專利名稱：與人髓細胞白血病相關(guān)的基因和多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及癌癥研究領(lǐng)域。本發(fā)明尤其涉及參與細胞曾殖機制的新基因RHBDF1及其編碼的多肽。本發(fā)明的基因和多肽可用于，例如診斷細胞增生性疾病，并作為研發(fā)抗所述疾病的藥物的靶分子。
背景技術(shù)：
最近的研究證明，cDNA微陣列分析產(chǎn)生的基因表達分布圖信息可提供的個體癌癥病理性質(zhì)比傳統(tǒng)的組織病理學(xué)方法所能提供的更為詳盡。這種信息的前景在于其改善治療腫瘤疾病的臨床策略以及發(fā)展新藥物的可能性(Petricoin等，2002.Nat.基因t.，32Suppl.，474-479.)。微陣列技術(shù)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用包括(i)發(fā)現(xiàn)對腫瘤形成(tumorigenesis)有貢獻的基因，(ii)發(fā)現(xiàn)有用的診斷生物標(biāo)志以及抗癌劑的新分子靶；和(iii)鑒定參與賦予化學(xué)敏感性的基因。實際上，根據(jù)我們對這些技術(shù)的理解，已經(jīng)開始了多種有效的臨床應(yīng)用。靶向?qū)е掳┌Y發(fā)展的分子的新藥物已被證實對于一些類型的癌癥非常有效。例如，ABL-選擇性酪氨酸激酶抑制物Imatinib methylate(Glivec；Novartis，Basel，Switzerland)顯著改善慢性期的慢性髓細胞白血病(chronicmyeloid leukemia)(CML)的控制(Druker等，2001.N.Engl.J.Med.，344，1031-1037.)。
為上述目的，我們還應(yīng)用了由23,040基因組成的人cDNA的微陣列來分析各種組織的腫瘤中的基因表達分布圖(Okabe等，2001.Cancer Res.，61，2129-2137.；Kitahara等，2002.Neoplasia，4，295-303.；Lin等，2002.Onco基因，21，4120-4128.；Nagayama等，2002.Cancer Res.，62，5859-5866.；Kaneta等，2002Jpn.J.Cancer Res.，93，849-856.；Okutsu等，2002.Mol.Cancer Ther.，1，1035-1042.；Hasegawa等，2002.Cancer Res.，62，7012-7017.；Kikuchi等，2003Onco基因，22，2192-2205.)。通過這些表達分布圖的分析，我們證實了鑒定的VANGL1通常在HCC中上調(diào)，并且用反義寡核苷酸抑制VALGL1表達可顯著降低HCC細胞的生長并誘導(dǎo)凋亡的細胞死亡(Yagyu等，2002.Int.J.Oncol.，20，1173-1178.)。此外，利用全基因組cDNA微陣列，我們分離了參與腫瘤生成的數(shù)種重要基因諸如AF17(Lin等，2001 Cancer Res.61，6345-6349.)，AXUD1(Ishiguro等，2001 Onco基因，20，5062-5066.)，HELAD1(Ishiguro等，2002 Onco基因，21，6387-6394.)，ENC1(Fujita等，2001.CancerRes.，61，7722-7726.)，APCDD1(Takahashi等，2002.Cancer Res.，62，5651-5656.)，其表達與T細胞因子/淋巴樣增強子-結(jié)合因子(lymphoidenhancer-binding factor)(Tcf-LEF)復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的活性相關(guān)，并且在結(jié)腸癌細胞中明顯升高。鑒定這些基因提供了意在靶向癌癥的藥物的新機會。
設(shè)計揭示致癌機理的研究已經(jīng)促進了鑒定抗腫瘤藥劑的分子靶。例如，法尼酰轉(zhuǎn)移酶(farnexyltransferase)(FTI)的抑制劑已被有效用于治療動物模型中的Ras依賴性腫瘤(He等，Cell 99335-45(1999))，所述抑制劑最初被發(fā)展用于抑制與Ras相關(guān)的生長信號通路，其中Ras的激活依賴翻譯后法尼基化(posttranslational farnesylation)。已聯(lián)合利用抗癌藥及抗HER2單克隆抗體trastuzumab對人類進行了臨床試驗，用以拮抗原癌基因受體HER2/neu；并已獲得乳癌患者的臨床反應(yīng)和總生存率的改善(Lin等，Cancer Res616345-9(2001))。選擇性滅活bcr-abl融合蛋白質(zhì)的酪氨酸激酶抑制劑(STI-571)已被發(fā)展用于治療慢性髓細胞性白血病，在該疾病中，bcr-abl酪氨酸激酶的組成型活化(constitutive activation)在白細胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮決定性作用。這類藥劑被涉及為用來抑制特定基因產(chǎn)物的致癌活性(Fujita等，Cancer Res 617722-6(2001))。因此，在癌性細胞中通常被上調(diào)的基因產(chǎn)物可作為發(fā)展新抗癌劑的潛在靶點。
已證明CD8+細胞毒T淋巴細胞(CTL)識別來自MHCI類分子呈遞的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的表位肽，并溶解腫瘤細胞。自從發(fā)現(xiàn)MAGE家族作為TAA的第一個實例，用免疫學(xué)方法已發(fā)現(xiàn)了許多其它的TAA(Boon，Int JCancer 54177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，J ExpMed 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))。一些已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TAA目前正處于作為免疫治療靶點的臨床開發(fā)階段。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE(van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))，SART(Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998))和NY-ESO-1(Chen等，Proc Natl Acad SciUSA941914-8(1997))。另一方面，已證實的在腫瘤細胞中尤其過表達的基因產(chǎn)物可作為誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)的靶點而被識別。這種基因產(chǎn)物包括p53(Umano等，Brit J Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等，Brit JCancer 8494-9(2001))，CEA(Nukaya等，Int J Cancer 8092-7(1999))等等。
盡管在關(guān)于TAA的基礎(chǔ)和臨床研究中取得了重要的進展(Rosenbeg等，Nature Med4321-7(1998)；Mukherji等，Proc Natl Acad Sci USA 928078-82(1995)；Hu等，Cancer Res 562479-83(1996))，只有有限數(shù)量的候選TAA能治療腺癌，包括結(jié)腸直腸癌。在癌細胞中大量的表達，同時其表達限制在癌細胞內(nèi)的TAA是有希望的免疫治療靶點的候選物(candidate)。此外，對誘導(dǎo)有效且特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的新型TAA的鑒定被預(yù)期能夠促進肽接種策略在多種類型癌中的臨床使用(Boon and can der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，JExp Med 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994)；Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998)；Chen等，Proc Natl Acad Sci USA941914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 881442-5(1996)；Butterfield等，Cancer Res 593134-42(1999)；Vissers等，Cancer Res 595554-9(1999)；vander Burg等，J Immunol 1563308-14(1996)；Tanaka等，Cancer Res 574465-8(1997)；Fujie等，Int J Cancer 80169-72(1999)；Kikuchi等，Int J Cancer 81459-66(1999)；Oiso等，Int J Cancer 81387-94(1999))。
已有報道重復(fù)指出，來自具體健康供體的肽刺激的外周血單核細胞(PBMC)對該肽產(chǎn)生響應(yīng)而產(chǎn)生顯著水平的IFN-γ，但在鉻-51釋放試驗中幾乎不以HLA-A24或-A0201限制性圖譜發(fā)揮針對腫瘤細胞的細胞毒作用(Kawano等，Cance Res 603550-8(2000)；Nishizaka等，Cancer Res 604830-7(2000)；Tamura等，Jpn J Cancer Res 92762-7(2001))。但是，HLA-A24和HLA-A0201均為一種在日本人以及高加索人中常見的HLA等位基因(Date等，Tissue Antigens 4793-101(1996)；Kondo等，J Immunol 1554307-12(1995)；Kubo等，J Immunol 1523913-24(1994)；Imanishi等，Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop andConference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams等，TissueAntigen 49129(1997))。因此，由這些HLA所呈遞的癌抗原肽特別適用于治療日本人和高加索人中的癌癥。此外，已知在體外誘導(dǎo)低親和力CTL通常是使用高濃度肽的結(jié)果，所述高濃度肽的使用在抗原呈遞細胞(APC)上生成高水平特異性肽/MHC復(fù)合物，所述復(fù)合物將有效激活這些CTL(Alexander-Miller等，Proc Natl Acad Sci USA 934102-7(1996))。
發(fā)明概述為全面研究致癌的詳細分子機制，我們試圖利用cDNA微陣列(代表23,040個轉(zhuǎn)錄物)獲得CML、急性髓細胞白血病(AML)和肺腺癌的癌細胞的全基因組表達分布圖(Kaneta等，2002，Jpn.J.Cancer Res.，93，849-856.；Okutsu等，2002.Mol.Cancer Ther.，1，1035-1042.；Kikuchi等，2003，Onco基因，22，2192-2205.)。在這些癌癥中上調(diào)的基因中，我們鑒定了RHBDF1基因(類似果蠅(Drosophila)Rhomboid-5)，其很可能屬于Rhomboid家族。Rhomboid家族是最近分離的，并且其功能僅在有限數(shù)量的生物體及范圍中顯示。其中，果蠅Rhomboid-1已經(jīng)被鑒定為膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶，其負責(zé)啟動果蠅表皮生長因子受體(EGFR)信號(Lee等，2001.Cell，107，161-171.；Urban等，2001.Cell，107，173-182.)。在果蠅中該途徑的活化通過三種跨膜EGFR配體前體Spitz，Keren和Gurken的選擇性蛋白水解來調(diào)節(jié)。在其跨膜形式中，這些配體是無活性的，并限制在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。在信號為陽性的細胞中，Star(2型膜蛋白)，將這些配體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出到高爾基體，在那里它們通過rhomboid膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶切割。所述切割釋出EGF配體結(jié)構(gòu)域并隨后分泌該結(jié)構(gòu)域，作為其它細胞的活化信號。Rhomboid的蛋白酶活性位點位于膜雙層中，且所述活化切割出現(xiàn)在配體跨膜結(jié)構(gòu)域中。該蛋白水解切割系統(tǒng)與其它已知生長因子相反，其利用細胞表面的金屬蛋白酶來釋放活性生長因子結(jié)構(gòu)域(Urban等，2002.Curr.Biol.，12，1507-1512.)。對于將近100種目前已知在進化中保守的rhomboid相關(guān)基因的功能知之甚少，但最近的研究表明來自病原細菌的Rhomboid參與群體感應(yīng)(quorum-sensing)因子的產(chǎn)生(Rather等，1994.J.Bacteriol.，176，5140-5144.；Gallio等，2000.Curr.Biol.，10，R693-694.)，提示Rhomboid相關(guān)的細胞內(nèi)信號機制在進化步驟中是保守的。
根據(jù)如上述最近對原核rhomboid的功能分析，可理解所有Rhomboid蛋白具有膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶功能。例如，果蠅Rhomboids1-4具有相似的蛋白水解活性并且所有膜粘連的(membrane-tethered)配體是Rhomboid蛋白酶的底物(Lee等，2001.Cell，107，161-171.；Urban等，2002.EMBO J.，21，4277-4286.)。然而，雖然RHBDF1含有高度保守的rhomboid結(jié)構(gòu)域(圖1band 1c)，催化蛋白水解的絲氨酸蛋白酶必要殘基在該rhomboid結(jié)構(gòu)域中不是保守的。因此，研究RHBDF1蛋白是否具有對膜-粘連的EGF受體配體諸如Spitz進行蛋白水解的能力有很大興趣。需要其它對純化的RHBDF1蛋白的直接生化分析來回答上述問題。
我們的結(jié)果提示活化的RHBDF1作為癌基因起作用，基于穩(wěn)定RHBDF1表達增強細胞生長以及通過反義S-寡核苷酸或RNAi降低RHBDF1表達抑制CML和肺腺癌細胞的生長的事實。此外，免疫細胞化學(xué)染色提示RHBDF1與其它Rhomboid蛋白一樣位于高爾基器。這些發(fā)現(xiàn)提示，RHBDF1可具有其自己的靶底物，所述底物介導(dǎo)RHBDF1-依賴的信號，盡管所述靶分子目前還不明確。如果是這樣，鑒定RHBDF1底物可提供設(shè)計新抗癌藥物的新線索。
因此，本發(fā)明提供了分離的基因RHBDF1，其作為癌癥的候選診斷標(biāo)志以及研制診斷新策略和有效抗癌試劑的有希望的潛在靶點。此外，本發(fā)明還提供了該基因編碼的多肽，制備方法及其應(yīng)用。更具體的，本發(fā)明提供了下述內(nèi)容本申請?zhí)峁┝诵碌娜祟惗嚯腞HBDF1，或其功能等價物，其促進細胞增殖并且在細胞增生性疾病中上調(diào)，所述細胞增生性疾病諸如CML，AML以及肺腺癌等。
一個優(yōu)選實施方案中，RHBDF1多肽包括公知的855氨基酸蛋白質(zhì)，其與黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的Rhomboid-5具有約39％同一性。RHBDF1由SEQ ID NO15的開放閱讀框編碼。SMART程序預(yù)期RHBDF1蛋白質(zhì)含有C末端部分的7個跨膜結(jié)構(gòu)域組成的rhomboid結(jié)構(gòu)域并提示其高爾基定位。RHBDF1多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO16的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了由至少部分RHBDF1多核苷酸序列，或與SEQ ID NO15的序列至少40％，更優(yōu)選至少50％互補的多核苷酸序列所編碼的分離的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了分離的編碼新的人類蛋白RHBDF1的多核苷酸，它在大多數(shù)CML中的表達相對于其在正常外周血細胞中的表達顯著提高。該分離的RHBDF1基因包括SEQ ID NO15所示的多核苷酸序列。具體地，RHBDF1 cDNA包括含有2568個核苷酸的開放閱讀框(SEQ ID NO15)的2958個核苷酸。本發(fā)明還包括與SEQ ID NO15所示的多核苷酸序列雜交并與其至少40％，更優(yōu)選至少50％互補的多核苷酸，使得它們編碼RHBDF1蛋白或其功能等價物。這種多核苷酸的實例為SEQ ID NO15的簡并變體和等位基因突變體。
本文中，分離的基因指多核苷酸，其結(jié)構(gòu)與任何天然存在的多核苷酸不同源，或與任何天然存在的基因組多核苷酸的片段不同。因此，該術(shù)語包括，例如(a)DNA，它具有生物體基因組中天然存在的天然基因組DNA分子的部分序列，其中所述DNA天然存在于所述生物體中；(b)插入載體或插入原核或真核生物基因組DNA中的多核苷酸，該插入方式使獲得的分子與任何天然存在的載體或基因組DNA不相同；(c)分離的分子，如cDNA、基因組片段、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段或限制性酶切片段；和(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因(即編碼融合蛋白的基因)的一部分。
因此，一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述多肽或其片段的分離的多核苷酸。優(yōu)選，該分離的多核苷酸包括與SEQ ID NO15所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更優(yōu)選，該分離的核酸分子與SEQ ID NO15所示核苷酸序列的同一性為至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。當(dāng)分離的多核苷酸比參照序列(例如SEQ ID NO15)的長度更長或者相同時，所述比較是以參照序列的全長進行的。當(dāng)分離的多核苷酸比參照序列(例如SEQ ID NO15)短，所述比較是以參照序列的相同長度的片段進行的(排除同源性計算所需的任何環(huán)(loop))。
本發(fā)明還提供了一種制備蛋白質(zhì)的方法，其通過用編碼RHBDF1蛋白的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞，并表達該多核苷酸序列來進行。另外，本發(fā)明還提供了含有編碼RHBDF1蛋白的核苷酸序列的載體，含有編碼RHBDF1蛋白的多核苷酸的宿主細胞。這種載體和宿主細胞可用于制備RHBDF1蛋白。
本申請還提供了識別RHBDF1蛋白的抗體。本發(fā)明的一部分還提供了RHBDF1基因的反義多核苷酸(例如，反義DNA)，核酶，和siRNA(小干擾RNA或短干擾RNA)。
本發(fā)明還提供了一種診斷細胞增生性疾病的方法，包括以下步驟確定樣本(specimen)生物樣品中的基因表達水平，并比較RHBDF1基因表達水平與正常樣品中，樣品中RHBDF1基因的高表達水平表示個體患有或?qū)⒖赡芑加屑毎錾约膊≈T如癌癥。通過RHBDF1的表達水平診斷的疾病可為CML，AML或肺腺癌。
