VEGF-A)及其它結(jié)構(gòu)同源性的VEGF，例如VEGF-2(VEGF-C)、VEGF-3(VEGF-B)、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長因子。已知的VEGF-1異構(gòu)體包括121、138、162、165、182、189及206個(gè)氨基酸。這些異構(gòu)體分別確定為VEGF-121、VEGF-165、VEGF-162、VEGF-182、VEGF-189及VEGF-206。這些異構(gòu)體的促有絲分裂和肝素結(jié)合活性是不同的。本發(fā)明使用的優(yōu)選的VEGF-1異構(gòu)體為VEGF-165。沒有列出的VEGF-1的其它異構(gòu)體和VEGF其它的同源物也可用于本發(fā)明。
本發(fā)明的VEGF可以與上述的VEGF之一具有氨基酸序列同一性。本發(fā)明的VEGF也可以是上述VEGF之一的變體，例如VEGF的片段、類似物和衍生物。這種變體包括例如，由天然VEGF基因(即編碼自然發(fā)生的哺乳動物VEGF的自然發(fā)生的核酸)的自然發(fā)生的等位基因變體編碼的多肽，天然VEGF基因的可選擇拼接形式編碼的多肽，天然VEGF基因的同源物編碼的多肽，以及VEGF基因的非自然發(fā)生的變體編碼的多肽。
VEGF變體具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸不同于天然VEGF的肽序列。這種變體的所述肽序列具有天然VEGF的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、添加或取代的特征。氨基酸的插入優(yōu)選為約1-4個(gè)連續(xù)的氨基酸的插入，而缺失優(yōu)選為約1-10個(gè)連續(xù)氨基酸的缺失。根據(jù)本發(fā)明的變體VEGF基本上保持的天然VEGF的功能活性。優(yōu)選的VEGF蛋白變體可由表達(dá)本發(fā)明的具有沉默或保守變化特征的核酸分子來產(chǎn)生。
對應(yīng)一個(gè)或多個(gè)特定基序和/或功能域或人工序列大小的VEGF片段也屬于本發(fā)明的范圍?？赏ㄟ^篩選編碼此肽的核酸的對應(yīng)片段重組產(chǎn)生的肽來獲得SDF-1蛋白的分離的肽基部分。此外，通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)例如，常規(guī)Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學(xué)來化學(xué)合成片段。
VEGF的變體也可包括VEGF的重組形式。除VEGF蛋白外，本發(fā)明優(yōu)選的重組多肽由與編碼哺乳動物VEGF基因的核酸序列有至少85％序列同一性的核酸來編碼。
VEGF變體可以包括組成性表達(dá)天然VEGF的功能活性的蛋白的激動劑形式。其它VEGF變體可包括由例如改變蛋白酶靶序列的突變而引起的抗蛋白裂解的變體。通過檢測VEGF功能活性變體可容易地檢測肽的氨基酸序列改變是否能夠產(chǎn)生具有VEGF的一個(gè)或多個(gè)功能活性的變體。
VEGF核酸本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及編碼VEGF的核酸分子及編碼哺乳動物VEGF的非天然的核酸。這種核酸分子可以是RNA或DNA(例如，cDNA、基因組DNA及合成DNA)形式。所述DNA可以是雙鏈或單鏈，及如果是單鏈可以是編碼(有義)鏈或非編碼(反義)鏈。
本發(fā)明的其它核酸分子為天然VEGF基因的變體，例如編碼天然VEGF的片段、類似物及衍生物的那些天然VEGF基因的變體。這些變體可以是例如，VEGF基因的自然發(fā)生的等位基因變體、天然VEGF基因同源物、或天然VEGF基因的非自然發(fā)生的變體。這些變體的核苷酸序列與天然VEGF基因的不同之處在于具有一個(gè)或多個(gè)不同的堿基。例如，這種變體的核酸序列具有天然VEGF基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、添加或取代的特征。核酸的插入優(yōu)選為約1-10個(gè)連續(xù)的核苷酸的插入，而缺失優(yōu)選為約1-30個(gè)連續(xù)氨基酸的缺失。
在其它的應(yīng)用中，表現(xiàn)結(jié)構(gòu)本質(zhì)變化的變體VEGF可由不引起所編碼多肽的保守改變的核苷酸取代來產(chǎn)生。這種核苷酸取代的例子為引起(a)多肽骨架結(jié)構(gòu)改變；(b)多肽電荷或疏水性改變；或(c)氨基酸側(cè)鏈大小變化的取代。通常希望產(chǎn)生蛋白質(zhì)特性最大變化的核苷酸取代為引起密碼子非保守性改變的取代。可能引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要變化的密碼子改變的例子為引起(a)親水性殘基(例如，絲氨酸或蘇氨酸)由(或被)疏水性殘基(例如，亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸氨酸或丙氨酸)所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸由(或被)其它任意殘基取代；(c)具有正電側(cè)鏈的殘基(例如，賴氨酸、精氨酸或組氨酸)由(或被)負(fù)電殘基(例如，谷氨酸或天冬氨酸)所取代；或(d)具有側(cè)鏈的殘基(例如，苯丙氨酸)由(或被)沒有側(cè)鏈的殘基(例如，丙氨酸)取代。
本發(fā)明的VEGF基因的自然發(fā)生的等位基因的變體為分離自哺乳動物組織的核酸，其與天然VEGF基因具有至少75％的序列同一性并編碼與天然VEGF具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。本發(fā)明中的天然VEGF同源物為分離自與天然基因具有至少75％的序列同一性的其它物種的核酸，其編碼與天然VEGF具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽?？伤褜す埠?或?qū)Ｓ械暮怂釘?shù)據(jù)庫來確定與天然VEGF基因具有較高百分比序列同一性的其它核酸分子。
