專利名稱：葡萄糖脫氫酶的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及葡萄糖脫氫酶的制造方法。由該方法得到的葡萄糖脫氫酶，可以用于葡萄糖傳感器中。
背景技術：
使用對于特定底物有特異反應的酶的生物傳感器的開發(fā)，不分產(chǎn)業(yè)領域地正在盛行起來。作為生物傳感器的代表，可以舉出主要在醫(yī)療領域使用的葡萄糖傳感器。
葡萄糖傳感器是用于構筑含有酶和電子傳遞物質的反應體系的器件，在利用該葡萄糖傳感器的情況下，例如采用電流分析的方法對葡萄糖進行定量測定。作為酶來說，使用葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脫氫酶(GDH)(日本國特開2002-65778號公報)。
GOD，因為針對葡萄糖的底物特異性高、熱穩(wěn)定性優(yōu)異、能夠實現(xiàn)酶的批量化生產(chǎn)，所以，與其它酶相比，有生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。其反面，使用GOD的體系，因為容易受到測定樣品中的溶解氧的影響，所以有溶解氧對測定結果產(chǎn)生影響的問題。
另一方面，使用GDH的體系不易受到測定樣品中的溶解氧的影響。因此，使用GDH的體系，即使在氧分壓低的環(huán)境下進行測定、對要求氧量多的高濃度樣品進行測定時，也可以精度高地測定葡萄糖濃度。其反面是GDH有熱穩(wěn)定性差、底物特異性比GOD差的問題。
從這樣的情況出發(fā)，摸索著彌補GOD和GDH雙方的缺點。如國際公開WO02/36779號公報所公開的那樣，作為本發(fā)明人之一的早出從溫泉附近的土壤中分離出新型菌株(Burkhorderia cepacia KS1株)，由該菌株取得了新的GDH。該GDH是由α、β、γ亞單位構成的(以下稱“CyGDH”)，與電子傳遞物質的反應速度高，在耐熱性方面也沒有問題，作為葡萄糖傳感器用的酶是合適的。
但是，在KS1菌株中，因為CyGDH的生產(chǎn)性差，所以在考慮到工業(yè)化應用時，由KS1菌株批量化生產(chǎn)CyGDH是困難的。因此，本發(fā)明人等人，將編碼α、β、γ亞單位的DNA導入大腸菌中進行表達，高效率地產(chǎn)生GDH。但是，該GDH是由α、γ亞單位構成的，欠缺β亞單位(以下稱“αGDH”)。這樣，在轉化大腸菌的方法中，不能使α、β、γ亞單位全部表達。
本發(fā)明人等人，再對αGDH的特性進行了調查，結果是，雖然與CyGDH相比，αGDH與電子傳遞物質的反應速度小，但是比CyGDH耐熱性高，相對于葡萄糖的Km小。即，與CyGDH同樣，αGDH是作為葡萄糖傳感器用的酶是有用的，這已確認。
目前，在制造這樣有用的2種酶時，需要分別進行表達菌株的取得、培養(yǎng)及精制，在制造成本、效率方面是不利的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于高效率地制造例如在葡萄糖傳感器等中能夠應用的2種GDH。
本發(fā)明的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于，將含有編碼在序列號1記載的具有葡萄糖脫氫活性的α亞單位和作為電子傳遞蛋白質的β亞單位的序列的DNA導入屬于假單胞菌屬的微生物中，形成轉化體，培養(yǎng)該轉化體，產(chǎn)生含有上述β亞單位的第1葡萄糖脫氫酶和不含上述β亞單位的第2葡萄糖脫氫酶。
上述α亞單位在例如還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的分子量是約60kDa。另一方面，上述β亞單位，在例如還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的分子量是約43kDa。
上述DNA也可以含有將在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的分子量是約14kDa的γ亞單位編碼的堿基序列。此時，產(chǎn)生上述第1及第2葡萄糖脫氫酶作為含有上述γ亞單位的產(chǎn)物。
作為屬于上述假單胞菌屬的微生物來說，可以列舉惡臭假單胞菌、螢光假單胞菌、銅綠假單胞菌等，但從重組體的安全性方面考慮，優(yōu)選使用惡臭假單胞菌。
上述DNA例如是屬于Burkhorderia屬的微生物，可以從具有產(chǎn)生帶有葡萄糖脫氫活性的酶的能力的微生物取得。在本發(fā)明中采用的屬于Burkhorderia屬的微生物，如果是屬于具有產(chǎn)生該酶能力的Burkhorderia屬的微生物，就沒有特別的限制，但優(yōu)選Burkhorderiacepacia，特別優(yōu)選Burkhorderia cepacia KS1株(以下簡稱為“KS1株”)。