此外，本發(fā)明提供了一種篩選用于治療細胞增生性疾病的化合物的方法。該方法包括將RHBDF1多肽與受試化合物接觸，選出與RHBDF1多肽結(jié)合的受試化合物。
此外，本發(fā)明提供了一種篩選用于治療細胞增生性疾病的化合物的方法，該方法包括將RHBDF1多肽與受試化合物接觸，選出抑制RHBDF1多肽的表達水平或生物活性的受試化合物。
本發(fā)明還提供了一種治療細胞增生性疾病諸如癌癥的藥物組合物。該藥物組合物可以是，例如抗癌劑。該藥物組合物可描述成SEQ ID NO15中顯示并描述的RHBDF1多核苷酸序列的反義S-寡核苷酸或siRNA的至少一部分。適合的反義S-寡核苷酸具有SEQ ID NO11的序列。包括具有SEQID NO11的核苷酸序列的寡核苷酸在內(nèi)的RHBDF1的反義S-寡核苷酸適用于CML，AML或肺腺癌。適宜的siRNA包括一組核苷酸，其具有SEQ IDNO13的核苷酸序列及其反義序列作為靶序列。RHBDF1的siRNA由SEQID NO13的核苷酸序列組成，并適用于治療CML，AML或肺腺癌。
期望藥物組合物的起效階段能抑制瘤性細胞的生長。該藥物組合物可施用于哺乳動物，包括人和家養(yǎng)哺乳動物。
本發(fā)明還提供了一種用本發(fā)明提供的藥物組合物治療細胞增生性疾病的方法。
另外，本發(fā)明還提供了一種用于治療或預(yù)防癌的方法，所述方法包括給予RHBDF1多肽的步驟。預(yù)期通過給予RHBDF1多肽誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性。因此，本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的方法，包括給予RHBDF1多肽的步驟，和給予用于治療或預(yù)防癌癥的含RHBDF1多肽的藥物組合物的步驟。
應(yīng)當(dāng)理解以上發(fā)明概述以及下述發(fā)明的詳細描述都是本發(fā)明的優(yōu)選實方案，并不限制本發(fā)明及其它替代實例。


圖1利用cDNA微陣列分析的CML表達分布圖。
(a)27CML患者中RHBDF1的Cy5/Cy3信號強度比。
(b)果蠅rhomboid結(jié)構(gòu)域Rhomboid-1到Rhomboid-6與C6135(RHBDF1)的ClustalW-衍生的序列比對；7個跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測的位置用黑線表示。
(c)來自Rhomboid家族的ClustalW序列比對的系統(tǒng)發(fā)生樹。
圖2RHBDF1基因的定性(a)各種人組織中C6135的Northern印跡。分子量顯示在左側(cè)。
(b)NIH3T3細胞中Myc-標(biāo)記的C6135(RHBDF1)的亞細胞定位。
圖3RHBDF1對NIH3T3細胞生長的影響(a)NIH3T3中外源轉(zhuǎn)染的C6135的過表達。三種細胞系與載體-轉(zhuǎn)染物相比穩(wěn)定表達。甘油醛-3-磷酸酶脫氫酶(GAPDH)基因的表達作為內(nèi)部對照。
(b)NIH3T3-C6135細胞和NIH3T3-載體細胞的生長速率。將所述細胞培養(yǎng)5天，然后通過MTT實驗定量細胞生長。所述實驗以一式三份進行實施。棒(Bar)表示SD。
圖4設(shè)計為降低RHBDF1在K562細胞中表達的反義S-寡核苷酸和小干擾RNA(siRNA)的生長抑制效應(yīng)。
(a)半定量RT-PCR測定的C6135在用反向(RHBDF1-R1)或反義(RHBDF1-AS1)S-寡核苷酸處理48小時的K562細胞中的表達。
(b)利用S-寡核苷酸(RHBDF1-R1和RHBDF1-AS1)的MTT實驗在K562細胞中進行。將未經(jīng)處理的組的值調(diào)節(jié)到1.0。該實驗進行5次。棒表示SD。
(c)由半定量RT-PCR測定的psiH1BX-RHBDF1或psiH1BX-EGFPsiRNA處理的K562細胞中C6135的表達。
(d)利用siRNA(psiH1BX-RHBDF1和psiH1BX-EGFP)的MTT實驗在K562細胞中進行。未處理的組的值調(diào)節(jié)到1.0。該實驗進行5次。棒表示SD。
圖5(a)AML患者和(b)肺腺癌患者中C6135表達的半定量RT-PCR分析。β-肌動蛋白基因的表達作為內(nèi)部對照。PB，外周血，BM，骨髓。
圖6反義S-寡核苷酸和siRNA在肺腺癌細胞中的生長抑制效應(yīng)(a)，(c)和(e)，RHBDF1在siRNA表達載體轉(zhuǎn)染的A549LC319，H522細胞系中的表達的半定量RT-PCR分析。
(b)，(d)和(f)，分別在肺癌細胞系A(chǔ)549 LC319，H522中進行的集落形成實驗(colony formation assay)。
(g)MTT實驗在肺癌細胞系LC319，A549和H522中進行。所述實驗按一式三份實施。棒表示SD。
發(fā)明詳述本文中“一個”指“至少一個”，除非另有特別說明。
本發(fā)明鑒定了新的人基因RHBDF1，其表達在CML中與正常外周血細胞中相比顯著升高。RHBDF1 cDNA由2958個核苷酸組成，所述2958個核苷酸含有SEQ ID NO15中所示的2568個核苷酸的開放閱讀框。所述開放閱讀框編碼推定的855-氨基酸蛋白質(zhì)。預(yù)期的氨基酸序列顯示與黑腹果蠅Rhomboid-5約39％的同一性。因此該蛋白質(zhì)稱RHBDF1。
同樣，RHBDF1外源表達入細胞使得細胞生長增加，而用反義S-寡核苷酸或小干擾RNA(siRNA)抑制其表達導(dǎo)致癌性細胞生長被明顯抑制。這些發(fā)現(xiàn)提示RHBDF1使得癌細胞具有致癌活性，且抑制這些蛋白的活性可能是治療癌癥的有希望的策略。
本發(fā)明包括新的人基因RHBDF1，包括SEQ ID NO15的多核苷酸序列及其簡并物或其變體，所述序列及其簡并物或其變體均編碼RHBDF1蛋白，包括SEQ ID NO16的氨基酸序列或其功能等同物。RHBDF1功能性等同多肽的實例包括例如，與人RHBDF1蛋白對應(yīng)的其它生物體的同源蛋白以及人RHBDF1蛋白的突變體。
本發(fā)明中，術(shù)語“功能等價(functionally equivalent)”指受試多肽與RHBDF1蛋白一樣，具有促進細胞增殖以及賦予癌細胞致癌活性的活性。受試多肽是否具有細胞增殖活性可如下所述進行判斷將編碼受試多肽的DNA導(dǎo)入表達相應(yīng)多肽的宿主細胞，檢測對細胞增殖的促進作用或集落形成活性的增加。這種細胞包括，例如，NIH3T3細胞，K562細胞，A549細胞，H522細胞和LC319細胞。
制備指定蛋白的功能等價多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括在蛋白中導(dǎo)入突變的已知方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過定點誘變在這些蛋白質(zhì)之一的氨基酸序列中導(dǎo)入合適的突變，來制備人類RHBDF1蛋白的功能等價多肽(Hashimoto-Gotoh等，Gene 152271-5(1995)；Zoller andSmith，Methods Enzymol 100468-500(1983)；Kramer等，Nucleic Acids Res.129441-9456(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82488-92(1985)；Kunkel，Methods Enzymol852763-6(1988))。氨基酸突變也會自然發(fā)生。本發(fā)明的多肽包括具有人類RHBDF1蛋白氨基酸序列的蛋白，其中一或多個氨基酸發(fā)生突變，產(chǎn)生的突變多肽與人類RHBDF1蛋白功能等價。這種突變體中突變氨基酸的數(shù)量通常是10個或更少，優(yōu)選6個或更少，最優(yōu)選3個或更少。
已知突變或修飾的蛋白保持原來的生物活性，所述蛋白為具有通過對具體氨基酸序列的一或多個氨基酸殘基進行取代，缺失，插入和/或添加修飾而成的氨基酸序列的蛋白(Mark等，Proc Natl Acad Sci USA 815662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 106487-500(1982)；Dalbadie-McFarland等，Proc Natl Acad Sci USA 796409-13(1982))。
被突變的氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)椴煌陌被幔浒被醾?cè)鏈的性質(zhì)是保守的(即保守氨基酸取代過程)。氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)，親水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，以及側(cè)鏈帶有下述功能基團或具有共有性質(zhì)脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含有羥基的側(cè)鏈(S，T，Y)；含有硫原子的側(cè)鏈(C，M)；含有羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含堿基的側(cè)鏈(R，K，H)；含芳香基的側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。注意，括號中的字母是指氨基酸的單字母密碼。
在人RHBDF1蛋白的氨基酸序列中添加了一或多個氨基酸殘基的多肽的例子是包含人RHBDF1蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人RHBDF1蛋白與其它肽或蛋白的融合體，并且包括在本發(fā)明的范圍?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備融合蛋白，如將編碼本發(fā)明人RHBDF1蛋白的DNA與編碼其它肽或蛋白的DNA連接，使編碼框匹配，將該融合DNA插入表達載體并在宿主細胞中表達。對于與本發(fā)明蛋白融合的肽或蛋白沒有限制。
可用作與本發(fā)明蛋白進行融合的已知的肽包括，例如FLAG(Hopp等，Biotechnology 61204-10(1988))，含6個His(組氨酸)殘基的6×His，10×His，流感血凝素(Influenza agglutinin)(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7-標(biāo)記，HSV-標(biāo)記，E-標(biāo)記，SV40抗原片段，lck標(biāo)記，α-微管蛋白片段，B-標(biāo)記，蛋白C片段及類似物?？膳c本發(fā)明蛋白融合的蛋白包括例如GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)，流感血凝素(HA)，免疫球蛋白恒定區(qū)，β-半乳糖苷酶，MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)等。
融合蛋白可如下制備將編碼上述融合肽或蛋白的可購得DNA，與編碼本發(fā)明多肽的DNA融合，并表達制備的融合DNA。
另一個本領(lǐng)域中已知的分離功能等價多肽的方法例如，使用雜交技術(shù)的方法(Sambrook等，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold Spring HarborLab.Press(1989))。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易的分離與編碼人RHBDF1蛋白的全部或部分DNA序列(即SEQ ID NO15)高度同源的DNA，并從分離的DNA中分離人RHBDF1蛋白的功能等價多肽。本發(fā)明的多肽包括與編碼人RHBDF1蛋白的DNA序列的全部或部分雜交的DNA編碼的多肽，并且它們與人RHBDF1蛋白的功能等價。這些多肽包括對應(yīng)于衍生自人蛋白的哺乳動物同系物(例如，猴，鼠，兔和?；蚓幋a的多肽)。當(dāng)從動物分離與編碼人RHBDF1蛋白DNA高度同源的cDNA時，特別優(yōu)選使用來自氣管，甲狀腺，脊髓，前列腺，骨骼肌或胎盤的組織。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)選擇分離編碼人RHBDF1蛋白功能等價多肽的DNA的雜交條件。例如，雜交如下進行用“Rapid-hyb緩沖液”在68℃預(yù)雜交30min或更長，加入標(biāo)記探針，68℃保溫1h或更長。隨后的洗滌步驟可在例如低嚴謹條件進行。低嚴謹條件是，例如42℃，2×SSC，0.1％SDS，或優(yōu)選50℃，2×SSC，0.1％SDS。更優(yōu)選，采用高嚴謹條件。高嚴謹條件是，例如室溫、于2×SSC，0.01％SDS中洗滌3次每次20min，隨后37℃，于1×SSC，0.1％SDS中洗滌3次每次20min，然后50℃，于1×SSC，0.1％SDS洗滌2次每次20min。雖然一些因素如溫度和鹽濃度會影響雜交的嚴謹性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)倪x擇這些因素以獲得必要的嚴謹度。
可利用基因擴增方法如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)代替雜交，來分離編碼人RHBDF1蛋白功能等價多肽的DNA，使用根據(jù)編碼該蛋白的DNA的序列信息(SEQ ID NO15)合成的引物。
通過上述雜交技術(shù)或基因擴增技術(shù)分離的DNA編碼的人RHBDF1蛋白的功能等價多肽通常與人RHBDF1蛋白的氨基酸序列高度同源。“高度同源”通常指40％同源性或更高，優(yōu)選60％或更高，更優(yōu)選80％或更高，甚至優(yōu)選95％或更高。多肽的同源性可用“Wilbur and Lipman，Proc Natl AcadSci USA 80726-30(1983)”的算法確定。
本發(fā)明多肽的氨基酸序列，分子量，等電點，糖鏈的存在或缺失，或形態(tài)可能發(fā)生變異，這取決于制備該多肽所使用的細胞或宿主或使用的純化方法。不過，只要它的功能等同于本發(fā)明的人RHBDF1蛋白，它就屬于本發(fā)明的范圍。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法以重組蛋白或天然蛋白的形式制備本發(fā)明的多肽。重組蛋白如下制備將編碼本發(fā)明多肽的DNA(例如，含SEQID NO15的核苷酸序列的DNA)插入合適的表達載體，將該載體導(dǎo)入合適的宿主細胞，獲得提取物，使用其上固定有抗本發(fā)明蛋白抗體的柱或聯(lián)合使用多個上述柱，對該提取物進行層析從而純化所述多肽，所述層析如離子交換層析，反相層析，凝膠過濾或親和層析。
當(dāng)本發(fā)明多肽在宿主細胞(例如動物細胞和大腸桿菌)中被表達為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋白融合的融合蛋白或附加了多個組氨酸的重組蛋白時，該表達的重組蛋白可用谷胱甘肽柱或鎳柱純化?；蛘?，當(dāng)本發(fā)明的多肽被表達為c-myc、多組氨酸或FLAG標(biāo)記的蛋白時，其可分別使用抗c-myc、His或FLAG抗體檢測和純化。
純化該融合蛋白后，還可能通過按需切除凝血酶或因子Xa除去與受試多肽不同的區(qū)域。
分離天然蛋白可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如與親和柱接觸，其中與下述RHBDF1蛋白結(jié)合的抗體與表達本發(fā)明多肽的組織或細胞的提取物相結(jié)合。所述抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
本發(fā)明還包括本發(fā)明多肽的部分肽。該部分肽含有本發(fā)明多肽的特異性氨基酸序列，并由至少7個氨基酸，優(yōu)選8個或更多氨基酸，更優(yōu)選9個或更多氨基酸組成。所述部分肽可用于，例如制備抗本發(fā)明多肽的抗體，篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物，篩選本發(fā)明多肽的促進劑(accelerator)或抑制劑。
可通過基因工程方法，已知的肽合成方法，或用合適的肽酶消化本發(fā)明多肽來制備本發(fā)明的部分肽。對于肽合成，可使用例如固相肽合成或液相肽合成。
本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可用于在體內(nèi)或體外制備上述本發(fā)明的多肽，或者應(yīng)用于疾病的基因治療，所述疾病歸因于編碼本發(fā)明多肽的基因的遺傳異常。可利用本發(fā)明多核苷酸的任意一種形式，只要它編碼本發(fā)明的多肽，所述多核苷酸的形式包括mRNA，RNA，cDNA，基因組DNA，化學(xué)合成的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括含有給定核苷酸序列的DNA及其簡并序列，只要形成的DNA編碼本發(fā)明的多肽。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備本發(fā)明的多核苷酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可如下制備從表達本法明多肽的細胞中制備cDNA文庫，用本發(fā)明DNA的部分序列(如SEQ ID NO15)作為探針進行雜交。cDNA文庫可依照Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)描述的方法制備；或者也可以使用可購得的cDNA文庫。cDNA文庫還可如下制備從表達本發(fā)明多肽的細胞中提取RNA，根據(jù)本發(fā)明DNA序列(如SEQ ID NO15)合成寡DNA，以該寡DNA為引物進行PCR，擴增編碼本發(fā)明蛋白的cDNA。
另外，通過測序獲得的cDNA的核苷酸序列，可以常規(guī)的確定cDNA編碼的翻譯區(qū)，也就可以容易地獲得本發(fā)明多肽的氨基酸序列。而且，用獲得的cDNA或其部分作為探針篩選基因組DNA文庫，可以分離基因組DNA。
更具體地，可以首先從表達本發(fā)明目的多肽的細胞，組織或器官(氣管，甲狀腺，脊髓，前列腺，骨骼肌或胎盤)中制備mRNA。用已知的方法分離mRNA；例如用胍超速離心(guanidine ultracentrifugation)(Chirgwin等，Biochemistry 185294-9(1979))或AGPC方法(Chomczynski and Sacchi，AnalBiochem 162156-9(1987))制備總RNA。另外，用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)從總RNA中純化mRNA?；蛘?，用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接純化mRNA。
利用逆轉(zhuǎn)錄酶從獲得的mRNA合成cDNA。cDNA的合成可使用可購得的試劑盒，如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(Seikagaku Kogyo)。或者，用5’-RACE方法合成并擴增cDNA(Frohman等，Proc Natl Acad SciUSA 858998-9002(1988)；Belyavsky等，Nucleic Acids Res 172919-32(1989))，其中使用本文所述的引物，5’-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech)以及聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。