非自然發(fā)生的VEGF變體為自然界中沒有出現(xiàn)的核酸(例如，由人工制造的)，其與天然VEGF基因具有至少75％的序列同一性，并編碼與天然VEGF具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。非自然發(fā)生的VEGF基因SDF-1基因變體的例子為編碼天然VEGF片段的那些變體、或在嚴(yán)格條件下與天然VEGF基因雜交或與天然VEGF基因互補(bǔ)的那些變體、與天然VEGF基因或天然VEGF基因互補(bǔ)序列共有至少65％序列同一性的那些變體、以及編碼VEGF的那些變體。
本發(fā)明中的編碼天然VEGF片段的核酸為編碼天然VEGF殘基的那些核酸。編碼或與編碼天然VEGF片段的核酸雜交的較短的寡核苷酸能夠用作探針、引物或反義分子。編碼或與編碼天然VEGF片段的核酸雜交的較長的多聚核苷酸也能夠用于本發(fā)明的多個(gè)方面。編碼天然VEGF片段的核酸可通過對全長天然VEGF基因或其變體的酶切(例如，使用限制性內(nèi)切酶)或化學(xué)降解來獲得。
在嚴(yán)格條件下與上述核酸中的一種雜交的核酸也可用于本發(fā)明。例如，此核酸可以是在較低嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、或較高的嚴(yán)格條件下與上述核酸中的一種雜交的核酸，其也屬于本發(fā)明的范圍。
編碼VEGF融合蛋白的核酸分子也可用于本發(fā)明。此種核酸可通過制備當(dāng)其被介入到適合的靶細(xì)胞中時(shí)能表達(dá)VEGF融合蛋白的構(gòu)建(例如，表達(dá)載體)來獲得。例如，此種構(gòu)建能夠通過將融合在框架內(nèi)的編碼的VEGF蛋白的第一多聚核苷酸與編碼另一種蛋白的第二多聚核苷酸相連接，使得該構(gòu)建在適合的表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)生一種融合蛋白來制備此構(gòu)建。
本發(fā)明的寡核苷酸可以為單鏈或雙鏈的DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修飾體?？稍趬A基部分、糖部分或磷酸骨架對此寡核苷酸進(jìn)行修飾，例如改進(jìn)該分子的穩(wěn)定性、雜交等等。本發(fā)明的寡核苷酸可另外含有其它的附加的基團(tuán)，諸如肽(例如，用于在體靶向靶細(xì)胞受體)或促進(jìn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑。為此，該寡核苷酸應(yīng)連接到另外的分子上，例如肽、雜交促發(fā)交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)劑、雜交促發(fā)裂解劑等等。
VEGF表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可通過向靶細(xì)胞介入增加VEGF表達(dá)的試劑來增加梗塞的心肌中VEGF的表達(dá)。
所述靶細(xì)胞可包括梗塞的心肌中的細(xì)胞或體外再回輸?shù)募?xì)胞，例如自體同源骨骼肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，其可在試劑介入之后移植到梗塞的心肌中。當(dāng)靶細(xì)胞是被移植到梗塞的心肌中的細(xì)胞時(shí)，所述的靶細(xì)胞可以與用來促進(jìn)上調(diào)SDF-1蛋白的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染了編碼SDF-1蛋白載體的細(xì)胞相同。
所述的試劑包括天然和合成的VEGF核酸，其被連接到能夠介入并在細(xì)胞中復(fù)制的重組核酸構(gòu)建(典型的為DNA構(gòu)建)中。此構(gòu)建優(yōu)選包括能夠在給定的靶細(xì)胞中進(jìn)行多肽編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的復(fù)制系統(tǒng)和序列。
也可將其它試劑介入到靶細(xì)胞中來增加靶組織中VEGF水平。例如，增加編碼VEGF基因轉(zhuǎn)錄的試劑可增加編碼VEGF的mRNA的翻譯，和/或那些降低編碼VEGF的mRNA的降解的試劑能夠用于增加VEGF水平。通過在該編碼VEGF基因的上游誘導(dǎo)外源性啟動子可提高細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄率。也可使用促進(jìn)異源性基因表達(dá)的增強(qiáng)子元件。
將所述的試劑介入到靶細(xì)胞的優(yōu)選的方法包括基因治療。本發(fā)明的基因治療可用于體內(nèi)體外在靶細(xì)胞中表達(dá)VEGF。
優(yōu)選的基因治療的方法包括使用含有編碼VEGF核苷酸的載體。能夠使用的載體的例子包括，例如，病毒載體(諸如腺病毒(Ad)、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)及逆轉(zhuǎn)錄病毒)、脂質(zhì)體及其它含有脂質(zhì)的絡(luò)合物、以及能夠介導(dǎo)多聚核苷酸釋放到靶細(xì)胞的其它大分子絡(luò)合物。