該KS1株是早出等人從溫泉附近的土壤中分離的新型菌株，從其菌學性質鑒定為Burkhorderia cepacia，被命名為KS1株。該KS1株在平成12年9月25日(2000年9月25日)在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6)以微生物保藏號第FERM BP-7306號保藏。
另外，對于KS1株以外的株，本發(fā)明人等人索取了寄存在財團法人發(fā)酵研究所(Institute for Fermentation Osaka，IFO)或理化學研究所微生物系統(tǒng)保存設施(Japan Collection of Microorganisms，JCM)的該Burkhorderia cepacia的幾個菌株，測定了葡萄糖脫氫活性，結果確認所有的菌株都有活性。因此，作為用于取得本發(fā)明中所使用的DNA的微生物來說，可以采用KS1株以外的Burkhorderia cepacia、例如JCM5506、JCM5507、JCM2800、JCM2801、IFO15124、IFO14595。
上述DNA從Burkhorderia cepacia染色體的DNA分離，但其堿基序列及由該堿基序列編碼的氨基酸序列很清楚，所以，基于這些序列，也可以通過化學合成取得。
作為上述α亞單位來說，例如可以采用具有序列號3的氨基酸序列、或在序列號3的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成了一個或多個的氨基酸殘基的氨基酸序列的α亞單位。該α亞單位由例如序列號1的堿基序列之中由堿基序號764～2380組成的堿基序列來編碼。因此，作為本發(fā)明中所使用的DNA來說，優(yōu)選使用具有上述堿基序列的DNA。
作為上述β亞單位來說，例如可以采用具有序列號5的氨基酸序列、或在序列號5的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成了一個或多個的氨基酸殘基的氨基酸序列的β亞單位。該β亞單位由例如序列號1的堿基序列之中由堿性序號2386～3660組成的堿基序列來編碼。因此，作為本發(fā)明中所使用的DNA來說，優(yōu)選使用具有上述堿基序列的DNA。
早出等人確認，與只表達α亞單位的情況相比，若使上述γ亞單位與α亞單位一起表達，則可以得到高的酶活性。因此，從酶活性的觀點出發(fā)，優(yōu)選表達γ亞單位，在上述DNA中，編碼γ亞單位的堿基序列，優(yōu)選在編碼α亞單位的堿基序列的上游區(qū)域含有。如果那樣，可以認為，在產(chǎn)生α亞單位時，首先表達γ亞單位，作為蛋白質而存在，由此可以在微生物體內高效率地產(chǎn)生α亞單位。
作為上述γ亞單位來說，例如可以采用具有序列號2的氨基酸序列、或在序列號2的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成了一個或多個的氨基酸殘基的氨基酸序列的γ亞單位。該γ亞單位由例如序列號1的堿序列之中由堿基序號258～761組成的堿基序列來編碼。因此，作為本發(fā)明中所使用的DNA來說，優(yōu)選使用具有上述堿基序列的DNA。
序列號1的堿基序列之中，堿基序號2386以后的堿基序列，推定為編碼β亞單位，但堿基序號2386～2451的堿基序列，推定為編碼β亞單位的信號肽。推定該信號肽的氨基酸序列是序列號4的氨基酸序號1～22的氨基酸序列。
由于信號肽是用核糖體合成的蛋白質通過內膜而在胞質空間分泌時是必要的肽，所以，如果信號肽存在，則在菌體胞質或培養(yǎng)上清液中含有的蛋白質量就增加。因此，作為上述DNA來說，優(yōu)選使用含有編碼上述β亞單位的信號肽的表達的堿基序列的DNA。


圖1表示從轉化體取得的可溶化部分的Q-Sepharose FF層析法的結果。
圖2表示SDS-PAGE的結果。
具體實施例方式
以下，具體地說明本發(fā)明的葡萄糖脫氫酶的制造方法。
在本制造方法中，包括取得編碼例如α亞單位及β亞單位的表達的DNA的第1工序；將含有該DNA的重組媒介物導入屬于假單胞菌屬的微生物中形成轉化體的第2工序；在培養(yǎng)基上培養(yǎng)該轉化體、產(chǎn)生含有β亞單位的葡萄糖脫氫酶(例如CyGDH)和不含β亞單位的葡萄糖脫氫酶(例如αGDH)的第3工序；和，從培養(yǎng)基或微生物中采取葡萄糖脫氫酶的第4工序。
<第1工序(DNA的取得)>