從PCR產(chǎn)物制備所需的DNA片段并與載體DNA連接。重組載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌等，并從選出的集落中制備所需的重組載體。通過常規(guī)方法驗證所需的DNA的核苷酸序列，例如雙脫氧核苷酸鏈終止法(dideoxynucleotide chain termination)。
考慮到用于表達的宿主細胞中的密碼子利用頻率，設(shè)計本發(fā)明多核苷酸的核苷酸序列，使其更有效地表達(Grantham等，Nucleic Acids Res 943-74(1981))?？捎蒙唐坊噭┖谢虺Ｒ?guī)方法改變本發(fā)明多核苷酸的序列。例如，可用限制酶消化，插入合成的寡核苷酸或合適的多核苷酸片段，增加接頭，或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA，TGA或標(biāo)記)來改變所述序列。
具體地，本發(fā)明的多核苷酸包括含有SEQ ID NO15的核苷酸序列的DNA。
另外，本發(fā)明提供了多核苷酸，其在嚴謹條件下與具有SEQ ID NO15所示核苷酸序列的多核苷酸雜交，并編碼上述與本發(fā)明RHBDF1蛋白功能等價的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇嚴謹條件。例如，可采用低嚴謹條件。更優(yōu)選，可采用高嚴謹條件。這些條件與前文所述條件相同。上述用于雜交的DNA優(yōu)選cDNA或染色體DNA。
本發(fā)明還提供了插入了本發(fā)明多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體用于在宿主細胞中保留本發(fā)明的多核苷酸具體是DNA、用于表達本發(fā)明的多肽，或用于給予本發(fā)明的多核苷酸進行基因治療。
當(dāng)以大腸桿菌作為宿主細胞并在大腸桿菌中(例如JM109，DH5α，HB 101或XL1Blue)大量的擴增和生產(chǎn)載體時，該載體應(yīng)當(dāng)具有在大腸桿菌中擴增的“復(fù)制起始點ori”，以及用于篩選轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)記基因(例如，通過例如氨卡青霉素，四環(huán)素，卡那霉素，氯霉素等藥物進行篩選的抗藥基因)。例如，可使用M13系列載體，pUC系列載體，pBR322，pBluescript，pCR-Script等等。另外，也可使用pGEM-T，pDIRECT和pT7來進行亞克隆及提取cDNA和上述載體。當(dāng)利用載體制備本發(fā)明的蛋白時，表達載體特別有用。例如，在大腸桿菌中表達的表達載體應(yīng)當(dāng)具備上述性質(zhì)以便在大腸桿菌中擴增。當(dāng)以大腸桿菌如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue作為宿主細胞時，載體應(yīng)當(dāng)具有啟動子，如lacZ啟動子(Ward等，Nature 341544-6(1989)；FASEB J62422-7(1992))，araB啟動子(Better等，Science2401041-3(1988))，T7啟動子等，它們能在大腸桿菌中有效的表達所需的基因。在這方面，可使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIAexpress system”(Qiagen)，pEGFP和pET(在這種情況中，宿主優(yōu)選表達T7RNA聚合酶的BL21)代替上述載體。另外，該載體還可包含多肽分泌的信號肽序列。指導(dǎo)多肽分泌到大腸桿菌周質(zhì)的信號肽序列的實例是pelB信號序列(Lei等，JBacteriol 1694379(1987))。將所述載體導(dǎo)入靶宿主細胞的方法包括，例如氯化鈣法和電穿孔法。
除了大腸桿菌，還可利用例如哺乳動物表達載體(如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)5322(1990))，pEF，pCDM8)，昆蟲細胞表達載體(如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，植物表達載體(如pMH1，pMH2)，動物病毒表達載體(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體(如pZIpneo)，酵母表達載體(如“畢赤酵母(Pichia)表達試劑盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)，枯草桿菌(Bacillus subtilis)表達載體(如pPL608，pKTH50)制備本發(fā)明的多肽。
為了在動物細胞如CHO，COS或NIH3T3細胞中表達所述載體，該載體應(yīng)當(dāng)具有在這些細胞中表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等，Nature277108(1979))，MMLV-LTR啟動子，EF1α啟動子(Mizushima等，Nucleic Acids Res 185322(1990))，CMV啟動子等，并優(yōu)選具有用于篩選轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記基因(如，經(jīng)藥物(例如新霉素，G418)選出的抗藥基因)。已知具備這些性質(zhì)的載體包括，例如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。
本發(fā)明還提供了在細胞中穩(wěn)定表達基因同時擴增該基因拷貝數(shù)的方法。例如，將含有互補DHFR基因的載體(如pCHOI)導(dǎo)入核酸合成途徑被缺失的CHO細胞，然后由甲氨蝶呤(MTX)進行擴增。另外，當(dāng)瞬時表達基因時，可采用下述方法將含有SV40復(fù)制起始點的載體(pcD等)轉(zhuǎn)化入COS細胞，該細胞染色體包含SV40T抗原表達基因。
如上所述獲得的本發(fā)明多肽可以從宿主細胞內(nèi)或外(如培養(yǎng)基)分離，并純化為基本純的均質(zhì)的多肽。本文給定多肽所用的術(shù)語“基本純”是指該多肽基本上與其它生物大分子分離?；炯兊亩嚯闹父芍刂辽?5％(如至少80，85，95，或99％)是純的。用合適的標(biāo)準方法測定純度，所述方法例如柱層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析。多肽分離純化的方法并不限于任何具體方法；事實上，可采用任何標(biāo)準方法。
例如，可以適當(dāng)選擇并聯(lián)合使用柱層析，過濾，超濾，鹽沉淀，溶劑沉淀，溶劑提取，蒸餾，免疫沉淀，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電點電泳，透析和重結(jié)晶以分離純化所述多肽。
層析的實例包括，例如親和層析，離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾，反相層析，吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。這些層析法可以液相層析如HPLC和FPLC進行。因此，本發(fā)明提供了上述方法制備的高純度的多肽。
在純化之前或之后用合適的蛋白修飾酶處理本發(fā)明的多肽，可任選修飾或部分缺失所述多肽。有用的蛋白修飾酶包括、但不限于胰蛋白酶，糜蛋白酶，賴氨酰內(nèi)肽酶，蛋白激酶，糖苷酶等等。
本發(fā)明提供了與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以任意形式如單克隆抗體或多克隆抗體進行使用，并且包括用本發(fā)明多肽免疫動物如兔獲得的抗血清，所有類型的多克隆和單克隆抗體，人抗體以及通過基因重組制備的人源化抗體。
以本發(fā)明多肽作為抗原可以從任何動物種系獲得抗體，但優(yōu)選從哺乳動物諸如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選從人獲得抗體。來自人的多肽可從本文所述的核苷酸或氨基酸序列獲得。
如本發(fā)明所述，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白或蛋白的部分肽。部分肽包括，例如本發(fā)明多肽的氨基端(N)或羧基端(C)片段。將編碼本發(fā)明多肽或其片段的基因插入到已知的表達載體，然后用該載體轉(zhuǎn)化本文所述的宿主細胞。用任意標(biāo)準方法從宿主細胞內(nèi)或外回收所需多肽或其片段，并隨后將所述多肽或其片段用作抗原。或者，以表達該多肽的整個細胞或其裂解物或化學(xué)合成多肽作為抗原。
用所述抗原免疫任意哺乳動物，但優(yōu)選考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性。通常使用嚙齒目(Rodentia)，兔類(Lagomorpha)或靈長類(Primates)的動物。嚙齒目動物包括，如小鼠，大鼠和倉鼠。兔類動物包括兔。靈長類動物包括，例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old world monkey))如Macaca fascicularis，恒河猴(rhesus monkey)，狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。
用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫動物的標(biāo)準方法。更具體地，可以用適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，生理鹽水等稀釋和懸浮抗原。如果需要，將抗原懸液與適量的標(biāo)準佐劑如福氏(Freund’s)完全佐劑混合，形成乳液，然后給予哺乳動物。優(yōu)選，將與適量福氏完全佐劑混合的抗原每4至21天給藥數(shù)次。也可使用合適的載體進行免疫。上所述免疫后，用標(biāo)準方法檢驗血清中所需的抗體數(shù)量的增加。
本發(fā)明多肽的多克隆抗體可如下制備從經(jīng)免疫的動物(該動物經(jīng)檢測其血清中所需的抗體增加)收集血液，用任意常規(guī)的方法從所述血液中分離血清。多克隆抗體包括含多克隆抗體的血清且可從所述血清中分離含有該多克隆抗體的級分。利用例如與本發(fā)明多肽偶聯(lián)的親和層析柱，從僅識別本發(fā)明多肽的級分制備免疫球蛋白G或M，隨后進一步用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。
為制備單克隆抗體，從用所述抗原免疫、并且如上述經(jīng)檢測血清中所需抗體水平增高的動物中收集免疫細胞，并進行細胞融合。用于細胞融合的免疫細胞優(yōu)選獲自脾。其它待與上述免疫細胞融合的優(yōu)選親本細胞包括，例如哺乳動物骨髓瘤細胞，更優(yōu)選具備獲得的特性以便用藥物篩選融合細胞的骨髓瘤細胞。
根據(jù)已知的方法。如Milstein等(Galfre and Milstein，Methods Enzymol 733-46(1981))的方法將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞融合。
通過在標(biāo)準選擇性培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)等中進行培養(yǎng)來選擇細胞融合所得的雜交瘤。通常，細胞培養(yǎng)物在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)數(shù)天至數(shù)周，該時間要足以使除了所需的雜交瘤細胞之外的所有其它細胞(非融合的細胞)死亡。然后，以標(biāo)準有限稀釋法篩選并克隆生產(chǎn)所需抗體的雜交瘤細胞。
除了上述以抗原免疫非人動物制備雜交瘤的方法外，人淋巴細胞諸如EB病毒感染的淋巴細胞也可在體外用多肽，表達多肽的細胞或其裂解物進行免疫。然后，被免疫的淋巴細胞與能模糊分裂的(indefinite dividing)、人來源的骨髓瘤細胞諸如U266融合，以獲得產(chǎn)生與所述多肽結(jié)合的所需人抗體的雜交瘤細胞(未審查的日本專利申請(Unexamined Published JapanesePatent Application No.)(JP-A)Sho 63-17688)。
獲得的雜交瘤細胞隨后移植到小鼠的腹腔，并抽提腹水。獲得的單克隆抗體可通過，例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)了本發(fā)明多肽的親和柱進行純化。本發(fā)明的抗體不僅可以用于純化和檢測本發(fā)明的多肽，還可以作為本發(fā)明多肽的候選激動劑和拮抗劑。另外，該抗體可應(yīng)用于本發(fā)明多肽相關(guān)疾病的抗體治療。當(dāng)將獲得的抗體給予人體(抗體治療)時，優(yōu)選人抗體或人源化抗體以降低免疫原性。
例如，用選自多肽，表達多肽的細胞或其裂解物的抗原來免疫具有人抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動物。然后從該動物收集產(chǎn)生抗體的細胞，將其與骨髓瘤細胞融合獲得雜交瘤，從該雜交瘤制備抗所述多肽的人抗體(參見WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。
或者，用癌基因使產(chǎn)生抗體的免疫細胞如經(jīng)免疫的淋巴細胞永生化，用于制備單克隆抗體。
如此獲得的單克隆抗體也可以利用基因工程技術(shù)通過重組方法制備(參見，如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可從免疫細胞，如產(chǎn)生抗體的雜交瘤或經(jīng)免疫的淋巴細胞來克隆編碼該抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，并轉(zhuǎn)入宿主細胞制備重組抗體。本發(fā)明還提供了如上所述制備的重組抗體。
另外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或修飾的抗體，只要它結(jié)合一或多種本發(fā)明的多肽。例如，所述抗體片段可以是Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或單鏈Fv(scFv)，其中H鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接(Huston等，Proc NatlAcad Sci USA 855879-83(1988))。更具體地，抗體片段可用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體而生成?；蛘呖蓸?gòu)建編碼該抗體片段的基因，將其插入合適的表達載體，并在適合的宿主細胞中表達(參見，如Co等，JImmunol 1522968-76(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol 178476-96(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121652-63(1986)；Rousseaux等，MethodsEnzymol 121663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9132-7(1991))。
抗體可通過與各種分子，如聚乙二醇(PEG)連接進行修飾。本發(fā)明提供了這種修飾的抗體。也可通過化學(xué)修飾抗體而獲得修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的。
或者，本發(fā)明的抗體可作為嵌合抗體而獲得，所述嵌合抗體可變區(qū)來自非人抗體而恒定區(qū)來自人抗體；或者作為人源化抗體而獲得，所述人源化抗體包括來自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)，來自人抗體的框架區(qū)(FR)以及恒定區(qū)。通過利用已知技術(shù)制備這種抗體。
如上所述獲得的抗體可以純化成均質(zhì)的。例如，以用于普通蛋白的分離純化方法進行抗體的分離純化。例如，抗體可通過適當(dāng)?shù)剡x擇并聯(lián)合使用柱層析來分離及純化，所述層析諸如親和層析，過濾，超濾，鹽析，透析，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及等電聚焦(AntibodiesA Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))等，但不限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可用作親和柱?？衫玫氖纠缘鞍譇柱包括，如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了親和層析，層析的實例還包括，如離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾，反相層析，吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。層析過程可以通過液相層析諸如HPLC和FPLC等實施。
例如，通過測定吸光度，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，酶免疫分析(EIA)，放射免疫分析(RIA)和/或免疫熒光來測定本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。ELISA中，本發(fā)明的抗體固定在平板上，本發(fā)明的多肽施加于平板上，然后施加含有所需抗體的樣品(諸如產(chǎn)生抗體的細胞的培養(yǎng)上清或純化的抗體)。接著施加識別第一抗體并用酶諸如堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，溫育所述平板。洗滌后，向平板添加酶底物如磷酸對硝基苯酯，測定吸光度以評價樣品的抗原結(jié)合活性。多肽片段，如C末端或N末端片段也可用作抗原來評價抗體的結(jié)合活性。根據(jù)本發(fā)明，可用BIAcore(Pharmacia)評價抗體的活性。
上述方法可以檢測或測定本發(fā)明的多肽，這是通過將本發(fā)明的抗體暴露于假設(shè)含有本發(fā)明多肽的樣品，檢測或測定抗體和多肽形成的免疫復(fù)合物。
因為本發(fā)明所述的檢測或測量多肽的方法可以特異性的檢測或測量多肽，所以該方法能用于各種使用了多肽的實驗。
本發(fā)明還提供了與編碼人RHBDF1蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO15)或其互補鏈互補且包括至少15個核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選與編碼本發(fā)明多肽的DNA特異性雜交的多核苷酸。本文術(shù)語“特異性雜交”指在通常的雜交條件、優(yōu)選嚴謹雜交條件下，與編碼其它蛋白的DNA不發(fā)生明顯的交叉雜交。這種多核苷酸包括探針，引物，核苷酸及核苷酸衍生物(例如，反義寡核苷酸和核酶)，它們與編碼本發(fā)明多肽的DNA或其互補鏈特異性雜交。而且，這種多核苷酸可用于制備DNA陣列。
本發(fā)明包括與SEQ ID NO15的核苷酸序列的任意位點雜交的反義寡核苷酸。該反義寡核苷酸優(yōu)選針對SEQ ID NO15的核苷酸序列的至少15個連續(xù)的核苷酸。在上述至少15個連續(xù)的核苷酸中包含起始密碼子的上述反義寡核苷酸是更優(yōu)選的。更具體地，所述反義寡核苷酸包括含有SEQ IDNO11的核苷酸序列的寡核苷酸，其可抑制RHBDF1的表達。