載體還可包括進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因釋放和/或基因表達(dá)的其它成分或功能物，或另外對靶細(xì)胞提供有益特性的物質(zhì)。這些其它的成分包括例如，影響對細(xì)胞結(jié)合或靶定的成分(包括介導(dǎo)細(xì)胞類型或組織特異結(jié)合的成分)；影響細(xì)胞對載體核酸攝取的成分；在攝取后影響細(xì)胞中多聚核苷酸定位的成分(例如介導(dǎo)核定位試劑)；及影響多聚核苷酸表達(dá)的成分。此成分還可包括標(biāo)志，例如可檢測和/或選擇性標(biāo)志，其可用于檢測或選擇已經(jīng)攝取并表達(dá)由載體傳輸?shù)暮怂岬募?xì)胞。此成分以載體的天然特征來提供(例如具有調(diào)節(jié)結(jié)合和攝取的成分和功能物的某種病毒載體的使用)，或能夠修飾載體來提供此功能物。
選擇性標(biāo)志能夠是陽性、陰性或雙功能性的。陽性選擇性標(biāo)志能對攜帶此標(biāo)志的細(xì)胞進(jìn)行選擇，而陰性選擇性標(biāo)志可對攜帶此標(biāo)志的細(xì)胞進(jìn)行選擇性排除。已有多種此類標(biāo)志基因，包括雙功能(即陽性/陰性)標(biāo)志的描述。此標(biāo)志基因可提供控制的附加方法，其在治療方案中具有優(yōu)越性。此載體的大多數(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的并是常規(guī)可獲得的。
本發(fā)明的用于表達(dá)VEGF的載體包括病毒載體、脂質(zhì)為基礎(chǔ)的載體及其它能夠釋放本發(fā)明的核酸到靶細(xì)胞中的載體。此載體可以是靶向載體，特別是優(yōu)選結(jié)合到心肌細(xì)胞的靶向載體。本發(fā)明使用的優(yōu)選的病毒載體為對靶細(xì)胞低毒性并以組織特異性方式誘導(dǎo)治療性作用量的VEGF的產(chǎn)生。
目前優(yōu)選的病毒載體衍生自腺病毒(Ad)或腺病毒相關(guān)病毒(AAV)?？墒褂萌撕头侨瞬《据d體但優(yōu)選的重組病毒載體在人類中復(fù)制缺陷。當(dāng)載體為腺病毒時(shí)，優(yōu)選包括多聚核酸，該多聚核酸其具有可操作地連接到編碼促形成蛋白或肽的基因的啟動子，并在人類中復(fù)制缺陷。其它的載體包括本領(lǐng)域公知的病毒和非病毒載體以及也可使用上述載體。
在多種能夠用于本發(fā)明方法中的病毒載體中，載體可包括多于一個(gè)的啟動子使得該載體可表達(dá)多于一種的異源性基因。此外，該載體可含有編碼信號肽的序列或促進(jìn)VEGF產(chǎn)物從靶細(xì)胞中分泌的其它部分。
結(jié)合兩種病毒載體系統(tǒng)的優(yōu)越性，可使用雜交的病毒載體來向靶組織(例如，心肌)中傳輸VEGF核酸。也可考慮其它促進(jìn)VEGF基因表達(dá)及載體克隆的核酸序列元件。例如啟動子上游的增強(qiáng)子或編碼區(qū)下游的終止子的存在可例如促進(jìn)表達(dá)。在本發(fā)明的載體中，增強(qiáng)VEGF心肌特異表達(dá)的元件也可用于基因治療。
本發(fā)明還考慮將組織特異的啟動子用于細(xì)胞靶向。通過融合，例如，將左心室肌球蛋白輕鏈-2(MLC2V)或肌球蛋白重鏈(MHC)的組織特異性轉(zhuǎn)錄控制序列可融合到轉(zhuǎn)染基因上，例如在腺病毒構(gòu)建中的vEGF-165基因，轉(zhuǎn)染基因表達(dá)僅限于心室心肌細(xì)胞。
通過使用MLC2V或MHC啟動子并在體傳輸轉(zhuǎn)染基因，相信單獨(dú)心肌細(xì)胞(即不與心臟中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞伴隨表達(dá))能夠提供充足的促血管形成蛋白(例如促進(jìn)血管生成的VEGF-165)的表達(dá)。對于充血性心肌衰竭的基因轉(zhuǎn)移治療，限于心肌細(xì)胞的表達(dá)也是有優(yōu)勢的。通過對心臟的限制性表達(dá)，可避免非心肌組織中血管形成的潛在有害作用。此外，對于心臟中的細(xì)胞，由于該細(xì)胞不進(jìn)行快速周轉(zhuǎn)，因此該肌細(xì)胞有可能提供最長期的轉(zhuǎn)染基因表達(dá)，而不會如內(nèi)皮細(xì)胞那樣因細(xì)胞分裂和死亡而降低表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞特異啟動子也已用于此目的。
通過使用藥物調(diào)節(jié)啟動子系統(tǒng)(例如，四環(huán)素)，有或沒有干細(xì)胞動員的SDF-1表達(dá)可在工程細(xì)胞或遺傳載體移植所必需的手術(shù)或經(jīng)皮步驟后較長一段時(shí)間后開始。這將使心肌或非心肌組織在循環(huán)干細(xì)胞增加前能夠得到恢復(fù)。
除病毒載體為基礎(chǔ)的方法外，也可使用非病毒方法將VEGF基因介入到靶細(xì)胞中。本發(fā)明使用的優(yōu)選的非病毒基因傳輸方法是利用質(zhì)粒DNA來介導(dǎo)VEGF核酸進(jìn)入細(xì)胞。質(zhì)粒為基礎(chǔ)的基因傳輸方法是本領(lǐng)域所公知的。
本發(fā)明也可使用同時(shí)包括病毒和非病毒為基礎(chǔ)的成分的方法。例如，如Cui et al.，Gene Therapy 81508-1513，2001中所述的用于治療性基因傳輸?shù)腅pstein Barr病毒(EBV)為基礎(chǔ)的質(zhì)粒。此外，包括將DNA/配體/多陽離子附屬物結(jié)合到腺病毒上的方法，如Curiel，D.T.，Nat.Immun.13141-164，1994中所述。
編碼VEGF表達(dá)的載體能夠以注射制劑的形式傳輸?shù)桨屑?xì)胞中，如果需要，該制劑可含有藥物可接受的載體(諸如鹽)。也可使用其它藥物載體、制劑和劑型。
當(dāng)所述靶細(xì)胞包括梗塞的心肌細(xì)胞時(shí)，在熒光鏡的(nuoroscopic)指引下可使用結(jié)核菌素注射器并以足夠表達(dá)VEGF至能夠產(chǎn)生較高療效的量直接進(jìn)行冠狀動脈(或移植血管)內(nèi)注射來傳輸所述載體。通過將該載體直接注射到梗塞心肌組織，有可能更有效地靶向該基因并將該重組載體的丟失降低到最小。