在取得DNA時，首先構筑重組媒介物。重組媒介物通過如下這樣來構筑，即，從屬于Burkhorderia屬的微生物(例如Burkhorderia cepaciaKS1株)分離并精制染色體DNA后、切斷該染色體DNA的染色體DNA斷片或由PCR等放大的DNA斷片與直鏈的表達媒介物進行結合閉鏈。
染色體DNA的分離和精制，基于將微生物溶菌而得到的溶菌物來進行。作為溶菌的方法來說，可以列舉由例如溶菌酶(lysozyme)等溶菌酶來處理，除了該處理之外，還可以根據(jù)需要現(xiàn)時使用蛋白水解酶、其它的酶和十二烷基硫酸鈉(SDS)等表面活性劑。而且，還可以組合凍結熔解或法式細胞破碎儀(French press)處理等的物理破碎方法。另一方面，DNA從溶菌物中的分離和精制，可以通過適當組合例如苯酚處理或蛋白水解酶處理的除蛋白處理、核糖核酸酶處理、醇沉淀處理等的方法來進行。
染色體DNA的切斷，按照通常方法、例如可以使用超聲波處理或限制酶處理來進行。作為限制酶來說，可以使用例如在特定核苷酸序列作用的II型限制酶。
染色體DNA斷片和表達媒介物的結合，使用例如DNA連接酶來進行。
作為表達媒介物來說，適合在宿主微生物內從能自律地增殖的噬菌體或質粒作為基因重組用而被構筑。作為噬菌體來說，例如在將后述的大腸桿菌作為宿主微生物時，例示Lambda gt10、Lambda gt11等。另一方面，作為質粒來說，例如在將大腸桿菌作為宿主微生物時，例不pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pTrc99A、pBluescript或作為粘粒的SuperCosI等。另外，使用假單胞菌時，例示革蘭氏陰性菌用廣宿主域媒介物的RSF1010、pBBR122、pCN51等。
接著，在重組媒介物上實施標記，將該重組媒介物移入宿主微生物中，形成轉化體。從該轉化體，以媒介物的標記和酶活性的表達為指標進行篩選，得到保持含有將GDH編碼的基因的重組媒介物的基因給予微生物。
作為宿主微生物來說，只要重組媒介物是穩(wěn)定的、且能自律地增殖、可以表達外來性基因，就沒有特別的限制。一般地，可以使用大腸桿菌DH5α、XL-1Blue MR等。作為在宿主微生物中移入重組媒介物的方法，例如在宿主微生物是大腸桿菌時，可以使用由鈣處理的感受態(tài)細胞法和電蝕孔法等。
培養(yǎng)基因給予微生物，再從該微生物分離和精制重組媒介物后，從重組媒介物中采集將GDH編碼的基因(克隆化斷片)。該克隆化斷片的采集可以用與采集染色體DNA同樣的方法進行。
該克隆化斷片，具有編碼含葡萄糖脫氫活性的α亞單位和作為電子傳遞蛋白質的β亞單位的堿基序列。在從Burkhorderia cepacia KS1株得到目標DNA時，克隆化斷片，除了編碼α亞單位和β亞單位(包括β亞單位的信號肽)的堿基序列以外，還得到作為含有編碼γ亞單位的堿基序列的克隆化斷片。另外，可以通過如下這樣確認，克隆化斷片編碼α亞單位和β亞單位或者編碼γ亞單位，可以用通常的方法解讀該克隆化斷片的堿基序列。
<第2工序(轉化體的形成)>
含有作為目標的DNA的轉化體，將在第1工序得到的克隆化斷片組入媒介物中后，通過導入屬于假單胞菌屬的微生物就可以形成。作為屬于假單胞菌屬的微生物來說，優(yōu)選使用例如惡臭假單胞菌。向宿主微生物中導入重組媒介物的導入方法，可以用與第1工序中篩選時形成轉化體同樣的方法進行。
<第3工序(轉化體的培養(yǎng)和GDH的產(chǎn)生)>
在第2工序中得到的轉化體，為了產(chǎn)生GDH而進行培養(yǎng)。從該轉化體同時產(chǎn)生含有β亞單位的GDH和不含β亞單位的GDH。例如，從Burkhorderia cepacia KS1株得到作為目標的DNA時，同時產(chǎn)生具有α、β、γ亞單位的CyGDH和具有α、γ亞單位的αGDH。
轉化體的培養(yǎng)形態(tài)，考慮宿主的營養(yǎng)生理性質、選擇培養(yǎng)條件就可以，多數(shù)情況下進行液體培養(yǎng)。工業(yè)上進行通氣攪拌培養(yǎng)是有利的。
作為培養(yǎng)基的營養(yǎng)源來說，在微生物培養(yǎng)中通常所使用的就可以廣泛使用。作為碳源來說，如果是可供應的碳化合物就可以，例如使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糖蜜、丙酮酸等。作為氮源來說，可供應的氮化合物就可以，例如使用胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、豆粕提取物等。其它，根據(jù)需要可使用磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、鎂、鈣、鉀、鐵、錳、鋅等的鹽類、特定的氨基酸、特定的維生素等。