反義寡核苷酸的衍生物或修飾的產(chǎn)物也可作為反義寡核苷酸。這種修飾的產(chǎn)物包括低級烷基膦酸鹽/酯修飾，如甲基膦酸鹽型或乙基膦酸鹽型，硫代磷酸酯(phosphorothioate)修飾以及氨基磷酸鹽(phosphoroamidate)修飾。
本文所用的術(shù)語“反義寡核苷酸”不僅指其中對應(yīng)于組成DNA或mRNA具體區(qū)域的核苷酸完全互補的寡核苷酸，還指包含一或多種錯配核苷酸的寡核苷酸，條件是所述DNA或mRNA以及反義寡核苷酸能特異性的與SEQ ID NO15的核苷酸序列雜交。
這種多核苷酸包括在“至少15個連續(xù)核苷酸序列區(qū)域”中有至少70％同或70％以上、優(yōu)選80％或80％以上、更優(yōu)選90％或90％以上、甚至最優(yōu)選95％或95％以上同源性的多核苷酸。本文所述的運算規(guī)則可用于確定同源性。本領(lǐng)域中已知的運算規(guī)則也可用于確定同源性。這種反義多核苷酸可作為探針以分離或檢測編碼本發(fā)明多肽的DNA、或作為引物用于擴增。
本發(fā)明反義寡核苷酸的衍生物通過與編碼多肽的DNA或mRNA結(jié)合作用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的細胞，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進所述mRNA的降解，抑制本發(fā)明多肽的表達，因此抑制所述多肽的功能。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物可通過與適宜的基質(zhì)(base)物質(zhì)混合而制成外用制劑，如涂敷膏藥或敷劑，所述基質(zhì)物質(zhì)對于該衍生物而言是無活性的。
同樣，如果需要，通過添加輔料，非離子試劑，助溶劑，穩(wěn)定劑，防腐劑，止痛藥等，所述衍生物可制成片劑，粉劑，顆粒劑，膠囊，脂質(zhì)膠囊，注射劑，溶液劑，滴鼻劑以及凍干劑。依照常規(guī)方法制備這些制劑。
所述反義寡核苷酸衍生物可通過直接施用在患病部位或通過將注射入血管使其到達患病部位而給藥患者。還可以使用封固劑以增加耐久性和膜通透性。封固劑的實例包括脂質(zhì)體，聚-L-賴氨酸，脂質(zhì)、膽固醇，脂轉(zhuǎn)染劑或其衍生物。
根據(jù)患者的情況適當(dāng)調(diào)整本發(fā)明反義寡核苷酸衍生物的劑量并以所需用量使用。例如，給藥劑量范圍為0.1至100mg/kg，優(yōu)選0.1至50mg/kg。
本發(fā)明還包括小干擾RNA(siRNA)，其含有SEQ ID NO15核苷酸序列的有義核酸鏈和反義核酸鏈的組合。更具體地，這種抑制RHBDF1表達的siRNA包括其有義鏈含有SEQ ID NO13的核苷酸序列的siRNA。
術(shù)語“siRNA”指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。用于將siRNA導(dǎo)入宿主細胞的標(biāo)準技術(shù)包括以DNA作為模板進行RNA轉(zhuǎn)錄的方法。所述siRNA包含編碼人RHBDF1蛋白(SEQ ID NO15)的多核苷酸的有義核酸序列和反義核酸序列。所述siRNA被構(gòu)建成單個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有來自靶基因例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的的有義序列和互補反義序列。
所述方法用于改變細胞的基因表達，即上調(diào)RHBDF1多肽的表達，例如作為細胞惡性轉(zhuǎn)化的結(jié)果。siRNA與靶細胞中RHBDF1轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合導(dǎo)致該細胞的蛋白生成減少。所述寡核苷酸的長度是至少10個核苷酸，也可能與天然轉(zhuǎn)錄物一樣長。優(yōu)選，所述寡核苷酸有19-25個核苷酸。更優(yōu)選，所述寡核苷酸的長度少于75，50，25個核苷酸。
用Ambion網(wǎng)站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)的siRNA設(shè)計程序設(shè)計siRNA的核苷酸序列。根據(jù)下述方案由計算機程序選擇siRNA的核苷酸序列siRNA靶位點的選擇1.從目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼開始，向下游掃描尋找AA雙核苷酸序列。記錄每個AA的出現(xiàn)，臨近3′的19個核苷酸作為可能的siRNA靶位點。Tuschl等反對針對5′和3′非翻譯區(qū)(UTR)和鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個堿基之內(nèi))設(shè)計siRNA，因為上述區(qū)域可能較為富含調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)結(jié)合位點。UTR結(jié)合蛋白質(zhì)和/或翻譯起始復(fù)合物可干擾與siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合的。
2.將所述潛在靶位與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，不考慮與其它編碼序列顯著同源的任何靶序列。利用BLAST進行同源搜索，BLAST可在NCBI服務(wù)器找到，網(wǎng)址是www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion，優(yōu)選沿該基因選擇數(shù)個靶序列進行評估。
本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA抑制本發(fā)明多肽的表達，因此可抑制本發(fā)明多肽的生物活性。同樣，含有本發(fā)明反義寡核苷酸或siRNA的表達抑制劑可用于抑制本發(fā)明多肽的生物活性。因此，含有本發(fā)明反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療細胞增生性疾病，如癌癥。
本發(fā)明還提供一種利用本發(fā)明多肽的表達水平作為診斷標(biāo)志，診斷細胞增生性疾病的方法。
該診斷方法包括下述步驟(a)檢測本發(fā)明RHBDF1基因的表達水平；和(b)將表達水平的提高與細胞增生性疾病，如癌癥相聯(lián)系。
具體樣品中RHBDF1基因表達水平可以通過定量RHBDF1基因相應(yīng)的mRNA或RHBDF1基因編碼的蛋白來估計。mRNA的定量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，通過Northern印跡或RT-PCR估計RHBDF1基因相應(yīng)的mRNA的水平。因為RHBDF1基因的全長核苷酸序列如SEQ ID NO15所示，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員都能夠設(shè)計用于定量RHBDF1基因的探針或引物的核苷酸序列。
也可以根據(jù)該基因編碼的蛋白的活性或量來分析RHBDF1基因的表達水平。測定RHBDF1蛋白量的方法如下。例如，以免疫測定法檢測生物材料中的蛋白質(zhì)。任何生物材料都可用于進行蛋白或其活性的測定。例如，可分析血液樣品來評估血清標(biāo)記所編碼的蛋白。另一方面，應(yīng)根據(jù)要分析的蛋白的活性選擇合適的方法來測定RHBDF1基因編碼的蛋白的活性。
評估樣品(受試樣品)中RHBDF1基因的表達水平，并將其與正常樣品中該基因的表達水平進行比較。當(dāng)這種比較顯示靶基因的表達水平高于正常樣品中的所述表達水平時，則判斷該受試者患細胞增生性疾病。可以在同一時間確定來自正常樣品和受試樣品中RHBDF1基因的表達水平。或者可通過統(tǒng)計方法確定表達水平的正常范圍，所述方法基于分析先前從對照組收集的樣品的基因表達水平所得的結(jié)果。對檢測受試樣品所得結(jié)果與正常范圍進行比較，如果該結(jié)果沒有落入正常范圍，則判斷該受試者患有細胞增生性疾病。本發(fā)明中，優(yōu)選待診斷的細胞增生性疾病為癌癥。更優(yōu)選，當(dāng)RHBDF1基因的表達水平被估計并與正常樣品中的相比較時，所述細胞增生性疾病被診斷為CML，AML或肺腺癌之一。
本發(fā)明也提供了診斷細胞增生性疾病，如CML，AML或肺腺癌的診斷試劑。本發(fā)明的診斷試劑包括與本發(fā)明多核苷酸或多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選，將與本發(fā)明多核苷酸雜交的寡核苷酸或與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體用作這樣的化合物。
因此，本發(fā)明提供了一種利用本發(fā)明多肽篩選治療細胞增生性疾病的化合物的方法。這種篩選方法的一個實實施方案包括以下步驟(a)將受試化合物與本發(fā)明多肽接觸；(b)檢測本發(fā)明多肽與受試化合物的結(jié)合活性；和(c)選擇與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。
用于篩選的本發(fā)明多肽可以是重組多肽或衍生自天然的蛋白或其部分肽。任何受試化合物，例如，細胞提取物，細胞培養(yǎng)上清液，微生物發(fā)酵產(chǎn)物，海洋生物提取物，植物提取物，純化的或粗制的蛋白，肽，非肽化合物，合成的小分子化合物以及天然化合物都可用。與受試化合物接觸的本發(fā)明多肽可以是，例如純化的多肽，可溶性蛋白，與載體結(jié)合的形式或與其它多肽融合的融合蛋白。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法都可作為利用本發(fā)明多肽篩選例如與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的方法。這種篩選通過，例如免疫沉淀方法進行，具體地以下述方式進行。將編碼本發(fā)明多肽的基因插入外源基因表達載體諸如pSV2neo，pcDNAI和pCD8等，在動物細胞等中表達所述基因。用于表達的啟動子是通常使用的任意啟動子，包括，例如SV40早期啟動子(Rigbyin Williamson(ed.)，Genetic Engineering，Vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-1α啟動子(Kim等，Gene 91217-23(1990))，CAG啟動子(Niwa等，Gene 108193-200(1991))，RSV LTR啟動子(Cullen，Methods inEnzymology 152684-704(1987))，SRα啟動子(Takebe等，Mol Cell Biol 8466(1988))，CMV立即早期啟動子(Seed and Aruffo，Proc Natl Acad Sci USA843365-9(1987))，SV40晚期啟動子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1385-94(1982))，腺病毒晚期啟動子(Kaufman等，Mol Cell Biol 9946(1989))，HSV TK啟動子等等。將基因?qū)雱游锛毎员磉_外源基因可采用任意方法，例如電穿孔法(Chu等，Nucleic Acids Res 151311-26(1987))，磷酸鈣法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 72745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopata等，Nucleic Acids Res 125707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol41642-3(1985))，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Derijard，B Cell 71025-37(1994)；Lamb等，Nature Genetics 522-30(1993)Rabindran等，Science 259230-4(1993))等等。本發(fā)明多肽也以融合蛋白的形式表達，所述融合蛋白包含單克隆抗體識別位點(表位)，所述位點通過將特異性已知的單克隆抗體的表位導(dǎo)入本發(fā)明多肽的N-或C-末端獲得?？衫每少彽玫谋砦?抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine 1385-90(1995))。利用其多克隆位點表達與，例如β-半乳糖苷酶，麥芽糖結(jié)合蛋白，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，綠色熒光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白的載體是可購得的。
還報道了通過僅導(dǎo)入小表位而制備的融合蛋白，該小抗原表位包含幾個至十幾個氨基酸因而并不改變本發(fā)明融合多肽的性質(zhì)。表位，如聚組氨酸(His-標(biāo)記)，流感凝集素HA，人c-myc，F(xiàn)LAG，水泡性口膜炎病毒(Vesicularstomatitis virus)糖蛋白(VSV-GP)，T7基因10蛋白(T7-標(biāo)記)，人單純皰疹病毒(simple herpes virus)糖蛋白(HSV-標(biāo)記)，E-標(biāo)記(單克隆噬菌體的表位)等，以及識別它們的單克隆抗體都可以作為表位-抗體系統(tǒng)來篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白(Experimental Medicine 1385-90(1995))。
免疫沉淀法中，通過在用合適的洗滌劑制備的細胞裂解物中添加這些抗體形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物含有本發(fā)明的多肽，具有與所述多肽結(jié)合的能力的多肽以及抗體。除了使用如上所述制備的、針對上述表位的抗體，免疫沉淀法中還可以使用抗本發(fā)明多肽的抗體實施。
當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體時，可例如用蛋白A瓊脂糖或蛋白G瓊脂糖沉淀免疫復(fù)合物。如果本發(fā)明多肽制備成與表位如GST融合的融合蛋白形式，使用與這些抗原表位特異性結(jié)合的物質(zhì)諸如谷胱甘肽瓊脂糖4B等形成免疫復(fù)合物的方式可與使用抗本發(fā)明多肽的抗體時一樣。
免疫沉淀法可根據(jù)例如文獻記載的方法進行(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。
SDS-PAGE經(jīng)常用來分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白，并且以合適濃度的凝膠根據(jù)蛋白的分子量也可以分析結(jié)合蛋白。因為與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白很難用普通染色方法如考馬斯染色或銀染來檢測，該蛋白的檢測靈敏度可如下改進用含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，標(biāo)記細胞中的蛋白并檢測該蛋白。當(dāng)?shù)鞍椎姆肿恿恳阎獣r，靶蛋白可以經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳直接純化并確定其序列。
例如West-Western印跡分析(Skolnik等，Cell6583-90(1991))可作為利用多肽篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的方法。具體地，與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白可如下獲得從細胞，組織，器官(例如，氣管，甲狀腺，脊髓，前列腺，骨骼肌或胎盤)，或者培養(yǎng)的細胞制備cDNA文庫，其中預(yù)計利用噬菌體載體(如ZAP)表達與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白；在LB瓊脂糖中表達蛋白；將表達的蛋白固定在濾膜上；經(jīng)純化和標(biāo)記的本發(fā)明多肽與上述濾膜反應(yīng)；根據(jù)標(biāo)記檢測表達與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的噬斑。本發(fā)明多肽的標(biāo)記可利用生物素和抗生物素蛋白之間的結(jié)合，或利用特異性與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體，或與本發(fā)明多肽融合的肽或多肽(如GST)。也可以采用放射性同位素或熒光法等方法。
或者，本發(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，采用了利用細胞的雙雜交系統(tǒng)(two-hybrid system)(“MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)”，“哺乳動物MATCHMAKER雙雜交試驗試劑盒”，“MATCHMAKER單雜交(one-hybrid)系統(tǒng)”(Clontech)；“HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)”(Stra標(biāo)記ene)；參考文獻“Dalton and Treisman，Cell68597-612(1992)”，“Fields and Stemglanz，TrendsGenet 10286-92(1994)”)。
雙雜交系統(tǒng)中，本發(fā)明多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合并在酵母細胞中表達。從預(yù)計表達與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的細胞中制備cDNA文庫，使得當(dāng)所述文庫表達時，即與VP16或GAL4的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后將該cDNA文庫導(dǎo)入上述酵母細胞，從檢測的陽性克隆中分離來自該文庫的cDNA(當(dāng)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白在酵母細胞中表達時，兩者的結(jié)合激活報告基因，使得陽性克隆可以檢測到)。將上述分離的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌并表達該蛋白從而制備該cDNA編碼的蛋白。
除了HIS3基因，例如Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，螢光素酶基因等也可用作報告基因。
與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物也可利用親和層析進行篩選。例如，將本發(fā)明多肽固定在親和層析柱的載體上，并將含有能與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的受試化合物施加于層析柱。本文的受試化合物可以是，例如細胞提取物，細胞裂解物等。裝載該受試化合物后，洗滌柱，制備與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。