這種形式的注射能夠在受影響的心肌中的實(shí)現(xiàn)所希望數(shù)量的細(xì)胞(特別是心肌細(xì)胞)的局部轉(zhuǎn)染，因此最大化基因轉(zhuǎn)移的治療效率并最小化病毒蛋白引起炎癥反應(yīng)的可能性?？墒褂眯氖倚募〖?xì)胞特異性啟動子，例如用來確保限于心肌細(xì)胞的表達(dá)的。因此在這種情況下轉(zhuǎn)基因的傳輸可導(dǎo)致靶定基因在例如左心室細(xì)胞中的表達(dá)。本領(lǐng)域其它公知的技術(shù)也可用于將所述載體移植到梗塞心肌的靶細(xì)胞中。
當(dāng)靶細(xì)胞為所培養(yǎng)的隨后將被移植到梗塞心肌的細(xì)胞時(shí)，所述的載體可通過直接注射到培養(yǎng)液中來傳輸。轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的VEGF核酸能夠可操作地連接到任何適合的調(diào)控序列，包括心肌特異啟動子和增強(qiáng)子。
通過本領(lǐng)域公知的移植技術(shù)，例如使用結(jié)核菌素注射器直接進(jìn)行冠狀動脈內(nèi)注射，來隨后將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞移植到梗塞的心肌中。通過首先進(jìn)行離體的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染，然后將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞移植到梗塞的心肌，與對梗塞的心肌進(jìn)行載體的直接注射比較，將最小化梗塞心肌中炎癥反應(yīng)的可能性。
本發(fā)明的VEGF核酸可表達(dá)任意長度的時(shí)間，包括瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定、長期表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的SDF-1核酸將可以以有效的劑量在適合并規(guī)定的時(shí)間長度內(nèi)表達(dá)。
實(shí)施例通過以下的特定實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。所給出的實(shí)施例僅是為了說明的目的而不是任何方式的對本發(fā)明范圍或內(nèi)容的限定。
MI 8周后G-CSF對干細(xì)胞動員的作用為了利用建立的缺血性心肌病模型，確定由G-CSF誘導(dǎo)的干細(xì)胞動員是否能夠引起大鼠心肌再生，將MI后8周的大鼠隨機(jī)分為接受重組人G-CSF(125μg/kg/天，5天，腹腔注射)組或鹽水組。開始G-CSF治療5天后，獲得血液樣本來證明骨髓刺激，與鹽水組(11.8±4.0細(xì)胞/μl)比較，G-CSF組表現(xiàn)三倍的白血病計(jì)數(shù)(37.3土5.3細(xì)胞/μl)。在G-CSF給藥的最后一天開始給予5-溴-2′-脫氧尿苷BrdU，共14天，來標(biāo)記心肌20中的增殖細(xì)胞。
如圖1(a和b)所示，分別為梗塞區(qū)域的BrdU-陽性細(xì)胞數(shù)量(a)和縮短分?jǐn)?shù)(b)給予鹽水或G-CSF 4周后(LAD結(jié)扎后12周)。細(xì)胞以每mm2計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組n＝6-8。
LAD結(jié)扎后2個(gè)月，給予G-CSF 2不導(dǎo)致梗塞區(qū)域中(圖1a)BrdU陽性細(xì)胞的增加或有意義的心肌再生(由梗塞區(qū)域中血管形成或心肌肌球蛋白陽性細(xì)胞的缺乏來測定(數(shù)據(jù)未顯示))。LAD結(jié)扎后12周，這些動物顯示顯著的心肌病，對照動物的縮短分?jǐn)?shù)顯著小于10％(正常＞60％)。與結(jié)扎8周后對G-CSF的反應(yīng)缺少顯著的心肌再生的組織學(xué)證據(jù)一致，對于G-CSF沒有觀察到有意義的收縮功能的恢復(fù)(圖1b)。
干細(xì)胞動員前SKMB移植對缺血性心肌病的作用為了驗(yàn)證在心肌梗塞的一段較長時(shí)間后對干細(xì)胞動員反應(yīng)的心肌再生是較理想的假說，在LAD結(jié)扎8周后進(jìn)行骨骼肌成肌細(xì)胞的移植。在梗塞邊界區(qū)域內(nèi)，動物接受了5個(gè)200,000SKMB/注射的注射。由于最初的假說是移植的SKMB可用于表達(dá)負(fù)責(zé)干細(xì)胞歸巢的基因產(chǎn)物，作為對照，用編碼熒光素酶的腺病毒來轉(zhuǎn)染SKMB。
如圖2(a和b)所示為骨骼肌成肌細(xì)胞(SKMB)移植(LAD結(jié)扎后12周)在細(xì)胞移植4周后梗塞區(qū)域內(nèi)對BrdU+細(xì)胞計(jì)數(shù)的作用。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組n＝6-8。
在沒有G-CSF存在下，將SKMB介入到梗塞心臟不能顯著增加BrdU陽性細(xì)胞在梗塞區(qū)域中的摻入。然而，SKMB移植與G-CSF聯(lián)合使用確實(shí)在4周后可顯著增加梗塞區(qū)域中BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)量(圖2a)。此外，與單獨(dú)接受G-CSF或SKMB移植的動物比較，接受聯(lián)合治療的動物相對于鹽水對照組表現(xiàn)出顯著的縮短分?jǐn)?shù)的增加(圖2b)。