培養(yǎng)溫度，可以在轉化體生長發(fā)育、轉化體產(chǎn)生GDH的范圍內適當變化，但優(yōu)選是20～42℃左右。預計GDH達到最高產(chǎn)量時、在適當時間結束培養(yǎng)就可以，通常培養(yǎng)時間設為12～72小時。培養(yǎng)基的pH，可以在轉化體生長發(fā)育、轉化體產(chǎn)生GDH的范圍內適當變化，但優(yōu)選是pH為5.0～9.0左右的范圍。
<第4工序(GDH的采集)>
GDH的采集，一般按照通常方法，從培養(yǎng)液或轉化體中分離含有GDH的溶液后，精制該含有GDH的溶液。
含有GDH的溶液，在GDH存在于菌體內時，通過過濾或離心分離等手段從培養(yǎng)液中采集菌體之后，以機械方法或溶菌酶等酶方法破壞該菌體，根據(jù)需要添加EDTA等螯合劑和表面活性劑，使GDH成為可溶化，從而可以得到。另一方面，GDH存在于菌體外(培養(yǎng)液中)時，可以由過濾或離心分離等手段分離培養(yǎng)液和菌體而得到。
含有GDH的溶液的精制，可以從該溶液直接進行，但也可以濃縮該溶液中的GDH之后進行。就濃縮來說，可以由例如減壓濃縮、膜濃縮、鹽析處理或由親水性有機溶劑(例如甲醇、乙醇、丙酮)進行分別沉淀來進行。在GDH的濃縮中，加熱處理或等電點處理也是有效的精制手段。濃縮液的精制，可以通過適當組合例如過濾、吸附層析法、離子交換層析法、親和層析法來進行。由此，可以分別地得到含有β亞單位的GDH和不含β亞單位的GDH。
這樣得到的精制酶，可以由例如冷凍干燥、真空干燥、噴霧干燥而粉末化，在市場上流通。
實施例以下，對上述制造方法的具體例子進行說明，同時，由該例實際證明可以得到2種GDH。
<源自Burkhorderia cepacia KS1株的染色體DNA的調制>
源自Burkhorderia cepacia KS1株的染色體DNA，根據(jù)通常的方法來調制。即，首先，使用TL液體培養(yǎng)液(聚蛋白胨＝10g、酵母提取液＝1g、NaCl＝5g、KH2PO4＝2g、葡萄糖＝5g、總量為1L、pH7.2)，在34℃溫度下，振蕩KS1株一個晚上。用離心分離機回收增殖的菌體。在含有10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5％SDS、100μg/mL的蛋白酶K的溶液中懸濁該菌體，在50℃處理6小時。在該懸濁液中加入等量的苯酚-氯仿，在室溫下攪拌10分鐘后，用離心分離機回收上清液。在其中加入醋酸鈉，使最終濃度為0.3M，將2倍量的乙醇成為雙層，使染色體DNA在中間層析出。用玻璃棒撈出析出物，用70％乙醇洗凈后，使之溶解在適當量的TE緩沖液中，成為染色體DNA溶液。
<轉化體的形成>
以先前得到的染色體DNA為模型，用PCR法放大編碼GDH的基因全長。就引物來說，使用了GDH的γ亞單位的N末端部分的序列和GDH的β亞單位的C末端部分的序列。調整在位于各引物的端部的限制酶識別部位切斷該DNA斷片而得到的斷片以及含有trc啟動子的DNA斷片，與廣宿主域媒介物RSF1010結合后，導入大腸桿菌JM109中，用含有50μg/ml鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基形成菌落。由所產(chǎn)生的菌落調整質粒，以此為模型，通過使用上述PCR引物的PCR，選擇約3.4kb的斷片被放大的克隆，通過將其導入惡臭假單胞菌ATCC47054株中，得到作為目標的轉化體(GDH表達菌株)。
<轉化體的培養(yǎng)和GDH的產(chǎn)生>
轉化體的培養(yǎng)，在有氧的培養(yǎng)條件下進行。更具體地說，轉化體的培養(yǎng)，使用每1升培養(yǎng)液的組成如表1所示那樣調整的7L培養(yǎng)基、在34℃下進行8小時。以9000×g(4℃、10分鐘)離心分離該培養(yǎng)液7L而得到了菌體。
表1培養(yǎng)基組成

<GDH的精制>
在10mM的磷酸鉀緩沖液(pH6.0)使所得到的菌體分散的狀態(tài)下，用法式細胞破碎儀(大竹制作所 東京 日本)施加1,500Kg/cm2的壓力差進行破壞。以8000×g、10分鐘離心分離此時所得到的細胞提取液，除去細胞固形物，得到了粗酶溶液。
粗酶溶液，添加Triton-X100，使最終濃度成為1％。然后，在4℃下緩慢攪拌一個晚上。接著，在超離心(4℃、69800×g、90分鐘)后，再離心(4℃、15000×g、15分鐘)，作為上清液，得到了可溶化部分。