當(dāng)受試化合物是蛋白質(zhì)時，分析所得蛋白的氨基酸序列，根據(jù)該序列合成寡DNA，用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫獲得編碼該蛋白的DNA。
利用表面胞質(zhì)團共振現(xiàn)象的生物傳感器可作為檢測或定量本發(fā)明結(jié)合的化合物的一種方法。當(dāng)使用這種生物傳感器時，本發(fā)明多肽和受試化合物之間的相互作用可作為表面胞質(zhì)團共振信號而被實時觀察，僅僅使用極少量的多肽并且不需要標(biāo)記(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能利用生物傳感器如BIAcore評估本發(fā)明多肽和受試分子之間的結(jié)合。
篩選當(dāng)本發(fā)明固定化的多肽暴露于合成化合物、或天然物質(zhì)庫、或隨機噬菌體肽展示文庫時發(fā)生結(jié)合的分子的方法，或根據(jù)組合化學(xué)技術(shù)(Wrighton等，Science 273458-64(1996)；Verdine，Nature 38411-13(1996)；Hogan，Nature 38417-9(1996))利用高通量以分離與本發(fā)明蛋白(包括激動劑和拮抗劑)結(jié)合的蛋白及化合物的篩選方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
另外，本發(fā)明的篩選方法可包括以下步驟a)使受試化合物與導(dǎo)入了載體的細胞接觸，該載體含有一或多種標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)以及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報道基因，其中所述標(biāo)記基因包含SEQ ID NO15的核苷酸序列，b)測定所述報道基因的活性；和
c)選擇降低所述報道基因表達水平的化合物，所述降低是與在缺乏所述受試化合物時檢測到的所述報道基因的表達水平相比。
適宜的報道基因和宿主細胞是本領(lǐng)域中所眾所周知的。篩選所需的報告物構(gòu)建體可通過使用標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來制備。當(dāng)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知時，報告物構(gòu)建體可通過使用已知序列信息來制備。如果標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)未被鑒定，包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸片段可從基于該標(biāo)記基因的核苷酸序列信息的基因組文庫中分離。
通過所述篩選分離的化合物是促進或抑制本發(fā)明多肽活性的候選物，其用于治療或預(yù)防由于例如細胞增生性疾病諸如癌癥造成的疾病。由本發(fā)明篩選方法獲得的化合物還包括這樣的化合物，其中由本發(fā)明篩選方法獲得的化合物的部分結(jié)構(gòu)經(jīng)添加，缺失和/或取代修飾而改變。
另一實施方案中，本發(fā)明提供篩選候選藥劑的方法，所述候選藥劑為細胞增生性疾病治療中的潛在靶。如上所述，通過控制RHBDF1表達水平，可控制CML，AML或肺腺癌的開始和進展。因此，作為細胞增生性疾病治療中的潛在靶的候選藥劑可通過利用RHBDF1表達水平和活性作為指示物進行篩選來鑒定。本文中，所述篩選可包括例如以下步驟a)將候選化合物與表達RHBDF1的細胞接觸；和b)選擇降低RHBDF1表達水平的化合物，所述降低與缺乏受試化合物時檢測到的RHBDF1表達水平相比。
表達至少一種RHBDF1的細胞包括例如，從CML，AML，以及肺腺癌建立的細胞系；所述細胞可用于本發(fā)明上述篩選中。所述表達水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法估計。篩選方法中，降低至少一種RHBDF1表達水平的化合物可選為候選藥劑。
篩選治療本發(fā)明細胞增生性疾病的化合物的方法的另一實施方案中，該方法利用本發(fā)明多肽的生物活性作為指示物。由于本發(fā)明的RHBDF1蛋白具有促進細胞增殖的活性，促進或抑制本發(fā)明蛋白之一的活性的化合物可利用該活性為指標(biāo)進行篩選。該篩選方法包括以下步驟(a)將受試化合物與本發(fā)明的多肽接觸；(b)檢測步驟(a)的多肽的活性；和(c)選出與選擇與缺乏受試化合物時檢測到的所述多肽活性相比抑制所述多肽生物活性的化合物。
任何包含RHBDF1蛋白的生物活性的多肽都可用于篩選。所述生物活性包括人RHBDF1蛋白的細胞增殖活性。
可以使用任何受試化合物，例如，細胞提取物，細胞培養(yǎng)上清，微生物發(fā)酵產(chǎn)物，海洋生物提取物，植物提取物，純化的或粗制蛋白質(zhì)，肽，非肽化合物，合成小分子化合物和天然化合物。
通過這種篩選分離的化合物是本發(fā)明多肽的激動劑或拮抗劑。術(shù)語“激動劑“指通過與本發(fā)明多肽結(jié)合活化其功能的分子。同樣，“拮抗劑”指通過與本發(fā)明多肽結(jié)合抑制其功能的分子。而且，通過這種篩選分離的化合物是抑制本發(fā)明多肽與分子(包括DNA和蛋白質(zhì))在體內(nèi)相互作用的候選化合物。
當(dāng)本發(fā)明方法中所檢測的生物活性是細胞增殖作用時，可例如如下進行檢測例如通過制備表達本發(fā)明多肽的細胞，在存在受試化合物的情況下培養(yǎng)所述細胞，測定細胞增殖速度，測量細胞周期等，以及如實施例所述測定集落形成活性。
通過上述篩選而分離的化合物是藥物的候補物，所述藥物抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性，且可用于治療或預(yù)防與本發(fā)明多肽相關(guān)的疾病，例如細胞增生性疾病包括癌癥。更具體地，當(dāng)RHBDF1蛋白的生物活性用作指標(biāo)時，通過本發(fā)明方法篩選的化合物可作為治療CML，AML，肺腺癌的候選藥物。
此外，可由本發(fā)明篩選方法獲得的化合物還包括這樣的化合物，其中該化合物中能夠抑制RHBDF1蛋白質(zhì)的活性的部分結(jié)構(gòu)經(jīng)添加，缺失和/或取代修飾而改變。
當(dāng)通過本發(fā)明篩選方法分離的化合物作為藥物而施用于人類或其它哺乳動物諸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、貓、犬、綿羊、豬、牛、猴、狒狒以及猩猩來治療細胞增生性疾病(例如癌)時，該分離的化合物可被直接施用或可采用已知的藥物制備方法而被制成劑型。例如，根據(jù)需要，該藥物可作為糖衣片劑，膠囊劑，酏劑和微囊劑而口服，或以水或任何其它可藥用的液體的無菌溶液或懸浮液的注射液形式以非口服方式施用。例如，該化合物可與可藥用的載體或介質(zhì)以通常可接受的藥物制備方法所需的單位劑型進行混合，所述載體或介質(zhì)具體而言為無菌水，生理鹽水，植物油，乳化劑，懸浮劑，表面活性劑，穩(wěn)定劑，調(diào)味劑，賦形劑，載體，防腐劑，粘合劑等。這些制劑中活性成分的量為所述范圍內(nèi)的適宜劑量。
可混合至片劑和膠囊的添加劑的實例是，粘合劑諸如明膠，玉米淀粉，黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑諸如微晶纖維素；溶脹劑諸如玉米淀粉，明膠和海藻酸；潤滑劑諸如硬脂酸鎂；增甜劑諸如蔗糖，乳糖或糖精；以及調(diào)味劑諸如薄荷，Gaultheria adenothrix油和櫻桃紅(cherry)。當(dāng)單位劑型是膠囊時，液體載體諸如油，也可進一步包括在上述成份中。用于注射的無菌組合物可按照標(biāo)準的藥物制備方法采用載體諸如用于注射的蒸餾水進行制備。
生理鹽水，葡萄糖，以及包含佐劑諸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉的其它等張液可被用作注射用含水溶液。其可與適宜的增溶劑，諸如醇，具體地乙醇，多元醇諸如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，諸如聚山梨醇酯(Polysorbate)80(TM)和HCO-50聯(lián)合使用。
麻油或大豆油可用作油性液體，其可與以下物質(zhì)聯(lián)合使用用作增溶劑的苯甲酸芐酯或苯甲醇，可采用緩沖液諸如磷酸鹽緩沖液和醋酸鈉緩沖液進行配制；止痛藥，諸如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，諸如苯甲醇和苯酚；和抗氧化劑。可將制備的注射劑裝于適宜的安瓿中。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法將本發(fā)明的藥物組合物給藥患者，例如以動脈內(nèi)，靜脈內(nèi)，或經(jīng)皮注射的方式，也可以經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、經(jīng)肌內(nèi)或口服投藥。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重和年齡以及施用方法而改變；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地選擇適宜的施用方法。如果所述化合物可由DNA編碼，可將該DNA插入用于基因治療的載體中，并施用該載體來實施治療。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重，年齡和癥狀而改變但本領(lǐng)域技術(shù)人員能適當(dāng)?shù)貙ζ溥M行選擇。
例如，不同癥狀適宜的劑量不同，但經(jīng)口服施用于正常成年受試者(體重60kg)時，與本發(fā)明多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物的劑量為約0.1mg-約100mg/日，優(yōu)選約1.0mg-約50mg/日且更優(yōu)選約1.0mg-約20mg/日。
當(dāng)經(jīng)胃腸外以注射劑方式施用于正常成年受試者(體重60kg)時，雖然根據(jù)患者、靶器官、癥狀和施用方法而存在一些差異，適于靜脈內(nèi)注射的劑量是約0.01mg-約30mg/日，優(yōu)選約0.1-約20mg/日且更優(yōu)選約0.1-約10mg/日。而且，當(dāng)用于其它動物時，可以施用按60kg體重轉(zhuǎn)換的量。
另外，本發(fā)明提供了一種用抗本發(fā)明多肽的抗體治療或預(yù)防細胞增生性疾病，諸如癌的方法。根據(jù)該方法，給予藥物有效量的抗本發(fā)明多肽的抗體。因為癌細胞中RHBDF1蛋白的表達上調(diào)，并且抑制這些蛋白的表達能降低細胞增殖活性，所以預(yù)計將所述抗體與這些蛋白結(jié)合可以治療或預(yù)防細胞增生性疾病。因此，抗本發(fā)明多肽的抗體以足以降低本發(fā)明蛋白的活性的劑量給予，該劑量是約3至2000mg/天(60kg體重)。例如，盡管根據(jù)癥狀會有一些差異，對于正常成年人(60kg體重)而言與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體的劑量從約5mg至約1000mg/天，優(yōu)選約10mg至約500mg/天。
另外，用與腫瘤細胞特異性細胞表面標(biāo)志物結(jié)合的抗體作為藥物遞送工具。例如，以足以殺傷腫瘤細胞的劑量給予與細胞毒藥劑偶聯(lián)的抗體。
本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，包括給予RHBDF1蛋白或其免疫活性片段，或編碼所述蛋白或其片段的多核苷酸的步驟。RHBDF1蛋白或其免疫活性片段可用作抗細胞增生性疾病諸如癌等的疫苗。一些情況中，蛋白或其片段以結(jié)合于T細胞受體(TCR)的形式或由抗原呈遞細胞(APC)如巨噬細胞，樹突細胞(DC)或B細胞呈遞的形式給予。由于DC細胞的強抗原呈遞活性，APC中最優(yōu)選使用DC細胞。
本發(fā)明中，抗細胞增生性疾病的疫苗指具有一經(jīng)接種到動物便具有抗腫瘤免疫的物質(zhì)。通常，抗腫瘤免疫包括下述免疫反應(yīng)-誘導(dǎo)抗腫瘤的細胞毒淋巴細胞，-誘導(dǎo)識別腫瘤的抗體，和-誘導(dǎo)抗腫瘤細胞因子的產(chǎn)生。
因此，當(dāng)某種蛋白在接種動物中誘導(dǎo)這些免疫反應(yīng)的任意一種時，則確定該蛋白具備抗腫瘤免疫誘導(dǎo)效應(yīng)。通過在體內(nèi)或體外觀察宿主免疫系統(tǒng)對蛋白的反應(yīng)檢測蛋白對抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)。
例如，檢測誘導(dǎo)細胞毒T淋巴細胞的方法是已知的。進入活體的外來物質(zhì)經(jīng)過抗原呈遞細胞(APC)的作用呈遞到T細胞和B細胞。對APC以抗原特異性方式呈遞的抗原有反應(yīng)的T細胞由于受到該抗原的刺激，分化成細胞毒T細胞(或細胞毒T淋巴細胞，CTL)，隨后進行增殖(本文中稱為T細胞激活)。因此，具體肽對CTL的誘導(dǎo)可通過由APC將肽呈遞到T細胞來評估，并檢測對CTL的誘導(dǎo)。另外，APC能激活CD4+T細胞，CD8+T細胞，巨噬細胞，嗜酸性粒細胞和NK細胞。因為CD4+T細胞和CD8+T細胞對抗腫瘤免疫也很重要，所以肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用可利用這些細胞的活化效應(yīng)作為指示物進行評價。
用樹突細胞(DC)作為APC評價對CTL的誘導(dǎo)作用的方法是本領(lǐng)域已知的。DC是一種代表性APC，它的CTL誘導(dǎo)活性在APC中最強。在本方法中，受試多肽首先與DC接觸，然后該DC與T細胞接觸。與DC接觸后若檢測到T細胞對感興趣的細胞有細胞毒效應(yīng)，則說明受試多肽具有誘導(dǎo)細胞毒T細胞的活性。CTL的抗腫瘤活性可利用例如，51Cr-標(biāo)記的腫瘤細胞的溶解作為指示進行檢測?；蛘?，利用3H-胸苷吸收活性或LDH(乳糖脫氫酶)-釋放作為指示物，評價腫瘤細胞損傷程度的方法也是本領(lǐng)域已知的。
除了DC，外周血單核細胞(PBMC)也可作為APC。有報道當(dāng)存在GM-CSF和IL-4時培養(yǎng)PBMC能促進CTL的誘導(dǎo)。類似地，當(dāng)存在匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)和IL-7時培養(yǎng)PBMC也能誘導(dǎo)CTL。
經(jīng)這些方法證實具有CTL誘導(dǎo)活性的受試多肽是具備DC活化效應(yīng)以及隨后的CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，誘導(dǎo)抗腫瘤細胞CTL的多肽可用作抗腫瘤的疫苗。另外，通過與該多肽接觸而獲得了誘導(dǎo)抗腫瘤CTL能力的APC也可用作抗腫瘤的疫苗。此外，由于APC對多肽抗原的呈遞而獲得了細胞毒性的CTL也可作為抗腫瘤的疫苗。這種利用由APC和CTL造成的抗腫瘤免疫治療腫瘤的方法稱作細胞免疫療法。
通常，當(dāng)使用多肽進行細胞免疫療法時，已知聯(lián)合使用具有不同結(jié)構(gòu)的多種多肽并將它們與DC接觸可以增加CTL誘導(dǎo)的效率。因此，當(dāng)用蛋白片段刺激DC時，使用多種類型片段的混合物是有利的。
或者，多肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用可通過觀察到誘導(dǎo)抗腫瘤抗體的產(chǎn)生而證實。例如，當(dāng)在用多肽免疫的實驗室動物中誘導(dǎo)了抗多肽的抗體時，以及腫瘤細胞的生長被這些抗體抑制時，則確定該多肽具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力。
通過給予本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，并且抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)使得可以治療和預(yù)防細胞增生性疾病諸如CML，AML或肺腺癌等。治療癌癥或預(yù)防癌癥發(fā)病包括下述任意步驟，諸如抑制癌性細胞的生長，癌癥的退化以及抑制癌癥的發(fā)生。降低癌癥患者受試者的死亡率，減少血液中的腫瘤標(biāo)志物，減輕伴隨癌癥的可檢測的癥狀等，都包括在治療或預(yù)防癌癥的效果中。這種治療或預(yù)防效果優(yōu)選是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。例如，在觀察中，顯著性水平是5％或更低時，將抗細胞增生性疾病的疫苗的治療或預(yù)防效果與不給予疫苗的對照組進行比較。如，Student’s t-檢驗，曼-惠特尼U-檢驗或ANOVA都可用來進行統(tǒng)計分析。
上述具有免疫活性的蛋白或編碼該蛋白的載體可與佐劑聯(lián)合。佐劑指當(dāng)與具有免疫活性的蛋白同時給予(或相繼給予)時，能促進針對該蛋白的免疫反應(yīng)的化合物。佐劑包括霍亂毒素，沙門氏菌毒素，鋁等，但并不限于這些。此外，本發(fā)明疫苗可與適當(dāng)?shù)目伤幱幂d體聯(lián)合。這種載體例如無菌水，生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，培養(yǎng)液等。而且，如果必要，疫苗可包含穩(wěn)定劑，混懸劑，防腐劑，表面活性劑等。疫苗全身性或局部給藥。給予疫苗可以是單次給藥或通過多次給藥進行強化。
當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗，可例如通過體外方法治療或預(yù)防腫瘤。更具體地，收集正接受治療或預(yù)防療法的受試者的PBMC，在離體條件下將該細胞與所述多肽接觸，誘導(dǎo)APC或CTL之后，再將該細胞給予受試者。也可通過在離體條件下將編碼所述多肽的載體導(dǎo)入PBMC從而誘導(dǎo)APC?？稍诮o藥之前克隆在體外誘導(dǎo)的APC或CTL。通過克隆對靶細胞有高損傷活性的細胞并使其生長，細胞免疫療法可以更加有效地進行。另外，以這種方式分離的APC和CTL可用于細胞免疫療法，所述療法不僅針對所述細胞來源的受試者，也針對其它受試者相似類型的腫瘤。
另外，提供了治療和預(yù)防細胞增生性疾病，諸如癌等的藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的多肽。該藥物組合物可用于激發(fā)抗腫瘤免疫。正常的RHBDF1表達局限于睪丸，而PCOTH的表達局限于氣管，甲狀腺，脊髓，前列腺，骨骼肌或胎盤。因此，抑制這些基因的表達不會對其它器官造成不利影響。所以，優(yōu)選RHBDF1多肽用于治療細胞增生性疾病，具體為CML，AML或肺腺癌。
下述實施例用來解釋本發(fā)明，并幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實施本發(fā)明。所述實施例并不限制本發(fā)明的范圍。
除非另有定義，本文所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然與本文所述的相同或相似的方法和材料也可用來實施或驗證本發(fā)明，但適宜的方法和材料如下所述。本文引用的任何專利，專利申請和出版物都包含在本文作為參考。
本發(fā)明最佳實施方式通過下述實施例詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實施例。