為了確定梗塞區(qū)域中的BrdU陽性細(xì)胞是來源于骨髓還是來自分裂的心肌的內(nèi)源性細(xì)胞，LAD結(jié)扎后8周，給予BrdU，共5天，在SKMB移植和G-CSF起始前6天開始。
如圖3a所示，BrdU標(biāo)記的骨髓(BM)顯示培養(yǎng)自多種動物的幾乎100％的骨髓細(xì)胞標(biāo)記。圖3b顯示在未處理的心肌中，BrdU給藥5天后，沒有觀察到顯著的Brdu+細(xì)胞。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，由獨(dú)立的兩個(gè)觀察者，對每組動物進(jìn)行一致的雙盲陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組n＝6-8。比例條表示25μM。這導(dǎo)致在骨髓的細(xì)胞中有標(biāo)記而心肌的細(xì)胞沒有任何Brdu的顯著標(biāo)記(17.5±2.9陽性細(xì)胞/mm2)。
如圖3c所示為本發(fā)明治療產(chǎn)生的梗塞區(qū)域中增加的BrdU+細(xì)胞。
在這些實(shí)驗(yàn)中，只有接受SKMB和G-CSF的動物在梗塞區(qū)域內(nèi)具有顯著增加的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量。這些數(shù)據(jù)與BrdU-陽性細(xì)胞來自于骨髓并在聯(lián)合治療后歸巢于梗塞區(qū)域的觀點(diǎn)一致。該數(shù)據(jù)也支持了SKMB的移植重建了干細(xì)胞歸巢到心肌所必需的信號。
負(fù)責(zé)干細(xì)胞歸巢到梗塞組織的信號分子在SKMB移植產(chǎn)生的組織“刺激”下，循環(huán)細(xì)胞將會在MI后8周移入梗塞組織，此觀察推動了干細(xì)胞歸巢潛在介導(dǎo)劑的評價(jià)。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)為已知的介導(dǎo)造血干細(xì)胞行走和骨髓中干細(xì)胞歸巢的因子；因此其作為干細(xì)胞移植到MI中以及響應(yīng)SKMB移植的潛在的信號分子的作用可以實(shí)現(xiàn)。
如圖4所示為以心肌梗塞后的時(shí)間為函數(shù)，顯示基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)表達(dá)的RT-PCR照片。SDF-1表達(dá)在基線沒有出現(xiàn)，在MI后1和24小時(shí)增加。在MI后24小時(shí)與7天之間SDF-1表達(dá)返回到未表達(dá)的狀態(tài)并在MI后保持30天未表達(dá)。在MI后30天(30+)進(jìn)行SKMB移植，SDF-1表達(dá)可在移植后72小時(shí)重新出現(xiàn)。
因此，通過RT-PCR，在1與24小時(shí)觀測到SDF-1表達(dá)，但在0、7或30天、LAD結(jié)扎后沒有觀測到。SKMB誘導(dǎo)SDF-1表達(dá)，并在移植后72h可觀察到，但在假手術(shù)動物中沒有觀察到(數(shù)據(jù)未顯示)。相同樣品中的GAPDH的PCR顯示所有樣品中的cDNA是完整的(數(shù)據(jù)未顯示)。由SKMB移植引起的SDF-1表達(dá)增加可被實(shí)時(shí)PCR證實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)時(shí)PCR顯示在組間GAPDH水平是相似的。
為評估SDF-1是否調(diào)節(jié)BrdU陽性細(xì)胞移植進(jìn)入梗塞區(qū)域，將對照心肌成纖維細(xì)胞或用SDF-1表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞移植進(jìn)入LAD結(jié)扎后4周的心肌中。10天后，為下調(diào)內(nèi)源性SDF-1表達(dá)，給予G-CSF共5天，相同的地，在G-CSF給藥最后一天開始給予BrdU共5天。
如圖5(a和b)所示為心肌成纖維細(xì)胞移植后4周梗塞區(qū)域中(a)BrdU+細(xì)胞數(shù)和(b)CD117+細(xì)胞數(shù)，該移植細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染了SDF-1表達(dá)載體，在心肌成纖維細(xì)胞移植后給予或不給予G-CSF共5天。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，由兩個(gè)獨(dú)立的觀察者，對每組動物進(jìn)行一致的雙盲陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組n＝3-5。
如圖5c所示為SDF-1/G-CSF處理的動物CD117+標(biāo)記細(xì)胞。刻度條表示25μM。
與足夠誘導(dǎo)干細(xì)胞歸巢到損傷心肌的SDF-1一致，在對G-CSF的反應(yīng)中，接受SDF-1表達(dá)的心肌成纖維細(xì)胞移植的心臟在整個(gè)梗塞區(qū)域表現(xiàn)出大于3倍的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量的增加。接受對照心肌成纖維細(xì)胞移植的動物的BrdU信號與對照組沒有差異。
BrdU陽性細(xì)胞的鑒定我們通過免疫熒光來測定梗塞區(qū)域中BrdU細(xì)胞特性?？贵w標(biāo)記CD45表明，在分別對細(xì)胞移植和G-CSF給藥的反應(yīng)中＜5％的BrdU-陽性細(xì)胞為白細(xì)胞。在進(jìn)行G-CSF處理、同時(shí)未進(jìn)行或進(jìn)行SKMB或心肌成纖維細(xì)胞移植的動物梗塞區(qū)域中沒有觀察到心肌肌球蛋白-BrdU陽性細(xì)胞。