用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)透析該可溶化部分后，將此溶液供給至用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)等量化過的Q-Sepharose FF柱(22mmID×20cmAmershambiosciences)。使蛋白質以直線性梯度來洗脫，使得10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中的NaCl的濃度成為0～500mM。其流速為5mL/min。
對于洗脫液，測定每部分GDH活性。圖1示意性地表示了該結果。如圖1所示的那樣，在梯度范圍內確認了2個大峰。
GDH的活性測定，基于葡萄糖的脫氫化，通過追蹤電子接收體的還原反應來進行。作為電子接收體，使用了2，6-二氯靛酚(DCIP)和菲雙甲氧硫酸鹽(PMS)。反應在聚乙烯管內以規(guī)定的溫度來實施。
首先，在20μL的含有0.75mM PMS和0.75mM DCIP的25mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8.0)中添加5μL酶溶液，準備混合液。該混合液在事前定溫放置1分鐘。在混合液中加入1μL的2M葡萄糖(最終濃度77mM)，使反應開始，定溫放置2分鐘。接著，加入100μL的冰冷蒸餾水或120μL的7.5M尿素，將試樣冷卻。對于該試樣，使用超微量測量用比色皿(100μL)和可以用其測量的分光光度計(UV160島津制作所 京都 日本)，隨著時間推移地測量基于DCIP還原的退色。測定波長設定為DCIP吸收波長600nm。DCIP的摩爾吸收系數(shù)為22.23mM×cm-1。1單位酶(U)定義為，在標準檢測條件下，每1分鐘氧化1μM葡萄糖的量。蛋白濃度以半限注法測定。
其次，對于2個GDH活性的峰，分別收集部分(fraction)，用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0、4℃)透析一夜，調整了2種GDH溶液。
對于各自的GDH調整溶液，使用DEAE-5PW柱(8.0mmID×7.5cm東ソ一、東京)，進行個別的精制。柱預先用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)平衡化。蛋白質用直線性梯度、流速為1mL/min來洗脫，使得10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中的NaCl濃度為0-400mM。收集各個層析法中的GDH活性最高的部分，用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)脫鹽一夜，得到了2種精制酶(以下，為了方便，稱為“第1精制酶”和“第2精制酶”)。
<精制酶的亞單位的特定>
用SDS-PAGE對各精制酶液進行電泳，特定亞單位的分子量。就SDS-PAGE來說，使用Tris-Tricline緩沖液，在8～25％聚丙烯酰胺的梯度凝膠中實施。該凝膠的蛋白質進行科麥西染料染色。通過PhastSystem(Pharmacia)，自動地進行分離和展開。由標準蛋白的相對移動度測定了分子質量。
圖2表示SDS-PAGE電泳的結果。在圖2中，路線1表示分子量標準標記蛋白質的科麥西染料染色，路線2表示第1精制酶的科麥西染料染色，路線3表示第2精制酶的科麥西染料染色。由該圖中可以看出，第1精制酶分離為分子量約60kDa、約43kDa和約14kDa的蛋白質。因此，顯示出第1精制酶是分子量約60kDa的α亞單位、分子量約43kDa的β亞單位和分子量約14kDa的γ亞單位結合在一起。第2精制酶分離為分子量約60kDa和約14kDa的蛋白質。因此，顯示出第2精制酶是分子量約60kDa的α亞單位和分子量約14kDa的γ亞單位結合在一起。SDS-PAGE電泳的結果顯示出，第1精制酶和第2精制酶是不同的GDH，同時生成2種GDH。
分別切取由電泳得到的含有α亞單位、β亞單位的帶，復制到聚偏氟乙烯膜之后，由氨基酸定序器(島津制作所、PPSQ-10)解讀氨基酸序列。
對于α亞單位來說，確認了在序列號3的氨基酸序列中含有由氨基酸序號2～12組成的11殘基構成的肽序列。另一方面，對于β亞單位來說，可以確認序列號5所示的N末端的16殘基的氨基酸序列。
<重組媒介物的分析>
從具有GDH活性的惡臭假單胞菌的轉化體中提取目標重組媒介物。對于該重組媒介物的插入DNA斷片，由通常方法決定堿基序列。其結果是，含有序列號258～3660的堿基序列。