材料和方法細胞系和臨床材料人白血病K562細胞得自Dr.M.Towatari(Nagoya Univ.，School of Med.，Nagoya，Japan)。人肺癌系A(chǔ)549，LC319和H522，以及小鼠成纖維細胞系NIH3T3購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC，Rockville，MD)。所有細胞均培養(yǎng)在適宜培養(yǎng)基中，即RPMI-1640(Sigma，St.Louis，MO)用于K562，A549，LC319和H522；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于NIH3T3，每種培養(yǎng)基都添加10％胎牛血清和1％抗生素/抗菌素溶液(Sigma)。細胞保持在37℃、含5％CO2潮濕空氣的環(huán)境中。急性髓細胞白血病和肺癌樣品獲自預(yù)先告知并征得同意的患者。
用cDNA微陣列分離人基因C6135已經(jīng)描述了cDNA微陣列載片的構(gòu)建(Ono等，2000，Cancer Res605007-11)。對于每一次表達分布圖的分析，本發(fā)明人制備了兩組相同的含23,040cDNA點的cDNA微陣列載片，以減小試驗波動。簡言之，從CML患者和健康志愿者的白細胞純化總RNA。進行基于T7的RNA擴增以獲得足夠的RNA進行微陣列試驗。從CML細胞和正常自愿者的等分試樣擴增的RNA分別用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP通過反轉(zhuǎn)錄進行標(biāo)記(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)。雜交，洗滌和檢測如前文所述進行(Kaneta等，2002 Jpn.J.Cancer Res.，93，849-856.)。隨后，在所有上調(diào)基因中，選擇內(nèi)部標(biāo)識號為C6135的基因。在提供信息的(informative)的CML病例中，超過60％的病例的C6135表達比大于5.0。
Northern-印跡分析C6135(所述微陣列上的基因)的[α32P]dCTP標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與人多個組織的Northern印跡(Clontech，Palo Alto，CA)雜交。該PCR產(chǎn)物是利用下述引物經(jīng)RT-PCR制備的5’-GTGCTCTTCCTCTTCACCTTTG-3’(SEQ.IDNO.1)和5’-GGTGGTCGTCAAGAAACAAGTTA-3’(SEQ.IDNO.2)。根據(jù)提供商的推薦進行預(yù)雜交，雜交和洗滌。在-80℃，所述印跡用增光屏放射自顯影9天。
半定量RT-PCR分析根據(jù)制造商的方案，用TRIzol試劑(Invitrogen)從培養(yǎng)細胞和臨床樣品提取總RNA。提取的RNA用DNAeI(Roche)處理，并用寡(dT)16引物和SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。適當(dāng)稀釋每種單鏈cDNA以進行隨后的PCR擴增，所述擴增是通過監(jiān)測作為定量對照的β-肌動蛋白(ACTB)進行的。引物序列是5’-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ.IDNO.3)和5’-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ.IDNO.4)用于ACTB；5’-GTGCTCTTCCTCTTCACCTTTG-3’(SEQ.IDNO.5)和5’-GGTGGTCGTCAAGAAACAAGTTA-3’(SEQ.IDNO.6)用于C6135；5’-GACAACTCACTCAAGATTGTCAG-3’(SEQ.IDNO.7)和5’-GATCCACGACGGACACATTG-3’(SEQ.ID.NO.8)用于GAPDH。所有反應(yīng)包括94℃初始變性2min，然后在94℃、30s，58℃、30s，72℃、1min進行21個循環(huán)(對ACTB和GAPDH)或30個循環(huán)(對C6135)，所述反應(yīng)均在GeneAmp PCR系統(tǒng)9700(PE Applied Biosystems)進行。
表達載體的構(gòu)建用下述引物經(jīng)RT-PCR擴增C6135cDNA的全長編碼序列C6135-正向(5’-CGGAATTCCGATGAGTGAGGCCCGCAGG-3’(SEQ.IDNO.9))和C6135-反向(5’-GGGGTACCCCAGTGGAGCTGAGCGTCCAG-3’(SEQ.IDNO.10))。所得產(chǎn)物被插入pcDNA3.1(-).myc.his(invitrogen)的EcoRI and KpnI位點，其攜帶巨細胞病毒(CMV)啟動子和賦予新霉素抗性的基因(pcDNA3.1(-)-C6135-myc-his)。通過DNA測序證實構(gòu)建體。
免疫細胞化學(xué)染色根據(jù)制造商的說明書，利用FuGENE6(Roche)以pcDNA3.1(-)-C6135-myc.his瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，隨后所述細胞隨后用4％低聚甲醛固定，并在室溫用含0.2％Triton X-100的PBS通透化3min。接著，室溫用封閉液(含0.2％Triton X-100的3％BSA/PBS)覆蓋所述細胞30min，并在室溫、封閉液中與兔抗myc抗體(Santa Cruz Biotechnology)和小鼠單克隆抗-高爾基體(Golgi)58K蛋白(Sigma)共同溫育60min。用PBS洗滌后，細胞用FITC-偶聯(lián)的抗兔第二抗體(Organon teknika)，若丹明偶聯(lián)的-抗小鼠第二抗體(ICN Biomedicals)以及4’，6’-聯(lián)脒(diamidine)-2’-苯基吲哚二氫氯化物(phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)(Roche)在室溫染色60min，然后用Nikon Eclips E800熒光顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)顯像。
生長實驗穩(wěn)定表達C6135的NIH3T3細胞(NIH3T3-C6135細胞)通過用pcDNA3.1(-)-C6135-myc.his質(zhì)粒利用FuGENE 6轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞建立。作為對照，空載體轉(zhuǎn)染的細胞(NIH3T3-載體細胞)也被亞克隆。NIH3T3-C6135和NIH3T3-載體細胞接種在6孔板(1×104細胞/孔)，且利用細胞計數(shù)試劑盒-8(Wako pure chemicals industries)根據(jù)生產(chǎn)商說明通過MTT實驗測定細胞增殖。
反義S-寡核苷酸對細胞生長的影響NIH3T3細胞鋪在24孔板(2×106細胞/孔)，并用C6135的相應(yīng)合成S-寡核苷酸(10mM)轉(zhuǎn)染所述細胞，保持在含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中48小時。MTT(3-(4，5-二甲基(dimethyl)-噻唑(thiazol)-2-基)-2，5-二苯基(diphenyl)-2H-四唑(tetrazolium)溴化物(bromide))實驗如其它部分所述按一式三份進行(Akashi等，2000.Int.J.Cancer，88，873-880.).S-寡核苷酸序列如下反義(5’-CTGTGTGATGGACGTCTG-3’(SEQ.IDNO.11))，反向(5’-GTCTGCAGGTAGTGTGTC-3’(SEQ.IDNO.12))。
RNAi對細胞生長的影響siRNA表達載體(psiH1BX)用于RNAi。H1啟動子克隆入基因特異性序列(來自靶轉(zhuǎn)錄物的19nt序列，通過短間隔物與其反向互補序列分開)上游，5個胸腺嘧啶作為終止信號，并且整合neo盒變?yōu)閷eneticin(Sigma)抵抗。RHBDF1和EGFP的靶序列分別為5’-GTACGTGCAGCAGGAGAAC-3’(SEQ.IDNO.13)以及5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ.IDNO.14)。人肺腺癌細胞系A(chǔ)549，H522和LC319鋪于10-cm皿(5×105細胞/皿)，并用含EGFP靶序列的psiH1BX，psiH1BX(psiH1BX-EGFP)以及含RHBDF1靶序列的psiH1BX(psiH1BX-RHBDF1)、利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)、根據(jù)生產(chǎn)商說明進行轉(zhuǎn)染。細胞通過500mg/ml Geneticin選擇一周，并用Giemsa溶液染色并進行MTT實驗。
結(jié)果鑒定RHBDF1為CML細胞中上調(diào)的基因利用代表23,040人基因的cDNA微陣列(Kaneta等，2002.Jpn.J.CancerRes.，93，849-856.)分析來自27CML患者的癌細胞的基因-表達分布圖，并鑒定了在CML細胞中通常上調(diào)的150種基因。其中，焦點集中在內(nèi)部編號為C6135的一種基因，其在超過60％CML患者中上調(diào)(圖1a)。C6135 cDNA由含開放閱讀框2568bp的2958核苷酸(SEQ.ID.NO.15)組成，其編碼推定的855氨基酸的蛋白質(zhì)(DNA序列獲自GenBank，登錄號NM022450)(SEQ.ID.NO.16)。利用BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中(National Center forBiotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)對預(yù)測的氨基酸序列以及蛋白進行的同源性搜索顯示，該蛋白質(zhì)與黑腹果蠅Rhomboid-5具有一定程度的同一性(39％氨基酸同一性)。SMART程序預(yù)測C6135蛋白質(zhì)含有C末端部分的7個跨膜結(jié)構(gòu)域組成的rhomboid結(jié)構(gòu)域，并提示其高爾基體定位。比較C6135蛋白質(zhì)與果蠅rhomboid家族還表明該家族成員中rhomboid結(jié)構(gòu)域高度保守(圖1b)。由此我們將該基因命名為RHBDF1，Rhomboid家族1(Drosophila)。如圖1c所示，來自這些序列的系統(tǒng)發(fā)生樹也表示RHBDF1與果蠅Rhomboid-5同源性最高。
利用RHBDF1 cDNA克隆作為探針的Northern印跡分析(圖2a)鑒定了3.1-kb轉(zhuǎn)錄物，其遍在表達但主要見于氣管、甲狀腺、脊髓、前列腺、骨骼肌或胎盤。為進一步研究RHBDF1蛋白質(zhì)的亞細胞定位，將表達RHBDF1蛋白質(zhì)(pcDNA3.1(-)-C6135-myc-his)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入NIH3T3細胞并進行免疫細胞化學(xué)染色。如圖2b所示，用抗-myc抗體在高爾基體觀察到RHBDF1蛋白質(zhì)。
RHBDF1對NIH3T3細胞生長的影響為說明RHBDF1潛在的致腫瘤作用，建立NIH3T3-RHBDF1細胞。通過將pcDNA3.1(-)-RHBDF1-myc-his轉(zhuǎn)染入NIH3T3細胞，NIH3T3-RHBDF1穩(wěn)定過表達RHBDF1，并通過半定量RT-PCR證實一些轉(zhuǎn)化物中的穩(wěn)定表達(圖3a)。隨后，為利用這些轉(zhuǎn)化的克隆研究RHBDF1表達對生長的影響，通過MTT實驗將其生長與用模擬(mock)轉(zhuǎn)染的對照細胞(NIH3T3-模擬細胞)進行比較。如圖3b所示，NIH3T3-RHBDF1細胞(#1，#2，and#3)與對照細胞相比生長速率明顯提高。這些結(jié)果被以一式三份在孔中進行的三次獨立實驗證實。該發(fā)現(xiàn)表明過表達RHBDF1的NIH3T3細胞具有生長優(yōu)勢。
設(shè)計為降低RHBDF1表達的反義S-寡核苷酸和小干擾RNA(siRNA)對生長抑制性影響為進一步評估RHBDF1的促生長作用，合成與部分RHBDF1序列相對應(yīng)的5種反義S-寡核苷酸并將其轉(zhuǎn)染入K562細胞，所述細胞過表達RHBDF1。轉(zhuǎn)染后48小時，提取mRNA并通過半定量RT-PCR檢測RHBDF1表達水平。所檢測的5種反義S-寡核苷酸中，一種(RHBDF1-AS1)與具有所述反義寡核苷酸的反向序列的對照寡核苷酸(RHBDF1-R1)相比顯著抑制RHBDF1表達(圖4a)。RHBDF1-AS1的生長抑制效應(yīng)通過利用MTT實驗證實，并證實與導(dǎo)入RHBDF1-R1相比，導(dǎo)入RHBDF1-AS1明確抑制K562細胞生長(圖4b)。
為進一步證實RHBDF1在K562CML細胞中的生長抑制作用，通過基于哺乳動物載體的RNA干擾(RNAi)技術(shù)(見材料和方法)敲除外源RHBDF1基因表達(圖4c)。psiH1BX-RHBDF1的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致表達降低，并導(dǎo)致生長抑制，這與利用反義S-寡核苷酸所得結(jié)果一致(圖4d)?？傊?，我們的發(fā)現(xiàn)表明RHBDF1在CML細胞中有致癌作用。
我們最近的表達分布圖表明，與各自的正常對照相比RHBDF1還在急性髓細胞白血病(AML)以及肺腺癌中明顯上調(diào)。隨后的半定量RT-PCR實驗鑒定了14AML樣品中的一半以上以及所有7個肺腺癌樣品中的RHBDF1表達增加(圖5a和5b)。因此，為研究RHBDF1在肺癌形成中的作用，在A549，LC319和H522，肺腺癌細胞系中通過基于哺乳動物載體的RNA干擾(RNAi)技術(shù)敲除RHBDF1表達并檢測對細胞生長的影響。如圖6a，6c和6e所示，導(dǎo)入psiH1BX-RHBDF1明顯降低RHBDF1在所有肺腺癌細胞系中的表達，并導(dǎo)致這些細胞的生長抑制，而用對照質(zhì)粒psiH1BX以及psiH1BX-GFPsiRNA表達載體轉(zhuǎn)染的細胞中沒有觀察到所述影響。為進一步確認psiH1BX-RHBDF1的基因-特異性生長降低作用，利用三種肺腺癌細胞系進行集落形成實驗。如圖6b，6d和6f，將psiH1BX-RHBDF1導(dǎo)入所述三種細胞系導(dǎo)致細胞生長明顯被抑制。此外，RHBDF1表達被抑制時，MTT實驗的結(jié)果還顯示生長抑制效應(yīng)(圖6g)。這些結(jié)果通過三次獨立實驗證實。
討論為全面研究致癌的詳細分子機制，我們試圖通過cDNA微陣列方法(代表23,040個轉(zhuǎn)錄物)獲得CML、急性髓細胞白血病(AML)和肺腺癌的癌細胞的全基因組表達分布圖(Kaneta等，2002，Jpn.J.Cancer Res.，93，849-856.；Okutsu等，2002.Mol.Cancer Ther.，1，1035-1042.；Kikuchi等，2003，Onco基因，22，2192-2205.)。在這些癌癥中上調(diào)的基因當(dāng)中，我們鑒定了RHBDF1基因(類似果蠅Rhomboid-5)，其很可能屬于Rhomboid家族。Rhomboid家族是最近分離的，并且其功能僅在有限數(shù)量的生物體和背景中顯示。其中，果蠅Rhomboid-1已經(jīng)被鑒定為膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶，其負責(zé)啟動果蠅表皮生長因子受體(EGFR)信號(Lee等，2001.Cell，107，161-171.；Urban等，2001.Cell，107，173-182.)。在果蠅中該途徑的活化通過三種跨膜EGFR配體前體Spitz，Keren和Gurken的選擇性蛋白水解來調(diào)節(jié)。在其跨膜形式中，這些配體是無活性的，并限制在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。在信號為陽性的細胞中，Star(2型膜蛋白)，將這些配體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出到高爾基體，在那里它們通過rhomboid膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶切割。所述切割釋出EGF配體結(jié)構(gòu)域并隨后分泌該結(jié)構(gòu)域，作為其它細胞的活化信號。Rhomboid的蛋白酶活性位點位于膜雙層中，且所述活化切割出現(xiàn)在配體跨膜結(jié)構(gòu)域中。該蛋白水解切割系統(tǒng)與其它已知生長因子相反，其利用細胞表面的金屬蛋白酶來釋放活性生長因子結(jié)構(gòu)域(Urban等，2002.Curr.Biol.，12，1507-1512.)。對于將近100種目前已知在進化中保守的rhomboid相關(guān)基因的功能知之甚少，但最近的研究表明來自病原細菌的Rhomboid參與群體感應(yīng)(quorum-sensing)因子的產(chǎn)生(Rather等，1994.J.Bacteriol.，176，5140-5144.；Gallio等，2000.Curr.Biol.，10，R693-694.)，提示Rhomboid相關(guān)的細胞內(nèi)信號機制在進化步驟中是保守的。
根據(jù)如上述最近對原核rhomboid的功能分析，可理解所有Rhomboid蛋白具有膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶功能。例如，果蠅Rhomboids 1-4具有相似的蛋白水解活性并且所有膜粘連的(membrane-tethered)配體是Rhomboid蛋白酶的底物(Lee等，2001.Cell，107，161-171.；Urban等，2002.EMBO J.，21，4277-4286.)。然而，雖然RHBDF1含有高度保守的rhomboid結(jié)構(gòu)域(圖1band 1c)，催化蛋白水解的絲氨酸蛋白酶必要殘基在該rhomboid結(jié)構(gòu)域中不是保守的。因此，研究RHBDF1蛋白是否具有對膜-粘連的EGF受體配體諸如Spitz進行蛋白水解的能力有很大興趣。需要其它對純化的RHBDF1蛋白的直接生化分析來回答上述問題。
我們的結(jié)果提示活化的RHBDF1作為癌基因起作用，基于穩(wěn)定RHBDF1表達增強細胞生長以及通過反義S-寡核苷酸或RNAi降低RHBDF1表達抑制CML和肺腺癌細胞的生長的事實。此外，免疫細胞化學(xué)染色提示RHBDF1與其它Rhomboid蛋白一樣位于高爾基器。這些發(fā)現(xiàn)提示，RHBDF1可具有其自己的靶底物，所述底物介導(dǎo)RHBDF1-依賴的信號，盡管所述靶分子目前還不明確。如果是這樣，鑒定RHBDF1底物可提供設(shè)計新抗癌藥物的新線索。
結(jié)論是，該研究證實了Rhomboid蛋白質(zhì)可能參與致癌。由于RHBDF1轉(zhuǎn)錄物的表達在正常成人組織中相對較低，RHBDF1本身可作為癌癥的新治療靶。
工業(yè)實用性新的人RHBDF1基因在CML和AML中的表達與在正常外周血細胞中的表達相比而言顯著提高。因此，這些基因可作為癌的診斷標(biāo)志物，其編碼的蛋白可用于癌的診斷試驗。
本發(fā)明人還指出新蛋白RHBDF1的表達促進細胞生長，而對應(yīng)于RHBDF1基因的反義寡核苷酸或小干擾RNA抑制細胞生長。這些發(fā)現(xiàn)證明每個RHBDF1蛋白都刺激致癌活性。因此，這些新的癌蛋白每個都是研制抗癌藥物的有用靶點。例如，阻斷RHBDF1表達或抑制其活性的的試劑可用作抗癌試劑，特別是用于治療CML，AML和肺腺癌。這種試劑的實例包括抗RHBDF1基因的反義寡核苷酸，小干擾RNA，以及識別RHBDF1的抗體。
已經(jīng)詳細描述了本發(fā)明并以具體實施例作為參考，不偏離本發(fā)明精神和范疇進行的各種改變和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