在MI后期VEGF表達(dá)SKMB與G-CSF對新血管形成和LV功能的作用雖然在接受SKMB移植和用G-CSF刺激骨髓的聯(lián)合處理動物中有BrdU陽性細(xì)胞數(shù)的增加，但沒有觀測到梗塞區(qū)域中有血管密度或心肌細(xì)胞數(shù)量的增加。因此，我們另外對VEGF過表達(dá)對SKMB移植和G-CSF給藥的影響進(jìn)行了研究。
如圖6(a和b)所示，梗塞區(qū)域中的免疫組織化學(xué)顯示LAD結(jié)扎12周后，用(a)SKMB細(xì)胞移植或(b)VEGF表達(dá)SKMB移植后用G-CSF進(jìn)行干細(xì)胞動員時(shí)，BrdU+陽性細(xì)胞(開放箭頭)和心肌肌球蛋白表達(dá)細(xì)胞(閉合箭頭)。
如圖6c所示為相對于沒有處理對照組的LV功能的改善，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組n＝6-8?？潭葪l表示10μM。
MI后8周進(jìn)行VEGF-165表達(dá)SKMB細(xì)胞移植，與鹽水對照比較可產(chǎn)生梗塞區(qū)域中血管密度的增加(44.1±5.2vs.17.7±2.8血管數(shù)/mm2；分別為VEGF-165vs.鹽水)。此外，VEGF-165表達(dá)與利用G-CSF的干細(xì)胞動員聯(lián)合處理可導(dǎo)致梗塞區(qū)域中心肌肌球蛋白表達(dá)細(xì)胞再生，這與心肌細(xì)胞再生一致(圖6a)。如縮短分?jǐn)?shù)檢測所示，對SKMB加入VEGF-165表達(dá)也可顯著增加LV功能(圖6b)。在VEGF-165表達(dá)SKMB移植和SKMB移植聯(lián)合G-CSF給藥的治療策略之間沒有觀察到縮短分?jǐn)?shù)的顯著差別(數(shù)據(jù)未顯示)。
方法LAD結(jié)扎所有動物實(shí)驗(yàn)得到了動物研究委員會(Animal Research Committee)的批準(zhǔn)，并將所有動物飼養(yǎng)在Cleveland臨床基地的AAALAC動物設(shè)施中。戊巴比妥鈉麻醉動物，50mg/kg，插管，使用壓力循環(huán)嚙齒動物呼吸機(jī)(Kent Scientific Corp，RSP1002)以室內(nèi)空氣每分鐘80次進(jìn)行通氣。在外科顯微鏡(Leica M500){}下通過左前降支(LAD)的結(jié)扎在150-175g雄性Lewis大鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生前壁MI。
2D-超生心動圖使用與Sequoia C256(Acuson)連接的15-MHz線性陣列傳感器(lineararray transducer)，在LAD結(jié)扎后5-7天和8周，以及SKMB移植后4周，進(jìn)行2D-超生心動圖的檢測。在每次超生心動圖中用開他命(ketamine)(50mg/kg)對大鼠進(jìn)行輕微的鎮(zhèn)靜。對于LV容積和壁厚度的定量，我們數(shù)字記錄了從正位于乳頭肌下方的mid-LV的短軸切面(short axisview)上觀測的2D鉗(clip)和m-模式圖像，這能使在不同大鼠中得到相同解剖位置的一致的檢測。檢測由兩個(gè)雙盲的觀察者使用ProSolve脫線(offine)進(jìn)行。每只動物的每種檢測進(jìn)行6次，從對處理手段不知情的觀察者記錄的5個(gè)中隨機(jī)選擇3個(gè)m-模式鉗。當(dāng)分析LV功能時(shí)，從M-模式記錄中計(jì)算縮短分?jǐn)?shù)。縮短分?jǐn)?shù)(％)＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD*100，其中LVEDD-左心室舒張末期容積，LVESD-左心室收縮末期容積。從恰好位于乳肌水平下方的短軸切面測量前壁和后壁之間的距離來檢測容積。此外，在舒張末期檢測前壁厚度。
細(xì)胞的制備和傳輸從一些Lewis大鼠(Harlan Labs)的前肢中收集骨骼肌成肌細(xì)胞，放入175ml培養(yǎng)瓶(Falcon)中，并在含有10％胎牛血清、300mg/l ECGS以及青霉素、鏈霉素和吡啶羧酶(ofloxacin)的DMEM中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞到達(dá)75％融合時(shí)進(jìn)行傳代以避免分化。在細(xì)胞移植前一天，在CMV啟動子控制下，用108pfu/ml的表達(dá)vEGF-165的復(fù)制缺陷腺病毒或熒光素酶(對照)轉(zhuǎn)染純化的成肌細(xì)胞。在移植的當(dāng)天，用胰蛋白酶收集成肌細(xì)胞，在PBS中進(jìn)行充分的清洗來去除游離的病毒顆粒，并在移植前立即進(jìn)行再生。隨后麻醉動物，通氣并進(jìn)行外側(cè)開胸術(shù)(lateral thoracotomy)來直接觀察梗塞區(qū)域。在每只動物的5個(gè)區(qū)域中注射約1×10(6)個(gè)細(xì)胞。
從一些成年大鼠心臟中收集心肌成纖維細(xì)胞并以與SKMB相同的方式培養(yǎng)。將來自總RNA的SDF-1克隆至PCDNA3.1表達(dá)載體(正向-NOT-l)-AATAAGAAATGCGGCCGCATGGACGCCAAGGTCGTCGCTGTGCTGGCC；反向-(Xba-l)-TCTAGACTTGTTTAAGGCTTTGTCCAGGTA-CTCTTGGA)，該總RNA回收自梗塞后24小時(shí)的心臟。利用新霉素選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了SDF-1 PCDNA3.1表達(dá)載體的心肌成纖維細(xì)胞。