如國際公開WO02/36779號公報等公開的那樣，編碼α亞單位的堿基序列是序列號1的堿基序列中的堿基序號764～2380的堿基序列，編碼β亞單位的堿基序列是序列號1的堿基序列中的堿基序號2386～3660的堿基序列，編碼γ亞單位的堿基序列是序列號1的堿基序列中的堿基序號258～761的堿基序列，編碼β亞單位的信號肽的堿基序列是序列號1的堿基序列中的堿基序號2386～2451的堿基序列。
因此，確認了目標重組媒介物含有編碼α亞單位、β亞單位(包含β亞單位的信號肽)、γ亞單位的堿基序列。另外，對應于各堿基序列的氨基酸序列，對于α亞單位來說，示于序列號3，對于β亞單位來說，示于序列號5，對于γ亞單位來說，示于序列號2，對于β亞單位的信號肽來說，示于序列號4的氨基酸序列中的氨基酸序號1～22。
由以上可以清楚，在本發(fā)明中，例如αGDH和CyGDH那樣，可以同時而且高效率地制造2種GDH。
序列表<110>早出廣司；愛科來株式會社<120>葡萄糖脫氫酶的制造方法<130>WO-AR2003-7<150>JP 2002/253752<151>2002-8-30<160>5<210>1<211>3706<212>DNA<213>Burkhorderia cepacia<220>
<221>CDS<222>(258)..(761)<220>
<221>CDS<222>(764)..(2380)<220>
<221>CDS
<222>(2386)..(3660)<400>1aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc290Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg1 5 10cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln15 20 25ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu30 35 40cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg 434Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met45 50 55acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc 482Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile60 65 70 75ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc 530Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala80 85 90gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg 578Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr95 100 105cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc 626
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1.一種葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于將含有編碼在序列號1記載的具有葡萄糖脫氫活性的α亞單位及作為電子傳遞蛋白質的β亞單位的序列的DNA導入屬于假單胞菌屬的微生物中，形成轉化體，培養(yǎng)該轉化體，產(chǎn)生含有所述β亞單位的第1葡萄糖脫氫酶和不含所述β亞單位的第2葡萄糖脫氫酶。
2.如權利要求1所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述α亞單位在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的分子量約為60kDa，所述β亞單位在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的分子量約為43kDa。
3.如權利要求1所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有編碼在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的分子量約為14kDa的γ亞單位的堿基序列，所述第1及第2葡萄糖脫氫酶，作為含有所述γ亞單位的酶來產(chǎn)生。