序列表<110>腫瘤療法科學(xué)股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO<120>與人髓細胞白血病相關(guān)的基因和多肽<130>ONC-A0213P2<150>US60/414,867<151>2002-09-30<160>16<170>PatentIn version3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>1gtgctcttcc tcttcacctt tg 22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>2ggtggtcgtc aagaaacaag tta 23<210>3<211>23<212>DNA<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>3catccacgaa actaccttca act 23<210>4<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>4tctccttaga gagaagtggg gtg 23<210>5<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>5gtgctcttcc tcttcacctt tg 22<210>6<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>6ggtggtcgtc aagaaacaag tta 23
<210>7<211>23<212>DNA<213>人工<220>
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<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>8gatccacgac ggacacattg 20<210>9<211>28<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>9cggaattccg atgagtgagg cccgcagg 28<210>10<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>10ggggtacccc agtggagctg agcgtccag29<210>11<211>18<212>DNA<213>人工<220>
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<223>SiRNA的靶序列<400>13gtacgtgcag caggagaac 19<210>14<211>19<212>DNA<213>人工
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<223>SiRNA的靶序列<400>14gaagcagcac gacttcttc 19<210>15<211>2958<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(111)..(2678)<223>
<400>15ctcggcgcgg gcgccctccc ggccagcggc ggcagcccct cctccccggc gccctcagga 60ccccccagag acccccggcg gcggcagcct gccttgctct gccaggaacc atg agt 116Met Ser1gag gcc cgc agg gac agc acg agc agc ctg cag cgc aag aag cca ccc 164Glu Ala Arg Arg Asp Ser Thr Ser Ser Leu Gln Arg Lys Lys Pro Pro5 10 15tgg cta aag ctg gac att ccc tct gcg gtg ccc ctg acg gca gaa gag 212Trp Leu Lys Leu Asp Ile Pro Ser Ala Val Pro Leu Thr Ala Glu Glu20 25 30ccc agc ttc ctg cag ccc ctg agg cga cag gct ttc ctg agg agt gtg 260Pro Ser Phe Leu Gln Pro Leu Arg Arg Gln Ala Phe Leu Arg Ser Val35 40 45 50agt atg cca gcc gag aca gcc cac atc tct tca ccc cac cat gag ctc 308Ser Met Pro Ala Glu Thr Ala His Ile Ser Ser Pro His His Glu Leu55 60 65cgg cgg ccg gtg ctg caa cgc cag acg tcc atc aca cag acc atc cgc 356Arg Arg Pro Val Leu Gln Arg Gln Thr Ser Ile Thr Gln Thr Ile Arg70 75 80
agg ggg acc gcc gac tgg ttt gga gtg agc aag gac agt gac agc acc404Arg Gly Thr Ala Asp Trp Phe Gly Val Ser Lys Asp Ser Asp Ser Thr85 90 95cag aaa tgg cag cgc aag agc atc cgt cac tgc agc cag cgc tac ggg452Gln Lys Trp Gln Arg Lys Ser Ile Arg His Cys Ser Gln Arg Tyr Gly100 105 110aag ctg aag ccc cag gtc ctc cgg gag ctg gac ctg ccc agc cag gac500Lys Leu Lys Pro Gln Val Leu Arg Glu Leu Asp Leu Pro Ser Gln Asp115 120 125 130aac gtg tcg ctg acc agc acc gag acg cca ccc cca ctc tac gtg ggg548Asn Val Ser Leu Thr Ser Thr Glu Thr Pro Pro Pro Leu Tyr Val Gly135 140 145cca tgc cag ctg ggc atg cag aag atc ata gac ccc ctg gcc cgt ggc596Pro Cys Gln Leu Gly Met Gln Lys Ile Ile Asp Pro Leu Ala Arg Gly150 155 160cgt gcc ttc cgt gtg gca gat gac act gcg gaa ggc ctg agt gcc cca644Arg Ala Phe Arg Val Ala Asp Asp Thr Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro165 170 175cac act ccc gtc acg ccg ggt gct gcc tcc ctc tgc tcc ttc tcc agc692His Thr Pro Val Thr Pro Gly Ala Ala Ser Leu Cys Ser Phe Ser Ser180 185 190tcc cgc tca ggt ttc cac cgg ctc ccg cgg cgg cgc aag cga gag tcg740Ser Arg Ser Gly Phe His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Lys Arg Glu Ser195 200 205 210gtg gcc aag atg agc ttc cgg gcg gcc gca gcg ctg atg aaa ggc cgc788Val Ala Lys Met Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ala Leu Met Lys Gly Arg215 220 225tcc gtt agg gat ggc acc ttt cgc cgg gca cgg cgt cga agc ttc act836Ser Val Arg Asp Gly Thr Phe Arg Arg Ala Arg Arg Arg Ser Phe Thr230 235 240cca gct agc ttt ctg gag gag gac aca act gat ttc ccc gat gag ctg884Pro Ala Ser Phe Leu Glu Glu Asp Thr Thr Asp Phe Pro Asp Glu Leu245 250 255
gac aca tcc ttc ttt gcc cgg gaa ggt atc ctc cat gaa gag ctg tcc 932Asp Thr Ser Phe Phe Ala Arg Glu Gly Ile Leu His Glu Glu Leu Ser260 265 270aca tac ccg gat gaa gtt ttc gag tcc cca tcg gag gca gcg cta aag 980Thr Tyr Pro Asp Glu Val Phe Glu Ser Pro Ser Glu Ala Ala Leu Lys275 280 285 290gac tgg gag aag gca ccg gag cag gcg gac ctc acc ggc ggg gcc ctg1028Asp Trp Glu Lys Ala Pro Glu Gln Ala Asp Leu Thr Gly Gly Ala Leu295 300 305gac cgc agc gag ctt gag cgc agc cac ctg atg ctg ccc ttg gag cga1076Asp Arg Ser Glu Leu Glu Arg Ser His Leu Met Leu Pro Leu Glu Arg310 315 320ggc tgg cgg aag cag aag gag ggc gcc gca gcc ccg cag ccc aag gtg1124Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Ala Ala Ala Pro Gln Pro Lys Val325 330 335cgg ctc cga cag gag gtg gtg agc acc gcg ggg ccg cga cgg ggc cag1172Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Thr Ala Gly Pro Arg Arg Gly Gln340 345 350cgt atc gcg gtg ccg gtg cgc aag ctc ttc gcc cgg gag aag cgg ccg1220Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe Ala Arg Glu Lys Arg Pro355 360 365 370tat ggg ctg ggc atg gtg gga cgg ctc acc aac cgc acc tac cgc aag1268Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr Asn Arg Thr Tyr Arg Lys375 380 385cgc atc gac agc ttc gtc aag cgc cag atc gag gac atg gac gac cac1316Arg Ile Asp Ser Phe Val Lys Arg Gln Ile Glu Asp Met Asp Asp His390 395 400agg ccc ttc ttc acc tac tgg ctt acc ttc gtg cac tcg ctc gtc acc1364Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Ser Leu Val Thr405 410 415atc cta gcc gtg tgc atc tat ggc atc gcg ccc gtg ggc ttc tcg cag1412Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly Phe Ser Gln420 425 430
cat gag acg gtg gac tcg gtg ctg cgg aac cgc ggg gtc tac gag aac1460His Glu Thr Val Asp Ser Val Leu Arg Asn Arg Gly Val Tyr Glu Asn435 440 445 450gtc aag tac gtg cag cag gag aac ttc tgg atc ggg ccc agc tcg gag1508Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly Pro Ser Ser Glu455 460 465gcc ctc atc cac ctg ggc gcc aag ttt tcg ccc tgc atg cgc cag gac1556Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Met Arg Gln Asp470 475 480ccg cag gtg cac agc ttc att cgc tcg gcg cgc gag cgc gag aag cac1604Pro Gln Val His Ser Phe Ile Arg Ser Ala Arg Glu Arg Glu Lys His485 490 495tcc gcc tgc tgc gtg cgc aac gac agg tcg ggc tgc gtg cag acc tcg1652Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser Gly Cys Val Gln Thr Ser500 505 510gag gag gag tgc tcg tcc acg ctg gca gtg tgg gtg aag tgg ccc atc1700Glu Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val Trp Val Lys Trp Pro Ile515 520 525 530cat ccc agc gcc cca gag ctt gcg ggc cac aag aga cag ttt ggc tct1748His Pro Ser Ala Pro Glu Leu Ala Gly His Lys Arg Gln Phe Gly Ser535 540 545gtc tgc cac cag gat ccc agg gtg tgt gat gag ccc tcc tcc gaa gac1796Val Cys His Gln Asp Pro Arg Val Cys Asp Glu Pro Ser Ser Glu Asp550 555 560cct cat gag tgg cca gaa gac atc acc aag tgg ccg atc tgc acc aaa1844Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile Cys Thr Lys565 570 575aac agc gct ggg aac cac acc aac cat ccc cac atg gac tgt gtc atc1892Asn Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro His Met Asp Cys Val Ile580 585 590aca gga cgg ccc tgc tgc att ggc acc aag ggc agg tgt gag atc acc1940Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys Gly Arg Cys Glu Ile Thr595 600 605 610
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ttg ccc tac atc agc ttt ggc aag ttc gac ctg tac cgg aaa cgc tgc 2516Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp Leu Tyr Arg Lys Arg Cys790 795 800cag atc atc atc ttt cag gtg gtc ttc ctg ggc ctc ctg gct ggc ctg 2564Gln Ile Ile Ile Phe Gln Val Val Phe Leu Gly Leu Leu Ala Gly Leu805 810 815gtg gtc ctc ttc tac gtc tat cct gtc cgc tgt gag tgg tgt gag ttc 2612Val Val Leu Phe Tyr Val Tyr Pro Val Arg Cys Glu Trp Cys Glu Phe820 825 830ctc acc tgc atc ccc ttc act gac aag ttc tgt gag aag tac gaa ctg 2660Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe Cys Glu Lys Tyr Glu Leu835 840 845 850gac gct cag ctc cac tga gctggctgcg ggctccagcg gccgtgtgct2708Asp Ala Gln Leu His855ccagcaggcc agagccagac acgacctccc tgagcctcac aggcttacag gagtcacctg 2768ctccatgtgg ggactggcct gtttcctgaa cacagacctc tttcttgtgc cttgttcact 2828tctgttgaac ccctcgtact gccgggcatt tattatacta cttcctgtca taaccttcta 2888acttgtttct tgacgaccac ctcatgtggc caataaatgg actgggagcg ttttagctgc 2948cattaacttg 2958<210>16<211>855<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>16Met Ser Glu Ala Arg Arg Asp Ser Thr Ser Ser Leu Gln Arg Lys Lys1 5 10 15Pro Pro Trp Leu Lys Leu Asp Ile Pro Ser Ala Val Pro Leu Thr Ala20 25 30