干細(xì)胞動員在骨骼肌成纖維細(xì)胞移植當(dāng)天，開始通過腹腔內(nèi)注射(i.p.)給予重組人G-CSF(125μg/kg)，共5天。在移植后0、5、14、及21天獲得全血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及不同數(shù)據(jù)(Bayer，ADVIA)。為檢測細(xì)胞增殖的累計(jì)程度，在第5天進(jìn)行50mg/kg BrdU的i.p.注射，共14天，使BrdU標(biāo)記由G-CSF誘導(dǎo)的任何增殖的干細(xì)胞。
組織學(xué)分析大鼠安樂死后，在移植4周后，進(jìn)行HistoChoice(Amresco Inc.，Solon，OH)灌注固定后，收集其心臟，并垂直于LV長軸將其分割成3個(gè)等份。中間心室和頂端小片用石蠟包埋并分割成6um厚的小塊用于免疫組織化學(xué)分析。使用心肌肌球蛋白(Chemicon)、CD45(Chemicon)、因子VIII(Chemicon)、CD 117(Santa Cruz Biotehnology)及BrdU(Vector labs)的單克隆抗體，并使用FITC-或生物素標(biāo)記的第二抗體。對于定量分析，對梗塞區(qū)域中的5個(gè)部分進(jìn)行陽性細(xì)胞和血管密度的分析。我們不能進(jìn)行CD117和BrdU的雙標(biāo)記，由于我們的步驟中用于檢測BrdU抗原的HCl處理可導(dǎo)致核抗原決定簇的表達(dá)，其可由三種不同的CD117抗體識別。
PCR分析以SKMB移植后和LAD結(jié)扎后的時(shí)間為函數(shù)，對分離自大鼠心臟中的總RNA進(jìn)行RT-PCR分析。用異硫氰酸胍-氯化銫方法從組織中提取總RNA。使用大鼠SDF-1特異引物(正向TTGCCAGCACAAAGACACTCC；反向CTCCAAAGCAAACCGAATACAG，設(shè)計(jì)表達(dá)產(chǎn)物243bp，40個(gè)循環(huán))，GAPDH引物(正向CCCCTGGCCAAGGTCATCCA；反向CGGAAGGCCATGCCAGTGAG，設(shè)計(jì)表達(dá)產(chǎn)物238bp，20個(gè)循環(huán))。隨后通過實(shí)時(shí)PCR(Perkin-Elmer，ABI Prism 7700)，用SYBR-綠結(jié)合到上述PCR產(chǎn)物 SDF-1(正向ATGCCCCTGCCGATTCTTTG；反向TGTTGTTGCTTTTCAGCCTTGC，設(shè)計(jì)產(chǎn)物116bp)和GAPDH中，來驗(yàn)證梗塞和移植心臟中表達(dá)的增加。
腺病毒構(gòu)建由Gen Vec，Inc(Gaithersburg，MD)慷慨惠贈編碼VEGF-165的腺病毒構(gòu)建。簡而言之，從美國典型培養(yǎng)收集中心(American Type CultureCollection)獲得293細(xì)胞(ATCC CRL.1573)并保持在含10％牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)液(DMEM)中。通過在反向末端重復(fù)序列(ITR)的左側(cè)末端相鄰的唯一限制性位點(diǎn)將穿梭質(zhì)粒載體線性化來產(chǎn)生E1-、E3-腺病毒載體AdVEGF-165，并與ClaI消化的H5d1324 DNA共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。兩次連續(xù)斑點(diǎn)純化后，將載體原料(stocks)在293細(xì)胞中繁殖，并通過氯化銫梯度上三個(gè)連續(xù)帶(three sequential banding)來純化。純化的病毒用含10mM Tris，pH 7.8，150mM NaCl，10mM MgCl2及3％蔗糖的緩沖液來透析，并儲存在-80℃直到使用由細(xì)胞肥大病毒即刻早期啟動子來控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過Student t-檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。
權(quán)利要求
1.一種治療梗塞的心肌組織的方法，所述的梗塞組織含有第一濃度的SDF-1蛋白，所述梗塞組織的外周血含有第一濃度的干細(xì)胞，所述的方法包括如下步驟將所述的梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度從第一濃度增加到第二濃度；及，將所述的梗塞組織的外周血中的干細(xì)胞濃度從第一濃度增加到第二濃度，當(dāng)所述的梗塞組織中的SDF-1濃度增加時(shí)，所述的外周血中的干細(xì)胞濃度同時(shí)增加。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的增加干細(xì)胞數(shù)量的步驟包括給予能夠引起干細(xì)胞從骨髓動員到外周血的試劑。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的能夠引起干細(xì)胞從骨髓動員到外周血的試劑選自細(xì)胞因子、趨化因子和所述的化療試劑。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的試劑包括G-CSF。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的增加干細(xì)胞數(shù)量的步驟包括注射干細(xì)胞到外周血中。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的增加梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度的步驟包括將表達(dá)載體介入所述的梗塞組織中，所述的表達(dá)載體含有編碼SDF-1蛋白的核酸。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的載體包括針對心肌組織的組織特異性啟動子。