4.如權利要求1所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述屬于假單胞菌屬的微生物是惡臭假單胞菌。
5.如權利要求1所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述DNA是屬于Burkhorderia屬的微生物，從具有產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶能力的微生物取得。
6.如權利要求5所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于屬于所述Burkhorderia屬的微生物是Burkhorderia cepacia KS1株(FERMBP-7306)。
7.如權利要求1所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述α亞單位具有序列號3的氨基酸序列或在序列號3的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。
8.如權利要求7所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有在序列號1的堿基序列之中、編碼由堿基序號764～2380組成的α亞單位的堿基序列。
9.如權利要求1所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述β亞單位具有序列號5的氨基酸序列或在序列號5的氨基酸序列之中取代、空缺、插入或加成一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。
10.如權利要求9所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有在序列號1的堿基序列之中、編碼由堿基序號2386～3660組成的β亞單位的堿基序列。
11.如權利要求3所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述γ亞單位具有序列號2的氨基酸序列或在序列號2的氨基酸序列之中取代、空缺、插入或加成一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。
12.如權利要求11所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有在序列號1的堿基序列之中、編碼由堿基序號258～761組成的γ亞單位的堿基序列。
13.如權利要求12所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述DNA，在編碼α亞單位的堿基序列的上游區(qū)域含有編碼γ亞單位的堿基序列。
14.如權利要求1所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述DNA含有編碼所述β亞單位的信號肽的堿基序列。
15.如權利要求15所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述信號肽具有序列號4的氨基酸序列之中的氨基酸序號1～22的氨基酸序列。
16.如權利要求15所述的葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于所述信號肽由序列號1的堿基序列之中的堿基序號2386～2451的堿基序列來編碼。
全文摘要
本發(fā)明涉及葡萄糖脫氫酶的制造方法。該制造方法是，將含有編碼在序列號1記載的具有葡萄糖脫氫活性的α亞單位及作為電子傳遞蛋白質的β亞單位的序列的DNA導入屬于假單胞菌屬的微生物中，形成轉化體，培養(yǎng)該轉化體，產(chǎn)生含有上述β亞單位的第1葡萄糖脫氫酶和不含上述β亞單位的第2葡萄糖脫氫酶。所述α亞單位在例如還原條件下的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的分子量約為60kDa，所述β亞單位在例如還原條件下的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的分子量約為43kDa。
文檔編號C12N9/04GK1753997SQ03824735
公開日2006年3月29日 申請日期2003年8月20日 優(yōu)先權日2002年8月30日
發(fā)明者早出廣司, 山岡秀亮, 星島光博, 黑坂啓介, 川瀬至道 申請人:早出廣司, 愛科來株式會社