Glu Glu Pro Ser Phe Leu Gln Pro Leu Arg Arg Gln Ala Phe Leu Arg35 40 45Ser Val Ser Met Pro Ala Glu Thr Ala His Ile Ser Ser Pro His His50 55 60Glu Leu Arg Arg Pro Val Leu Gln Arg Gln Thr Ser Ile Thr Gln Thr65 70 75 80Ile Arg Arg Gly Thr Ala Asp Trp Phe Gly Val Ser Lys Asp Ser Asp85 90 95Ser Thr Gln Lys Trp Gln Arg Lys Ser Ile Arg His Cys Ser Gln Arg100 105 110Tyr Gly Lys Leu Lys Pro Gln Val Leu Arg Glu Leu Asp Leu Pro Ser115 120 125Gln Asp Asn Val Ser Leu Thr Ser Thr Glu Thr Pro Pro Pro Leu Tyr130 135 140Val Gly Pro Cys Gln Leu Gly Met Gln Lys Ile Ile Asp Pro Leu Ala145 150 155 160Arg Gly Arg Ala Phe Arg Val Ala Asp Asp Thr Ala Glu Gly Leu Ser165 170 175Ala Pro His Thr Pro Val Thr Pro Gly Ala Ala Ser Leu Cys Ser Phe180 185 190Ser Ser Ser Arg Ser Gly Phe His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Lys Arg195 200 205Glu Ser Val Ala Lys Met Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ala Leu Met Lys210 215 220Gly Arg Ser Val Arg Asp Gly Thr Phe Arg Arg Ala Arg Arg Arg Ser225 230 235 240Phe Thr Pro Ala Ser Phe Leu Glu Glu Asp Thr Thr Asp Phe Pro Asp245 250 255Glu Leu Asp Thr Ser Phe Phe Ala Arg Glu Gly Ile Leu His Glu Glu260 265 270
Leu Ser Thr Tyr Pro Asp Glu Val Phe Glu Ser Pro Ser Glu Ala Ala275 280 285Leu Lys Asp Trp G1u Lys Ala Pro Glu Gln Ala Asp Leu Thr Gly Gly290 295 300Ala Leu Asp Arg Ser Glu Leu Glu Arg Ser His Leu Met Leu Pro Leu305 310 315 320Glu Arg Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Ala Ala Ala Pro Gln Pro325 330 335Lys Val Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Thr Ala Gly Pro Arg Arg340 345 350Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe Ala Arg Glu Lys355 360 365Arg Pro Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr Asn Arg Thr Tyr370 375 380Arg Lys Arg Ile Asp Ser Phe Val Lys Arg Gln Ile Glu Asp Met Asp385 390 395 400Asp His Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Ser Leu405 410 415Val Thr Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly Phe420 425 430Ser Gln His Glu Thr Val Asp Ser Val Leu Arg Asn Arg Gly Val Tyr435 440 445Glu Asn Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly Pro Ser450 455 460Ser Glu Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Met Arg465 470 475 480Gln Asp Pro Gln Val His Ser Phe Ile Arg Ser Ala Arg Glu Arg Glu485 490 495Lys His Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser Gly Cys Val Gln
500 505 510Thr Ser Glu Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val Trp Val Lys Trp515 520 525Pro Ile His Pro Ser Ala Pro Glu Leu Ala Gly His Lys Arg Gln Phe530 535 540Gly Ser Val Cys His Gln Asp Pro Arg Val Cys Asp Glu Pro Ser Ser545 550 555 560Glu Asp Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile Cys565 570 575Thr Lys Asn Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro His Met Asp Cys580 585 590Val Ile Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys Gly Arg Cys Glu595 600 605Ile Thr Ser Arg Glu Tyr Cys Asp Phe Met Arg Gly Tyr Phe His Glu610 615 620Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Met Asp Asp Val Cys Gly625 630 635 640Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg Leu645 650 655Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Leu His Cys Leu Val Ser660 665 670Ile Cys Phe Gln Met Thr Val Leu Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala Gly675 680 685Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Ser Gly Val Thr Gly Asn690 695 700Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro Ala705 710 715 720Gly Ser Gln Phe Gly Ile Leu Ala Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe Gln725 730 735
Ser Trp Gln Ile Leu Ala Arg Pro Trp Arg Ala Phe Phe Lys Leu Leu740 745 750Ala Val Val Leu Phe Leu Phe Thr Phe Gly Leu Leu Pro Trp Ile Asp755 760 765Asn Phe Ala His Ile Ser Gly Phe Ile Ser Gly Leu Phe Leu Ser Phe770 775 780Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp Leu Tyr Arg Lys785 790 795 800Arg Cys Gln Ile Ile Ile Phe Gln Val Val Phe Leu Gly Leu Leu Ala805 810 815Gly Leu Val Val Leu Phe Tyr Val Tyr Pro Val Arg Cys Glu Trp Cys820 825 830Glu Phe Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe Cys Glu Lys Tyr835 840 845Glu Leu Asp Ala Gln Leu His850 85權(quán)利要求
1.一種基本上純的多肽，其選自(a)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，其中一或多個氨基酸被置換、刪除、插入、和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ IDNO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ IDNO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
2.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1的多肽。
3.一種載體，其包含權(quán)利要求2的多核苷酸。
4.一種宿主細胞，其含有權(quán)利要求2的多核苷酸或權(quán)利要求3的載體。
5.一種制備權(quán)利要求1的多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求4的宿主細胞；(b)使該宿主細胞表達所述多肽；和(c)收集表達的多肽。
6.一種抗體，其與權(quán)利要求1的多肽結(jié)合。
7.一種多核苷酸，所述多核苷酸與權(quán)利要求2的多核苷酸或其互補鏈互補并包含至少15個核苷酸。
8.一種反義多核苷酸或小干擾RNA，其針對權(quán)利要求2的多核苷酸。
9.權(quán)利要求8的反義多核苷酸，其核苷酸序列包含SEQ ID NO11的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求8的小干擾RNA，其有義鏈包含SEQ ID NO13的核苷酸序列。
11.一種診斷細胞增生性疾病的方法，所述方法包括以下步驟(a)檢測受試生物樣品中編碼SEQ ID NO16的氨基酸序列的基因的表達水平；和(b)使所述表達水平的升高與所述疾病相關(guān)聯(lián)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述表達水平通過選自下組的任一方法進行測定(a)檢測編碼SEQ ID NO16的氨基酸序列的mRNA，(b)檢測包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，和(c)檢測包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的生物活性。
13.篩選用于治療細胞增生性疾病的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將受試化合物與選自下組的多肽接觸(1)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(2)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、插入、和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(3)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ IDNO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性；b)檢測所述多肽與受試化合物的結(jié)合活性；和c)選擇與所述多肽結(jié)合的化合物。
14.篩選用于治療細胞增生性疾病的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將候選化合物與細胞接觸，所述細胞表達含SEQ ID NO15所示核苷酸序列的多核苷酸；和(b)選出使所述多核苷酸的表達水平與沒有該受試化合物時檢測到的表達水平相比降低的化合物。
15.篩選用于治療細胞增生性疾病的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將受試化合物與選自下組的多肽接觸(1)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(2)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、插入、和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(3)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ IDNO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQID NO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性；b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選出與缺乏該受試化合物時檢測到的所述多肽的生物活性相比抑制該多肽生物活性的化合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物活性是促細胞增殖活性。
17.篩選用于治療細胞增生性疾病的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將候選化合物與導(dǎo)入了載體的細胞接觸，所述載體包含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)以及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因，其中所述標(biāo)記基因包含SEQ ID NO15的核苷酸序列，(b)測定所述報告基因的活性；和(c)選出使所述報告基因表達水平與缺乏所述受試化合物時檢測到的表達水平相比降低的化合物。
18.權(quán)利要求11-17的方法，其中所述細胞增生性疾病是癌癥。
19.一種治療細胞增生性疾病的組合物，所述組合物包含藥物有效量的反義多核苷酸或小干擾RNA作為有效成分并含有可藥用的載體，其中所述反義多核苷酸或小干擾RNA針對編碼選自下組的多肽的多核苷酸(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ ID NO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
20.一種治療細胞增生性疾病的組合物，所述組合物包含藥物有效量的抗多肽抗體作為活性成分并含有可藥用的載體，其中所述多肽選自(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且其具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ IDNO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ IDNO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
21.一種用于治療細胞增生性疾病的組合物，所述組合物包含藥物有效量的化合物作為活性成分并包含可藥用的載體，所述化合物通過權(quán)利要求13-17任意一種方法選出。
22.權(quán)利要求19-21之一的組合物，其中所述細胞增生性疾病為癌癥。
23.一種用于治療細胞增生性疾病的方法，所述方法包括給予藥物有效量的反義多核苷酸或小干擾RNA的步驟，該反義多核苷酸或小干擾RNA針對編碼選自下組的多肽的多核苷酸(1)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ IDNO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ IDNO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
24.一種用于治療細胞增生性疾病的方法，所述方法包括給予藥物有效量的抗多肽抗體的步驟，所述多肽選自(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ IDNO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ IDNO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
25.一種用于治療細胞增生性疾病的方法，所述方法包括給予藥物有效量的化合物的步驟，所述化合物通過權(quán)利要求13-15任意一種方法選出。
26.權(quán)利要求23-25之一的組合物，其中所述細胞增生性疾病為癌癥。
27.一種用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括給予藥物有效量的多肽或編碼該多肽的多核苷酸的步驟，所述多肽選自(a)-(c)之一(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多個氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且該多肽具有與含SEQ IDNO16的氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ ID NO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
28.一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括將選自(a)-(c)之一的多肽與抗原遞呈細胞接觸的步驟(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多個氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ IDNO16的氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ ID NO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
29.權(quán)利要求28的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其中該方法進一步包括將所述抗原遞呈細胞給予受試者的步驟。
30.一種治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述組合物包含藥物有效量的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽選自(a)-(c)之一(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多個氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ IDNO16的氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴謹條件下與由SEQ ID NO15的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的人基因RHBDFI，其在CML和AML中的表達與在正常外周血細胞中的表達相比明顯提高，且在肺腺癌中的表達與正常肺細胞中的相比明顯提高。所述基因及其編碼的多肽，可用于例如診斷細胞增生性疾病，以及作為研發(fā)抗所述疾病藥物的靶分子。
文檔編號C12Q1/68GK1701079SQ0382537
公開日2005年11月23日 申請日期2003年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月30日
發(fā)明者中村佑輔, 片桐豐雅 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司, 國立大學(xué)法人東京大學(xué)