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的載體包括針對心肌細(xì)胞的組織特異性啟動子。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的增加梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度的步驟包括將體外培養(yǎng)再回輸?shù)募?xì)胞介入所述的梗塞組織中。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的細(xì)胞包括自體同源細(xì)胞，其在培養(yǎng)前收集自欲進(jìn)行治療的個(gè)體。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中介入到所述梗塞組織中的所述的細(xì)胞在介入到所述梗塞組織中之前用表達(dá)載體來轉(zhuǎn)染，所述的表達(dá)載體含有編碼SDF-1蛋白的核酸。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的梗塞組織含有第一濃度的VEGF，并進(jìn)一步包括在增加所述梗塞組織中SDF-1濃度的同時(shí)將所述梗塞組織中的VEGF濃度從所述的第一濃度增加到第二濃度的步驟。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的增加所述梗塞組織中所述的VEGF濃度的步驟包括向所述梗塞組織的細(xì)胞中介入試劑。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的增加所述梗塞組織中所述的VEGF濃度的步驟包括向所述梗塞組織中介入表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體包括編碼VEGF的核酸。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的載體含有針對心肌組織的組織特異性啟動子。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的載體含有針對心肌細(xì)胞的組織特異性啟動子。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的增加所述梗塞組織中所述VEGF濃度的步驟包括向所述的梗塞組織中介入細(xì)胞，所述的細(xì)胞在介入到所述梗塞組織中之前用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，所述的表達(dá)載體含有編碼VEGF的核酸。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的用編碼VEGF表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與介入到所述梗塞組織中來增加所述梗塞組織中SDF-1濃度的細(xì)胞相同。
19.一種治療梗塞的心肌組織的方法，所述的梗塞組織含有距心肌梗塞后較長時(shí)間時(shí)的第一濃度的SDF-1蛋白和第一濃度的VEGF，所述的方法包括如下步驟將所述梗塞組織中的SDF-1蛋白濃度從所述的第一濃度增加到基本上高于所述的第一濃度的第二濃度；將所述梗塞組織中的所述的VEGF濃度從所述的第一濃度增加到基本上高于第一濃度的第二濃度；給予能夠使干細(xì)胞從骨髓動員到所述梗塞組織外周血的試劑，在所述的梗塞組織中的SDF-1和VEGF濃度增加的同時(shí)，所述的干細(xì)胞從所述骨髓中動員到所述外周血中。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的增加所述梗塞組織中所述SDF-1蛋白濃度的步驟包括向所述的梗塞組織中介入經(jīng)過體外培養(yǎng)再回輸?shù)募?xì)胞。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中被介入到所述梗塞組織中的所述細(xì)胞在被介入到所述梗塞組織中之前用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，所述的表達(dá)載體含有編碼SDF-1蛋白的核酸。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的增加所述梗塞組織中所述VEGF濃度的步驟包括向所述梗塞組織中介入細(xì)胞，所述的細(xì)胞在被介入到所述梗塞組織中之前用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，所述的表達(dá)載體含有編碼VEGF的核酸。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的用編碼VEGF表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與介入到所述梗塞組織中來增加所述梗塞組織中所述SDF-1濃度的細(xì)胞相同。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療梗塞的心肌組織的方法，包括梗塞組織中的SDF－1蛋白濃度。梗塞組織的外周血中的干細(xì)胞濃度也增加。當(dāng)所述的梗塞組織中的SDF－1蛋白濃度增加時(shí)，所述外周血中干細(xì)胞數(shù)量也同時(shí)增加。
文檔編號C12N5/10GK1688318SQ03824147
公開日2005年10月26日 申請日期2003年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月22日
發(fā)明者馬克·S·佩恩, 阿爾曼·T·阿斯卡里, 馬修·凱德羅夫斯基 申請人:克里夫蘭診所基金會